Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania antybiotycznie czynnej mieszaniny lub jej skladników Verdamycyny I; G-418, gentamycyny A i sizomycyny, na drodze hodowli nieznanego dotychczas gatunku rodzaju Micromonospora, a mianowicie Micromonospora grisea.W sklad antybiotycznie czynnej mieszaniny wchodzi nowy antybiotyk, nazwany Verdamycyna I, który jest wytwarzany razem z nowym antybiotykiem G-418 w hodowli Micromonospora grisea. Ponadto mieszanina zawiera znane antybiotyki sizomycyne i gentamycyne A, które równiez sa wytwarzane w hodowli M. grisea.Wynalazek obejmuje równiez sposób wytwarzania farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych nowych anty¬ biotyków Verdamycyny I i G-418 takich, jak sole addycyjne z kwasami. Pochodne oksazolidynowe zasady Schiffa skladników mieszaniny równiez sa cennymi antybiotykami.Przy opisywaniu mikroorganizmu M. grisea zastosowano dwa oznaczenia zabarwienia. Pierwsze oznaczenie zaczerpnieto z „Color Harmony Manual" IV wydanie, 1958, opublikowane przez Container Corporation of America (St. Zjedn. Ameryki), a opis pierwszego oznaczenia zabarwienia zaczerpnieto z „Descriptive Color Name Dictionary" Taylora, Knoche'a i Granville'a, równiez opublikowanego przez Container Corporation of America (1950). Drugie oznaczenia zabarwienia jest synonimem lub bliskim synonimem pierwszego oznaczenia i jest zaczerpniete z National Bureau of Standards Circular Nr 553 (1955) St. Zjedn. Ameryki.Mikroorganizm Micromonospora grisea (czasami w dalszej czesci opisu nazywany M. grisea) otrzymano z próbek ziemi najblizszej okolicy Topekaw Kansas.Mikroorganizm zdeponowano w Northern Utilisation Research and Development Division Ministerstwa Rolnictwa St. Zjedn. Ameryki, Peoria, Illinois pod numerem NRRL 3800.2 91795 Mikroorganizm Micromonospora grisea zostal zaklasyfikowany jako nowy gatunek Micromonospora na podstawie wlasciwosci taksonomicznych i wlasciwosci wzrostu na róznych standartowych pozywkach.M. grisea wytwarza szaro-zielony pigment w hodowli na róznych, wymienionych nizej pozywkach.Najbardziej wyrózniajaca cecha M. grisea jest jego zdolnosc wytwarzania w kontrolowanych warunkach substanqi aktywnej antybiotycznie, która sklada sie z 4 glównych skladników, zdefiniowanych ponizej, jak równiez z mniejszej ilosci innych substanqi przewidzianych do identyfikacji.Drozdze Difco Sacharoza Weglan wapnia Agar Difco Woda (destylowana) Charakterystyka pozywki 0,5% 3,0% 0,1% 1,5% 1 litr Gdy sterylna pozywke zaszczepi sie Micromonospora grisea i hoduje w temperaturze 26-28°C w ciagu 24 dni, obserwuje sie nastepujace zabarwienie.Obszar zarodnikowania: szarozielony g 23 li, szarawozielony 150, po przedluzeniu czasu hodowli obszar zarodnikowania moze przeksztalcic sie w czarny. « Obszar wegetatywny: jasny braz g 3 g c, jasny zóltawy braz 76. « Mikroorganizm M. grisea charakteryzuja ponadto nastepujace dane taksonomiczne. < Pozywka: 3% NZ Amina TypA, 1 % dekstrozy i 1,5% agaru.Obserwacje (21 dni po zaszczepieniu) Makroskopowe Mikroskopowe Wzrost dostateczny, pofaldowany, zabarwienie, Grzybnia dluga slabo rozgaleziona, srednicy brzegów: jasny braz g3gc, jasny zóltawy braz 0,5-0,8 /i. Zarodniki stosunkowo obfite, 76. Zabarwienie srodka: bobrowe g3li, ciemny wytwarzane pojedynczo, wykazuja zabarwienie szarawo-zóltawy braz81 brazowe w swietle przepuszczonym, srednica 1,0-1,5 ju Mikroorganizm M. grisea nie redukuje azotanów, rosnie dobrze na zelatynie, powodujac hydrolize, a ponadto rosnie na pozywce, zawierajacej 1,5% chlorku sodowego, natomiast nie rosnie na podobnej pozywce, zawierajacej 3% chlorku sodowego. M. grisea dla dobrego wzrostu i produkcji antybiotyku wymaga zdolnych do asymilaqi zródel wegla i azotu, które moga byc stosowane w szerokim zakresie. Mikroorganizm jest aerobowy i rosnie w temperaturze 20—40°C, korzystnie 28—35°C i przy wartosci pH = 6,5-8<5, korzystnie 7,2-8,3.W tablicach I, II i III zamieszczono dalsze dane, charakteryzujace M. grisea.Tablica I Obserwacje kolonii Micromonospora grisea na róznych pozywkach Pozywka Obserwacje 1 2 Pozywka Czapka (Glikoza) Wzrost:slaby, nie dajacy sie opisac Asparagina—glikoza Wzrost: dostateczny do slabego, ziarnisty, jasny braz g31g, umiarkowany zóltawy braz 77 Maleinian wapnia.Agar Wzrost: slaby, nie dajacy sie opisac Zwykly Agar (woda,agar) Wzrost: slaby, nie dajacy sie opisac Agarodzywczy Wzrost: slaby, nie dajacy sie opisac Surowica LoeffleKa (Difco) Wzrost: slaby, brak reakcji Korekziemniaczany Wzrost: dobry, pofaldowany, jasny braz g3gc, jasny zóltawy braz 76 F^pton, glikoza,Agar Wzrost: slaby, nie dajacy sie opisac91795 3 Jajko, agar (Jajko Dorset, pozywka Difco) Skrobia, agar Lakmus, mleko (Difco) Celuloza Agar Bennett'a Agar Emersona Pasta pomidorowa, Maka owsiana. Agar Glikoza, wyciag z drozdzy, Agar Plaster ziemniaka Azotan sacharozy, agar (Czapek's Agar) Tyrozyna, agar Obserwaqe w 2,7 i 14 dniu (wedlug Gordon'a i Smitha J. Bact 69 :147) Pepton, zelazo, agar Obserwacje w 2,7 i 14 dniu Glikoza, aspargina, agar Mleko Roztwór glikozy, Czapka Wzrost:slaby, brak reakcji Wzrost: dobry, pofaldowany i z bruzdami, brak grzybni powietrznej. Zabarwienie: musztardowy braz g2NI, umiarkowane oliwkowe 107 Hydroliza: dodatnia Czesciowo speptonizowany w reakcji kwasnej Rozklad bardzo powolny, wymaga 3-6 miesiecy lub wiecej Wzrost: dobry, pofaldowany, barwa bluszczu g24 ml, ciemna szarawa zielen 151 Wzrost: dostateczny plaski, g3gc jasny braz, jasny zóltawy braz 76 Wzrost: dostateczny, wypukly z bruzdami, zabarwienie g4ga morelowe, jasny oranz 52 Wzrost: dobry, pofaldowany, kolor g31E wielbladzi, umiarko¬ wany zóltawy braz 77 Wzrost: dobry, pofaldowany, jasny braz g3gc, jasny zóltawy braz 76 Wzrost: dostateczny, praski, g3ec jasny bez, szarawo-zóltawy braz 79 Wzrost: slaby, brak reakcji barwnej Wzrost: dostateczny, brak reakq*i barwnej Wzrost: dostateczny, do