PL97283B1 - Sposob otrzymywania nizyny w postaci czystej - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania z produktów, uzyskiwanych przez fermentacje znanych pozywek za pomoca drobnoustrojów ze szczepu nizynowotwórczego Streptococcus lactis, czystych preparatów nizyny o mocy 40 X 106 jedn./g, z przeznaczeniem dla przemyslu farmaceutycznego jako standard do oznaczania handlowej nizyny oraz do badan nad struktura i funkcja polipeptydów.Pod sformulowaniem jednostek w calym opisie wynalazku rozumie sie jednostki Readinga.Stan techniki. Nizyna jest antybiotykiem, wytwarzanym przez szczep Streptococcus lactis w logarytmicznej fazie wzrostu i stanowi mieszanke polipeptydów, które hamuja wzrost róznych mikroorganizmów miedzy innymi szczepów Clostridien. Dzieki temu nizyna znalazla zastosowanie w przemysle spozywczym.Znane dotychczas sposoby wyodrebniania czystej nizyny (Berridge NJ. Biochem. J.1949, 45, 486; Berridge N.J., Newton G.F., Abraham E.P. BiochemJ. 1952,52,529) polegaja na frakcjonowaniu plynnej hodowli Streptococcus lactis rozpuszczalnikami organicznymi w srodowisku kwasnym, w wyniku czego uzyskuje sie surowy preparat nizyny, który nastepnie oczyszcza sie popriez frakcjonowanie róznymi stezeniami chlorku sodu w srodowisku kwasnym, a nastepnie krystalizuje z alkoholu lub tez wydziela sie metoda rozdzialu przeciwpradowego.Metoda opisana przez Berridge'a jest pracochlonna, kosztowna i malo wydajna.Handlowe koncentraty nizyny otrzymuje sie wedlug postepowania, przedstawionego w opisach patento¬ wych Wielkiej Brytanii nr 844782 Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2939503 i Polski nr 68835. Postepowanie to polega na wyodrebnieniu nizyny przez wytracanie bialka ze srodowiska fermentacyjnego, wyplukaniu nizyny z wytraconego osadu oraz wypienieniu uzyskanych cieczy zawierajacych nizyne, a nastepnie wytraceniu nizyny z tych cieczy, odwirowaniu osadu i jego suszeniu Handlowe koncentraty nizyny sa sprowadzane do mocy okolo 1 X 106 jedn./g i zawieraja oprócz nizyny chlorek sodu i inne bialka, pozbawione aktywnosci nizynowej.Istota wynalazku. Celem wynalazku jest uzyskiwanie czystej nizyny z handlowych koncentratów, a zadanie to zrealizowano poprzez opracowanie prostego i szybkiego sposobu, przedstawionego w niniejszym opisie.Sposobem wedlug wynalazku, otrzymuje sie czysty preparat nizyny o mocy 40 X 106 jedn./g z produktu: , 97 283 handlowego, otrzymanego: w wyniku stosowania procesu'kvhnologicz.nego, opisanego na przyklad w opisie patentowym nr 08835.Zgodnie z wynalazkiem handlowy koncentrat nizyny, zawierajacy jako glówny skladnik chlorek sodu i zanieczyszczenia bialkowe oraz nizyne wstanie stalym, zawiesza sie w srodowisku silnie kwasnym o pH = I-,5-2,5, przez rozmieszanie w takiej ilosci 0,02 N kwasu solnego, aby otrzymac gesta zawiesino, która wprowadza sie do worka dializacyjnego i poddaje kilkunastogodzinnej dializie do 0,02 N kwasu solnego w temperaturze pokojowej celem obnizenia stezenia, soli i rozpuszczenia nizyny po czyn* zawartosc worka poddaje sie saczeniu na sicie molekularnym o zakresie frakcjonowania 1000 do 10000, w wyniku czego otrzymuje sie czysty roztwór nizyny wolny od soli i zwiazków niskoczasteczkowych oraz zanieczyszczen bialkowych. Frakcje, zawierajace nizyne po krótkiej dializie do wody destylowanej poddaje sie liofilizacji Zasadnicza zaleta, wynikajaca ze stosowania sposobu otrzymywania nizyny wedlug wynalazku, jest proste i krótkie postepowanie prowadzace do uzyskania preparatu nizyny, wolnego od soli, zwiazków drobnoczastecz- kowych i zanieczyszczen bialkowych oraz o aktywnosci czterdziestokrotnie wyzszej od preparatów wyjsciowych, a zblizonej do aktywnosci nizyny, otrzymanej metoda Beridge'ai wsp. (Berridge NJ., Newton G.F., Abraham E.P., Biochem. J., 1952,52 529).Podany nizej przyklad wyjasnia blizej istote sposobu wedlug wynalazku. < Przyklad. 