PL95385B1 - Sposob otrzymywania dezalanylotetainy - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 31.03.1978 95385 MKP C07g 11/00 A61k 21/00 Int. Cl.2 C07G 11/00 AG1K 21/00 Twórcy wynalazku: Hanna Wojciechowska, Malgorzata Gumieniak, Ry¬ szard Andruszkiewicz, Aleksandra Andruszkiewicz, Maciej Smulkowski, Jerzy Gumieniak, Jadwiga Wolf, Edward Borowski Uprawniony z patentu: Politechnika Gdanska, Gdansk (Polska) ¦ Sposób oirzyniywania dezalanylotetairty i Przedmiotem: wynalazku jest sposób otrzymy¬ wania dezalanylotetainy.Dotychczas zriany sposób otrzymywania deza¬ lanylotetainy polega na enzyimatyezriej degrada¬ cji czystej tetainy przy pomocy lipazy i wyodreb¬ nieniu otrzymanego produktu przez rozdzial prze- ciwpradowy.Niedogodnoscia znanego sposobu sa wysokie ko¬ szty procesu zwiazane z cena lipazy. Ponadto, opisanym sposobem mozna otrzymywac dezalany- ldteitaine jedynie ma skale laboratoryjna ze wizgle- du na stosowanie rozdzialu przeciwpradowego do jej izolacji.Sposób otrzymywania dezalanylotetainy na dro¬ dze enzymatycznej degradacji wedlug wynalazku polega na tym, ze na tetaine lub na jej ekstra¬ kty butanolowe, otrzymywane w wyniku wstepnej izolacji z brzeczki, dziala sie preparatami enzy¬ matycznymi zawierajacymi egzopeptydiazy, korzy¬ stnie nieoczyszczonymi preparatami lipaz bakte¬ ryjnych, zwierzecych lub roslinnych, w srodowi¬ sku o pH od 7 do 8,5 zwlaszcza w buforze fosfo¬ ranowym, w temperaturze ponizej 30°iC. Uzyskany produkt wydziela sie z mieszaniny reakcyjnej znanymi sposobami, poczym oczyszcza, korzystnie przy pomocy chromatografii jonowymiennej, fil¬ tracji molekularnej i/lub chromatografii podzialo¬ wej.Tetaina jej mieszanina dwóch izomerycznych dwu£e£tyidów L-alanyló-L-^-i(2,S-e^oksycykioheksi- nono-40-alaniny, zwanych tetaina A i B. Obydwie sulbsitaincje wykazuja podobne dzialanie przeciw- drobnioustroijowe, obejmujace bakiterie grammdo- datnie i grammujemne oraz niektóre gatunki grzy¬ bów.Szczególnie cenna cecha tetainy jest niska toksy¬ cznosc dla organizmów zwierzecych, wynikajace z mechanizmu jej dzialanie, (który polega na ha¬ mowaniu syntezy mureiny sciany komórkowej drobnoustroju poprzez zahamowanie inkorporacji L-alaniny do reszty kwasu N-acetyloimuraminowe- go, Poniewaiz dotychczas nie sa znane antybiotyki hamujace ten proces enzymatyczny, zbadanie me¬ chanizmu hamowania syntezy 'mureiny otwiera nowe mozliwosci uzyskiwania nietoksycznych che- moterapeutyków na drodze syntezy analogów stru- ktualnych tetainy. Otrzymanie tych analogów jest celowe równiez ze wzgledu na to, ze tetaina jest podatna na dzialanie szeregu enzymów, zwlaszcza egzopeptydaz, latwo powodujacych jej unieczyn- riienie w organizmach zywych.Egzopeptydazy dezaktywuja tetaine, powodujac degradacje lanculcha peptydowego na aminokwasy alanine i dezalanylotetaine A i B. Dezalanyloteta- ina jest dogodnym substratem do syntez pochod¬ nych tetainy róznego typu.Zalety sposobu wedlug wynalazku polegaja na 3o otrzyimanilu oczyszczonych produktów z dobry- 05 385Ó53S5 mi wydajnosciami w prostym procesie technologi¬ cznym oraz mozliwosci prowadzenia procesu na skale przemyslowa. Ponadto, nieoczyszczone pre¬ paraty lipaz sa tanim i latwo dostepnym zródlem egzopeptydaz, natomiast w przypadku wykorzysta¬ nia w procesie preparatów tetainy wstepnie izo¬ lowanych z brzeczki eliminuje sie zmudne i ko¬ sztowne etapy oczyszczania antybiotyku.Przyklad I. 10 mg liofilizatu tetainy