PL91677B1 - - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 30.12.1977 91677 MKP Q12k 5/0Q Int. Cl.2 C12K 5/00 Twórca wynalazku: Uprawniony z patentu: Institut Merieux, Lyon (Francja) Sposób wytwarzania szczepionki przeciw wsciekliznie Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania szcze¬ pionki przeciw wsciekliznie, która ma podwyzszo¬ ne miano zywych wirusów lub antygenów,, moze byc stosowana bez zagrozenia i zapewnia znacznie zwiekszona odpornosc poszczepienma.

Znane jest wytwarzanie szczepionki przeciw wsciekliznie przez hodowanie szczepu wirusów wscieklizny ma kulturze komórek okreslonego ro¬ dzaju, pobranych z organu zwierzecia z rodziny gryzoni lub ikuraków. Przy tym stosuje sie podlo¬ ze, zawierajace surowice zgodnie z powszechnym mniemaniem, ze wirus wscieklizny rozwija sie dobrze w srodowisku, zawierajacym bialko i ze surowica stanowi jedyne dajace sie ekonomicznie stosowac zródlo bialka.

Wynalazek opiera sie na niespodziewanym stwierdzeniu, ze szczepionke przeciw wsciekliznie mozna wytwarzac na wspomnianych i jeszcze in¬ nych kulturach komórek, które tylko w pierwszej fazie hodowli zawieraja surowice, a w ostatniej fazie juz nie. Przez to osiaga sie nie tylko wiekszy uzysk wirusów, ale takze uzyskuje sie szczepion¬ ke, która nie zawiera w ogóle bialka surowiczego, które nalezy uwazac jako przyczyne licznych trud¬ nosci i nieszczesliwych wypadków przy szczepie¬ niach ochronnych przeciw wsciekliznie, W oparciu o ito stwierdzenie opracowano zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania szczepionki ochronnej przeciwko wsciekliznie, polegajacy na tym, ze hoduje sie szczep wirusów wscieklizny na 2 kulturze komórek okreslonego rodzaju, pobranych z organu takiego, jak skóra, pluca lub inerki zwie¬ rzecia z rodziny gryzoni lub kuraków, przy uzyciu znanej pozywki, po czym komórki niszczy sie i oddziela ciekle srodowisko, który to sposób cha¬ rakteryzuje sie tym, ze hodowle prowadzi sie na tych komórkach lub takze na komórkach zwie¬ rzecia z rodziny kunowatych (imiustelidae), lub na szczepie komórek albo 'kulturze komórek pierwot¬ nych ssaków naczelnych zwlaszcza komórkach BHK, NIL lub Wl 38, najpierw w srodowisku, zawierajacym surowice, a w ostatniej fazie hodo¬ wli w 'odpowiednim srodowisku, nie zawierajacym w ogóle surowicy, po czym przeprowadza sie zna¬ ne operacje rozdrabniania tkanki komórkowej i oddzielania powstalej iprzy tym cieczy do uzycia jako zywej szczepionki lub ewentualnie w koncu szczepionke ite dezaktywuje sie i konserwuje.

Jako dezaktywator stosuje sie korzystnie 13-pro- piolaktan, aldehyd glicydowy lub formol.

Konserwowania szczepionki dokonuje sie przez liofilizacje, aby poprawic jej trwalosc.

Korzystnie szczepionke wytwarza sie ze zdeza- ktywowanych wirusów ze szczepu wirusa Pasteura, który zostal przystosowany do komórek, uzytych do hodowli.

Równiez wytwarza sie szczepionke z zywych wirusów, wychodzac ze zmodyfikowanego szczepu wirusa, znanego pod nazwa Flury H.E.P. (H. Ko¬ prowski, J. Black, D.j. Nelsen, Studies om chick 91 G773 embrio adapted rabies virus VI — Further chan- ges lin pathogenic properries followirug prolonged oultiv.ation im the developing chick emibrio, J. Im- munol. zeszyt 12 (1954) str. 94).

Kulture komórek, sluzaca do hodowli wirusa, 5 wybiera sie korzystnie sposród komórek organów zwierzat klinowatych (muistelideae) i szczególnie organów gryzoni takich, jak myszy, szczurów i ,chomików, na przyklad ze skóry, pluc lub nerek tychzwierzat. 10 Mozna na przyklad zastosowac w sposobie-we¬ dlug wynalazku komórki, znane pod oznaczeniem BHK (H. Stoker, I. Mac Pherson, Syrian hamster fibroblasit celi line BHK 21 and its derivatives.

