PL89652B1 - Stable virus preparations[za7106689b] - Google Patents
Stable virus preparations[za7106689b] Download PDFInfo
- Publication number
- PL89652B1 PL89652B1 PL15139071A PL15139071A PL89652B1 PL 89652 B1 PL89652 B1 PL 89652B1 PL 15139071 A PL15139071 A PL 15139071A PL 15139071 A PL15139071 A PL 15139071A PL 89652 B1 PL89652 B1 PL 89652B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- virus
- cells
- infected
- stabilizing agent
- suspension
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 84
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 13
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 31
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 31
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 31
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 31
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 31
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 28
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 14
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 claims description 12
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 10
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 9
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 9
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 8
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 4
- 150000002306 glutamic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 57
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 22
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 22
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 19
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 14
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 12
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 8
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 7
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 7
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 229960001760 dimethyl sulfoxide Drugs 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 3
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- UVZZAUIWJCQWEO-DFWYDOINSA-N (2s)-2-aminopentanedioic acid;sodium Chemical compound [Na].OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UVZZAUIWJCQWEO-DFWYDOINSA-N 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000318 alkali metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 101710150365 Albumin-1 Proteins 0.000 description 1
- -1 Alkali metal glutamates Chemical class 0.000 description 1
- 241001492342 Anatid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000724565 Chorella virus Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 206010026749 Mania Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical class [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 206010044302 Tracheitis Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 208000019420 lymphoid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- HQQSBEDKMRHYME-UHFFFAOYSA-N pefloxacin mesylate Chemical compound [H+].CS([O-])(=O)=O.C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCN(C)CC1 HQQSBEDKMRHYME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania trwalej, bezkomórkowej i o wysokim mianie zawiesiny, zdolnych do zycia wirusów, wiazacych sie z komórkami. W szczególnosci wynalazek odnosi sie do sposobu ekstrakcji wiazacych sie z komórka wirusów z zainfekowanych komórek, przy czym wirusy te utrzymuje sie w stanie zdolnym do zycia. Zawiesina wiazacego sie z komórka wirusa, uzyskiwana sposobem wedlug wynalazku, jest trwala i odznacza sie dzialaniem nawet po liofilizacji. Mozna ja przechowywac przez dluzszy okres czasu w temperaturach lodówki oraz mozna ja przesylac w rózne miejsca bez niedogodnego do realizacji zamrozenia.Zawiesine, otrzymana sposobem wedlug wynalazku, mozna stosowac w badaniach naukowych, przesylac bez klopotu na duze odleglosci i przechowywac przez dluzszy okres czasu w lodówce. Sposób wedlug wynalazku mozna równiez stosowac do ekstrakcji wiazacych sie z komórka wirusów z komórek, w których wirus oslabiono albo z malo zlosliwego szczepu, antygenicznie zwiazanego z konkretna choroba. Otrzymane w ten sposób bezko- mórkowe zawiesiny wirusów mozna stosowac do przygotowania szczepionek ochronnych przeciw chorobom.Z uwagi na oczywiste powiazanie przyczynowe z leukoza u ptactwa wiele wirusów, wiazacych sie z komór¬ ka, jest ostatnio przedmiotem intensywnych badan. W ostatniej publikacji, Witter i in., Avian Dis., 13,171—184 (1969), opisano wirus typu opryszczki jako etiologiczny czynnik choroby Marek'a, bedacej choroba zakazna kurczaków, u których w róznych organach wystepuja nowotwory limfoidalne. Wystepowanie choroby Marek'a ma powazne znaczenie ekonomiczne na swiecie, gdyz jest ona-bardzo zarazliwa i w pewnych przypadkach wywo¬ luje wsród drobiu 50-cio procentowa lub wyzsza smiertelnosc zbiorowa, oraz wysoki procent odrzutów w dro¬ biu, zabijanego na mieso.Ze wzgledu na wielka wage badan nad zapobieganiem chorobie Marek'a nalezalo najpierw ustalic czynnik ja wywolujacy, wyizolowac go, poddac ja testom kontrolnym, oraz róznym badaniom w celu pelniejszego zrozumienia istoty tej choroby.Dotychczasowe próby wyizolowania i oddzielenia wirusa z zainfekowanych komórek doprowadzaly nieste¬ ty do kompletnego zaniku zakaznosci wirusa.2 89652 Koniecznosc pozostawiania wirusa w stanie zwiazanym z komórka, o ile chcialo sie zachowac jego moc i zdolnosc do zycia, calkowicie