slabego, ziarnisty, g31gjasny braz, umiarkowany zóltawy braz 77 Hydroliza: dodatnia, wzrost slaby Wzrost w 3 i 10 dniu slaby, struktura nie dajaca sie zaob¬ serwowac, po 10 dniach inkubacji w bulionie obecne zabar¬ wienie blade slomkowe Tablica II Zastosowanie weglowodanów Weglowodan L(+) Arabinoza D(—) Arabinoza D(+) Glikoza D(—) Lewuloza D(+) Mannoza Sacharoza D(+) Ksyloza Skrobia Dulcyt D(+) Galaktoza Gliceryna i - Inozitol j3— Laktoza D(+)Mannitol L-D(+ ) Melibioza D(+) Rafinoza L(+) Ramnoza Salicyna Wzorzec: 0,5% wyciag drozdzy Wzrost dobry dobry dobry dobry. dobry dobry dobry dobry slaby * slaby slaby slaby slaby slaby slaby slaby slaby slaby slaby91795 Tabl ica III Zastosowanie zródel azotu Zródlo azotu + 1%gllkozy Obserwacje wzrostu 0,5% wyciqg z drozdzy Dlfco dobry 1%NZ Amina typA dobry 1%Asparaglna slaby 1% kwas glutaminowy slaby 1% azotansodu slaby 1 % azotanamonu , slaby Tablica IV Porównanie Micromonospora grisea z innymi Micromonospora M.carbonacea M. carbonacea M. megalomicea M. grisea M.purpurea M.echinospora var.carfbonacea var*aurantiaca NRRL 3274 NRRL 3800 NRRL2953 NRRL 2985 NRRL 2972 NRRL 2997 i 3275 Sporofory dlugie Sporofory rozgalezione Sporofory krótkie Wzrost na agarze odzywczym Wzrost na ziemniaku Rozpuszczanie zelatyny Hydroliza skrobii Inwersja sacharozy Rozklad celulozy Przeciwdzialanie tak*) tak*) tak*) dostateczny do slabego slaby tydzien tak tak atakowana w slabym stopniu Gentamycyny tak tak tak dostateczny do sl&bego slaby tydzien tak tak atakowana w slabym stopniu Gentamycyny tak tak tak dostateczny do slabego dostateczny tak tak tak atakowana w slabym stopniu Ewernino- tak tak tak dostateczny do slabego dostateczny tak tak tak atakowana w slabyhi stopniu Ewernino- tak tak tak slaby brak nie tak tak brak ' tak tak tak slaby dobry tak tak tak powolny Megalomycyny Antybiotyk mycyny mycyny G-418 Verdamycyna I Sizomycyna GentamycynaA *) zarodnikowanie slabe lub zanikajace Fermentacje Micromonospora grisea prowadzi sie znanymi metodami wytwarzania antybiotyków na drodze hodowli mikroorganizmów.Znaczna ilosc antybiotyków jest wytwarzana w hodowli odpowiedniego mikroorganizmu w wodnej pozywce hodowlanej, zawierajacej zdolne do asymilaqi zródla wegla i azotu, w warunkach aerobowych, korzystnie podpowierzchniowych. Przykladami zdolnych do asymilacji zródel wegla sa weglowodany takie, jak wymienione w tablicy 2, zwlaszcza glikoza, ksyloza i mannoza. Przykladami zródel azotu sa proteiny i aminokwasy oraz substancje je zawierajace takie, jak wyciag z miesa wolowego, wyciag z drozdzy i maczka sojowa. Dobry wzrost i wytwarzanie antybiotyku mozna osiagnac, stosujac przy prowadzeniu fermentacji postepowanie opisane dalej w przykladach. Pozywki w celu zwiekszenia wytwarzania antybiotyku mozna uzupelnic sladowymi ilosciami soli nieorganicznych takich, jak siarczan magnezu, siarczan zelaza, a zwlaszcza chlorek kobaltu. < Fermentaqe na ogól prowadzi sie w dwóch lub trzech etapach. Pierwszy etap lub dwa pierwsze etapy sa przeznaczone do kielkowania mikroorganizmu w celu wytworzenia wlasciwej szczepionki. Fermentacja w kadzi wymaga dwóch etapów kielkowania, podczas gdy fermentacja we wstrzasanej kolbie wymaga tylko jednego etapu kielkowania. < Kielkowanie prowadzi sie w warunkach aerobowych, stosujac mieszanie, korzystnie obrotowe np. przy 250-400 obrotach na minute, zazwyczaj w temperaturze 25-35°C, w ciagu 1-4 dni. Ostatni etap fermentacji (etap produkcyjny) rozpoczyna sie przez zaszczepienie w sterylnych warunkach odpowiedniej pozywki, za pomoca uprzednio przygotowanej szczepionki. Etap ten prowadzi sie w takiej samej temperaturze, jak etap91 795 5 kielkowania i zazwyczaj wymaga on 4-7 dni w celu osiagniecia maksimum aktywnosci. W odróznieniu od etapu kielkowania, gdzie wartosc pH jest na ogól stala, etap produkcyjny wymaga regulaqi wartosci pH w granicach 7,2-8,3. • W czasie fermentacji, zwlaszcza po pierwszych 24 godzinach, pobiera sie próbki (np. w kazdej 6—8 godzinie), w celu okreslenia momentu osiagniecia maksimum aktywnosci antybiotycznej. Próba jest korzystnie standartowa próba szczepienia na krazku, przy zastosowaniu standartowej pozywki i organizmu badanego. Pelny opis korzystnych prób podano w ostatniej czesci opisu. < Gdy osiagnie sie maksimum aktywnosci antybiotycznej, produkt wydziela sie, zazwyczaj na drodze kombinaqi czynnosci takich, jak zakwaszanie, saczenie, adsorpcja, eluq"a i odparowanie, np. liofilizacja. < W korzystnej metodzie* wyodrebnienia produktu, wytraca sie obecne jony wapnia w postaci nierozpuszczalnej soli, bulion zakwasza sie, korzystnie kwasem mineralnym, a nastepnie mieszanine fermentacyjna klaruje sie przez saczenie lub wirowanie. Po neutralizacji, antybiotyk adsorbuje sie na odpowiedniej zywicy kationowymiennej, np. slabo kwasnej zywicy jonowymiennej w postaci soli amoniowej, eluowanej za pomoca rozcienczonych alkalii, korzystnie wodorotlenku amonu, a nastepnie izoluje przez odparowanie, np. liofilizacje. « W metodzie szczególnie korzystnej, do bulionu, w celu wytracenia wapnia w postaci nierozpuszczalnego szczawianu, dodaje sie 5-8 g/litr roztworu fermentujacego, kwasu szczawiowego i pH doprowadza sie do wartosci = 2 za pomoca mocnego kwasu mineralnego, np. 6 n kwasu siarkowego w celu wyodrebnienia antybiotyku z grzybni. Po odsaczeniu, klarowny bulion neutralizuje sie wodorotlenkiem amonu, antybiotyki adsorbuje sie na Amberlicie IRC—50 NH4 20—50 mesh (zywica jonowymienna, Rohm and Haas, Filadelfia, Pensylwania), a wyekstrahowany bulion odrzuca sie. Zestaw antybiotyków eluuje sie z zywicy zasada, korzystnie 2 n wodorotlenkiem amonu, eluat zateza sie do malej objetosci pod obnizonym cisnieniem i odparowuje do sucha, np. na drodze liofilizacji.Antybiotyki wytworzone w hodowli M. grisea poddano analizie. Wykrywanie antybiotyków i okreslenie jednorodnosci frakcji prowadzi sie metoda chromatografii