Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych estrów antybiotyków B-5050 oraz czte¬ rowodoro B-5050.Estry antybiotyku B-5050 okresla wzór la, w którym Rx oznacza grupe acetylowa lub propio- nylowa, R2 oznacza grupe acetylowa, propionylo- wa lub izowalerylowa, jeden lub obydwa pod¬ stawniki Mj i M2 oznaczaja grupe o wzorze R-CO-, w której R oznacza reszte weglowodoru, ewentualnie nienasyconego, zawierajacego 2—7 ato¬ mów wegla, natomiast kazdy z pozostalych pod¬ stawników Mj altyo M2 oznacza atom wodoru.Estry antybiotyku czterowodoro B-5050 przed¬ stawia wzór lb„ w którym Rx oznacza grupe ace¬ tylowa lub propionylowa, R2 oznacza grupe acety¬ lowa, propionylowa lub izowalerylowa, jeden, dwa lub wszystkie podstawniki Mlt M2, M3 oznaczaja grupe o wzorze R-CO-, w którym R oznacza re¬ szte weglowodoru, ewentualnie nienasyconego, za¬ wierajacego 2—7 atomów wegla, a kazdy z po¬ zostalych podstawników Mj, M2 lub M3 oznacza atom wodoru.Estry te wytwarza sie przez estryfikacje anty¬ biotyków B-5050 lub czterowodoro B-5050, otrzy¬ manych metoda przedstawiona w belgijskim opi- slie patentowym nr 7514819.Antybiotyki B-5050 naleza do grupy makrolidów hamujacych wzrost bakterii gram — dodatnich.Okresla je wzór 2, w którym Rx i R2 maja wy¬ zej podane znaczenie.Antybiotyki czterowodoro B-5050 przedstawia wzór 3, w którym Rx i R2 maja wyzej podane znaczenie a M3 oznacza atom wodoru lub grupe R-CO-, w której R ma wyzej podane znaczenie.Antybiotyki B-5050, w zaleznosci od znaczen podstawników Rx i R2, zostaly dodatkowo ozna¬ czone literami A, B, C, D, E, F.Rx i R2 oznaczaja nastepujace podstawniki: B-5050-A B-5050-B B-5050-C B-5050-D B-5050-E B-5050-F Ri propionyl acetyl propionyl acetyl propionyl acetyl R2 izowaleryl izowaleryl propionyl propionyl acetyl acetyl Antybiotyki te zostaly nazwane wspólnym mia¬ nem „B-5050" (o ile nie zaznaczono inaczej, okre¬ sla sie je po prostu B-5050).Antybiotyk B-5050 posiada dwie drugorzedowe grupy "hydroksylowe w polozeniu 9 oraz 2'. Obie te grupy oznacza sie odpowiednio jako grupe a- i |3-hydroksylo\va. Jezeli jedna z tych grup hydro¬ ksylowych lub obie podda sie selektywnej estry- fikacji, w jedno- lub wieloetapowym procesie, 88 91688 916 w okreslonych warunkach, otrzymuje sie a-mono- estrjr, p monoestry lub a, P-dwuestry B-5050.B-5050 posiada jedno nienasycone podwójne wia¬ zanie w polozeniu 10 i 11 oraz jedna grupe epoksy w polozeniu 12 i 13.Stwierdzono, ze jesli B-5050 o wzorze 3 podda sie katalitycznej redukcji, to nienasycone podwój¬ ne wiazanie zostaje wysycone, a równoczesnie gru¬ pa epoksy zostaje odszczepiona, przy czym otrzy¬ muje sie odpowiedni czterowodoro-B^5050 o wzo¬ rze 3a posiadajacy nowoutworzona grupe hydro¬ ksylowa w polozeniu 13. Kazdy czterowbdoro B-5050 A, B, C, D, E, F lub mieszanine dwu lub wiecej z nich,, jezeli nie podano inaczej, okresla sie jako czterowodoro-B-5050. Antybiotyk cztero- wodoro-B-5050 jest bardziej stabilny w stosunku do kwasów niz B-5050. Otrzymany w ten sposób czterowodoro-B-5050 posiada trzy drugorzedowe grupy hydroksylowe w polozeniu 9, 2' oraz 13.Wspomniane wyzej trzy drugorzedowe grupy hydroksylowe okresla sie odpowiednio jako grupy a-, P- i Y_nydroksylowe- Jezeli jedna lub wiecej z grup a-, p- i y-hydroksylowych zostanie selek¬ tywnie lub nieselektywnie zestryfikowana w jedno- lub wieloetapowym procesie, w okreslonych wa¬ runkach, otrzymuje sie p-monoestry, a, p-dwu- estry, a, y-dwuestry oraz a, P, Y^tró3estry cztero¬ wodoro-B-5050.Estry B-5050 oraz czterowodoro-B-5050 mozna oddzielac bezposrednio lub chromatograficznie, albo innymi konwencjonalnymi sposobami, umozliwia¬ jacymi uzyskanie wymaganej czystosci. Estry te wykazuja lepsze dzialanie terapeutyczne w sto¬ sunku do B-5050 lub czterowodoro-B-5050.