hamowala wszelkie próby uzyskania trwalych szczepionek.Celem niniejszego wynalazku bylo opracowanie sposobu otrzymywania zawiesin wirusa, wiazacego sie z komórkami, tak, aby zawiesiny te nie zawieraly komórek i byly przy tym trwale, nadajace sie do przechowy¬ wania lub liofilizacji, a jednoczesnie, aby wirusy nie utracily nic ze swoich wlasciwosci i sily dzialania.Sposób wedlug wynalazku polega na zmieszaniu komórek, zainfekowanych wirusem wiazacym sie z ko¬ mórkami z czynnikiem stabilizujacym, zawierajacym albumine lub kazeine w ilosci wystarczajacej do wytworze¬ nia homogenicznej zawiesiny zainfekowanych komórek w czynniku stabilizujacym, po czym otrzymana homoge¬ niczna zawiesine poddaje sie niszczeniu komórek tak, aby nastapilo ich rozerwanie. W ten sposób uwalnia sie nienaruszony, zdolny do zycia wirus. Uzyskana bezkomórkowa zawiesine wirusa w czynniku stabilizujacym ewentualnie poddaje sie liofilizacji.Dotychczas bylo wiadomo, ze wirusy, wiazace sie z komórka, tracily swoja zdolnosc do zycia i moc po oddzieleniu ich od komórki. Zaskakujacy jest w zwiazku z tym fakt, ze produkt, uzyskany sposobem wedlug wynalazku, nie zawierajacy komórek, wykazuje znacznie wieksza zdolnosc do zycia i dzialania, niz preparaty, nie zawierajace czynnika stabilizujacego i ekstrahowane z komórki. Inna, nieoczekiwana zaleta wirusowych produk¬ tów, uzyskiwanych sposobem wedlug wynalazku jest fakt, ze pomimo, iz na ogól wiele typów wirusów, wiaza¬ cych sie z komórka, wymaga zamrazania do krancowo niskich temperatur, aby zachowac ich stabilnosc, to produkt, otrzymywany wedlug wynalazku, mozna utrzymywac w stanie zamrozenia w znacznie wyzszych tem¬ peraturach w dluzszych okreach czasu bez utraty zdolnosci do zycia i dzialania. Ponadto, liofilizowane produk¬ ty, uzyskiwane zgodnie ze sposobem wedlug wynalazku, mozna przechowywac przez dluzszy okres czasu w tem¬ peraturach lodówki bez znacznych strat ich zdolnosci do zycia i dzialania.Sposób wedlug wynalazku mozna stosowac ogólnie do wirusów, wiazacych sie z komórkami, a zwlaszcza do preparatów wirusowych w postaci suchej lub wodnej, które sa albo zarazliwe albo moga byc stosowane do wytwarzania szczepionek za pomoca uprzedniego oslabienia wirusa znanymi metodami, albo za pomoca zastoso¬ wania wirusa, antygenicznie zwiazanego z konkretna choroba. Wiadomo na przyklad, ze zywy, oslabiony wirus typu opryszczki choroby Marek'a, tj. szczep HPRS-16, mozna stosowac do uodpornienia przeciw chorobie Marek'a, co opisali ChurchUl i in., J.Gen.Virol. 4, 577-564 (1969) i Nature, 221, 744-747 (1969). Wiadomo równiez, ze szczepienie szczepem FC-126 wirusa opryszczki indyka zabezpiecza przeciw chorobie Marek'a.Sposób wedlug wynalazku znajduje zatem szerokie zastosowanie do zwiazanych z komórkami wirusów, a w tym zywych wirusów zlosliwych, zywych oslabionych wirusów, zywych wirusów, antygenicznie zwiazanych z choroba Marek'a i do zabitych wirusów. Dla przykladu, niektóre z wielu wiazacych sie z komórkami wirusów, do których stosuje sie sposób wedlug wynalazku, naleza do grupy B wirusa opryszczki, które opisal Melnick, J. Immunol, 92, 595-601 (1964).Szczególnie korzystne wyniki uzyskuje sie, stosujac w sposobie wedlug wynalazku takie wirusy, wiazace sie z komórkami, jak wirus varicella herpes zoster, cytomegalovirus, wirus Burkitt lymphoma, wirus Lucke tumor, wirus opryszczki indyka i wirus choroby Marck'a.Czynnikami stabilizujacymi, stosowanymi w sposobie wedlug wynalazku, sa substancje bialkowe, takie jak albumina i kazeina, ewentualnie w polaczeniu z innymi dodatkowymi skladnikami. Ich stabilizujace dzialanie pozwala na utrzymywanie wysokiego miana wirusa podczas i/lub po rozerwaniu komórek. Czynnik stabilizujacy moze prócz albuminy lub kazeiny zawierac pochodna skrobi, korzystna szczególnie w przypadkach, gdy mieszan¬ ka ma byc poddana liofilizacji. Czynnik stabilizujacy moze takze zawierac inne srodki pomocnicze, takie jak czynniki buforowe. Jako zródlo albuminy korzystnie stosuje sie surowice wolowa, a jako zródlo kazeiny — mle¬ ko w proszku.Ilosc stosowanego czynnika stabilizujacego zalezy od gestosci materialu komórkowego, wzglednego steze¬ nia wystepujacego wirusa i innych podobnych czynników. Korzystnie dodaje sie czynnik stabilizujacy w postaci suchego proszku lub rozcienczonego roztworu wodnego do materialu komórkowego, jednoczesnie mieszajac w niskiej temperaturze, do uzyskania homogenicznej zawiesiny substancji komórkowej w czynniku stabilizuja¬ cym.Ogólnie, zainfekowany material komórkowy rozprowadza sie w wodnym roztworze, zawierajacym substan¬ cje bialkowa w niskim stezeniu (okolo 0,1% wagowych/objetosc). Stezenie w procentach wagowych (objetosc oznacza stosunek suchej masy substancji, zawierajacej bialka, wyrazonej w gramach, do objetosci roztworu w mililitrach, w którym zawiera sie substancje komórkowa. W celu uzyskania plynnej, homogenicznej zawiesiny mozna czynnik stabilizujacy stosowac w mniejszym stezeniu, takim jak 0,05% wagowych/objetosc. Dopuszczal¬ ne sa stezenia substancji, zawierajacej proteiny, okolo 1% wagowych/objetosc. Mozna równiez stosowac wyzsze89652 3 stezenia, pod warunkiem, ze substancja bialkowa zasadniczo rozpuszcza sie w wodnym srodowisku. Ogólnie stezenie substancji, zawierajacej bialka, wyrazone w procentach wagowych/objetosc, jest takie, aby uzyskac homogeniczna zawiesine substancji komórkowej w czynniku stabilizujacym.Moze byc korzystne takie nastawianie