bibulowej dwoma sposobami. W pierwszym stosuje sie reagenty, drugi polega na metodzie mikrobowej. Wedlug pierwszego sposobu bibule chromatograficzna spryskuje sie 0,25% roztworem ninhydryny w mieszaninie pirydyny i acetonu, a nastepnie ogrzewa w temperaturze 105°C w ciagu kilku minut. Pojawiaja sie strefy w postaci zabarwionych plam na bialym tle. < Mikrobowe wykrywanie stref antybiotyku prowadzi sie przez rozlozenie bibuly na plytce agarowej, zaszczepionej przez Staphylococcus aureus ATCC 6538 P. Po 10 minutach papier usuwa sie i po uplywie odpowiedniego okresu inkubaq'i (zazwyczaj 16—18 godzin) obserwuje sie strefy hamowania, odpowiadajace antybiotykom. < Opisane wyzej i podane testy wykazuja, ze produkt wytworzony w procesie fermentaqi wyzej opisanym sklada sie z wielu skladników. Cztery z tych skladników tworza wieksza czesc produktu i dalej beda nazywane „czterema glównymi skladnikami", Rozdzielenie skladników mozna prowadzic za pomoca wielu znanych sposobów takich, jak ekstrakq'a przeciwpradowa.lub chromatografia na zywicach jonowymiennych lub innych stalych adsorbentach takich, jak zel krzemionkowy, chromosorb lub celuloza. Korzystna jest chromatografia na zelu krzemionkowym. Pierwsze dwa z czterech glównych skladników eluuje sie zdolna warstwa mieszaniny rozpuszczalników, skladajacej sie z chloroformu, izopropanolu i stezonego wodorotlenku amonu w stosunku objetosciowym 2:1 :!,. Elucje kontynuuje sie dolna warstwa mieszaniny wyzej wymienionych rozpuszczalników w stosunku objetosciowym 1 :1 :1, az do calkowitej desorpcji pozostalych antybiotyków.Na podstawie danych fizycznych, chemicznych i biologicznych stwierdzono, ze czterema glównymi skladnikami sa: Verdamycyna I, antybiotyk dotychczas nieznany, Sizomycyna, której wlasciwosci biologiczne opisano w Journal of Antibiotics tom XXIII, Nr, 11, str. 551—565. Wytwarzanie i wlasciwosci tego antybiotyku opisano w belgijskim opisie patentowym nr 735145. « Antybiotyk G-418 —dotychczas nieznany, Gentamycyna A — przeciwbakteryjne wlasciwosci gentamycyny A przedstawil Weinstein i inni w Antimi- crobial Agents and Chemotherapy 1965, str. 816-820, a jej strukture podali Maehr ,Schaffner w Journal the American Chemical Society, 89 :25, 6 grudzien 1967. « Zachowanie sie czterech glównych skladników na bibule chromatograficznej podano w tablicy V.91795 Tablica V Porównawcze wartosci Rf i R^ Rf antybiotyków 1 Chloroform: metanol: stezony wodo¬ rotlenek amonu (1 :1 i 1V na plycie 1 Chloroform: metanol: 17% wodorotlenek amonu Whatmana nr 1, zstepujaca 1 ' ' i Butanon-2.ll hrzed.butanol: metanol: stezony wodorotlenek amonu (16:3:1 i 6) na bibule Whatmana nr 1, zstepujaca Verdamycyna I 2 0,65 Rt antybiotyków t 2 0,40.Rt antybiotyków t = 2 0,44 Sizornycyna 3 0,58 = 6 godzin 3 021 = 16 godzin 3 0,36- Antybiotyk G-418 4 0,41 4 0,05 4 0,27 Gentamycyna 0,18 - - odleglosc strefy od punktu wyjsciowego Rt— ' w czasie t odleglosc od punktu wyjsciowego do kon¬ ca bibuly Oprócz czterech glównych skladników czasami mozliwe jest wykrycie obecnosci innych substancji antybiotycznych. Jednakze te substancje sa wytwarzane w tak minimalnych ilosciach, ze ich izolacji, oczyszcze¬ nia i scharakteryzowania nie dokonano z powodzeniem. Np. surowy ekstrakt, zawierajacy zasadniczo wszystkie antybiotyki wytworzone w procesie fermentaqi odparowano do takiej objetosci, az otrzymano syropowaty koncentrat Koncentrat ten poddano chromatografii wstepnej na plycie Chromar 500 w ciagu okolo 1 godziny, stosujac uklad, skladajacy sie z chloroformu, metanolu i stezonego wodorotlenku amonu w stosunku objetoscio¬ wym 1:1:1. Gdy chromatogram poddano bioautografii przeciwko Staphylococcus aureus ATCC 6538P, wykryto zaledwie niewielkie ilosci trzech dodatkowych produktów fermentaqi. Produkty te mialy nastepujace wartosci Rf: 0,41, 0,30 i 0,12.Jak wspomniano wyzej, analiza fizyko-chemiczna Verdamycyny I wykazala, ze jest ona nowym zwiazkiem.Struktura jej odpowiada jednak gentamycynie C2. Hydroliza tych dwóch antybiotyków za pomoca 6 n kwasu solnego w temperaturze 100°C i w ciagu 2 godzin, a nastepnie bibulowa chromatografia w ukladzie rozpuszczal¬ ników, skladajacym sie zn-butanolu, pirydyny, wody, kwasu octowego w stosunku objetosciowym 6 :4 :3 :1 albo z propanolu, pirydyny, wody, kwasu octowego w stosunku objetosciowym 6:4:3:1 i wywolanie chromatogramów ninhydryna, jasno wykazuje, ze gentamycyna Cj i Verdamycyna I daja rózne produkty hydrolizy. W obydwu ukladach chromatogramy wykazuja obecnosc dwóch prostych produktów, z których jednym jest 2-deoksystreptamina. Produkt hydrolizy Verdamycyny I jest jednakze inny od odpowiedniego produktu hydrolizy gentamycyny C2.Na podstawie danych fizycznych i chemicznych podanych nizej i analizy produktów hydrolizy stwierdzo¬ no, ze Verdamycyna I ma strukturalny wzór 2, pc lany bez oznaczen stereochemicznych. ¦ Chemiczne i fizyczne wlasciwosci Verdamycyny I podano w tablicy VI.91 795 Tablica VI Chemiczne i fizyczne wlasciwosci Verdarnycyny I Analiza elementarna C H N z róznicy S04 Skrecalnosc Woda Ciezar równowaznikowy pKa Wzór empiryczny Cao Analiza dla C30Hf9O, Zasada srednia z 2 oznaczen 2 47,98 8,13 13,43 ,45. - + 155,7°. c=0,3 108,5 8,1 Hf907N5 7N5-3H20 brednia : 2 oznaczen 48,04 822 13,28 ,47 • . - + 167,1° c=0,3 104,9 . 8,1 Siarczan Srednia z 2 oznaczen z 31,10 6,61 B,99 29,30- +06,5° c=0,3 brednia 2 oznaczen ,95. 