Nalture 1964, zesz. 203, Nr 4952, strony 1355—1357) 15 lub pod oznaczeniem NIL (L. Diamond, Two spontaneously transformed oell lines derived frorn the same embryo culture — International J. of Cancer, zesz. 2, 1967, strony 143—152) lub inne rodzaje komórek, wywodzace sie z komórek ner- 20 kowych chomika, zwlaszcza mlodego chomika.

Przy stosowaniu sposobu wedlug wynalazku trzeba najpierw przystosowac w znany sposób szczep wirusa do (komórek, sluzacych do hodowli.

Zastosowana w pierwszym etapie pozywka moze zawierac izotoniczny roztwór soli, aminokwasy, wi¬ taminy, cukier i surowice. Przykladowo moze to byc pozywka wedlug Stoeker^s i MC Pherson'a.

Hodowle wirusa mozna prowadzic na zawiesinie komórek w pozywce, ale takze na sciance nieru¬ chomej lub korzystnie wirujacej kolby szklanej.

Na poczatku hodowle prowadzi sie w srodowi¬ sku, zawierajacym surowice na przyklad przez 48 godzin w temperaturze 34 ido 38°C, po czym zawarta w pozywce hodowlanej kulture przenosi sie do drugiego osrodka, nie zawierajacego surowi¬ cy, którego objetosc jest znacznie mniejsza, na przyklad dwukrotnie mniejsza od objetosci pierw¬ szegoosrodka. 40 Hodowle w drugim osrodku, bez surowicy, moz¬ na na przyklad prowadzic przez 24 do 48 godzin, co 'Odpowiada calkowitemu okresowi hodowli, wy¬ noszacemu okolo 72 do 96 godzin.

Surowieja, zawarta w osrodku, powinna byc suro- 45 wica, do/Której dostosowane sa komórki.

Zgodnie z inna cecha charakterystyczna sposobu wedlug wynalazku, przy rozpoczynaniu hodowli przeprowadza sie zmiane pH przez wprowadzenie do osrodka dwutlenku wegla w celu doprowadze- 50 nia pH ido osrodka do wartosci optymalnej zwykle okolo 7.

Gdy hodowla zostaje zakonczona przeprowadza sie w znany sposób zamrazanie, nastepnie rozmro¬ zenie komórek i natychmiastowe roztarcie ich w 55 plynie, który korzystnie stanowi plyn, wplywajacy na powierzchnie.

Nastepnie przeprowadza sie odwirowywanie ply¬ nu w celu usuniecia resztek komórek.

W przypadku wytwarzania szczepionki na ba- 60 zie wirusa, pozbawionego aktywnosci, dezaktywi- zacje prowadzi sie natychmiast, dodajac najko¬ rzystniej B-propiolakton w rozcienczeniu od 1/1000 do 1/6000, aldehyd glicydowy lub formaline.

Dezaktywacje mozna prowadzic w temperatu- 65 4 , /!".' :'i -i ¦/¦¦ rach, zawartych na przyklad pomiedzy 0°C a 37°C przez okres trwajacy o kilka godzin dluzej ponad 24 godziny.

Tak wiec przy temperaturze 0°C otrzymuje sie wystarczajaca dezaktywacje, stosujac B-propiolak¬ ton w rozcienczeniu 1/5000. Przy takim samym rozcienczeniu, otrzymany zostaje równiez wystar¬ czajacy stopien dezaktywacji po 16 godzinach przy temperaturze 18°C.

Przy rozcienczeniu 1/2000 B-propiolakton pozwa¬ la na pozbawienie wirusa aktywnosci w ciagu trzech godzin przy temperaturze 25°C, podczas gdy przy temperaturze 37°C taki sam stopien dezakty¬ wacji otrzymuje sie po dwóch godzinach przy rozcienczeniu i/4000.

Wedlug wynalazku dlatego wybrano B-propio¬ lakton do pozbawiania wirusa aktywnosci, ponie¬ waz daje on dobra powtarzalnosc wyników i duze bezpieczenstwo.