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych uzytecznych estrów B-5050 lub cztero¬ wodoro-B-5050, w którym otrzymuje sie estry po¬ jedyncze lub ewentualnie ich mieszanine.Sposobem wedlug wynalazku estry antybiotyku B-5050 o wzorze la, w którym Rj, R2, M± i M2 maja wyzej podane znaczenie otrzymuje sie przez estryfikacje antybiotyku B-5050 o wzorze 2, w którym Rx i R2 maja wyzej podane znaczenie, kwasem organicznym o wzorze RCOOH, w którym R oznacza reszte weglowodoru ewentualnie niena¬ syconego, zawierajaca 2—7 atomów wegla, lub jego reaktywna pochodna, korzystnie halogenkiem albo bezwodnikiem.Sposób otrzymywania estrów antybiotyku cztero¬ wodoro-B-5050 o wzorze Ib, w którym Rj, R2, Mlf M2 i Ms maja wyzej podane znaczenie polega we¬ dlug wynalazku na estryfikacji antybiotyku cztero¬ wodoro-B-5050 o wzorze 3a lub jego estru o wzo¬ rze 3, w których Rlf R2, Mj, M2 i M8 maja wyzej podane znaczenie, kwasem organicznym o wzorze R-COOH, w którym R ma wyzej podane zna¬ czenie, lub jego reaktywna pochodna zwlaszcza halogenkiem albo bezwodnikiem.Substancje wyjsciowe B-5050,, jak podano we wspomnianym belgijskim opisie patentowym, o- trzymuje sie przez hodowle droibnousitroju, nale¬ zacego do rodzaju Streptomyces, w pozywce za¬ wierajacej przyswajalne zródla wegla i azotu, w warunkach tlenowych, do czasu nagromadzenia sie antybiotyku w brzeczce fermentacyjnej, po czym oddziela sie B-5050. Wsród drobnoustrojów wy¬ twarzajacych B-5050 typowym przykladem jest Streptomyces hygroscopics (IFO12995).Substancje wyjsciowa — czterowodoro-B-5050, o- trzymuje sie z B-5050 na drodze katalitycznej re¬ dukcji. Antybiotyk B-5050 jest rozpuszczalny w tluszczach oraz w niektórych organicznych roz- puszczalnikachj takich jak metanol, etanol i octan etylu. Stad, jesli B-5050 uprzednio rozpusci sie w jednym z wymienionych rozpuszczalników, wów¬ czas po katalitycznej redukcji wodorem w obec¬ nosci katalizatora, takiego jak pallad osadzony na weglu, tlenek platyny i innych otrzymuje sie czterowodoro-B-5050 z dobra wydajnoscia. Inne !5 substancje wyjsciowe, mianowicie a-estry cztero¬ wodoro-B-5050. otrzymuje sie przez estryfikacje J3-5050, zgodnie ze sposobem wedlug wynalazku, a nastepnie otrzymane w ten sposób a-estry B-5050 poddaje sie opisanej wyzej redukcji katalitycznej.Nalezy dodac, ze jesli B-5050 oraz jego estry sa katalitycznie redukowane w polozeniach 10 i 12, zgodnie ze wzorem 2, to nie nastepuje naruszenie * czasteczki w innych polozeniach.Estryfikacje antybiotyku B-5050 prowadzi sie przy uzyciu róznych znanych zwiazków e^sitryfalku- jaeych. Gru|pa tworzaca ester jest pochodzaca od kwasu grupa o wzorze R, w którym R ozna¬ cza reszte organiczna, lub gruipa o wzorze ogólnym R O CO-, w którym R posiada wyzej podane zna- czenie. Grupy ROCO otrzymuje sie przez usunie¬ cie podstawników hydroksylowych z organicznych kwasów karbonowych. Mozna takze stosowac srod¬ ki estryfikujace, zawierajace te grupy. Chociaz najprostszymi