3g handlowego .koncentratu nizyny z przeznaczeniem do przemyslu spozywczego o mocy okolo 1 X 106 jedn./g zadaje sie 6 ml 0,02 N kwasu solnego, zawiesza przez rozmieszanie i przenosi sie do worka dializacyjnego, po czym dializuje 12 godzin do 41 0,02 N kwasu solnego w temperaturze pokojowej.Zawartosc woreczka dializacyjnego przenosi sie do probówki wirówkowej i poddaje wirowaniu przy lOOOOg przez 10 minut. Plyn znad osadu poddaje sie saczeniu molekularnemu na Bio-Gelu P-10 o stopniu granulacji 200-M00 mesh firmy Calbiochem. W tym celu na kolumne szklana o wymiarach 150 X 1,5 cnm wypelnionr- uprzednio napecznialym w wodzie destylowanej bio-Gelem P-10 i zrównowazona 0,02 N kwasem solnym, wlewa sie cala objetosc plynu znad osadu. Do elucji stosuje sie 0,02 N kwas solny i zbiera sie okolo 60 frakcji o objetosci 6 ml przy szybkosci wyplywu 12 ml/godzine. We wszystkich frakcjach oznacza sie ilosc bilaka przez pomiar ekstynkcji w spektrofotometrze przy dlugosci fali 235 i 280 nm. We frakcjach, zawierajacych nizyne, stosunek ekstynkcji przy 235 nm do ekstynkcji przy 280 nm przekracza wartosc 10, we frakcjach, zawierajacych zanieczyszczenia bialkowe, stosunek ten przekracza wartosc 3.Na zalaczonym rysunku zilustrowano opisany przyklad i w ukladre wspólrzednych naniesiono profil elucyjny, uzyskany w wyniku saczenia molekularnego na Bio-Gelu P—10 handlowego preparatu nizyny produkcji polskiej. Na lewej osi rzednych naniesiono wartosc ekstynkcji E, na prawej osi aktywnosc nizynowa, zas na osi odcietych kolejne frakcje, wyplywajace z kolumny.Frakcje o najwyzszej aktywnosci nizynowej to jest frakcje od 48 do 51 wlacznie, zlewano i poddawano 3 godzinnej dializie do 21 wody destylowanej dwukrotnie zmienianej, po czym je liofilizowano. Uzyskano z3g handlowego preparatu nizyny 42 mg preparatu nizyny o mocy 40 X 106 jedn./g z wydajnoscia 56%.. \ty czasie licznych prób doswiadczalnych w sposób, nie budzacy watpliwosci, stwierdzono, ze zachowujac te same warunki polegajace na stosowaniu kolumny o okreslonej wielkosci, okreslonego sita molekularnego i okreslonego rozpuszczalnika frakcje o najwyzszej aktywnosci nizynowej wyplywaja w scisle okreslonym czasie. 0 +4 +6 52 fó 63 84 BB 7$ 76 80 NR FfiAKCJl PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania nizyny w postaci czystej znamienny tym, ze koncentrat handlowy nizyny zawierajacy jako glówny skladnik chlorek sodu i zanieczyszczenia bialkowe, pochodzace z brzeczki pofermenta¬ cyjnej, a nizyne wstanie stalym zawiesza sie w srodowisku silnie kwasnym o pH = 1,5^2,5, najkorzystniej w 0,02 N kwasie solnym,' dializuje sie do srodowiska kwasnego o tej samej kwasowosci i oddziela sie plyn od osadu, po czym na kolumne, która uprzednio wypelnia sie sitem molekularnym, najkorzystniej zelem poliakryloamidowym o stopniu granulacji 200 + 400 mesh i zakresie frakcjonowania od 1000 do 10000 i równowazy sie roztworem o tej samej wartosci pH, nanosi sie otrzymany plyn oraz roztworem o tej samej wartosci pH wymywa sie naniesiony na sita material, z którego sposród kolejnych frakcji pobiera sie tylko frakcje o najwyzszej aktywnosci nizynowej a nastepnie po okolo trzygodzinnej dializie do wody poddaje sie te frakcje liofilizacji.97 283 — £295 ~+ £290 Ni2YAfOffA *K7YHN0SC NlZYNOHA \ HJ£D/v/6-ml 5x*05 VW !i I A /£ L'0 2+ 28 Si' 56 * PL