stezenia substancji komórkowej, zeby uzyskac okreslone miana wirusa. Wplyw czynnika stabilizujacego, zawierajacego bialka, pozostaje jednak niezmieniony, dopóki stezenie jest zgodne z powyzszymi ustaleniami.Jezeli uzyskana sposobem wedlug wynalazku bezkomórkowa zawiesina wirusów ma byc poddana liofiliza¬ cji, to jej zdolnosc dzialania w znacznej mierze zabezpiecza i utrzymuje dodanie do cieklego preparatu (przed suszeniem) pochodnej skrobi lub mieszaniny pochodnych skrobi. Pochodna skrobi mozna dodawac do gotowego preparatu bezkomórkowego lub przed rozerwaniem komórek, lacznie z wymienionym czynnikiem stabilizuja¬ cym. Wiekszosc pochodnych skrobi mozna stosowac razem z substancja, zawierajaca bialka. Mozna np. laczyc produkty hydrolizy skrobi, jak sacharoza, dekstroza lub glikoza z albumina lub kazeina. Najkorzystniejsze jest zastosowanie sacharozy jako pochodnej skrobi.W celu utrzymania wysokiego miana preparatu w trakcie liofilizacji wystarczajace jest stezenie pochodnej skrobi okolo 2% wagowych na objetosc (tj. suchej masy pochodnej skrobi w gramach do objetosci wodnego roztworu w mililitrach). Mozna jednak stosowac i wyzsze stezenia. Stezenie substancji bialkowej nie jest bezpo¬ srednio zwiazane ze stezeniem pochodnej skrobi. Tak wiec, do homogenicznej zawiesiny bezkomórkowej, kazda ilosc homogenicznie zawieszona czynnika stabilizujacego i kazda ilosc pochodnej skrobi, 2% wagowych/objetosc lub wieksza, bedzie skuteczna do zabezpieczenia mocy i trwalosci preparatu.Czynnik stabilizujacy moze ewentualnie zawierac male dodatkowe ilosci buforów, wystarczajace do utrzy¬ mania wzglednie optymalnego pH wirusa w czynniku stabilizujacym, tj. pH=6,5-7,5. Taknp. korzystny czynnik stabilizujacy zawiera mieszanine albuminy wolowej, sacharozy i takiego buforu, jak fosforany metali alkalicz¬ nych. Mozna równiez dodawac glutaminiany metali alkalicznych, chociaz nie sa one konieczne do uzyskania efektu stabilizujacego.Korzystnie stosuje sie nastepujace mieszaniny: - albumine i sacharoze, - albumine, sacharoze i glutaminiany metali alkalicznych, - kazeine i sacharoze, - kazeine, amine N-Z i glikoze, - albumine, sacharoze i fosforany metali alkalicznych, - albumine wolowa, sacharoze, fosforany i glutaminiany metali alkalicznych.Najkorzystniejszym praktycznie stabilizatorem jest mieszanka, ogólnie znana pod nazwa „SPGA", opisana przez Bovarnicka i in., J.Bact., 59, 509-522 (1950). Mieszanina ta zawiera 7,46% sacharozy, 0,05 g fosforanu jednopotasowego, 0,16 g fosforanu dwupotasowego, 0,01 g jednosodowej soli kwasu glutaminowego i 0,1 g prosz¬ ku albuminy wolowej, przy czym wszystkie te skladniki sa rozpuszczone w 100 ml wody destylowanej. Dosko¬ nale wyniki uzyskuje sie, stosujac stezenie okolo 10 czesci wagowych opisanej „SPGA" na 1 czesc materialu komórkowego. Zadowalajace wyniki otrzymuje sie równiez przy zastosowaniu czynnika stabilizujacego „SPGA" o stezeniu, dochodzacym do 150 czesci wagowych. Jest rzecza oczywista, ze odpowienie wartosci stezenia substancji bialkowej iochodna skrobi w „SPGA" zawieraja sie w ustalonych powyzej zakresach.Sposobem wedlug wynalazku mozna tez otrzymac bardzo silnie dzialajace suche produkty, stabilizowane przez normalne suszenie preparatów cieklych, takie jak suszenie ze stanu zamrozenia i liofilizacja. Caly proces korzystnie prowadzi sie w warunkach aseptycznych, stosujac uprzednio wysterylizowane skladniki.Sposób wedlug wynalazku ilustruja nastepujace przyklady, nie ograniczajac jego zakresu. Jesli tego nie zaznaczono odrebnie, stezenie skladników podano w procentach wagowych/objetosc.Opis stosowanych wirusów. W celu ilustracji sposobu wedlug wynalazku stosowano trzy szczepy, silnie wiazacych sie z komórkami wirusów opryszczki. Szczepy tych wirusów zidentyfikowano jako szczep FC-126 wirusa opryszczki indyka, szczep JM choroby Marek'a i szczep GA choroby Marek'a. a) Szczep JM wirusa choroby Marek'a wiaze sie silnie z komórkami i jest antygenicznie zwiazany z wirusem opryszczki indyków, ale rózni sie wyraznie od zakaznych wirusów zapalenia tchawicy i wirusów zapalenia jelit u kaczek. Wirus ten oznaczono jako szczep JM i zgloszono bez ograniczen w American Type Culture Collection, Washington, D.C., pod numerem stalego zbioru wirusów A.T.C.C. VR No. 585. Zlozono go równiez w skladnicy Cornell University, gdzie jest dostepny pod oznaczeniem Accesion No. RT-711. Szczególowy opis preparatu i charakterystyke szczepu JM podal Sevoian in., Vet. Med., 57, 500-501 (1962). b) Szczep FC-1.26 wirusa opryszczki indyka wiaze sie silnie z komórkami i jest antygenicznie spokrewniony z wirusem choroby Marek'a u kurczaków. Opisano dzialanie zabezpieczajace tego wirusa przeciw chorobie4 89652 Marek'a, jesli jest zaszczepiony jednodniowym kurczetom i pózniej styka sie z wirusem choroby Marek'a. Ten wirus opryszczki oznaczono symbolem FG126 (HVT) i zlozono bez ograniczen w American Typo Culture Col- lection, Washington, D.C., gdzie znajduje sie w stalym zbiorze wirusów pod numerem A,T.C.C. VR No. 584.Zlozono go równiez w skladnicy Cornell University, gdziejest dostepny pod znaczeniem Accession No. RT-720.Dokladniejszy opis szczepu podali Witter i in., Am.J.Vet. Res. 31, 525-538 (1970) i Okzaki i in., Avian Dis., 14, 413-429(1970). c) Szczep GA wirusa choroby Marek'a równiez silnie wiaze sie z komórkami. Wirus ten oznaczono jako szczep GA i zlozono bez ograniczen w American Type Culture