zwiazkami estryfikujacymi sa kwa- sy organiczne, to mozna równiez stosowac odpo¬ wiednie halogenki i bezwodniki kwasowe. Z kwa¬ sów organicznych stosuje sie nasycone kwasy jednckarboksylowe, takie jak kwas octowy, pro- pionowy, n-maslowy, i-maslowy, n-walerianowy, 40 izowalerianowy oraz kwas palmitynowy; niena¬ sycone kwasy jednokarboksylowe, takie jak kwas krotonowy; wielozasadowe kwasy, takie jak kwas bursztynowy; aromatyczne kwasy karboksylowe, takie jak kwas benzoesowy, p-aminobenzoesowy i 45 inne; kwasy arylokarboksylowe, takie jak kwas fenylopropionowy i tym podobne. Z kwasów orga¬ nicznych stosuje sie takie kwasy, które zawieraja grupe estrowa o 1—10, korzystnie 2—7 atomach wegla, na przyklad kwas octowy, kwas propiono- 50 wy, kwas n-, izo- oraz III-rzed.-maslowy, n- oraz izo-walerianowy, kwasy krotonowy, bursztynowy, benzoesowy i inne. Kwasy organiczne moga po¬ siadac jeden lub wiecej podstawników, takich jak chlorowiec, grupe alkilowa, alkoksylowa, amino- 55 wa, hydroksylowa i inne grupy.Stosujac zwiazek estryfikujacy, korzystnie jest uzywac taki rozpuszczalnik, który nie przeciw¬ dziala estryfikacji, na przyklad pirydyne, cztero- wodorofuran? aceton lub ich mieszaniny, stoso- 60 wane powszechnie jako rozpuszczalniki.Jezeli wymagane jest zwlaszcza selektywne syn¬ tetyzowanie a-estrów, nalezy substancje wyjscio¬ wa poddawac reakcji z organicznym halogenkiem kwasowym, w temperaturze 5°C lub nizszej, w o- 65 becnosci rozpuszczalnika, takiego jak pirydyna,88 916 chinolina lub pikolina. Stwierdzono,, ze przypro¬ wadzenie reakcji w ten sposób nastepuje selektyw¬ na estryfikacja samej grupy a-hydroksylowej z dobra wydajnoscia. Dlatego tez zadany produkt mozna latwo wyodrebnic z mieszaniny reakcyjnej, bez^ uciekania sie do operacji rozdzielania a, p-estru, P-estru i nieprzereagowanej substancji wyjsciowej.W celu zsyntetyzowania p-monoestru nalezy sub¬ stancje wyjsciowa B-5050 lub czterowodoro-B-5050 poddac reakcji z bezwodnikiem kwasu organicz¬ nego wzglednie z jego halogenkiem w tempera¬ turze okolo 5°C lub nizszej, -w obecnosci roz¬ puszczalników, takich jak aceton, octan etylu, me¬ tanol albo czterowodorofuran. W przypadku, gdy potrzeba wprowadzic reszte aromatycznego kwasu karboksylowego w polozenie p, na przyklad sto¬ sujac bezwodnik kwasu benzoesowego, korzystnie jest prowadzic reakcje w temperaturze okolo 15°C lub wyzszej, w obecnosci na przyklad pirydyny.Aby otrzymac a, P-dwuestry reakcje korzystnie prowadzi sie w temperaturze okolo 15°C lub wyz¬ szej przez dluzszy czas na przyklad 10—30 godzin, niz to ma miejsce przy otrzymywaniu a-estrów.Dobre wyniki mozna na przyklad uzyskac pro¬ wadzac reakcje w ciagu nocy w temperaturze okolo20°C. / Synteze a, y-dwuestrów czterowodoro-B-5050 ko¬ rzystnie prowadzi sie w reakcji czterowodoro-B- -5050 lub a-estrów czterowodoro-B-5050 z orga¬ nicznym halogenkiem kwasowym w temperatu¬ rze okolo 5°C lub nizszej, w obecnosci takiego rozpuszczalnika, jak na przyklad pirydyna.Synteze a, p, ytrójestrów czterowodoro-B-5050 z czterowodoro-B-5050 lub jedno- albo dwuestrów, korzystnie jest prowadzic w temperaturze 15°C luib wyzszej, niz przy otrzymywaniu mono- lub dwuestrów, na przyklad a, p, Y-trójestry otrzy¬ muje sie podczas reakcji prowadzonej w ciagu nocy w temperaturze okolo 15°C lub wyzszej.W przypadku otrzymywania dwu- lub trójestrów, estryfikacje mozna