Przedmiotem wynalazku jest sposób i urzadzenie do pomiaru stezenia hemoglobiny we krwi metoda fotometryczna i przeznaczony jest do stosowania w laboratoriach analitycznych posiadajacych w swoim wyposazeniu spektrofotometry lub do stosowania w rozwiazaniach urzadzen do pomiarów stezenia hemoglobiny we krwi.Dotychczas pomiaru stezenia hemoglobiny we krwi metoda cyjanohemiglobinowa dokonuje sie poprzez pomiar ekstynkcji próbki krwi, przy dlugosci fali 540 mm, rozcienczonej odczynnikiem Drabkina w stosunku 1 :251. Stezenie hemoglobiny okresla sie zgodnie z prawem Bouguera-Lamberta-Beera. Roztwór Drabkina posiada w swoim skladzie cyjanek potasowy w ilosci 50 mg/l roztworu, zelazicyjanek potasowy w ilosci 200 mg/l roztworu oraz dwuweglan sodpwy w ilosci 1 g/l roztworu. Na skutek dzialania cyjanku oraz zelazicyjanku potasowego wszystkie pochodne hemoglobiny, takie jak oksyhemoglobina, hemoglobina zredukowana, hemiglobina itp. przechodza w jedna: cyjanohemiglobine. Poniewaz reakcja ta przebiega powoli, stad pomiaru ekstynkcji próbki mozna dokonywac po 20 minutach od chwili jej rozcienczenia. (Roland Richterich, Chemia kliniczna 1971, str. 106-119, str. 336-338).Zasadnicza wada pomiaru stezenia hemoglobiny metoda cyjanhemiglobinowa przy uzyciu odczynnika Drabkina lub jego modyfikacji jest dlugi, dwudziestominutowy czas zachodzenia procesów fizycznych i reakcji chemicznych. Na czas ten skladaja sie trzy procesy zachodzace w roztworze: hemoliza krwinek czerwonych, tworzenie sie kompleksu Fe (CN)* "na skutek dzialania cyjanku potasu i tworzenie sie kompleksu Fe(CN)|"na skutek dzialania zelazicyjanku potasowego, Czas tworzenia sie kompleksu Fe(CN)J "jest, w porównaniu z czasem hemolizy i czasem tworzenia sie kompleksu Fe(CN)J", pomijalnie maly. Zatem glównymi przyczynami, które powoduja wydluzenie czasu od momentu rozcienczenia do momentu pomiaru ekstynkcji jest hemoliza krwinek czerwonych oraz powolne zachodzenie reakcji: Fe(CN)"5 - e -* Fe(CN)"J2 97 913 Proponowany sposób umozliwia pomiar ekstynkcji próbki natychmiast po jej przygotowaniu, to jest rozcienczeniu i wymieszaniu.Celem wynalazkujest skrócenie czasu od momentu przygotowania próbki, do momentu pomiaru ekstynkcji tej próbki przy pomocy spektrofotometru lub urzadzenia co tego celu przeznaczonego.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze próbke krwi rozciencza sie odczynnikiem Drabkina zawierajacym dodatek saponiny w ilosci nie mniejszej niz 1 mg na 100 ml odczynnika, korzystnie 5-10 mg a oznaczenia dokonuje sie przy dlugosci fali promieniowania swietlnego, odpowiadajacej punktowi izobestycznemu cyjanohemoglobiny i cyjanohemiglobiny.Urzadzenie wedlug wynalazku posiada filtr optyczny, którego maksimum transmisji odpowiada dlugosci fali punktu izobestycznego cyjanohemoglobiny i cyjanohemiglobiny.Sposób polega na tym, ze próbke krwi rozciencza sie odczynnikiem Drabkina zawierajacym dodatek saponiny w ilosci nie mniejszej niz 1 mg na 100 ml odczynnika, najkorzystniej 5—10 mg. Po rozcienczeniu zachodzi proces hemolizy krwinek czerwonych. Po zakonczeniu tego procesu, to jest czasie 0,5-1 minut w roztworze znajduja sie dwie pochodne hemoglobiny; cyjanohemoglobina, której zelazo dwuwartosciowe tworzy z grupa CN " kompleks Fe(CN)"J oraz cyjanohemiglobina, której zelazo trójwartosciowe tworzy z grupa CN- kompleks Fe(CN)"|. Na skutek duzej zawartosci w odczynniku Drabkina kompleksu Fe(CN)~| pochodzacego z zelazicyjanku potasowego nastepuje wolne utlenienie kompleksu Fe/CN"J, zwiazanego z cyjanohemoglobina do postaci Fe(CN)~a. Zmiane ekstynkcji w czasie, spowodowana ta reakcja obserwuje sie na spektrofotometrze dla dlugosci fal, róznych od dlugosci fal odpowiadajacych punktom izobestycznym.W punktach izobestycznych ekstynkcja nie ulega zmianom w czasie od momentu zaknczenia procesu hemolizy, co umozliwia jej pomiar po uplywie 0,5-1 minuty od momentu przygotowania próbki Poniewaz spektrofotometry charakteryzuja sie róznymi na ogól dokladnosciami ustawienia dlugosci fali oraz róznia monochromatycznoscia swiatla, dlatego punkt izobestyczny na podzialce nastawienia dlugosci fali moze byc rózny dla róznych spektrofotometrów. Stad tez wynika koniecznosc jednorazowego znalezienia punktu izobestycznego cyjanohemoglobiny i