Gdy wytwarzanie szczepionki jest zakonczone, korzystnie jest zgodnie z wynalazkiem przeprowa¬ dzic liofilizacje, poslugujac sie w tym celu znana technika.

Zgodnie z wynalazkiem, korzystne jest równiez dodanie do szczepionki, przed liofilizacja lub w momencie jej stosowania, plynu zawierajacego skladniki zwykle stosowane w celu spotegowania dzialania szczepionek.

Mozna stosowac znane do tego celu substancje na bazie oleju mineralnego lub oleju roslinnego i sterynianu glinu, znane na przyklad pod nazwa olejowego dodatku metabolizujacego nr 65.

Jako dodatek mozna stosowac roztwór wodoro¬ tlenku glinu, zawierajacego 2 tez fosforan glinu o stezeniu 1%. Oba te dodatki moga byc stosowane na przyklad w ilosci 1 mg na 1 ml szczepionki. W celu lepszego zrozumienia sposobu wedlug wynalazku, podano ponizej przy¬ klady jego wykonania.

Przyklad I. Sporzadza sie zawiesine komó¬ rek rodzaju NIL w trypsynie. Zawiesine te zakaza sie przez dodanie stalego wirusa wscieklizny. Na¬ tychmiast po zakazeniu zawiesine rozlewa sie do flakonów, do których dodaje sie osrodek typu Mac Phersoin-Stoker, a nastepnie umieszcza w suszarce w temperaturze +37°C.

Skoro tylko warstwa komórek staje sie zawie¬ sista, zakazone komórki splukuje sie za pomoca trypsyny ze szkla i miesza sie z zawiesina komó¬ rek nie zakazonych w stosunku 1 czesci objetos¬ ciowej zawiesiny komórek zakazonych na 3—4 czesci objetosciowych zawiesiny komórek nie za¬ kazonych.

Mieszanine te rozlewa sie ponownie do flako¬ nów nieruchomych lub obracajacych sie i dodaje sie nowy osrodek taki sam, jak poprzednio wska¬ zano. Flakony przetrzymuje sie w suszarce w temperaturze +37°C.

Czesc tak otrzymanej zawiesiny przenosi sie na plytki szklane, na których prowadzi sie hodowle w celu kontrolowania kinetyki infekcji wirusowej.

Po okresie czasu wynoszacym zwykle pomiedzy 48 a 60 godzin, stwierdza sie obecnosc specyficz-91 nych wtracen wewnatrz cytoplazmy, majacych rózne wielkosci.

Pierwotny osrodek zastepuje sie wtedy nowym, nie zawierajacym surowicy w ilosci 1 czesci obje¬ tosciowej nowego osrodka na 10 czesci objetoscio¬ wych osrodka usunietego. Kwasowosc pH osrodka doprowadza sie do wartosci 7 przez wprowadze¬ nie dwutlenku wegla.

Flakony przechowuje sie przez dalszych 20 do 24 godzin w temperaturze 37°C, a nastepnie za¬ mraza sie je do temperatury —30°C.

Zakazony plyn zbiera sie po rozmrozeniu i gwal¬ townym wstrzasaniu flakonów w celu dobrego rozmrozenia skupisk komórek.

Zakazony plyn natychmiast po rozmrozeniu od¬ wirowuje sie w celu usuniecia pozostalosci komó¬ rek i przefiltrowuje przez odkazony filtr. Spraw¬ dzanie sterylnosci jest przeprowadzane w róznych stadiach procesu. Ponadto pobiera sie próbki, slu¬ zace do okreslania stopnia zakazenia przez prze¬ prowadzenie szczepien do wnetrza mózgu myszy i jednoczesnie wykorzystywane do reakcji wia¬ zania dodatków.

Dezaktywacje przeprowadza sie natychmiast za pomoca B-propiolaktonu, rozcienczonego w stosun¬ ku 1 do 4000 i pozostawia sie pod jego dzialaniem przez 24 godziny w temperaturze 0°C, a nastepnie przez 2 godziny w temperaturze 37°C.

Szczepionke nastepnie rozlewa sie do ampulek i poddaje liofilizacji w obecnosoi laktozy, stano¬ wiacej stabilizator.

Sprawdzanie czystosci bakteriologicznej i abso¬ lutnej nieszkodliwosci prowadzi sie przez zastoso¬ wanie prób klasycznych. Ma to na celu zapewnie¬ nie dobrej dezaktywacji i skutecznosci szczepionki.