prowadzic w dwu lub wiecej etapach.Jesli wytwarza sie na przyklad a- lub p-mono- estry, a nastepnie prowadzi sie dalsza estryfikacje przy uzyciu dwu róznych reszt kwasowych, to otrzymuje sie dwuester, w którym atomy wodoru grup hydroksylowych w polozeniu a i p zostaja podstawione róznymi resztami kwasowymi.Rózne estry B-5050 lub czterowodoro-B-5050 o- trzymywane sposobem wedlug wynalazku identy¬ fikuje sie za pomoca widm magnetycznego rezo¬ nansu jadrowego (NMR) 100 MHz, w dwuchlorofoor- mie (CDClg), j Tablica 1 NMR /8, ppm/ B-5050 • estry B-5050 a-ester P-ester a, P-dwuester 66, 6,03 ^proton olefihowy) ,00-* w przyblizeniu 5,0 3,52-? w przyblizeniu 5,0 f3,52-*w przyblizeniu 5,0 14,00 40 45 50 ¦czterowodoro¬ -B-5050 estry cztero¬ wodoro-B-5050 a-ester P-ester a, y-dwuester a, P, y-trójester 6 zanikanie protonów olefinowych 3„9 -+ w przyblizeniu 5,0 f3,5 -+ w przyblizeniu 5,0 12,5^2,4 w przyblizeniu 3,9 -? w przy- " , blizeniu 5,0 f3,5 -+ w przyblizeniu 5,0 13,9 -+ w przyblizeniu 5,0 1 |w przyblizeniu 3,95-? w przy- 1 blizeniu 5,0 U,5-^2,4 Innym sprawdzianem tozsamosci jest wartosc PKa', która dla B-5050 lub czterowodoro-B-5050, bedacych substancjami zasadowymi, wynosi okolo 6,6M6,9 podczas gdy wartosc PKa' dla P-estrów wynosi okolo 4,7—4,8, co wynika z tablicy 2.Tablica 2 PKa' B-5050 estry B-5050 a-ester P-ester a, P-dwuester czterowodoro¬ -B-5050 estry cztero¬ wodoro-B-5050 a-ester P-ester a, Y-dwuester a, p, Y-trójester w przyblizeniu 6,9 w w w w w w w w przyblizeniu 6,6 przyblizeniu 4,7 przyblizeniu 4,7 przyblizeniu 6,8 przyblizeniu 6,6 przyblizeniu 4,8 przyblizeniu 6,6 przyiblizeniu 4,8 60 65 Sposobem wedlug wynalazku mozna otrzymywac rózne estry, któpe w chromatografii cienkowarst¬ wowej wykazuja rózne wartosci Rf i dlatego pro¬ dukt reakcji latwo jest frakcjonowac. Jezeli jako rozpuszczalnik uzyje sie mieszanine chloroformu i metanolu, to dla B-5050 — jego a-propionianu, P-propionianu oraz a, p-dwupropionianu wartosci Rf wynosza odpowiednio 0,1—0,2; 0,37—0,52; 0,25— 0,30; oraz 0,67—0,80.Jezeli otrzymuje sie mieszanine B-5050, jego a-, P-monoestry i/lub a, P-dwuestry, to mozna je roz¬ dzielic na kolumnie chromatograficznej na zelu krzemionkowym albo tlenku glinu stosujac uklad rozpuszczalników, jak na przyklad chloroform— metanol, benzen—aceton lub benzen—octan etylu.Otrzymane, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, estry B-5050 i czterowodoro-B-5050 wykazuja zdol¬ nosc silnego hamowania wzrostu gram-dodatnich bakterii in vitro oraz doskonale dzialanie lecznicze w testach na doswiadczalnie zainfektowanych zwie¬ rzetach.Na podstawie stezenia antybiotyków we krwi7 88 916 8 zwierzat stwierdzono, ze estry te sa latwo wchla¬ niane do plynu ustrojowego. Niektóre z tych estrów sa bardziej odporne na dzialanie kwasów niz sub¬ stancja wyjsciowa Bf5050, a ponadto lepiej roz¬ puszczalne w tluszczach, stad mozliwosc przygoto¬ wywania z nich (masci.Ponizsza tablica 3 wykazuje lepsze fizykoche¬ miczne i biologiczne wlasnosci niektórych estrów B-5050 lub czterowodoro-B-5050 w porównaniu z B-5050 lub czterowodoro-B-5050. 10 moku kukurydzianego/ 1% odtluszczonej maki so¬ jowej, 0,5% chlorku sodowego, 0,05% siarczanu magnezu, 0,3% weglanu wapnia i wode. Inkuba¬ cje prowadzi sie w temperaturze 28°C z przeply¬ wem powietrza w ilosci 100 l/minute i mieszaniem z szybkoscia 200 obrotów na minute w ciagu 24 godzin. 