6,60 8,69 - +99,4° c=0,3 Verdamycyna I latwo tworzy solwaty i hydraty, z których trudno jest otrzymac niesolwatowany lub bezwodny antybiotyk. W zwiazku z tym analiza elementarna podana w tablicy VI calkowicie odpowiada antybiotykowi w postaci trójwodzianu (C2 o H39 07 N5 #3H2 O).Verdamycyna I nie wykazuje absorpcji w nadfiolecie w zakresie 200—400 m/i. Ponadto jest trwala, gdy podda sie ja gotowaniu wciagu co najmniej 30 minut w 0,1 molowym roztworze buforowym w zakresie pH=2-10. ¦ Verdamycyna I w postaci wolnej zasady wykazuje charakterystyczne widmo magnetycznego rezonansu jadrowego (NMR), przedstawione na fig. 2: Widmo to uzyskano przez zastosowanie spektrometru Varian A-60-A (Varian Associates, 611 Hansen Way, Palo Alto, Kalifornia), i okolo 0,31 ml roztworu, zawierajacego okolo 22 mg antybiotyku w mieszaninie tlenku deuteru (D2 O) i dwumetylosulfotlenku (DMSO).Widmo zapisano w czesciach na milion (PPM) soli sodowej kwasu 3-/trójmetylosililo/- propan osulfonowego jako wewnetrznego wzorca.Siarczan Verdamycyny I wykazuje charakterystyczne widmo absorpcyjne w podczerwieni w oleju mineral¬ nym (Nujol) przedstawione na fig. 1.< Bardziej charakterystyczne pasma obsorpcyjne podano w tablicy VII.Tablica VII Charakterystyczne pasma absorpcyjne w podczerwieni siarczanu Verdamycyny I 2,9-3,8 m (VS.VbrdJ 3,38-3,52/1 (Nujol) 4,25/i (Shd.) « 4,80 m (WJard.) < ,93 m (Shd.) < 6,16/1 (MS) 6,50 m (MS) 6,83/i (Nujol) 7,25/i (Nujol) 7,75m(W-M) 8,6-9,6/1 (VS, Vbrd,) ,30/i(W-M) ,92 /i(ShcL) < 11,42/i (W) 12,10 /i(VW,brd.) < 12,75/u (VW.brdJ < brd. = szerokie M = srednie, shd. = ramie S = mocne, V = bardzo, W = slabe Wymienione nizej dane fizykochemiczne i rozpad chemiczny pozwalaja na stwierdzenie, ze struktura antybio¬ tyku G-418 odpowiada wzorowi 1. Standartowa analiza chromatograficzna czystego antybiotyku G-418 daje naste¬ pujace wyniki8 91795 Kf fct(16godz.) < I. Chloroforrrwnetanol-stezony amoniak na Chromar 500 (wstepujaca) TT. butanon-2-lll-rzed.butanol-metanol-stezony amoniak (zstepujaca) 111.80% wodny roztwór fenolu (wstepujaca) IV. metanol-woda + 3% NaCI (zstepujaca) V. propanokpirydyna-kwasoctowy-woda (wstepujaca) 0f40 0,32 0,64 0,61 0,24 Rt = odleglosc strefy od punktu wyjsciowego odleglosc od punktu wyjsciowego do konca bibuly w czasie t Antybiotyk G-418 jest antybiotykiem aminoglikozydowym i nalezy do klasy antybiotyków, do której naleza gentamycyna, reomycyna, paromomycyna, sizomycyna i kanamycyna. Antybiotyk G-418 dogodnie izoluje sie w postaci amorficznego bialego ciala stalego, majacego nastepujace stale fizyczne. Temperatura topnienia 138—144°C, skrecalnosc +140°±9° (c=0,3, H20), ciezar czasteczkowy (spektrometria masowa) = - 497, wzór empiryczny-C2oH4o Oi oN4 (zasada), C2oH4o01oNl4#2H2S04 (siarczan). « Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego (NMR), otrzymane dla roztworu, zawierajacego 15% antybio¬ tyku G-418 w deutero-metanolu z dodatkiem 3% czterometylosilanu jako wewnetrznego wzorca, przedstawiono na fig. 4j < Widmo w podczerwieni (I.R) (próbka w zawiesinie woleju o nazwie handlowej Nujol) przedstawiono na fi& 3 3,02 n (S) 9,07/z(S) 11,86 /i (W) 6,32 M(M) 9,49/i (S) 13,05 jli (W) 7,76 M (W) 9,77 M(S) 13,87 /z (W) 8,70 M(M) 10,42 m(M) (S) — mocne, (M) — srednie, (W) — slabe W tablicach VIII i IX podano inne wlasciwosci chemiczne i fizyczne antybiotyków Verdamycyny I i G-418.Tablica VIII.Testy klasyfikacyjne antybiotyku Wywolywanie ninhydryna Reagent Sakaguchi Podchloryn skrobii KI Test Elsona Morgana Siarczan Verdamycyny I Siarczan antybiotyku G-418 dodatni dodatni ujemny ujemny dodatni dodatni ujemny ujemny Tablica IX Rozpuszczalnosc (Terminologiawedlug Farmakopei St. Zjedn. Ameryki XVIII str. 8) Rozpuszczalnik 1 Metanol Chloroform Verdamycyny I 2 trudno rozpuszczalna trudno rozpuszczalna Siarczan Verdamycyny I 3 nierozpuszczalna bardzo slabo rozpuszczalny Antybiotyk G-418 4 trudno rozpuszczalny bardzo slabo rozpuszczalny Siarczan antybiotyku G-418 nierozpuszczalny bardzo slabo rozpuszczalny91795 9 1 Benzen 2 bardzo slabo rozpuszczalna 3 nierozpuszczalny 4 nierozpuszczalny nierozpuszczalny Analize mikrobiologiczna antybiotyku G-418 prowadzi sie wedlug standartowej analizy zaszczepiania krazków przy zastosowaniu pozywki antybiotycznej Difco nr 5 i Bacillus subtilis A.T.C.C. 6633 jako organizmu badanego. Fizyczne warunki testu sa opisane przez Grove'a ,Randalla dla neomycyny w „Assay Methods of Antibiotics", wydanego przez Medical Encyclopedia Incorporated (1955). Próbe prowadzi sie w porównaniu ze standartowa próbka antybiotyku G-418 o zdefiniowanej mocy równej 1000mcg/mg. Jeden mikrogram tego wzorca daje w próbie strefe hamowania 16,5±1,5 mm. Wzorcowy siarczan antybiotyku ma moc 750 mcg/mg w porównaniu z wzorcem antybiotyku w postaci zasady.Analize mikrobiologiczna Verdamycyny I i innych antybiotyków, wytwarzanych przez W. grisea, prowadzi sie wedlug analizy zaszczepiania krazków przy zastosowaniu Staphylococcus aureus ATCC 6538P jako organizmu badanego.Warunki fizyczne testu sa podobne do opisanych dla gentamycyny (Oden i inni* Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1963, American Society for Microbiology). Wzorcowa Verdamycyna I w postaci zasady ma okreslona moc równa 1000 mcg/mg. Jeden mikrogram wzorca w warunkach analizy wytwarza strefe hamowania 17,0±1,3mm.Verdamycyna I w postaci zasady wykazuje moc 1000 mcg/mg w próbie gentamycynowej i krzywa dawek Verdamycyny jest równolegla do krzywej gentamycyny. Siarczan Verdamycyny I wykazuje moc 674 mcg/mg w próbie gentamycynowej i 695 mcg/mg w porównaniu z Verdamycynaw postaci zasady jako wzorcem.Wytwarzane sposobem wedlug wynalazku nowe antybiotyki — Verdamycyna I i G-418 maja charakter zasadowy i tworza sole addycyjne z kwasami nieorganicznymi i organicznymi.Przykladami kwasów sa: kwas siarkowy, chlorowodorowy, fosforowy, p-toluenosulfonowy, bursztynowy, maleinowy, octowy, propionowy, cyk lopropanokarboksyIowy, adamantanokarboksylowy, piroslazowy, benzo¬ esowy i fenylooctowy. Do soli zalicza sie równiez pochodne metali alkalicznych soli antybiotyków z kwasami dwu- lub trójzasadowymi. Sole sa na ogól rozpuszczalne w wodzie i wytwarza sie je przez dzialanie na wodny roztwór antybiotyku stechiometryczna iloscia kwasu i liofilizowanie otrzymanego roztworu. Sole mozna równiez wytracac z roztworu wodnego przez dodanie mieszajacych sie z woda rozpuszczalników