cyjanohemiglobiny dla danego spektrofotometru oraz jego kalibracji przy pomocy wzorca cyjanohemiglobiny.Sposób wedlug wynalazku mozna takze stosowac w fotometrach przeznaczonych do bezposredniego pomiaru stezenia hemoglobiny we krwi posiadajacych filtr optyczny, którego maksimum transmisji odpowiada dlugosci fali punktu izobestycznego cyjanohemoglobiny i cyjanohemiglobiny.Wynalazek umozliwia pomiar ekstynkcji próbki, a zatem i stezenia hemoglobiny we krwi w czasie —30 sekund. Umozliwia takze zastosowanie fotometrów w systemach automatycznych analizatorów hematologicznych o duzej wydajnosci.Sposób wedlug wynalazku nie zmienia metody pomiarowej oraz stosowanych powszechnie odczynników.Przyklad. Odczynnik Drabkina przygotowuje sie nastepujaco: 100 ml dostepnego w handlu odczynnika Drabkina o skladzie: Na HCO3-l,0%, K2CO3-0,l%, KCN-0,05%, Ka Fe(CN)6 - 0,2% rozpuszcza sie w wodzie destylowanej, dodaje sie 10 mg saponiny i dokladnie miesza sie. Takprzygotowany roztwór uzywa sie w dalszych czynnosciach. Nastawia sie na spektrofotometrze dlugosc fali 525 mm, nastepnie odmierza sie 5 ml przygotowanego uprzednio odczynnika Drabkina oraz 0,02 ml krwi. W momencie wprowadzenia próbki krwi do odczynnika uruchamia sie stoper, miesza sie próbke i przelewa sie do kuwety spektrofotometru. Do kuwety porównawczej wlewa sie odczynnik Drabkina. Po uplywie dwóch minut od momentu wprowadzenia próbki krwi do odczynnika odczytuje sie ekstynkcje E521 (t = 2 min). Po odczekaniu nastepnych osiemnastu minut ponownie odczytuje sie ekstynkcje E^s (t = 20 min). Nastepnie ustawia sie dlugosc dali 540 m i powtarza uprzednio wykonywane czynnosci, uzyskujac w ten sposób ekstynkcje E540 (t = 2 min) oraz E540 (t = 20 min).W celu prowadzenia dalszych prób niezbedne sa nastepujace obliczenia: E525(t = 2min)-E5a5(t = 20min) ó525 '100 Eg 2 5 (t = 20 min) E«4o (t = 2 min) - Ej40 (t = 20 min) 6640= - -100 E540(t = 20 min)97913 3 Obliczana wartosc \t ustawia sie .na spektrofotometrze i dokonuje sie ponownie badania dynamiki zmian ekstynkcji poprzez jej pomiar w 2 i 20 minucie, uzyskujac w ten sposób EXl (t = 2 min) oraz EXl (t = 20 min).Nastepnie dokonuje sie obliczenia: EXl (t = 2 min)- EXl (t = 20 min) SXl=—— — --100 EXl (t = 20 min) Po obliczeniu 8Xl moga zaistniec dwa przypadki: ISjuj^o* 15xi l50- W przypadku gdy modul zSXl jest mniejszy od zalozonej dokladnosci 5Q wówczas wartosc Xi przyjmuje sie za dlugosc fali promieniowania swietlnego odpowiadajaca punktowi izobestycznemu cyjanhemoglobiny i cyjanhemiglobiny.W przypadku, gdy modul 6Xl jest wiekszy od zalozonej dokladnosci fl0 wówczas jezeli 5XX) przyjmuje sie do obliczen 8Xl, Xi ,554o, 540 jezeli 5Xl0 przyjmuje sie do obliczen6Xl, Xi,6525,525; Oblicza sie X2 wedlug zaleznosci: *40*1 -8\i 540 X2= jezeli 5Xl<0 §640 —8x1 5Xl 525-5^5X1 . ¦ X2=— jezeh5Xl0 Ustawia sie na spektrofotometrze dlugosc fali Xa i ponownie przeprowadza sie pomiary dynamiki zmian ekstynkcji otrzymujac EXz (t = 2 min), EXl (t = 20 min).Powtarza sie przeprowadzenie obliczen i badan do momentu uzyskania ISjuK^o- Dojoblieten kolejnych dlugosci fali przyjmuje sie bledy wzgledne 6Xl o przeciwnych znakach i wartosciach najbardziej bliskich zera.Zazwyczaj juz w pierwszym lub drugim przyblizeniu uzyskuje sie wartosc dlugosci fali odpowiadajaca punktowi izobestycznemu. Wartosc 50 nalezy przyjmowac w granicach 1% do 2%, w zaleznosci od jakosci spektrofotometru. Przy poszukiwaniu punktu izobestycznego, nie jest koniecznie stosowanie krwi od tego samego pacjenta. Powtarzalnosc rozcienczania próbki krwi nie ma wplywu na dokladnosc wyznaczenia punktu izobestycznego. ¦ Majac wyznaczony punkt izobestyczny mozna przystapic do kalibracji spektrofotometru w tym punkcie.Do kuwety pomiarowej wlewa sie wzorzec cyjanohemiglobiny i odczytuje sie ekstynkcje wzorca.Obliczamy wspólczynnik: CW iw" Cw — stezenie hemoglobiny Ew — ekstynkcja wzorca w punkcie izobestycznym Zaleznosc stezenia hemoglobiny dowolnej próbki od jej ekstynkcji jest nastepujaca: c = a E c -stezenie hemoglobiny we krwi wg/100 ml E — ekstynkcja próbki we krwi rozcienczonej w stosunku 1 :25 odczynnikiem Drabkina z saponina, mierzona w dowolnym momencie czasu po jej przygotowaniu w znalezionym punkcie izobesty¬ cznym cyjanohemoglobiny i cyjanohemiglobiny. PL