100 1 otrzymanej hodowli posiewowej przenosi sie do 1000 1 wyjalowionej pozywki produkcyjnej o tym samym skladzie co hodowla posiewowa Tablica 3 Zwiazek "^ i B-5050 /kontrola/ B-5050 a-octan B-5050 a-propionian B-5050 a-n-maslan B-5050 a-i-maslan B-5050 a-krotonian B-5050 a, (3-dwuoctan B-5050 a-propionylo (3-octan B-5050 czterowodoro-B-5050 czterowodoro-B-5050 / a, p, Y-trójoctan czterowodoro-B-5050 a, (3, Y^trójpropionian Dzialanie na Staphy lococcus aureus /P.O./ 2 1 2X 2—3X 2—3X 2X 2X 2X 2X 2X 1 3X nieco slabsze Stezenie w krwi szczurów ' /P.O./ 3 1 2—3X 2—3X 2X — — 2X — '3X 1 ^ 3X takie samo Ostra toksycznosc u myszy 1 /I.P./ 4 1 V* 1/2 1 Vi ' — — V2 lub mniej — V2 lub mniej — V2 lub mniej Odpornosc na kwas 1 prawie taka sama nieco wieksza 2X 2X 2X prawie ta sama 2X 1,5—2,0 X 2X 3X 3X 1 Niezaleznie od wspomnianych juz wlasnosci, estry ze wzgledu na mniej gorzki smak w porównaniu z substancja wyjsciowa, wykazuja jeszcze przy¬ datnosc w stosowaniu doustnym.Nastepujace przyklady wyjasniaja blizej sposób wedlug wynalazku.Zaleznosc miedzy stosunkiem wagowym i obje¬ tosciowym jest taka sama, jak zaleznosc miedzy gramami i mililitrami.Przyklad I. Substancje wyjsciowa B-5050 stosowana w I i dalszych przykladach wytwarza sie nastepujacymi sposobami. 500 ml pozywki do wstepnej hodowli posiewo¬ wej, wartosci pH=7, zawierajacej 2% glukozy, 3% rozpuszczalnej skrobi, 1% maki sojowej, 1% namoku kukurydzianego, 0,5% „Polipeptonu" (na¬ zwa handlowa hydrolizatu kazeiny firmy Daigo Nutritive Chemicals, Ltd, Osaka, Japonia), 0,3% chlorku sodowego,, 0,3% weglanu wapnia i wode, przenosi sie do 2000 ml kolb i wyjalawia. Steryli¬ zowana pozywke zakaza sie szczepem Streptomy- ces hydcroscopiocus (IFO 12995) z czterodniowej hodowli w temperaturze 28°C na agarze skosnym.Hodowle prowadzi sie w temperaturze 28° na wy¬ trzasarce przy 115 obrotach na minute skoku 10 cm, w ciagu 48 godzin. Otrzymana brzeczka w ilosci 1000 ml zostaje uzyta jako wstepna hodowla po¬ siewowa. Wstepna hodowle posiewowa zakaza sie 100 1 pozywki hodowlanej, wartosci pH=7 i wyja¬ lawia w 200 1 tankach ze stali nierdzewnej. Po¬ zywka hodowlana zawiera 3% glukozy, 0,5% na- i wprowadza do tanków ze stali nierdzewnej o pojemnosci 2000 1. Inkubacje prowadzi sie dalej w temperaturze 28°C z przeplywem powietrza w ilosci 1000 l/minute i mieszaniem z szybkoscia 120 obrotów na minute w ciagu 66 godzin. W cza- 40 sie inkubacji dodaje sie „Actocol'^ (nazwa han¬ dlowa mieszaniny pochodnych* polyoksypropyleno- wych o 56 grupach hydroksylowych, firmy Takeda Chemical Industries ltd., Osaka, Japonia), jako srodek przeciwpienieniu w ilosci okolo 0,05% w sto- 45 sunku do calej zawartosci pozywki. W ten spo¬ sób otrzymana hodowla produkcyjna wywiera dzialanie przeciwbakteryjne odpowiadajace 350 jednostkom rozcienczeniowym wobec Bacillus sub- tilis jako drobnoustroju testowego. 