Collection, Washington, D.C., gdzie znajduje sie w stalym zbiorze wirusów pod numerem A.T.C.C. VR No. 624. Zlozono go takze w skladnicy Cornell Universi- ty, gdzie jest dostepny pod oznaczeniem Accession No. RT-743. Dokladniejszy opis szczepu GA i sposobu jego otrzymywania podal Edison i in., Avian Dis., 12,467—475 (1968).Przyklad I. W opisanych ponizej próbach 1—3 stosowano podany powyzej wirus szczepu JM. Szczep wirusa otrzymuje sie z 2 partii skóry bezposrednio przedtem zabitych kurczaków, zainfekowanych szczepem JM choroby Marek'a. Paski skóry, z której usunieto upierzenie, miesza sie w stosunku 1:5 lub 1:10 z zawierajacym sól buforem fosforanowym o pH=6,8, miele sie, homogenizuje w ciagu 5 minut w mieszarce Sorvall Omni-Mixer, Ivan Sorvall, Inc., Norwalk, Conn. i rozdrabnia sie przy uzyciu drgan dzwiekowych wciagu 2 minut przy ustaleniu zasilania na pozycji 7 (26-32 ma), stosujac aparat Model W 140 D Sonifer Celi Disrupter (Heat Systema Ultraconics, Inc., Plainview, Long Island, N.Y.).Zawiesine klaruje sie przez odwirowania przy szybkosci 650 x C i ciecz sklarowana zamraza sie do temperatury -65°C. Uwaza sie, ze tak uzyskane zawiesiny nie zawieraja zdolnych do zycia komórek. W próbach 1 do 3, zawiesiny wirusa odmraza sie i po róznych, opisanych zabiegach próbki o objetosci 1 lub 2 ml zamraza sie.W próbach 4 do 8 postepuje sie troche inaczej. Zródlem wirusów JM, GA i FC426 sa znacznie zainfekowa¬ ne (powyzej 75 ^CPE) hodowle na plytkach Petriego o srednicy 50 mm. Oba szczepy wirusa choroby Marek'a rozwijaja sie w hodowli na nerce kurczaków. W grupach 643 i 659 wirusy opryszczki indyka rozrastaja sie w komórkach nerki kurczaka. W grupie 654 wirus opryszczki indyka rozwija sie w embrionsdnych fibroblastach kurczaka. Sklarowana ciecz odciaga sie i zastepuje 2 ml (próba 6), 2,5 ml (próby 4, 5, 7) lub 5 ml (próba 8) kultury jednego z dwóch mediów w postaci zawiesiny. Wolne komórki zeskrobuje sie gumowa paleczka do zbiorów z 4 lub 5 hodowli (1 hodowla na obróbke w próbie 8). Kazda zawiesine rozdrabnia sie przy pomocy drgan dzwiekowych w ciagu 2 minut i próbki o objetosci 1 ml zamraza sie do temperatury -65°C lub liofilizuje sie.Komórki z innych hodowli zbiera sie i zamraza do temperatury -65°C. Stosuje sie procedure, przeznaczona do zabezpieczenia calosci komórek, z zastosowaniem sulfotlenku dwumetylu jako srodka zabezpieczajacego we¬ dlug metody, opisanej przez Spencera i in., Avian Dis. 11, 274-287 (1967).W próbach 9 i 10, zawiesine embrionalnych fibroblastów kurczaka, zainfekowana wirusem HVT, zamraza sie jako calosc komórek do temperatury -196°C, odmraza sie i rozciencza w stosunku1"1:30 (próba 9) lub 1:40 (próba 10) w róznych cieczach dyspergujacych, patrz tabela 3. Porcje po 5 ml rozdrabnia sie przy uzyciu drgan dzwiekowych w ciagu 1 minuty i próbki o objetosci 1 ml zamraza sie do temperatury -65°C lub liofilizuje sie. W pierwszej próbie stosowano nastepujace roztwory: Stabilizatory i rozcienczalniki. 1.20%glikoze, 2. Stabilizator, skladajacy sie z 8% odtluszczonego mleka w proszku i 2% aminy N-Z typu AS (Sheffield Chemical, Norwich, N.Y.)z buforem Sorensena o pH=6,2 i z dodatkiem 5% glikozy, 3. Stabilizator „SPGA", opisany przez Bovarnicka i in., J.Bact., 59, 509-522 (1950); mieszanina zawierala 0,218 m sacharozy, 0,0038 m fosforanu jednopotasowego, 0 0072 m fosforanu dwupotasowego, 0,0049 m jedno- sodowej soli kwasu glutaminowego i 1 %proszku albuminy wolowej. 4. Amine „SPG—NZ" tj. taka sama mieszanine, jak SPGA, z tym, ze zamiast albuminy wolowej zawiera ona 1% aminy N-Z typu B (pozostalosc po trawieniu trzustkowym kazeiny) pH róznych roztworów wynosilo 6,2-7,0 tj. miescilo sie w zakresie, w którym nie wplywa ono na miano wirusa.W drugiej i trzeciej próbie przeprowadza sie dodatkowe testy ze stabilizatorem SPGA.W próbach 4-8 stosuje sie dwa roztwory: zawierajacy sól buforanowy (PBS) o pH=6,8 oraz SPGA.C 12 k /o-<" 89652 5 W próbach 9 i 10 stosowano nastepujace roztwory w buforze fosforanowym (0,0038 m fosforanu jednopo- tasowego i 0,0072 m fosforanu d^upotasowego): a) 0,218 m sacharozy (S), b) 0,0049 jednosodowej soli kwasu glutaminowego (G), c)SiG, d) 1% proszku albuminy wolowej (A), e)AiS, OAiG, g)A,GiS, h) 8% odtluszczonego mleka w proszku, 2% aminy N—Z typu AS oraz i) 8% odtluszczonego mleka w proszku.Stosowano równiez: a) nierozcienczona surowice plodowa (wolowa /BFS), b) 15% BFS w srodowisku hodowli tkankowej nr 99 (M 199), c) 10% sulfotlenku dwumetylu i 10% brzeczki fosforanowego tryptozy w M 199.We wszystkich próbach, próbki poddane liofilizacji rekonstytuuje sie przy uzyciu wody destylowanej. liofilizacja. Liofilizacje przeprowadza sie w aparacie Virtis Model USM—15 Reeze—Dryer (Virtis Co,. Inc.Gardiner, N.Y.). Próbki, umieszczone w 5 mililitrowych buteleczkach na surowice z przerwanymi zamknieciami gumowymi, zamraza sie wstepnie w oddzielnym zamrazalniku mechanicznym do temperatury -65°C lub zamraza sie do temperatury -60°C na pólkach chlodniczych urzadzenia do odparowania ze stanu zamrozenia. Próbki suszy sie pod próznia w temperaturze 38°C w ciagu 24 godzin, doprowadzajac cieplo do pólek suszarniczych, a nastepnie suszy sie jeszcze w ciagu okolo 15 godzin w temperaturze pólek 21°C. Buteleczki uszczelnia sie pod próznia i do chwili przeprowadzenia analizy przechowuje sie w temperaturze 4°C. Analize przeprowadza sie po uplywie 1 do 10 dni od momentu przygotowania wirusa.Próby z wirusami. We wszystkich