rozpu¬ szcza sie w 3 ml wody i dodaje 3 mg pronazy, zawieszonej w 3 ml buforu fosforanowego o pH = 8,2. Mieszanine reakcyjna inkubuje sie w 28°C przez 48 godzin, az do zaniku aktywnosci biologicznej, oznaczanej metoda krazkowa i mikro¬ biologiczna metoda dyfuzyjna wobec standartu chlorotetracykliny po ustaleniu liniowej zalezno¬ sci w hamowaniu wzrostu Shigella shigae przez tetaine i chlorotetracykline.Nastepnie mieszanine reakcyjna odsacza sie od zawiesiny bialka enzymatycznego i uzyskany kla¬ rowny roztwór zateza sie pod zmniejszonym cis¬ nieniem do objetosci 1 ml, po czym izoluje sie dezalanylotetaine przy pomocy chromatografii jo¬ nowymiennej. Frakcje zawierajace chromatografi¬ cznie czysta dezalanylotetaine laczy sie, zateza pod zmniejszonym cisnieniem i liofilizuje, uzysku¬ jac 5 mg liofilizatu dezalanylotetainy.Przyklad II. 50 mg liofilizatu antybiotyku, zawierajacego 60% tetainy, rozpuszcza sie w 10 ml wody i dodaje 8 mg pankreatyny, zawieszonej w 10 iml buforu otrzymanego w trój(hydxoksyme- tylo)-aminometanu i kwasu solnego, o pH =* 7y8.Reakcje degradacji enzymatycznej prowadzi sie w 30°C przez 72 godziny, az do zaniku aktyfwno- ici biologicznej antybiotyku.Nastepnie mieszanine reakcyjna saczy sie przez ziemie okrzemkowa, zateza pod zmniejszonym cis¬ nieniem do objetosci 5 ml, dodaje 50 ml oziebio¬ nego metanolu i powstaly osad odwirowuje sie.Supernatant zateza sie do objetosci 5 ml i dezala¬ nylotetaine izoluje sie przy pomocy chromatogra¬ fii jonowymiennej i filtracji molekularnej.Eluat z kolumny, zawierajacy chromatograficz¬ nie jednorodna substancje liofilizuje sie, uzysku¬ jac 13 mg dezalanylotetainy.Przyklad III. 10 mg liofilizatu tetainy roz¬ puszcza sie w 3 ml wody i dodaje 20 mg prepa¬ ratu lipazy, otrzymanej z hodowli Pseudomonas species, zawieszonej w 5 ml buforu fosforanowego o pH = 8,2.Reakcje degradacji enzymatycznej prowadzi sie w 30°C przez 88 godzin, az do zaniku aktywnosci biologicznej antybiotyku. Osad pochodzacy z pre- paraltu enzymatycznego odsacza sie, a roztwór za¬ teza pod zmniejszonym cisnieniem i wydziela de¬ zalanylotetaine metoda chromatografii jonowy¬ miennej. Frakcje zawierajace dezManyiotetaine za¬ teza sie i liofilizuje, uzyskujac 4 mig liofilizaitu dezalonyliottetainy.Przyklad IV. 20 mg liofilizatu tetainy roz¬ puszcza sie w 2 ml wody i dodaje sie 20 mg preparatu lipazy otrzymanego z hodowli Statphy- lococcus sureius zawieszonego w 10 ml buforu, otrzymanego z trój(hydroksymetylo)aminometanii i kwasu solnego, o pH = 8,1. Reakcje enzymaty¬ czna prowadzi sie w 30°C przez 80 godzin, az do aaniku aktywnosci biologicznej tetainy. Miesza¬ nine ireakcyjna saczy sie przez ziemie okrzemko¬ wa i otrzymany przesacz zateza sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem do objetosci 2 ml, po czym wydziela sie dezalanylotetaine droga preparatyw- nej chromatografii bibulowej w fazie górnej ukla¬ du n-butanol-imetanol^woda = 10:1:10. Dezalany¬ lotetaine efluuje sie z bibuly wioda i liofilizuje, uzyskujac 7 mg czystej substancji.Przyklad V. 40 mg liofilizatu tetainy rozpu¬ szcza sie w 10 ml wcdy i dodaje 20 mg preparatu lipazy otrzymanego z hodowli Candida albicans zawieszonego w 10 ml buforu, zawierajacego roz¬ twór kwasu cytrynowego i fosforanu dwusodowe- go o pH = 7,2. Reakcje prowadzi sie w 30°C przez 72 godziny. Nastepnie odsacza sie bialko enzymatyczne, a przesacz zateza do objetosci 5 ml pod zmniejszonym