50 950 1 przesaczu brzeczki neutralizuje sie 2n lu¬ giem sodowym do wartosci pH±=8,5 i ekstrahuje 300 1 octanu etylu. Oddziela warstwe octanu etylu, przemywa woda i ekstrahuje dwukrotnie porcjami po 70 1 kwasu solnego 0,005 n. Polaczone wodne 55 wyciagi neutralizuje sie do wartosci pH=8,5 roz¬ cienczonym wodnym roztworem amoniaku i ponow¬ nie ekstrahuje dwukrotnie porcjami po 45 1 octa¬ nu etylu.Polaczone wyciagi przemywa sie woda, osusza 60 i zageszcza w prózni do objetosci 50 ml. Do pozo¬ stalosci tej dodaje sie 750 ml n-heksanu li otrzy¬ muje 95 g mieszaniny antybiotyku B-5050 w po¬ staci proszku. Produkt ten rozpuszcza sie na go¬ raco w 450 ml benzenu, dodaje 2 g wegla akty- 65 wowanego, saczy, przesacz pozostawia do oziebie-88 916 9 nia i otrzymuje 19 g mieszaniny antybiotyków B^5050 w postaci (bezbarwnych igiel. g krystalicznej mieszaniny antybiotyku B-5050 rozpuszcza sie w 50 ml octanu etylu i rozdziela chromatograficznie na 450 g zelu krzemionkowego (Merck A. G., REN, granulacja od 0,05 do 0,2 mm).Elucje prowadzi sie mieszanina octanu etylu i ben¬ zenu w stosunku 2:1. Pierwsze 600 md eluatu, wykazujace aktywnosc przeciwbakteryjna, odpa¬ rowuje sie do sucha i pozostalosc rozpuszcza w go¬ racym benzenie. Po pewnym czasie z roztworu tego wydziela sie 1 g bezbarwnych krysztalów, bedacych glównie antybiotykiem B-5050-A.Kolumne eluuje slie 4 1 mieszaniny octanu ety¬ lu i benzenu, po czym 3 1 octanu etylu. Polaczone eluaty odparowuje sie w prózni, pozostalosc roz¬ puszcza w goracym benzenie i po pewnym czasie otrzymuje sie 550 mg bezbarwnych krysztalów, bedacych glównie antybiotykiem B-5050^F. 500 mg krysztalów, zawierajacych glównie anty¬ biotyk B-5050-A rozpuszcza sie w 1,5 ml octanu etylu i ponownie chromatografuje na 50 g zelu krzemionkowego. Eluuje sie mieszanina octanu etylu i benzenu, w stosunku 1 : 1„ zbierajac frak¬ cje. Kazda z tych frakcji bada sie na obecnosc zwiazków aktywnych za pomoca chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym (fir¬ my Merck A. G., RFN, pod nazwa HF^), stosujac jako faze rozwijajaca mieszanine benzenu i ace¬ tonu w stosunku 3:2. Frakcje, które zawieraja wylacznie antybiotyk B-5050-A laczy sie, odparo¬ wuje w prózni i po krystalizacji z benzenu otrzy¬ muje 88,5 mg antybiotyku B-5050-A, jako bezbarw¬ ne plytki. 350 mg krysztalów, zawierajacych glównie anty¬ biotyk B-5050-F rozdziela sie chromatograficznie na 50 g zelu krzemionkowego w taki sam sposób, jak powyzej. Kolumne eluuje sie najpierw 700 ml mieszaniny octanu etylu i benzenu, w stosunku 2:1, nastepnie mieszanina octanu etylu i ben¬ zenu w stosunku 3:1, po czym poszczególne frak¬ cje bada sie na obecnosc czynnych zwiazków za pomoca chromatografii cienkowarstwowej. Frakcje, które zawieraja wylacznie antybiotyk B-5050-F laczy sie, odparowuje w prózni otrzymujac pozo¬ stalosc, kt6ra po krytalizacji zawiera 73,6 mg B-5050-F w postaci bezbarwnych plytek.Po 500 ml wyjalowionej pozywki do wstepnej hodowli posiewowej, o wyzej podanym skladzie, w kolbach o pojemnosci 2 \, zakaza sie szczepem Streptomyces hygroscopicus (IFC 12995) i zakazo¬ ne pozywki w kolbach inkubuje w ten sam spo¬ sób, jak w przykladzie I, aby otrzymac wstepna hodowle posiewowa.W tanku nierdzewnym, o pojemnosci 500 1 przy¬ gotowuje sie 200 1 pozywki o tym samym skla¬ dzie, jak podano poprzednio dla hodowli posie¬ wowej. Po 20 minutach wyjalawiania w tempe¬ raturze 121°C, pozywke zakaza sie 2 1 wyzej otrzy¬ manej wstepnej hodowli posiewowej. Inkubacje prowadzi sie w ciagu 24 godzin w temperaturze 28°C z przeplywem powietrza w ilosci 200 l/min. i przy mieszaniu 200 obrotów na minute w celu przygotowania hodowli posiewowej dla .zasadniczej fermentacji. 