PL99294B1 - Sposob wytwarzania ryfamycyny s - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia ryfamycyny S, która jest substratem do otrzy¬ mywania jej pochodnych, bedacych waznymi le¬ kami antybiotycznymi.Znane sa sposoby otrzymywania ryfamycyny S na drodze chemicznej transformacji ryfamycyny B (opis patentowy Wielkiej Brytanii nr 924 472, bel¬ gijski opis patentowy nr 820 517). Transformacja ta wymaga stosowania specjalnej aparatury, a jej prowadzenie jest dosc uciazliwe.Stosowanie sposobu wedlug wynalazku pozwala na wyeliminowanie procesów chemicznych przy wytwarzaniu ryfamycyny S, co znacznie skraca i upraszcza technologie produkcji leków z grupy lyfamycyn. Sposób wytwarzania ryfamycyny' S v/edlug wynalazku polega na tym, ze mutant Strep- tomyces mediterranei TAR-17 hoduje sie metoda podpowierzchniowa w warunkach aerobowych na pozywce, zawierajacej przyswajalne zródla wegla i azotu oraz sole mineralne.Mutant Streptomyces mediterranei TAR-17 otrzy¬ mano w wyniku dzialania N-metylo-N-nitrozo-N'- -nitroguanidyna na strzepki Streptomyces medi¬ terranei ATCC 13685, zawieszone w roztworze fi¬ zjologicznym i selekcji kolonii, wyhodowanych na podlozu agarowym A-7.W tablicy 1 i 2 podano charakterystyke mutanta Streptomyces mediterranei TAR-17.Tablica 1 Przyswajalnosc weglowodanów, bedacych zród¬ lem wegla: d-glukoza d-fruktoza d-mannitol d-ksyloza L-arabinoza m-inozytol celuloza laktoza ramnoza podloze bezwe- glowe ++ + + + + + - ++ ++ — Tablica 2 Podloze 1 agar slodowo-drozdzo- wy agar owsiany Ocena hodowli szczepu 2 wzrost sredni, powierz¬ chnia pofaldowana, grzybnia podstawowa jasno-brazowa CO-77 wzrost bardzo obfity, grzybnia podstawowa jasno-brazowa Oc-117 99 2943 99 294 4 1 x podloze skrobiowe podloze asparaginowo- glicerolowe podloze z dekstryna podloze odzywcze wedlug Waksmana podloze Lindenbeina podloze Czapek Doxa z gliceryna r podloze tyrozynowe zelatyna bulion azotanowy mleczko lakmusowe [ 1 2 wzrost bardzo obfity, grzybnia podstawowa 1 zielono-brazowa CO-82 wzrost sredni, grzyb¬ nia podstawowa zielo- no-brazowo-zólta CO-77 wzrost sredni, grzyb¬ nia podstawowa zól- to-zielona CO-77 wzrost sredni, grzyba nia podstawowa jas- no-bezowa CO-74 | wzrost bardzo slaby wzrost sredni, gladki, grzybnia podstawowa zólto-zielona CO-77 wzrost dobry, brak barwnika typu mela- niny w podlozu brak uplynniania brak redukcji azota¬ nów brak koagulacji i pep- tyzacji | Obserwacje rozwoju Streptomyees mediterranei TAR-17 na róznych podlozach oraz obserwacje przyswajalnosci weglowodanów prowadzono we¬ dlug metody, podanej przez E. Shirlinga i D. Gott- lieba (Methods Manual 1964) oraz S.A. Waksmana (The Actinomycetes 1962).Biosynteze ryfamycyny S przy uzyciu mutanta Streptomyees mediterranei TAR-17 prowadzi sie na podlozach, zawierajacych przyswajalne zródla wegla i azotu pochodzenia naturalnego oraz sole mineralne. Podloza te moga równiez zawierac po¬ chodne kwasu barbiturowego, korzystnie etylofe- nylobarbituran sodowy lub dwuetylobarbituran so¬ dowy, jako inhibitory powstawania innych ryfa* myeyn. Hodowle prowadzi sie w temperaturze oko¬ lo 26 — 32°C. W czasie biosyntezy w miare potrze¬ by dozuje sie srodki przeciwpienne.Aktywnosc brzeczki, otrzymanej w wyniku bio¬ syntezy, oznaeza sie metoda, opisana przez G.G.Galio, C.B. Pasqualucci (II Farmaco Ed. Prat 18, 78, 1963) i C.R. Pasaualucci, A.V. Igevani oraz inni (Journ. Pharm. Sci. 59? 