takich, jak nizsze ketony alkilowe np. aceton, nizsze alkohole np. metanol, cykliczne etery np. czterowodorofuran lub trzeciorzedowe amidy np. dwumetyloformamid lub dwuetyloacetamid.Antybiotyk G-418 i Verdamycyna I tworza równiez pochodne oksazol idynowe zasad Schiffa z aldehydami.Korzystne pochodne tworzy sie przez kondensacje antybiotyku z alifatycznymi, alicyklicznymi, aromatycznymi lub heterocyklicznymi aldehydami, zawierajacymi do 12 atomów wegla, np. acetaldehydem, propionaldehydem, furfuralem, cyklopentyloacetaldehydem, wanilina, pirydoksalem, aldehydem, weratrowym, maslowym, akrole- ina, salicylowym, bursztynowym, krotonowym, benzoesowym i p-nitrobenzoesowym.Farmaceutycznie dopuszczalne pochodne oksazolidynowe zasad Schiffa wytwarza sie przez dzialanie na alkoholowy roztwór antybiotyku w postaci zasady z wolnym azotem nadmiarem aldehydu lub jego reaktywnej pochodnej takiej, jak acetal, zwlaszcza acetal dwuetylowy, nastepnie mieszanie otrzymanego roztworu w tempe¬ raturze otoczenia w ciagu 1 godziny i oziebienie roztworu w celu wytracenia produktu, zazwyczaj w postaci krystalicznej. Jak widac ze wzoru 1, antybiotyk G-418 ma 3 pierwszorzedowe grupy aminowe, z których kazda moze tworzyc zasade Schiffa. Antybiotyk ma ponadto drugorzedowa grupe aminowa i sasiadujaca z nia trzeciorzedowa grupe hydroksylowa, które to grupy w reakqi z aldehydem tworza pierscien oksazolidynowy.Tak wiec, gdy antybiotyk reaguje z nadmiarem aldehydu o wzorze Rj CHO lub jego reaktywna pochodna, cztery mole aldehydu reaguja z kazdym molem antybiotyku, dajac pochodna oksazolidynowa zasady Schiffa o wzorze 3, w którym Rt korzystnie oznacza rodnik alkilowy o 1-11 atomach wegla, rodnik cykloalkilowy o 3-11 atomach wegla, rodnik cykloalkiloalkilowy o 4-11 atomach wegla, albo rodnik aromatycznoheterocykliczny lub aromatycznoheterocykloalkilowy o 5—11 atomach wegla.Verdamycyna I, jak widac ze wzoru 2, ma cztery pierwszorzedowe grupy aminowe, które tworza zasade Schiffa, a ponadto drugorzedowa grupe aminowa i sasiadujaca z nia trzeciorzedowa grupe hydroksylowa, które w reakcji z aldehydem tworza pierscien oksazolidynowy. Tak wiec Verdamycyna I w reakcji z nadmiarem aldehydu o wzorze Ri CHO lub jego reaktywnej pochodnej daje pochodna oksazolidynowa zasady Schiffa.Pochodne oksazolidynowe zasad Schiffa nie sa dostrzegalnie rozpuszczalne w wodzie, sa natomiast rozpuszczalne w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych takich, jak chloroform, metanol, aceton, octan etylu10 91795 lub podobne. Pochodne te sa nietrwale w rozpuszczalnikach organicznych, zawierajacych slady wody i przekszta¬ lcaja sie w wolny antybiotyk. Obecnosc sladów kwasu ulatwia te rewersje.W dalszej czesci opisu omówiono wlasciwosci biologiczne wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku antybiotyków.Wyniki standartowych metod badania aktywnosci przeciwbakteryjnej in vitro antybiotyku G-418 przeciw¬ ko róznym bakteriom gram-dodatnim i gram-ujemnym zestawiono w tablicach X i XI.Tablica X Aktywnosc przeciwbakteryjna in vitro Pozywka: tryptoza Bulion fosforanowy o wartosci pH '¦= 72—7,5.Organizm Minimalne stezenie hamujace (mcg/ml) Staphylococcus aureus 209P Gray Wood Ziegler Streptococcus sp. C< C203 Escherichia coli Sc 894 Klebsiella pneumoniae DA20 Pseudomonasaeruginosc VA6 37 0,8 7,5 0,8 0,8 25 17,5 3,0 7.5 3,0 3,0 17,5 Tablica XI Aktywnosc przeciwbakteryjna in vitro Bulion Muellera-Hintona o wartosci pH = 72—7,5 Organizm Minimalne stezenie*hamujace (mcg/mg) Bacillussubtilis6633 Staphylococcus aureus 12 1257 Sm1 6 23 26 32 Streptococcus sp. 30 27 16245 6589 3045 Escherichia coli 777 887 Pseudomonas aeruginosa 1262 Proteus mirabilis 12453 1236 ' 83 morganii 8019 rettgeri 9250 3,0 3,0 0.3 0,3 0,3 0,3 3,0 7,5 7,5 7,5 7,5 7.5 7,5 3,0 3.0 17,5 17,5 3,0 7,5 7.5 0.8 0,391795 11 Wyniki badan dzialania przeciwbakteryjnego in vitro antybiotyku G-418 podano w tablicy XII. Badania prowadzono na myszach Garworach Farms CM wagi 18-20 g, podzielonych na 7 grup. Zabezpieczenie (PD50) in vivo okreslano przez wstrzykiwanie myszom dootrzewnowo smiertelnej dawki patogennych bakterii. Jedna grupa myszy byla grupa kontrolna, pozostale otrzymaly rózne pojedyncze dawki antybiotyku G-418 w godzine pózniej. Grupa kontrolna zmarla w ciagu 18-24 godzin. Po 48 godzinach od momentu infekcji obliczono ilosc myszy zyjacych w kazdej grupie, która otrzymala antybiotyk G-418. Wyniki analizowano standartowymi metodami statystycznymi dla okreslenia wartosci PDS 0 z 95% prawdopodobienstwem prawidlowosci wyniku.Tabl i ca XII Aktywnosc przeciwbakteryjna in vivo A. Dzialanie zabezpieczajace organizm Staphylococcus aureus szary Escherichia coli Sc Staphylococcus aureus St. M«nr 1 Pseudomonas aeruginosa nr 1 B. Chroniczne zatrucie Droga podawania podskórnie doustnie podskórnie podskórnie podskórnie dozylnie PD5omg/kg 2.5 40 1,5 3,0 ,0 LD50 mg/kg 140 W tablicy XIII zestawiono wyniki badan, ilustrujace dzialanie przeciwpierwotniakowe antybiotyku G-418.Badanie prowadzono na 3-4 tygodniowych samicach szczjrów Royal Hart Test byl modyfikacja testu opisanego przez R. J. Schmitzera w„Experimental Chemotherapy",str. 355—443, tom I, Academic Press, Nowy Jork (1963).Tablica XIII Doustne dzialanie antybiotyku G-418 i porównawczych substanqi w zwalczaniu eksperymentalnych zakazen jelita slepego przez E. Histolytica u szczurów Preparat Antybiotyk G-418 Paromomycyna Metronidazol Grupa kontrolna dawkowanie wody Dawka doustna mg/kg/dzien 12,5 6.5 6,5 6,5 3,5 3,5 12 6,5 6,5 6,5 3.5 3.5 13 6,5 . 6,5 6,5 Dni dawkowania 6 6 3 1 6 3 1 6 3 6 6 3 1 6 3 1 6 3 6 6 6 3 1 6 Parazytologiczne Lecznicze/ calkowite 19/10 24/24 7/7 4/7 4/4 4/5 2/5 /6 0/7 6/7 4/8 2/6 0/7 2/4 1/5 0/4 1/6 1/7 1/5 2/6 1/4 0/3 0/4 4/45 A.D.I.*) 0 0 0 0.7 0 0,4 1.0 0.2 1,7 0 0,8 1,0 2.1 1,3 1,0 1.0 1.5 1.0 0.8 0.8 0.8 1.7 1,5 2.212 91795 A.D.I.