próbach, próbki zaszczepia sie bezposrednio po odmrozeniu lub rekonsty- tucji do dwóch wysuszonych hodowli nerki kurczaka, rozwijanych wciagu 24 godzin. W przypadku wirusów choroby Marek'a, ekstrahowanych z zainfekowanych komórek hodowli, w celu zwiekszenia czulosci analizy dodaje sie czasem 0,2% etylenodwuaminy kwasu czterooctowego (EDTA). W celu uzyskania takiej szybkosci zainfekowania, która umozliwia zliczanie poszczególnych ognisk, w pewnych przypadkach wszczepia sie próbki w dziesieciokrotnym rozcienczeniu. Rozcienczalnikiem jest srodowisko dyspergujace. Metody komórkowej hodo¬ wli do analizy stosuje sie zgodnie z opisem Calneka i in., J.Nat.Cancer Institut.,45, 341-351 (1970). Uszkodze¬ nie ogniskowe zlicza sie po uplywie 8 dni po zaszczepieniu (wirus choroby Marek'a) lub po uplywie 6 dni (wirus opryszczki indyka). Do oceny liczby ognisk (FFU) na mililitr nierozcienczonego wirusa stosuje sie przecietna zliczen ognisk z dwóch jednakowych hodowli oraz wspólczynnik rozcienczenia.Wyniki. Wyniki przedstawiono w tabelach 1, 2 i 3. Badania wirusa JM choroby Marek'a, wyizolowanego z ekstraktów skóry, (tablica 1) wskazuja, ze: okres przetrwania wirusa po liofilizacji jest troche przedluzony przy uzyciu 20%rowej glikozy jako stabilizatora oraz wyraznie dluzszy przy zastosowaniu SPGA lub aminy SPG-NZ, dodatek SPGA do nieliofilizowanej zawiesiny wirusa ponad dwukrotnie podwyzsza jego miano, najwyzsze zawar¬ tosci uzyskuje sie z liofilizowanych próbek przy uzyciu SPGA.Z prób, przeprowadzonych z wirusem, pochodzacym z hodowli komórkowej, (tablica 2) wynika jasno, ze 1) ekstrakcja obu szczepów wirusa choroby Marek'a prowadzi do wyzszych mian przy uzyciu SPGA, niz PBS jako srodkowiska dyspergujacego oraz, ze 2) dla wirusa choroby Marek'a z powodzeniem mozna przeprowadzac liofilizacje przy uzyciu SPGA, jako stabilizatora, ponadto, ze 3) wydajnosci, uzyskiwane z ekstraktu hodowli, zainfekowanych wirusem opryszczki indyka, sa znacznie wieksze, niz dla hodowli zainfekowanych wirusem choroby Marek'a, chociaz miana zaleznosci w stanie zwiazanym z komórkami byly zblizone do siebie, oraz, ze 4) miana ekstraktu za pomoca PBS wirusa opryszczki indyka sa podobne do mian uzyskiwanych w przypadku zastosowania do ekstrakcji srodowiska hodowli komórkowej, opisanego przez Wittera iin., Am.J.Vet.Res., 31, 525-538 (1970). Miana ekstraktu SPGA sa czesto 30-50 razy wieksze, niz dla ekstraktów PBS oraz procent przetrwania po liofilizacji wynosi zazwyczaj 30—40 lub wiecej, podczas gdy dla innych ekstraktów wynosf ponizej 1%.Ponowne analizy wirusa liofilizowanego w próbach 2, 4, 6 i 7 przeprowadzano po okresie przechowywania 17 do 44 dni w temperaturze 4°C. Miano wirusa w tych próbach nie ulega zmianie w stosunku do oznaczen pierwotnych.Z wyników prób 9 i 10 (tablica 3) wnioskuje sie, ze sama albumina lub z sacharoza i/lub solami kwasu glutaminowego jest odpowiednim stabilizatorem przy ekstrakcji wirusa. Dodatek sacharozy jest jednak korzystny6 89652 w celu zwiekszenia ilosci wirusa, zdolnego do przetrwania w trakcie liofilizacji. Odtluszczone mleko w proszku, samo lub w polaczeniu z amina N—Z jest równiez odpowiednim stabilizatorem wdo ekstrakcji i wirus mozna potem liofilizowac. Stwierdzono czesciowo dzialanie stabilizujace w czasie ekstrakcji i innych substancji, np. surowicy (plodowej) wolowej, 10% BFS wM 199 lub 10% sulfotlenku dwumetylu i 10% brzeczki fosforanu tryptozy w M 199; sa one jednak gorsze od wymienionych powyzej substancji lub ich polaczen.Tablica I Wplyw róznych sposobów obróbki i stabilizatorów na miano preparatu bezkomór- kowego wirusa opryszczki szczepu JM choroby Marek'a, ekstrahowanego ze skóry* Próba P 1^ .2 3 Partia wirusa X-300 X-311 X-300 Sposób obróbki Rozcienczalnik i rozcienczenie bez rozcienczalnika %glikozy, 1:2 mleko odtluszczone % glikozy, 1:5 SPGA, 1:5 SPG-amina N-Z, 1:5 bez rozcienczalnika SPGA, 1:5 bez rozcienczalnika PBS, 1:10 SPGA, 1:10 FFU/ml nierozcienczonego wirusa Nie liofilizowany 2800 1680 2400 5600 4800 690 1330 2160 2880 4000 Liofilizowany.Rekonstytuowani woda 1 100 690 360 4900 3120 480 | 1 - - * Skróty: FFU, liczba ognisk, PBS, zawierajacy sól bufor fosforanowy (pH=6,8), SPGA i SPGA-amina N-Z, stabilizatory (patrz tekst), - nie badane Tablica II Wplyw róznych sposobów obróbki i stabilizatorów na miano preparatów bezkomórkowych wirusa opryszczki choroby Marek*a (MDHV) (szczepy JM i GA) oraz szczepu FC-126 wirusa opryszczki indyka (HVT) ekstrahowanych z hodowli zainfekowanych komórek* Próba 4 6 7 8 Typ i szczep wirusa MDHV/JM/ MDHV/GA/ HVT/FC126/ HVT/FC126/ HYT/FC 126/ Obróbka Zamrazanie Liofilizacja Zamrazanie Liofilizacja Zamrazanie Liofilizacja Zamrazanie Liofilizacja Zamrazanie Liofilizacja FFU/ml Ekstrakcja z rozcienczalnikiem Zawiesina calych komórek 58000 94000 68000 190000 240 PBS 120 0** 170 0** 1370 0 910 49400 0 SPGA 220 1 820** 3850** 398000 "1 125000 147000 \ 72000 144000 96000 * Skróty: PBS, zawierajacy sól bufor fosforanowy, SPGA, stabilizator, FFU- liczba ognisk, - nie badano ** - Analiza przeprowadzona z dodatkiem 0,2% EDTA do inokulum89652 7 Tablica III Wplyw róznych skladników srodowiska dyspergujacego na miano preparatu bezkomórkowego szczepu FC126 wirusa opryszczki indyka /HVT/, ekstrahowanych z zainfekowanych hodowli komórkowych*/!,2 Ciecz dyspergujaca I Tylkobufor fosforanowy Skladniki buforu fosforanowego: Sacharoza /0,218 m/ Glutaminian/0,0049 m/ Sacharoza i glutaminian