686, 1970). Analize chroma¬ tograficzna wykonuje sie w ukladzie chloroform- -metanol (100:3) na plytkach, pokrytych zawiesina zelu krzemionkowego GF3H w wodzie oraz na plyt¬ kach, pokrytych zawiesina zelu krzemionkowego GF,M w 5Vl roztworze wodnym kwasu cytrynowe¬ go. Chrornatogramy oglada sie w swietle widzial¬ nym i ultrafioletowym.Po zakonczeniu biosyntezy ryfamycyne S izoluje sie z przesaczu brzeczki metodami chemicznymi.Otrzymana ryfamycyna S posiada nastepujace wlasciwosci fizyko-chemiczne: temperatura topnienia 180—182°C, [<*]g+ 476 (w 1% CH3OH), widmo UV i w swietle widzialnym w buforze fos¬ foranowym o wartosci pH=8,04: 224 nmiri% 478. ¦^lcm A 317 nm E,1% 436 525 nm E1% 68.Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej istote wyna¬ lazku, nie ograniczajac jego zastosowania.Przyklad I. Szczep Streptomyees mediterra¬ nei TAR-17, wytwarzajacy ryfamycyne S, hoduje sie na podlozu agarowym A-7 o nastepujacym skladzie: ekstrakt drozdzowy 4 g, ekstrakt slodowy g, glukoza czysta 4 g, platki owsiane 20 g, agar- -agar 20 g, woda destylowana 1000 ml. Pozywke agarowa wyjalawia sie w temperaturze 120°C w czasie 30 minut, tworzac agary skcfsne, które szcze¬ pi sie strzepkami mutanta Streptomyees mediterr¬ anei TAR-17, ^liofilizowanymi w nosniku — mleku odtluszczonym. Agary skosne inkubuje sie w tem¬ peraturze 28°C w czasie 8 dni. Po uplywie tego czasu wstawia sie je do chlodni, w której tempe¬ ratura wynosi +4°C, Okres przechowywania w te temperaturze nie moze byc dluzszy niz dwa mie¬ siace. t m Pochodzacymi z hodowli agarowej strzepkami Streptomyees mediterranei TAR-17, uprzednio zde~ zintegrowanymi i zawieszonymi w 3 ml roztworu fizjologicznego, szczepi sie 50 ml umieszczonego w kolbach trzesawkowych o pojemnosci 250 ml pod- loza P^73 o nastepujacym skladzie: glukoza 30 g, 50% wyciag namokowy kukurydzy 20 g, maka ba¬ welniana 10 g, (NH4)2S04 6 g, CaC03 5 g, ZnS04- •7H20 0,05 g, MnS04-5H20 0,05 g, olej silikonowy 1 g, woda wodociagowa 1000 ml. Podloze przed 40 szczepieniem wyjalawia sie w temperaturze 120°C w czasie 20 minut; wartosc pH po wyjalowieniu powinna wynosic 6,4 — G,8. Zaszczepione podloze P-73 wstawia sie na trzesawke obrotowa i inku¬ buje sie przez 72 godziny w temperaturze 28°C 45 Po uplywie tego czasu przenosi sie 2,5 ml wyhodo¬ wanego inoculom do 50 ml podloza P-73 i inkobu- je przez 30 godzin w temperaturze 28°C. 2 ml tak przygotowanego inokulum przenosi sie do 20 ml podloza FOS-75, umieszczonego w kolbach trze- 50 sawkowych o pojemnosci 250 ml. Sklad podloza FOS-75: mielone wytloki orzechów ziemnych 10 gr maka bawelniana 20 g, KH2po4 i g, (NH4)2so4 g, MgS04-7H2Q i g, glukoza 60 g, sacharoza 50 g, gliceryna 40 g, etylofenylobarbituran sodowy 55 0,4 g, CaCQ3 14 g, CuS04-5«20 0,0033 g, ZnS04- •7HzO 0,05 g,CoCl2-4H20 0,002 g, MnS04-4H2O 0,004 g, (NH4)6Mov024-4H20 0,001 g, FeSo4-7H20 0,01 g, glikol propylenowy 5 g, olej silikonowy Ig, woda wodociagowa 1000 ml, Przed zaszczepieniem po^ so dloze FOS-75 wyjalawia sie w czasie 30 minut w temperaturze 120°C; po wyjalowieniu wartosc pH podloza powinna wynosic 6,5--6,8, Kolby z zaszcze¬ pionym podlozem FOS-75 wstawia sie na trzesawke.Inkubacje prowadzi sie w temperaturze 28°C w ciagu 240—260 godzin. Aktywnosc otrzymanej5 99 294 6 brzeczki, okreslona metoda opisana powyzej, wy¬ nosi 4000 mcg/ml.Przyklad II. 2 ml inokulum, otrzymanego sposobem, opisanym w przykladzie I, szczepi sie ml umieszczonego w kolbach trzesawkowych o pojemnosci 250 ml podloza FOS-12 o nastepujacym skladzie: mielone wytloki orzechów ziemnych 25 g, mielone wytloki nasion soi 10 g, KH2P04 1 g, (NH4/2S04 10 g, MgS04«7H20 1 g, glukoza czysta 110 g, gliceryna 40 g, CaC03 11 g, dwuetylobarbitu- ran sodowy 1,5 g, CuS04-5H20 0,0033 g, ZnS04-7H2O 0,05 g, CoCl2-6H20 0,002 g, MnS04-4H20 0,004 g, FeS04*7H20 0,01 g, glikol propylenowy 5 