* oznacza sredni stopien zakazenia, oparty na calkowitych obserwacjach zmian patologicznych jelita slepego i mikroskopowych obserwacjach ilosci wykrytych ameb. Obserwaqe te sa oceniane wedlug skali 0—4, przy czym 0 oznacza zasadniczo normalne jelito slepe. Nietraktowane antybiotykiem, lecz zakazone, zwierzeta kontrolne wykazuja sredni stopien zakazenia 2—4, podany w tablicy jako srednio 2,2. » Verdamycyna I wykazuje szeroki zakres dzialania przeciwbakteryjnego w badaniach in vitro w zwalczaniu bakterii gram-dodatnich i gram-ujemnych. Jest aktywna w zwalczaniu bakterii odpornych na kanamycyne, lecz nieodporna z gentamycyna. Antybiotyk nie wykazuje dzialania in vitro w zwalczaniu drozdzy. - W tablicy XIV zestawiono minimalne stezenia hamujace soarczanu Verdamycyny I w zwalczaniu róznych gatunków bakterii i drozdzy. Badania prowadzono w drozdzach hodowlanych na wolowym bulionie wartosci pH = 7,4, hamowanie oznaczono po 24 godzinach, a nastepnie po 48 godzinach. • Dla porównania podano rezultaty otrzymane dla siarczanu gentamycyny. i Tablica XIV Minimalne stezenie hamujace mcg/ml Organizm Siarczan Verdamycynyl 24 godziny 48 godzin Siarczan Gentamycyny 24 godziny Staphylococcus aureus 209P Streptococcus pyogenes C Streptococcus pyogenes 6 Aerobacter areogenes 3 Aerobacter aerogenes 4 Escherichia coli Sc Escherichia coli 5 Escherichia coli 19 Klebsiella pneumoniae Ad KR* Klebsiella pneumoniae 17 KR Proteus mirabilis MeF Proteus vulgaris 2 fteudomonas aeruginosa 8689 Pseudomonas aeruginosa Miller Salmonella paratyphi BI Salmonella paratyphi B2 Candida albicans 406 Candida albicans 401 Candida albicans 411 Saccharomyces cerevisiae 0,3 0,75 0,3 0,3.. 0,3 0,3 . 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,075 0,75. 0,3 0,3 10 10 10 10 0,75 3,0 0,75 0.3 0,3 0,75 0,75 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,75 0,75 0,3 • 10 10 10 10 0,1 3,0 1,0 0,6 0,3 0,75- 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,5 1.0 0,5 50 50 50 50 *) Odporne na kanamycyne — KR Dzialanie in vivo Verdamycyny I badano przeciwko czterem gatunkom bakterii infekcyjnych u myszy.Podawano ja jako pojedyncza dawke podskórnie po zakazeniu myszy smiertelna dawka patogenu, wstrzyknieta dootrzewnowe Jedna grupa myszy byla grupa kontrolna, pozostale otrzymaly rózne dawki Verdamycyny I.Zwierzeta kontrolne zmarly w ciagu 18—24 godzin. Badanie zakonczono po 48 godzinach od momentu zakazenia i obliczono ilosc myszy zyjacych w kazdej grupie, która otrzymala antybiotyk- Wyniki analizowano standartowymi metodami statystycznymi dla okreslenia wartosci PD50 z 95% prawdopodobienstwem prawidlo¬ wosci wyniku. < Wyniki badan zestawiono w tablicy XV. Wykazuja one, ze Verdamycyna I jest silnym srodkiem przeciwbakteryjnym w zwalczaniu organizmów gram-dodatnich i gram-ujemnych. Dla porównania zamieszczono wyniki dla gentamycyny. W tablicy XV zamieszczono równiez dane odnosnie chronicznego zatrucia Verdamycy- na I przy podawaniu dozylnym.Mieszanina antybiotyków, wytworzonych w hodowli Micromonospora grisea, zawierajaca glównie Ver- damycyne I, Sizomycyne, Antybiotyk G-418 i Gentamycyne A, wykazuje szeroki zakres dzialania przeciwbakte¬ ryjnego, w badaniach in vivo przeciwko bakteriom gram-dodatnim i gram-ujemnym. W ponizszej tablicy XVI podano minimalne stezenia hamujace mieszaniny antybiotyków przeciwko róznym gatunkom bakterii i drozdzy.Badania te prowadzono w drozdzach hodowlanych na wolowym bulionie o wartosci pH = 7,4. < Jak wykazano powyzej, antybiotyk G-418 i Verdamycyna I oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne sa wysoce aktywnymi antybiotykami, które niepomyslnie oddzialywuja na wzrost gram-dodatnich91795 15 Tablica XV A. Dzialanie zabezpieczajace u myszy PD5o mg/kg Organizm Droga podawania Verdamycyna I Gentamycyna Staphylococcus aureus Gray podskórnie 2,5 Streptococcus pyogenes C podskórnie 1,0 Escherichia coli 10536 podskórnie 1#5 Pseudomonas aeruginosa 8689 podskórnie 2,0 B. Chroniczne zatrucie dozylnie 75 Ta bl ica XVI Minimalne stezenie hamujace Organizm mcg/ml Bacillussubtilis 6633 Staphylococcus aureus 209P Staphylococcus aureus G Streptococus pyogenes G Escherichia coli 10526 Escherichia coli 3 Klebsiella sp. 803 Proteus sp. 126 Proteus sp. McFadden Pseudomonas aeruginosa Sc Pseudomonas aeruginosa 13 Salmonella sp. Sa 0,03 0,8 0,3 3.0 0,8 0,8 0.8 0,8 . 0,3 0,3 0,3 3,0 i gram-ujemnyeh mikroorganizmów. Np. wykazuja dzialanie, zwalczajace Staphylococcus aureus, Streptococus pyogenes, Bacillus Subtilis, Escherichia coli. Salmonella, Klebsiella, Proteus i Pseudomonas. Antybiotyk G-418 ponadto hamuje rozwój robaków takich, jak Syphacia obvelata i Hymenolepsisnana oraz pierwotniaków, zwlaszcza pierwotniaków pasozytujacych takich, jak Trichomonas vaginalis i Entameba histolytica. Obydwa antybiotyki sa jednakze nieaktywne przeciwko drozdzom i nitkowatym grzybom takim jak Saccharomyces, Candida, Aspergillus i Trichophyton0 - Antybiotyki i ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne moga byc stosowane w warunkach in vivo lub in vitro. Moga byc stosowane do hamowania wzrostu lub niszczenia wrazliwych gatunków wymienionych wyzej organizmów, a w polaczeniu z mydlami i detergentami do usuwania tych organizmów z powierzchni wyposaze¬ nia laboratoryjnego, narzedzi chirurgicznych, laboratoryjnych naczyn szklanych i podobnych. Z uwagi na dzialanie in vivo, antybiotyki i ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne moga byc stosowane do niszczenia lub hamowania wzrostu wrazliwych organizmów pasozytujacych u ssaków takich, jak myszy, szczury, koty, psy i bydla « Antybiotyki i ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne moga byc równiez stosowane do leczenia chorób, spowodowanych przez wymienione organizmy u ludzi.Do stosowania in vivo antybiotyk G-418 i Verdamycyna I oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne formuje sie w odpowiednie postacie