40 45 50 55 60 65 200 1 tak przygotowanej hodowli posiewowej przenosi sie do 4000 1 pozywki produkcyjnej o wyzej podanym skladzie i wprowadza do tanku nierdzewnego,, pojemnosci 6000 1. Fermentacje pro¬ wadzi sie w temperaturze 28°C z przeplywem po¬ wietrza w ilosci 2400 l/min. z mieszaniem o 180 obrotów na minute w czasie 48 godzin. W czasie hodowli dodaje sie „Actocol" jako srodek przeciw- pienieniu.Brzeczke fermentacyjna saczy sie i otrzymuje 4000 1 przesaczu, który neutralizuje sie do war¬ tosci pH=9 przy uzyciu 2 n lugu sodowego, eks¬ trahuje 1330 1 octanu etylu, wyciag ten przemywa woda i uzyskuje ostatecznie 1052 1 wyciagu orga¬ nicznego. Wyciag ten zageszcza sie w prózni do objetosci 100 ,1 i ekstrahuje dwukrotnie porcjami po 50 1 wodnego 1,5 M roztworu fosforanu jedno- potasowego, uprzednio doprowadzonego do warto¬ sci pH=4 kwasem fosforowym. Polaczone wyciagi neutralizuje sie do wartosci pH=8,5 rozcienczonym wodnym roztworem amoniaku i ekstrahuje 50 1 octanu etylu. Wyciag ten przemywa sie woda, osusza i zageszcza w prózni do konsystencji sy¬ ropu. Po dodaniu do tej pozostalosci 5 1 n-heksanu, otrzymuje sie 330 g surowego proszku. 300 g tego proszku rozpuszcza sie w 1,1 1 goracego benzenu, oziebia i otrzymuje 117 g krysztalów, zawieraja¬ cych glównie antybiotyki B-5050-C,-D oraz -E (krysztaly I).Otrzymany poprzednio wyciag octanu etylu, któ¬ ry byl juz ekstrahowany roztworem fosforanu jednopotasowego," poddaje sie ponownej ekstrakcji porcjami po 50 1 roztworu 0,02 n kwasu siarko¬ wego. Polaczone wyciagi wodne neutralizuje sie do wartosci pH=8 rozcienczonym wodnym roz¬ tworem amoniaku i ekstrahuje trzykrotnie por¬ cjami po 30 1 octanu etylu. Polaczone wyciagi organiczne przemywa sie woda, osusza i zagesz¬ cza w prózni do konsystencji syropu. Nastepnie dodaje sie 1,5 1 n-heksanu, otrzymujac 160 g su¬ rowego proszku. 150 g tego proszku krystalizuje sie z gorafcego benzenu otrzymujac 72,5 g kryszta¬ lów, które zawieraja glównie antybiotyki B-5050-A oraz -B wraz z niewielka iloscia antybiotyku B-5050-C (krysztaly II). 2 g krysztalów II rozpuszcza sie w 20 ml octanu etylu, dodaje 14 ml benzenu i roztwór ten podaje sie na kolumne zelu krzemionkowego (Merck A. G., RFN, granulacja 0,05—0,2 mm), uprzednio prze¬ myta mieszanina równych objetosci benzenu i octa¬ nu etylu. Kolumne eluuje .sie najpierw miesza¬ nina równych objetosci octanu etylu i benzenu, zbierajac 200 ml wycieku,, a nastepnie eluuje sie mieszanina octanu etylu i benzenu w stosunku 3:2, otrzymujac frakcje wykazujace aktywnosc przeciwbakteryjna w stosunku do Bacillus subti- lis. Frakcje zawierajace te same zwiazki laczy sie, zageszcza, krystalizuje z benzenu i otrzymuje 435 mg krysztalów antybiotyku B-5050-A oraz 185 mg krysztalów antybiotyku B-5050-B. g krysztalów I rozpuszcza sie w 50 ml octanu etylu, dodaje 25 ml benzenu i rozdziela chromato¬ graficznie na 400 g zelu krzemionkowego w spo¬ sób, podany powyzej. Kolumne eluuje sie naj¬ pierw 3 1 równych objetosci octanu etylu i ben-11 88 916 12 zenu, nastepnie mieszanina octanu etylu i benzenu w stosunku 2:1, zbierajac frakcje po 500 ml. Frak¬ cje otrzymane za pomoca pierwszego eluenta za¬ wieraja antybiotyki B-5050-A oraz -B. Pierwsza frakcja otrzymana za pomoca drugiego eluenta za¬ wiera antybiotyki B-5050-B oraz -C, druga frakcja zawiera antybiotyki B-5050hC oraz -D, wreszcieN trzecia frakcja zawiera antytoiotyildi B-5050-D oraz -E, zais ostatnia zawiera antybiotyki B-505'O-E oraz -F. 2 g krysztalów otrzymanych z frakcji