Przyklad II. Flakon, zawierajacy zawiesine komórek ludzkiej tkanki srodkostnej (WI 38) za¬ kaza sie wirusem wscieklizny HEP. Nastepnie za¬ wiesine przelewa sie do dwóch flakonów o jedna¬ kowej pojemnosci i dopelnia osrodkiem Eagle'a.

W czasie trzech do czterech dni przeprowadza sie badania w celu upewnienia sie o obecnosci we wszystkich komórkach wtracen specyficznych dla wscieklizny.

Tak zakazone komórki w postaci zawiesiny w trypsynie miesza sie z zawiesina komórek nowych nie zakazonych. Mieszanie to przeprowadza sie w stosunku jedna czesc objetosciowa zawiesiny ko¬ mórek zakazonych na 10 czesci zawiesiny komó¬ rek nie zakazanych. Mieszanine te nastepnie roz¬ lewa sie do 20 flakonów.

Warstwe powierzchniowa plynu z zakazonego flakoinu na poczatku równomiernie rozdziela sie na flakonów, z których kazdy zostal dopelniony nowa porcja osrodka Eeagle'a.

Piodzielna czesc mieszaniny komórek zakazonych, nie zakazonych i zakazonej warstwy powierzchnio¬ wej przenosi sie na plytki szklane w celu dalszej hodowli.

. W czwartym lub piatym dniu stwierdza sie obecnosc wtracen wscieklizny we wszystkich ko¬ mórkach.

W jednym z wariantów na drugi lub trzeci dzien od rozpoczecia hodowli, zmienia sie osrodek na no- 677 6 wy, nie zawierajacy surowicy. Objetosc nowego osrodka bez surowicy stosuje sie ma przyklad razy mniejsza od objetosci osrodka pierwotnego.

Flakony z kultura zamraza sie do temperatury _3o°C. Zbiera sie nastepnie zakazony produkt i pobiera próbki, przeznaczone do sprawdzenia czystosci bakteriologicznej i mozliwosci zakazenia przez wstrzykniecie do mózgów nowourodzonych myszek. io Wirus nastepnie odwirowuje sie i przefiltrowuje przez odkazony filtr oraz rozlewa do ampulek, w których zostal poddany w obecnosci laktozy, sta¬ nowiacej stabilizator fiofilizacji.

Kilka flakonów oddziela sie w celu wykorzysta- nia ich do nowej kontroli bakteriologicznej i pod¬ dania klasycznym próbom skutecznosci szczepionki zywej, nie pozbawionej aktywnosci.

Szczepionka, otrzymana sposobem wedlug wyna¬ lazku, jest calkowicie bezpieczna w uzyciu i za- pewnia odpornosc w znacznie podwyzszonym stopniu.

Przeprowadzone badania np. na myszach we¬ dlug klasycznej próby testowej NIH (Die TollwuL Technika laboratoryjna, OMS monografia, seria monografii nr 23, 1967 r. str. 151) ze znanymi szczepionkami i szczepionka wedlug wynalazku, które zostaly otrzymane na kulturze komórek „NIL" oznaczonych przez NIL).

Tabela I wykazuje znacznie wyzsza aktywnosc szczepionek, wytworzonych wedlug wynalazku, w porównaniu ze znanymi szczepionkami/ Wyniki, wyrazone przez 50% dawke profilak¬ tyczna DP50, sa przytoczone w ponizszej tabeli.

Tabela I Porównawcze kontrolne immunologiczne aktywnosci róznych rodzajów szczepionek Kontrola Szczepionka PATAS HDCS NIL (3*)* FERMI HEMPT Daw¬ ka 2 ml 2 ml 2 ml ml ml Test Habela >4 4 >6,3 Test NIH | P.R. (4) 3,7 1,3—7,1 <0,3 0,3 DP50(1) 1/43 1/20—1/100 1/500 1/2 1/3 . 50 **) szczepionka otrzymana wedlug wynalazku. 1) wartosc antygenna szczepionki DP 50 = dawka ochronna 50% 3) szczepionka Rabiffa 4) PR = moc wzgledna w stosunku do miedzyna¬ rodowej szczepionki odniesienia. 55 Ponadto przeprowadzono szereg badan wedlug klasycznej próby seroneutraliizacji (neutralizacji surowicy) (Die Tollwut. Technika laboratoryjna, OMS monografia, seria monografii Nr 23, 1967 r. str. 173) na psach, przez oznaczenie przeciwcial po 60 szczepieniu. Psy te byly zaszczepione szczepionka, wykonana wedlug wynalaku (Rabiffa 31).