cisnieniem. Dezalanylotetaine izoluje sie przy pomocy chromatografii jonowy¬ miennej i filtracji molekularnej. Eluat z kolumny zateia sie i liofilizuje, uzyskujac 15 mg chroma¬ tograficznie jednorodnej dezalanylotetainy.Przyklad VI. 100 ml ekstraktu butanolego surowego antybiotyku o zawartosci tetainy 2,5 mg/ml dodaje sie 80 mg preparatu lipazy trzustko¬ wej zawieszonej w 100 ml buforu fosforanowego o pH = 8,2. Reakcje proiwadzi sie w temperaturze 28*0 z jednoczesnym mieszaniem przez 72 godziny, az do zaniku aktywnosci biologicznej tetainy. Mie¬ szanine reakcyjna przesacza sie przez ziemie Okrzemkowa, po czym przesacz zateza sie do ob- jetnosci 25 ml, dodaje 150 ml oziebionego meta¬ nolu, a powstaly osad odwirowuje.Supernatant zateza sie pod zmniejszonym cis¬ nieniem do objetosci 25 ml i izoluje dezalanylo¬ tetaine przy pomocy chromatografii jonowymien¬ nej, po czym oczyszcza uzyskany produkt metoda chromatografii podzialowej na zelu krzemionko¬ wym w ukladzie chloroform^metanol-woda = 16:8:0,5. Frakcje zawierajace wylacznie dezalany¬ lotetaine liofilizuje sie, uzyskujac 75 mg prepara¬ tu czystej dezalanylotetainy.P,rz y k l a d VII. 30 mg liofilizatu antybiotyku, zawierajacego 80% tetainy, rozpuszcza sie w 10 ml wody i dodaje 5 mg preparatu lipazy z kiel- 50 ków zbozowych, zawieszonego w 10 ml buforu otrzymanego z trójhydroksymetylo/aiminometanu i kwasu solnego o pH = 7,8.Reakcje prowadzi sie w temperaturze 28°C przez 60 godzin. Zawiesine bialka enzymatycznego od¬ sacza sie na ziemi okrzemkowej, po czym otrzy¬ many przesacz zateza sie do objetosci 4 ml i pod¬ daje filtracji molekularnej.Izolacje czystego produktu przeprowadza sie metoda chromatografii podzialowej na zelu krze¬ mionkowym w ukladzie octan etylu-metanol-woda = 5:11:0,75. Po liofilizacji otrzymuje sie 15 mg dezalanylotetainy.Przyklad VIII. Do 100 ml ekstraktu fouta- nologowego jak w przykladzie VI, dodaje sie 0,5 40 45 55 60 65§5385 g suatowej lipazy uzyskanej przez odtluszczenie i odwodnienie swiezej trzuski za pomoca acetonu i eteru, zawieszonej w 100 ml buforu otrzymane¬ go z trój(hydroksymetylo)aminometanu i kwasu solnego, o pH = 7,8. Reakcje prowadzi sie przy ciaglym mieszaniu przez 2 doby w temperaturze 28°C.Nastepnie mieszanine reakcyjna zateza sie do objetosci 30 ml i dodaje 200 ml oziebionego me¬ tanolu, a powstaly osad odwirowuje sie. Superna- tant zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 25 ml, po czym izoluje dezalanyloteta- ine za pomoca chromatografii jonowymiennej, fil¬ tracji molekularnej i chromatografii podzialowej na zelu krzemionkowym, w ukladzie chloroform- -metanol-woda = 16:8:0,5 i liofilizuje, 'uzyskujac 60 mg czystej dezalanylotetainy. 6 PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe iSposób otrzymywania dezalanylotetainy na dro¬ dze enzymatycznej degradacji, znamienny tym, ze 5 nia tetaine lub na Jej ekstrakty butanolowe otrzy¬ mane w wyniku wstepnej izolacji z brzeczki dzia¬ la sie preparatami enzymatycznymi zawierajacymi egzopeptydazy, korzystnie nieoczyszczonymi prepa¬ ratami lipaz bakteryjnych, zwierzecych lub ros-, 10 linnych, w srodowisku o pH od 7 do 8,5, zwla¬ szcza w buforze fosforanowym, w temperaturze ponizej 30°C, a uzyskany produkt wydziela sie z mieszaniny reakcyjnej znanymi sposobami, po czym oczyszcza, korzystnie przy pomocy chroma- 15 tografii jonowymiennej, filtracji molekularnej i/lub chromatografii podzialowej na zelu krzemo¬ wym. PL