do terapeutycznego podawania, np. w polaczeniu z farmaceutycznym nosnikiem lub dodatkiem do leków. Preparaty farmaceutyczne moga byc w postaci jednostkowych dajrek np. o okreslonym ksztalcie. Korzystnymi postaciami leków sa preparaty w ampulkach do wstrzykiwania albo masci, kremy lub plyny. * Pochodne oksazolidynowe zasad Schiffa Verdamycyny I i antybiotyku G-418 moga byc, jesli to pozadane, stosowane w postaci roztworu w srodowisku organicznego rozpuszczalnika (np. w postaci nalewki). Moga byc równiez stosowane miejscowo, w postaci kremów i masci, wtedy gdy pozyteczne jest uzycie substancji tluszczowych. « 2,4 ,0 1,7 1,7 LD50 mg/kg14 91795 Przyklad I. Wytwarzanie antybiotyku przez M. grisea w wstrzasanej kolbie. < A. Wytwarzanie szczepionki. W kolbie o pojemnosci 300 ml umieszcza sie 100 ml sterylnej pozywki o podanym nizej skladzie i dodaje pelna eze do posiewów. M. grisea ze skosu agarowego. - Pozywka A. . wyciag z miesa wolowego 3g ' Tryptoza 5g Wyciag zdrozdzy 5 g Dekstroza 1 g . skrobia 24 g Weglanwapnia 2 g Woda wodociagowa 1000 ml Zawartosc kolby hoduje sie w temperaturze 25-35°C, stosujac ciagle mieszanie na wstrzasarce obrotowej przy szybkosci 250-300 obr/min., do momentu, az nastapi zasadniczy wzrost Ma to zazwyczaj miejsce po uplywie 1—4 dni.B. Fermentacja. W kolbie o pojemnosci 2 I umieszcza sie 500 ml pozywki o podanym nizej skladzie i zaszczepia 5% szczepionki, wytworzonej w etapie A.Pozywka B. Makasojowa 30 g Dekstryna 50 g Dekstroza 5 g Weglanwapnia 7 g Woda wodociagowa 1000 ml Zaszczepiona pozywke poddaje sie fermentami w temperaturze 26—35°C w ciagu 4—7 dni, stosujac ciagle mieszanie na wstrzasarce obrotowej z szybkoscia 200—300 obr/min. Produkt analizuje sie okresowo po uplywie pierwszych 48 godzin w celu oznaczenia szczytu aktywnosci antybiotycznej. Nastepnie postepuje sie w sposób, opisany w przykladzie IV.Przyklad II. Fermentacja M. grisea w kadzi o pojemnosci 14 I. < A. Etap kielkowania. Do kolby Erlenmeyera o pojemnosci 2 I, zawierajacej 500 ml sterylnej pozywki szczepionki dodaje sie 25 ml szczepionki, przygotowanej wedlug przykladu I. Szczepionke hoduje sie wciagu 2—4 dni, przy ciaglym mieszaniu z szybkoscia 280 obrotów na minute, w temperaturze 28°C.B. Etap fermentacji. Do kadzi fermentacyjnej o pojemnosci 141, zawierajacej 101 sterylnej pozywki B (przyklad I) dodaje sie cala zawartosc kolby, w której prowadzono kielkowanie. Mieszanine fermentacyjna hoduje sie w temperaturze 35°C w ciagu 90 godzin przy ciaglym mieszaniu z szybkoscia 250—500 obrotów na minute. W czasie fermentacji utrzymuje sie wartosc pH w granicach 7,2-8,3 i pozywke hodowlana napowietrza sie 3—5 I powietrza na minute. Mieszanine fermentacyjna analizuje sie okresowo po pierwszych 48 godzinach fermentacji w celu okreslenia maksimum aktywnosci antybiotycznej, a nastepnie postepuje sie tak, jak opisano w przykladzie IV.Przyklad III. Fermentacja M. grisea w kadzi o pojemnosci 95 litrów.Etap szczepienia. • Pozywka C. Wyciag zdrozdzy 5 g Wyciag z miesa wolowego 3 g Trypton 5 g Skrobia ziemniaczana 24 g Cereloza 1 g Weglan wapniowy 1 g Woda 1 I Przygotowuje sie 1 I pozywki C o podanym wyzej skladzie. Wartosc pH doprowadza sie do 7,3 i dozuje 0,51 wielokrotnosci do kolb Erlenmeyera o pojemnosci 2 I. Pozywke sterylizuje sie wciagu 45 minut w temperaturze 121°C, nastepnie ochladza do temperatury pokojowej i kazda kolbe zaszczepia 5 ml hodowli M. grisea. Kolby hoduje sie w temperaturze 30°C wciagu 72 godzin, na wstrzasarce obrotowej o szybkosci 200 obr/min. ¦ Szczepionke w ilosci 25 ml na kolbe przenosi sie do 0,5 I sterylnej pozywki C i kazda kolbe hoduje sie wciagu 48 godzin na wstrzasarce obrotowej w temperaturze 30°C. Nastepnie laczy sie SI tej szczepionki i dodaje do 901 sterylnej pozywki C, temperature doprowadza sie do 30°C, wartosc pH do 7,3-7,7, napowietrzanie 28-56 l/minute, a szybkosc 200-400 obr/min. Fermentacje prowadzi sie wciagu 100-130 godzin, az do osiagniecia maksimum aktywnosci antybiotycznej, a nastepnie postepuje sie wedlug przykladu IV.Przyklad IV. Wyodrebnianie kompleksu antybiotyków. Do 60 I bulionu fermentacyjnego, otrzymane¬ go w przykladach I—III, dodaje sie 400 g kwasu szczawiowego przy intensywnym mieszaniu. Wartosc pH mieszaniny doprowadza sie do 2 za pomoca 6 n kwasu siarkowego i miesza wciagu 20 minut Zakwaszona mieszanine fermentacyjna przesacza sie i zatrzymuje przesacz. Grzybniowy placek filtracyjny przemywa sie woda91795 15 wodociagowa, która laczy sie z przesaczem. W tym miejscu korzystne jest polaczenie przesaczy i wody z przemywania otrzymanych z trzech 60-litrowych porcji mieszaniny fermentacyjnej, tj. okolo 180 I. Polaczone przesacze i wode z przemywania zobojetnia sie i przemywa 6 n wodorotlenkiem amonu w ilosci 500-900 ml. < Mieszanine antybiotyków adsorbuje sie na IRC-50 w postaci amonowej, przepuszczajac zobojetniony bulion przez kolumne z zywica o wymiarach 5,1X65,6 cm. Szybkosc przeplywu reguluje sie na poziomie 175—200 ml/min. Nastepnie kolumne przemywa sie dojonizowana woda, az do zaniku zabarwienia (okolo 200 litrów wody). Mieszanine antybiotyków desorbuje sie za pomoca 2 n wodorotlenku amonu, przepuszczanego z szybkoscia 80 ml/min. Nastepnie prowadzi sie przemywanie woda, az eluat osiagnie wartosc pH =10. Eluat zateza sie pod obnizonym cisnieniem do objetosci 1 I i liofilizuje w celu otrzymania mieszaniny antybiotyków.W przypadku, gdy eluat jest silnie zabarwiony, traktuje sie go IRA-4018. Eluat z poprzedniej kolumny przeprowadza sie przez kolumne, wypelniona IRA-4018 o srednicy 2,54 cm i wysokosci 50,8 cm z szybkoscia 120 ml/min. Kolumne przemywa sie, eluat i wode z przemywania zateza sie w sposób wyzej opisany. < Przyklad V. A. Wytwarzanie siarczanu mieszaniny antybiotyków. 