g, olej si¬ likonowy 1 g, woda wodociagowa 1000 ml; pH pod¬ loza koryguje sie 20% lugiem"sodowym do wartosci 7,8. Po wyjalowieniu wartosc pH podloza powinna wynosic 6,4—6,6. Wyjalowienie oraz inkubacje za¬ szczepionego podloza FOS-12 prowadzi sie sposo¬ bem, opisanym w przykladzie I. Po uplywie 192 godzin inkubacji uzyskuje sie aktywnosc brzeczki rzedu 3000 mcg/ml (aktywnosc brzeczki okresla sie metoda, podana w przykladzie I).Przyklad III. 20 ml podloza FOS-14, przygo¬ towanego tak samo, jak w przykladzie I, szczepi sie 2 ml inokulum, otrzymanego sposobem, opisanym w przykladzie I, w kolbach trzesawkowych 6 po¬ jemnosci 250 ml.^Kolby z zaszczepiona pozywka umieszcza sie na trzesawce i inkubuje w tempera¬ turze 28°C. Sklad podloza FOS-14 jest nastepujacy: mielone wytloki orzechów ziemnych 10 g, maka bawelniana 20 g, KH2P04 1 g, MgS04 1 g, glukoza 110 g, gliceryna 40 g, CaC03 14 g, kwas etylocykloheksenylobarbiturowy 2 g, CuS04-5H20 0,0033 g, ZnS04-7H20 0,05 g, CoCl2- •6H20 0,002 g, MnS04-4H20 0,004 g, (NH4)6Mo7024- •4H20 0,001 g, FeS04-7H20 0,01 g, glikol propyle¬ nowy 5 g, olej silikonowy 1 g, woda wodociagowa 1000 ml. Wartosc pH po wyjalowieniu powinna wy¬ nosic 6,6—6,8. Po uplywie 192 godzin inkubacji aktywnosc brzeczki, oznaczona metoda, podana w przykladzie I, wynosi 3300 mcg/nu? Przyklad IV. Podloze FOD-5 o skladzie: mielone wytloki orzechów ziemnych 25 g, mielone wytloki nasion soi 10 g, KH2P04 1 g, (NHJ2S04 4g, MgS04 1 g, glukoza 110 g, gliceryna 40 g, CaC03 14 g, etylocykloheksenylobarbituran wapniowy 2 g, CuS04-5H20 0,0033 g, ZnS04-7H20 0,05 g, CoCl2- *6HoO 0,002 g, MnS04-4H20 0,004 g, (NH4)6Mo7024- •4HzO 0,001 g, FeSO^THaO 0,01 g, glikol propyle¬ nowy 5 g, olej silikonowy 1 g, woda wodociagowa 1000 ml szczepi sie inokulum, otrzymanym sposo¬ bem, opisanym w przykladzie I (2 ml inokulum na 20 ml podloza w kolbach trzesawkowych o pojem¬ nosci 250 ml). Przed szczepieniem pH podloza ko¬ ryguje sie 20°/oi lugiem sodowym do wartosci 7,8, a nastepnie wyjalawia w temperaturze 120°C w ciagu 30 minut; wartosc pH po wyjalowieniu po¬ winna wynosic 6,6—6,8. Kolby z zaszczepiona po¬ zywka umieszcza sie na trzesawce i inkubuje w temperaturze 28°C. Po uplywie 192 godzin inku¬ bacji aktywnosc brzeczki, oznaczona metoda, po¬ dana w przykladzie I, wynosi 2200 mcg/ml.Przyklad V. Podloze FOS-75/1 o skladzie: zmielone wytloki orzechów ziemnych 10 g, maka bawelniana 20 g, KH2P04 1 g, (NH4)2S04 10 gr MgS04-7H20 1 g, glukoza 60 g, sacharoza' 50 g, gliceryna 40 g, CaCOs 14 g, CuS04-5H20 0,0033 g ZnS04-7H20 0,05 g, CoCl2-4H20 0,002 g, MNS04* •4HzO 0,004 g, (NH4)6Mo7024-4H20 0,001 g, FeS04* •7HzO 0,01 g, glikol propylenowy 5 g, olej sili¬ konowy 1 g, woda wodociagowa 1000 ml wyja¬ lawia sie w temperaturze 120°C w ciagu 30 minut; wartosc pH po wyjalowieniu powinna wynosic 6,4—6,8. Nastepnie podloze szczepi sie inokulumv otrzymanym metoda, opisana w przykladzie I.Kolby z zaszczepiona pozywka umieszcza sie na trzesawce i inkubuje w temperaturze 28°C. Po u- plywie 192 godzin inkubacji aktywnosc brzeczki wynosi 2500 mcg/ml. PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania ryfamycyny S, znamien¬ ny tym, ze mutant Streptomyces mediterranei TAR-17 hoduje sie metoda podpowierzchniowa w warunkach aerobowych na pozywce, zawieraja¬ cej przyswajalne zródla wegla i azotu oraz sole mineralne.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie pozywke, zawierajaca pochodne kwasu barbiturowego, korzystnie etylofenylobarbituran sodowy lub dwuetylobarbituran sodowy.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w temperaturze okolo 26— 32°C. 15 20 25 SO 35 40 \ PL