Albumina wolowa /1%/ Albumina wolowa i sacharoza Albumina wolowa i glutaminian Albumina wolowa, sacharoza • i glutaminian /SPGA/ Odtluszczone mleko zbierane /8%/ •iaminaN-Z/2%/ Odtluszczone mleko zbierane /6%/ Rózne substancje Nierozcienczona surowica wolowa plodowa /BFS/ BFS /15%/ w hodowli tkanki Medl99/M199/ Dwumetylosulfotlenek /10%/ i brzeczka fosforanu tryptozy w M 199 FFU/ml, Ekstrakcja z rozcienczalnikiem Próba 9 Zamrozona 3500 3950 1925 5650 2760 100 50 Liofilizowana 0 0 0 0 1200 75 560 85 0 0 0 Próba 10 Zamrozona 2400 840 Liofilizowana 0 1520 110 */l ! Skróty: FFU - liczba ognisk, - nie badano */2 Dane tej tabeli sa wynikami doswiadczen, w których substancje komórkowa (zródlo wirusa) zamrazano w postaci zawiesiny calych komórek przy uzyciu dwumetylosulfotlenku jako srodka zabezpieczajacego. Nastepnie odmrazano ja, przemy¬ wano w buforze i przed ekstrakcja w róznych cieczach rozcienczano w stosunku 1:30 (próba 9) lub 1:40 (próba 10) przy uzyciu drgan dzwiekowych.Wyniki te wskazuja, ze wirus choroby Marek'a lub wirus opryszczki mozna uzyskac z duzymi wydajnoscia- mi przez ekstrakcje w obecnosci lub po rozcienczeniu w stabilizatorze wirusa, przy czym mozna nastepnie przeprowadzic liofilizacje bez dostrzegalnego zmniejszenia miana wirusa. Z powyzszych danych widac, ze trwala, bezkomórkowa zawiesina wirusa, wytwarzana sposobem wedlug wynalazku, wykazuje miano 103 lub wieksze w przypadku wirusów choroby Marek'a, a miano zawiesiny wirusa opryszczki indyka wynosi 105 lub wiecej.Wyniki tych doswiadczen wykazaly ponadto, ze przy ekstrakcji, prowadzonej w obecnosci surowicy plodowej wolowej, z zastosowaniem lub bez srodowiska hodowli tkankowej otrzymuje sie bardzo male miano wirusa, co oznacza prawie calkowita jego bezuzytecznosc jako szczepionki.Sposób wedlug wynalazku okazal sie nieoczekiwanie bardzo skuteczny do ekstrakcji wirusa, wiazacego sie z komórkami z zainfekowanych komórek.Rozerwanie i pekniecie komórek, powodujace uwolnienie nienaruszonego, zdolnego do zycia wirusa z ko¬ mórek, wywolywano w czasie przykladowych doswiadczen metoda drgan dzwiekowych. Wiadomo, jednak, ze mozna w tym celu stosowac inne znane sposoby, takie jak zamrazanie i odmrazanie, homogenizacje niskotempe¬ raturowa itp.Jedynym ograniczeniem procesu ekstrakcji sposobem wedlug wynalazku jest koniecznosc przeprowadzenia rozerwania i pekniecia komórek wówczas, gdy komórki sa zdyspergowane w czynniku stabilizujacym wirus, gdyz tylko to zapewnia otrzymanie wirusów, uwolnionych z komórki w stanie zdolnym do zycia.Przyklad II. Moc, tj. miano zakaznosci preparatów bezkomórkowych z komórek, zainfekowanych wirusem opryszczki, otrzymanych przez poddanie drganiom dzwiekowym roztworów, zawierajacych w róznych stezeniach albumine wolowa (frakcja surowicy V) jako czynnik stabilizujacy, okresla sie nastepujacym sposo¬ bem:8 ' 89652 Podstawowe hodowle komórek embrionalnych fibroblastów kurczaka /CEF/ szczepi sie szczepem FG-126 wirusa opryszczki indyka. Po okresie 3-dniowej inkubacji, zainfekowane komórki zbiera sie znanymi metodami trypsynowymi z 210 plytek Pertiego o srednicy 60 mm i uzyskuje sie 1,4 • 109 komórek. Objetosc osadu komó¬ rek po odwirowaniu z szybkoscia 1200 obrotów na minute w ciagu 10 minut wynosi okolo 3 ml. Odwirowane komórki rozprowadza sie w 60 ml srodowiska hodowli tkankowej (srodowisko nr 199 plus 10% brzeczki fosfora¬ nu tryptozy). Szesc próbek po 10 ml ponownie umieszcza sie w probówkach i odwirowuje. Objetosc osadu komórek w kazdej probówce wynosi okolo 0,5 ml. Ciecz sklarowana nad komórkami odprowadza sie i zainfeko¬ wane komórki dysperguje sie w 2,0 ml buforu fosforanowego zawierajacego rózne ilosci albuminy tak, aby uzyskac rozcienczenie 1:5 (stosunek objetosciowy). Nastepne rozcienczenia otrzymuje sie z tych zawiesin i w od¬ powiednich rozcienczalnikach wynosza one 1:10 i 1:100 objetosciowo.Kazda próbke poddaje sie w ciagu 45 sekund dzialaniu drgan dzwiekowychi bezposrednio potem rozcien¬ cza sie w stosunku 1:10 (objetosciowo) w czynniku stabilizujacym, skladajacym sie z 6,7% sacharozy, ^albu¬ miny wolowej w buforze fosforanowym oraz nastepnie zamraza sie do temperatury -70°C.W celu przeprowadzenia analizy próbki o dziesieciokrotnym rozcienczeniu wszczepia sie do podwójnych, wydrenowanych hodowli pierwotnych komórekCEF.Po uplywie 5 dni od zaszczepienia zlicza sie ogniska.Tablica IV Stosunek komórek do rozpuszczalnika /objetosciowo/ 1:5 1:10 1:100 Przecietna wydaj¬ nosc na mililitr osadu komórek |/FFUXl06/ Liczba ognisk/ml / x 106/ po dzialaniu drganiami dzwiekowymi w rozcienczalniku, zawierajacym wskazane ilosci albuminy* 1% ,5 /27,5/ 1,4 /14.4/ 0,17 /16,8/ 19,6 0,5% ,5 /27,5/ 1,8 /18,0/ 0,24 /24,0/ 23,2 0,25% 6,0 /30,0/ 2,2 /21,6/ 0,26 /26,4/ 26,0 0,1% ,5 Wcl 2,8 /27,8/ 0,28 /27,6/ 27,6 0,05% 2,3 /11,5/ 1,0 /9,6/ 0,14 /14,4/ 11,8 | * Liczby w nawiasach wskazuja liczbe ogniska /X 106/ na mililitr osadu komórek (liczba na mililitr razy wspólczynnik rozcienczenia).Z danych, przedstawionych w tabeli 4, widac, ze stosunek komórek do rozcienczalnika nie jest czynnikiem krytycznym (wydajnosci odpowiadaja liczbie wystepujacych komórek wirusa) i juz tak niska zawartosc albumi¬ ny, jak 0,1%, daje wystarczajacy efekt zabezpieczajacy wirus, umozliwiajacy utrzymanie duzego miana wirusa w trakcie i po rozerwaniu komórek. Mozna zauwazyc, ze przy stezeniu 0,05% równiez uzyskuje sie pewien efekt zabezpieczajacy, choc nie tak