Tabele II i III wykazuja •. znaczna wyzszosc aktywnosci szczepionek, wytwarzanych wedlug wynalazku, w porównaniu ze znanymi szczepion- 65 kami.91 677 7 Tabela II Ilosc przeciwcial, wywolana przaz poszczególne szczepionki Gatunek Pies Kot Bydlo Pies , 1 Pies Szczepionka Rabiffa 31**) Rabiffa 19**) Rabiffa 31**) typu Hempt ^ Fermi Rozciencze¬ nie czysty 1/10 ... 1/100 czysty czysty czysty czysty Objetosc (dawka) 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml ml ml Miano przeciwcial*) 28 drii po jednej injekcji 2,08 1,64 0,61 2,0. 1,20 0,10 0 14 dni po jednej injekcji wtórnej 3,20 2,90 1,80 3,2 2,20 0,45 *) Wartosci wyrazone przez logarytm odwrotnosci rozcienczenia surowicy ochraniajacej 50% myszy w stosunku do 100 X DL 50. **) szczepionka otrzymana wedlug wynalazku.

Tabela III Gatunek Owce Trzoda Konie Czlowiek Bydlo Szczepionka Aftorab**) 2010 Alurabiffa 3004 Aftorab**) 2010 Alurabiffa 3004 Rabisin 3003 Rabisin 3RBN OS 3 HDCS Aftorab 4023 Moc wzgledna NIH 12,6 12,6 22 22 3 47 Objetosc 2 ml 1 ml 3 ml 1 ml 1 ml 1 ml Miano przeciwcial*) Przeciwciala po jednej injekcji 2,10 1,90 1,50 1,80 1,80 2,40 1,26 2,36 Po jednej injekcji ¦¦, wtórnej 3,0 2,90 2,60 2,80 2,40 2,67 *) wartosci wyrazone przez logarytm odwrotnosci rozcienczenia surowicy ochraniajacej 50% myszy w stosunku do 100 X DL 50. **) szczepionka otrzymana wedlug wynalazku.

Claims (6)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania szczepionki przeciwko wsciekliznie, polegajacy na hodowaniu szczepu wi¬ rusa wscieklizny na kulturze komórek okreslonego rodzaju, pobranych z organu takiego, jak skóra, pluca lub nerki zwierzecia z rodziny gryzoni lub kuraków przy uzyciu powszechnie stosowanej zna¬ nej pozywki, niszczeniu komórek i oddzieleniu cieklego srodowiska, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie na tych komórkach lub takze na szczepie komórek lub kulturze komórek pierwot¬ nych ssaków naczelnych, zwlaszcza komórkach BHK, NIL lub Wi38, najpierw w srodowisku, za¬ wierajacym surowice, a w ostatniej fazie hodowli w odpowiednim srodowisku, nie zawierajacym w ogóle surowicy, po czym przeprowadza sie znane rozdrabnianie tkanki komórkowej i .oddzielanie powstalej przy tym cieczy jako zywej szczepionki lub ewentualnie w koncu szczepionke te dezakty- wuje sie i konserwuje. Cena 50 55

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze na poczatku hodowli pH osrodka doprowadza sie do wartosci optymalnej w zasadzie zblizonej do 7, przez wprowadzenie dwutlenku wegla.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w celu otrzymania szczepionki na bazie wirusa nieaktywnego stosuje sie szczep wirusa trwalego typu Pasteura.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w celu otrzymania zywej szczepionki stosuje sie szczep wirusa oslabionego, znanego pod nazwa Flury HEP.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze dezaktywacje wirusa przeprowadza sie za pomoca 60 13-propiolaktonu w rozcienczeniu od 1/1000 do 1/6000 lub innego czynnika dezaktywujaoego, ta¬ kiego jak formalina.

6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze konserwacji szczepionki dokonuje sie przez liofili¬ zacje. 10 zl 65 WZGraf. Z-d Nir % zam. 397/77, A4, 100