37 g surowej mieszaniny w postaci zasady, otrzymanej w przykladzie IV, rozpuszcza sie w 1000 ml wody i doprowadza pH do wartosci 4,5 za pomoca kwasu siarkowego. Roztwór miesza sie z Darco G60 w ciagu pól godziny i saczy. Przesacz zateza sie do objetosci 100 ml i dodaje do nadmiaru metanolu. Wytracony osad odsacza sie i suszy pod obnizonym cisnieniem. < B. Przeksztalcanie siarczanu w antybiotyk w postaci zasady. Mieszanine siarczanów, otrzymana sposobem wyzej opisanym, zawiesza sie w 100 ml chloroformu i przepuszcza belkotka gazowy amoniak wciagu pól godziny. Mieszanine saczy sie i przesacz odparowuje sie do sucha. Otrzymuje sie mieszanine antybiotyków w postaci zasady. • Przyklad VI. Wyodrebnianie Verdamycyny I, Sizomycyny, Antybiotyku G-418 i Gentamycyny A.Z 5,45 kg zelu krzemionkowego tworzy sie zawiesine w dolnej warstwie mieszaniny rozpuszczalników, skladajacej sie z izopropanolu, chloroformu i stezonego wodorotlenku amonowego w stosunku objetosciowym 1:2:1. Zawiesine przenosi sie do kolumny chromatograficznej o srednicy wewnetrznej 105 cm. • Ze 100 g mieszaniny antybiotyków, otrzymanej w przykladzie IV, tworzy sie zawiesine w1 I dolnej warstwy ukladu rozpuszczalników, zastosowanego do przygotowania kolumny chromatograficznej. Otrzymana zawiesine przesacza sie i nierozpuszczalne substancje zachowuje do nastepnych procesów. Przesacz zateza sie w przyblizeniu do objetosci 1 I przed umieszczeniem go na szczycie kolumny. < Otrzymane poprzednio nierozpuszczone substancje w ilosci okolo 66 g rozpuszcza sie w metanolu, stosujac ogrzewanie i mieszanie. Roztwór przesacza sie w celu oddzielenia okolo 6 g substancji nieorganicznych. Roztwór metanolowy chlodzi sie przez wystawienie na dzialanie powietrza i saczy ponownie w celu oddzielenia wiekszosci trudno rozpuszczalnego weglanu gentamycyny A. Nastepnie mieszanine antybiotyków, z której usunieto wieksza czesc gentamycyny A, adsorbuje sie w przygotowanej uprzednio kolumnie z zelem krzemion¬ kowym i rozwija chromatogram za pomoca mieszaniny rozpuszczalników, przepuszczajac 2-litrowe frakcje z pelna szybkoscia. Gdy ulegnie desorpcji sizomycyna (zazwyczaj po okolo 90—100 frakcjach), zmienia sie stosunek rozpuszczalników na 1 :1 :1 i kontynuuje elucje, az do zdesorbowania pozostalych skladników.Zazwyczaj, w celu uzyskania rozdzialu kompleksu antybiotyków w kolumnie tych rozmiarów, potrzeba 250—350 frakqi rozpuszczalników. Kazda frakcje nanosi sie na bibule i wywoluje ninhydryna w celu okreslenia obecnosci lub nieobecnosci antybiotyku Frakcje, zawierajace substancje antybiotyczne, poddaje sie chromato¬ grafii bibulowej w ukladzie, skladajacym sie z chloroformu, metanolu i 17% wodorotlenku amonu w stosunku objetosciowym 2:1 :1, a nastepnie bioautografii, przeciwko Staphylococcus aureus ATCC 6538P, w celu okreslenia frakcji, zawierajacych ten sam antybiotyk. Frakcje takie laczy sie ze soba, zateza pod obnizonym cisnieniem do objetosci 100 ml i liofilizuje. < Rozdzielenie antybiotyków w kolumnie jest nastepujace: Frakcje Antybiotyki 1—65 nieaktywne substancje organiczne 66-87 Verdamycyna I 88—91 Sizomycyna 119-259 Antybiotyk G-418 250-konce Pozostala gentamycyna A Przyklad VII. Wytwarzanie siarczanu Verdamycyny. 500 g Verdamycyny I, otrzymanej poprzednio, rozpuszcza sie w 90 ml wody i wartosc PH roztworu doprowadza sie do 4,5 za pomoca rozcienczonego kwasu siarkowego. Roztwór miesza sie nastepnie z 2 g odbarwiajacego wegla drzewnego (Darco G-60) w ciagu 30 minut16 91795 I saczy, FYzesacz zateza sie pod obnizonym cisnieniem do objetosci 10 ml i wylewa sie do 100 ml metanolu, mieszajac. Otrzymana zawiesine odsacza sie, osad przemywa swiezym metanolem i suszy. Otrzymuje sie 450 mg siarczanu Verdamycyny I. ¦ Przyklad VIII. Wytwarzanie chlorowodorku Verdamycyny I. 400g Verdarnycyny lr otrzymanej w przykladzie VI, rozpuszcza sie w 75 ml wody i doprowadza wartosc pH roztworu do 4,5 za pomoca rozcienczonego kwasu solnego. Roztwór miesza sie z 2 g odbarwiajacego wegla drzewnego (Darco G-60) w ciagu minut i saczy. Przesacz zateza sie pod obnizonym cisnieniem do objetosci 75 ml i wylewa do 150 ml mieszaniny metanolu i acetonu w stosunku objetosciowym 1 :2, mieszajac. Otrzymana zawiesine odsacza sie, osad przemywa sie swiezym acetonem i suszy. Otrzymuje sie 300 mg chlorowodorku Verdamycyny I. < Wyzej opisany sposób sluzy do otrzymania soli adycyjnych z innymi, wymienionymi w opisie kwasami, stosowanymi w równowaznych ilosciach, bedacymi funkcjonalnym równowaznikiem chlorowodorku lub siarcza¬ nu Verdamycyny I.Przyklad IX. Wytwarzanie Verdamycyny I w postaci zasady. < 330 mg siarczanu Verdamycyny I, otrzymanego wedlug przykladu, VII, rozpuszcza sie w 10 ml wody. « Przygotowuje sie kolumne IRA-401S (Amberlit, zywica aniono-wymieuna Rohm and Haas) o nastepujacych wymiarach: wysokosc 25 cm, srednica zewnetrzna 2 cm. Roztwór antybiotyku laduje sie na zywice kolumny i eluuje zdejonizowana woda do momentu, a z eluat da wynik ujemny w reakcji z ntnhydryna. Eluat zateza sie do objetosci 25 ml i liofilizuje. Otrzymuje sie 230 mg Verdamycyny I.Przyklad X. Dalsze oczyszczanie antybiotyku G-418 i wytwarzanie jego siarczanu. 2,6 g antybiotyku G-418, otrzymanego w przykladzie VI, rozpuszcza sie w 250 ml wody i doprowadza pH do wartosci 4,2 za pomoca rozcienczonego (1—6n) kwasu siarkowego. Nastepnie do roztworu dodaje sie 5g Darco G-60 i miesza w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Zawiesine saczy sie i przesacz zateza do sucha pod obnizonym cisnieniem. Pozostalosc rozpuszcza sie w 20 ml wody i otrzymany roztwór wkrapla do 500 ml metanolu przy intensywnym mieszaniu. Otrzymana zawiesine saczy sie, osad przemywa sie metanolem i suszy w temperaturze 40°C pod obnizonym cisnieniem, Otrzymuje sie 3,36 g siarczanu antybiotyku G418 o aktywnos- ' ci 700 mcg/mg. « Przez zastapienie kwasu siarkowego równowazna iloscia innego kwasu nieorganicznego lub organicznego i zastosowanie acetonu do wytracenia osadu, otrzymuje sie inne sole addycyjne z kwasami. « PL