duzy, jak przy stezeniach 0,1 do 1,0%.Przyklad III. Nastepujacym sposobem okresla sie okres stopien przezycia bezkomórkowego wirusa opryszczki indyka, ekstrahowanego przy uzyciu drgan dzwiekowych z zainfekowanych komórek CEF, zdysper- gowanych w jednym z czynników stabilizujacych, stosowanych w sposobie wedlug wynalazku (sacharoza, bufor fosforanowy i albumina wolowa), a nastepnie liofilizowanych po uprzednim rozcienczeniu w stosunku 1:10 w roztworach o róznych stezeniach sacharozy i albuminy wolowej w buforze fosforanowym.Podstawowe hodowle komórek CEF, zainfekowanych wirusem opryszczki indyka (szczep FCTl26,:takijak opisano w przykladzie II), rozciencza sie w czynniku stabilizujacym, skladajacym sie z 7,6% sacharozy i 1% albuminy wolowej., frakcji surowicy V w buforze fosforanowym /SPA/ przy stosunku objetosciowym 1 czesc osadu komórek do 20 czesci czynnika stabilizujacego SPA. Zawiesine poddaje sie drganiom dzwiekowym w cia¬ gu 1,5 minuty i nastepnie zamraza sie na okres nocy w temperaturze -70°C. Po odmrozeniu zawiesine bezkomór- kowa frakcji wirusa rozciencza sie w stosunku 1:10 w kazdym z nastepujacych 4 rozcienczalników: 10% sacharo¬ za, 10% sacharoza plus 1% albuminy, 1% albuminy (wszystkie w buforze fosforanowym) lub w samym buforze fosforanowym. Przez zmieszanie odpowiednich ilosci wirusa, rozcienczonego w 10% sacharozie i albuminie, z wi¬ rusem, rozcienczonym w samej albuminie, otrzymuje sie próbki o róznych stezeniach sacharozy przy tym samym stezeniu albuminy. Przygotowuje sie podobne mieszaniny wirusa w sacharozie lub w buforze fosforanowym.Stezenie albuminy w tych próbkach wynosi 0,1%, poniewaz stosuje sie rozcienczenie albuminy w wirusie 1:10.89652 9 Kazda z próbek o objetosci 1 ml liofilizuje sie. W celu przeprowadzenia analizy, kazda próbke w fiolce rekonstytuuje sie przy uzyciu 1 ml wody destylowanej. Nastepnie po 10-krotnym rozcienczeniu szczepi sie po dwie wydrenowane, pierwotne hodowle CEF, rozwijane w ciagu 24 godzin. Po uplywie 5 dni od zaszczepienia zlicza sie ogniska i dla kazdej próbki oblicza sie liczbe ognisk /FFU/ na mililitr. Uzyskuje sie nastepujace wyniki (tablica V).Tablica V Koncowe stezenie sacharozy % 8% 6% 4% 2% 1% FFU/ml w roztworach sacharozy, zawierajacych wskazane ilosci albuminy 1% albuminy 44400 36000 45600 31200 35200 14000 0,1% albuminy 43200 35200 56000 44800 33600 13600 Powyzsze wyniki wskazuja, ze zastosowanie sacharozy juz w stezeniu 2% wagowych dobrze zabezpiecza wirus, zwiazany z komórkami, w trakcie liofilizacji, przy czym stezenie albuminy wynosi 1,0 lub 0,1% wago¬ wych.Przyklad IV. Przyklad przedstawia skutecznosc liofilizowanej frakcji bezkomórkowej wirusa typu herpetycznego indyka /HVT/ jako szczepionki, zabezpieczajacej kurczaki przeciw chorobie Marek'a. W tym celu jednodniowe i trzytygodniowe, podatne kurczaki szczepi sie róznymi dawkami wirusa i po uplywie 20 lub 22 dni szczepione i nieszczepione kurczaki poddaje sie dzialaniu zlosliwego wirusa choroby Marek'a. Wyniki przedsta¬ wiono w tablicy 6.Tablica VI Zakaznosc i odpornosc przy zwalczaniu zlosliwego wirusa choroby Marek'a u kurczaków, szczepionych liofilizowanym bezkomórkowym preparatem wirusa opryszczki indyka (szczep FC-12.6).Próba 1 3 Wiek podczas szczepienia 1 dzien 3 tygodnie Rozcienczenie wirusa 1:50 1:500 1:5000 1:50000 1:50 1:500 1:5000 1:50000 Dawka /FFU/ 6000 600 60 6 zadna 2700 270 27 Xl zadna Testy na zarazliwosc*/1 przyuzyciu HVT Zakazone 9/9 /10 9/9 8/10 0/10 /10 /10 /10 1/10 0/10 Wytracone precypityna 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 1/10 0/10 0/10 0/10 0/10 Wrazliwosc na zwalczanie*/2 wirusa choroby Marek'a 'Zarazone kurczaki 0/10 0/10 1/9 1/8 0/10 0/10 0/9 1/7 Niezakazone kurczaki ...*/3 2/2 9/9 | 3/3 0/10 | */l Badano po okresie 20 dni (próba 1) lub 22 dni (próba 2) od zaszczepienia. Analize na zakazenie wirusem HVT przeprowadzono z nierozerwanymi komórkami w stanie swiezym (próba 1) lub zamrozonym przy uzyciu DMSO jako srodka zabezpieczajacego (próba 2). */2 Wszystkie kurczaki szczepiono dobrzusznie przy uzyciu komórek, zainfekowanych wirusem JM w dawce 10 000 FFU.Kurczaki, które padly /MD/ lub wykazywaly calkowicie zmiany patologiczne /MD/ w 8 tygodni po zaszczepieniu uwaza sie za podatne. */3 ... - nie ma drobiu w tej kategorii.Z tabeli 6 wynika, ze juz male dawki 2, 7 i 6 jednostek, tworzacych ogniska, sa zarazliwe dla wiekszosci szczepionych kurczaków, a wieksza dawka - dla wszystkich kurczaków. Widac równiez, ze prawie wszystkie zainfekowane kurczaki sa odporne na zlosliwy wirus choroby Marek'a podczas, gdy prawie wszystkie kurczaki nie szczepione padaja w identycznej próbie.10 89652 PL PL PL
Claims (9)
1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania trwalej, bezkomórkowej i o wysokim mianie zawiesiny zdolnych do zycia wiru¬ sów, wiazacych sie z komórkami, znamienny tym, ze komórki zainfekowane wirusem, wiazacym sie z komórkami, miesza sie z czynnikiem stabilizujacym, zawierajacym albumine lub kazeine, w ilosci, wystarczaja¬ cej do wytworzenia homogenicznej zawiesiny zainfekowanych komórek w czynniku stabilizujacym, po czym otrzymana homogeniczna zawiesine poddaje sie niszczeniu komórek tak, aby nastapilo ich rozerwanie, przy czym nastepuje uwolnienie nienaruszonego, zdolnego do zycia wirusa z komórek, a nastepnie uzyskana bezko- mórkowa, zdolna do zycia zawiesine wirusa w czynniku stabilizujacym poddaje sie ewentualnie liofilizacji.
2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie komórki, zainfekowane wirusem opryszczki grupy B.
3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie komórki, zainfekowane wirusem opryszczki indyka.
4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze stosuje sie komórki, zainfekowane wirusem FC126, wyizolowanym z wirusa opryszczki indyka.
5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie komórki, zainfekowane wirusem, wy¬ izolowanym z grupy wirusów JM i GA, wyizolowanych z wirusa opryszczki choroby Marek'a.
6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie czynnik stabilizujacy, zawierajacy do¬ datkowo pochodna skrobi, zwlaszcza sacharoze.
7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie czynnik stabilizujacy, skladajacy sie z mieszaniny albuminy lub kazeiny oraz jednej lub wiecej substancji, takiej jak sacharoza, fosforany, glutaminia- ny, glikpza i aminy N—Z.
8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie substancje bialkowe w takiej ilosci, aby ich stezenie w otrzymanej zawiesinie wynosilo co najmniej 0,05% wagowych/objetosc, obliczonych w g suchej masy w stosunku do objetosci w ml roztworu.
9. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze stosuje sie pochodna skrobi, a zwlaszcza sacharo¬ ze w takiej ilosci, aby jej stezenie w otrzymanej zawiesinie wynosilo co najmniej 2% wagowych/objetosc, obli¬ czonych w g suchej masy w stosunku do objetosci w ml roztworu. Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 10 zl PL PL PL
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9292070A | 1970-11-25 | 1970-11-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL89652B1 true PL89652B1 (en) | 1976-12-31 |
Family
ID=22235792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL15139071A PL89652B1 (en) | 1970-11-25 | 1971-11-04 | Stable virus preparations[za7106689b] |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| AT (1) | AT316742B (pl) |
| CS (1) | CS172934B2 (pl) |
| ES (1) | ES396884A1 (pl) |
| HU (1) | HU166890B (pl) |
| PL (1) | PL89652B1 (pl) |
| ZA (1) | ZA716689B (pl) |
-
1971
- 1971-10-06 ZA ZA716689A patent/ZA716689B/xx unknown
- 1971-10-22 HU HUME001435 patent/HU166890B/hu unknown
- 1971-11-04 PL PL15139071A patent/PL89652B1/pl unknown
- 1971-11-09 AT AT966671A patent/AT316742B/de not_active IP Right Cessation
- 1971-11-10 ES ES396884A patent/ES396884A1/es not_active Expired
- 1971-11-11 CS CS790671A patent/CS172934B2/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES396884A1 (es) | 1975-06-01 |
| AT316742B (de) | 1974-07-25 |
| CS172934B2 (pl) | 1977-01-28 |
| ZA716689B (en) | 1972-06-28 |
| HU166890B (pl) | 1975-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3783098A (en) | Highly potent,viable and stable cellfree virus preparations from cells infected with cell-associated viruses and method for obtaining the same | |
| Calnek et al. | Lyophilization of cell-free Marek's disease herpesvirus and a herpesvirus from turkeys | |
| US4622222A (en) | Process for the preparation of a lyophilized vaccine against duck virus hepatitis | |
| WO2000023104A1 (en) | Freeze-dried hepatitis a attenuated live vaccine and its stabilizer | |
| US4302444A (en) | Vaccines for immunizing egg-laying birds against Egg Drop disease, preparation of said vaccines, and method of use of said vaccines | |
| Coggin et al. | Induction of tumor-specific transplantation immunity in hamsters with cell fractions from adenovirus and SV40 tumor cells | |
| US2912361A (en) | Canine distemper vaccine and its preparation | |
| Finlay et al. | The use of the complement fixation test for rapid typing of infectious pancreatic necrosis virus | |
| PL89652B1 (en) | Stable virus preparations[za7106689b] | |
| JP3410744B2 (ja) | 無細胞マレック病ウイルスワクチン | |
| Scott et al. | Stability of pseudorabies virus during freeze-drying and storage: effect of suspending media | |
| US20070031450A1 (en) | Stabilizers for veterinary vaccines | |
| JP2887251B2 (ja) | 伝染性気管支炎ウイルス培養物及びそれからのワクチン | |
| US4837018A (en) | Vaccines for fowl colibacillosis | |
| US20070111211A1 (en) | Integrated viral complexes, methods of production thereof, vaccines containing same and methods of use thereof | |
| US3470294A (en) | Vaccine for immunization of dogs and foxes against distemper,hepatitis contagiosa and leptospirosis and process for preparing it | |
| RU2127604C1 (ru) | Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц | |
| PT1387693E (pt) | Vacina de micoplasma inactivado por saponina | |
| Bang | Synergistic action of hemophilus influenzae suis and the swine influenza virus on the chick embryo. II | |
| Lindenmann | The use of viruses as immunological potentiators | |
| Kaleta et al. | Persistent viraemia of a cell‐associated herpesvirus in white storks (Ciconia ciconia) | |
| Carmichael et al. | Secondary serological response to infectious canine hepatitis virus produced by adenovirus type 4. | |
| US3432391A (en) | Attenuated infectious canine hepatitis live virus vaccine and method of producing same | |
| Harris | A review of laboratory freeze-drying with particular reference to viruses | |
| Khodashenas et al. | Isolation and characterization of avian Reoviruses from the cases of malabsorption syndrome and arthritis/tenosynovitis in chickens |