zawiera¬ jacej antybiotyki B-5050-B oraz -C rozpuszcza sie w 15 ml octanu etylu i dodaje 10 ml benzenu.Roztwór ten rozdziela sie chromatograficznie na 250 g zelu krzemionkowego, nastepnie eluuje sie kolumne mieszanina octanu etylu i benzenu w sto¬ sunku 3:2 i zbiera frakcje po 20 'ml. Frakcje za¬ wierajace te same zwiazki laczy sie, zageszcza i krystalizuje z benzenu lub mieszaniny octanu etylu i n-heksanu, otrzymujac 85 mg krysztalów antybiotyku B-5050-iB, 940 mg krysztalów anty¬ biotyku B-5050-C oraz 75 mg krysztalów anty¬ biotyku B-5050-D.W ten sam sposób z 1,2 g frakcji zawierajacej antybiotyki B-5050-D oraz -E otrzymano, po chro- imatoigiratfii kolumnowej na zelu krzemionkowym, 600 mg krysztalów antybiotyku B-5050-E.Frakcja, która zostala otrzymana po frakcji za¬ wierajacej antybiotyki B-5050-B i -C, zawiera anty¬ biotyk B-5050-C jako glówny skladnik. 770 mg otrzymanych surowych krysztalów rozpuszcza sie w 5 ml acetonu i po chromatografii na 100 g zelu krzemionkowego, wykonanej w sposób podany wy¬ zej, otrzymuje sie 220 mg antybiotyku B-5050-C w postaci krysztalów. 4000 1 przesaczonej brzeczki, otrzymanej po fer¬ mentacji zasadniczej, jak podano wyzej, doprowa¬ dza sie do wartosci pH=8 i ekstrahuje 1333 litra¬ mi octanu etylu. Wyciag ten zageszcza sie do ob¬ jetosci okolo 100 1, przemywa 50 1 wody i eks¬ trahuje trzykrotnie porcjami po 50 1 wodnego 0,33 M roztworu fosforanu jednopotasowego, u- przednio zakwaszonego do wartosci pH=3 kwasem fosforowym. Polaczone wyciagi wodne zobojetnia sie do wartosci pH=9—10 wodnym 8n roztworem amoniaku i ekstrahuje 75 1 octanu etylu. Wyciag ten przemywa sie trzykrotnie porcjami po 25 1 wody i zageszcza do okolo 1,5 1. Nastepnie dodaje sie 30 1 n-heksanu otrzymujac 522 g surowych krysztalów. Krystalizacja tego produktu z benzenu daje 272 g krysztalów mieszaniny antybiotyku B-5050.W sposobie tym zastosowanie 0,2 n wodnego roztworu kwasu octowego zamiast roztworu fosfo¬ ranu jednopotasowego prowadzi do identycznych wyników. 19 g otrzymanej mieszaniny antybiotyku B-5050 rozpuszcza sie w 75 ml acetonu i rozdziela chro¬ matograficznie na 800 g zelu krzemionkowego (Merck A. G., jak wyzej).. Kolumne eluuje sie 3 1 mieszaniny octanu etylu i benzenu w stosunku 1 :1 uzyskujac 7,25 g krysztalów, zawierajacych glównie antybiotyki B-5050-A oraz -B. Nastepnie kolumne eluuje sie mieszanina octanu etylu i ben¬ zenu w stosunku 2: X zbierajac odpowiednie frak¬ cje. Pierwsza frakcja eluatu o objetosci 1100 ml jest przerabiana analogicznie, dajac 2,22 g krysz¬ talów, zawierajacych glównie antybiotyki B-5050-B oraz -C. Nastepna frakcja, o . objetosci 200 ml, daje 0,90 g krysztalów,'zawierajacych glównie anty¬ biotyk B-5050-C. Z kolejnej frakcji o objetosci 300 ml otrzymuje sie 1„4 g mieszaniny, zawieraja¬ cej glównie antybiotyki B-5050-C oraz -B. Z dal¬ szej frakcji o objetosci 600 ml otrzymuje sie 1,99 g krysztalów, zawierajacych glównie antybiotyki B-5050-D oraz -E. Nastepnie kolumne eluuje sie 600 ml, mieszaniny octanu etylu i benzenu w sto¬ sunku 3:1 uzyskujac 0,645 g krysztalów, zawie¬ rajacych glównie antybiotyki B-5050-D oraz -E.Ostatnia frakcja, otrzymana po eluacji kolumny 1600 ml octanu etylu, zawiera 2,09 g krysztalów, skladajacych sie glównie z antybiotyku B-5050-F. 7,25 g otrzymanych poprzednio krysztalów anty¬ biotyków B-5050-A oraz -B rozpuszcza sie w 40 ml acetonu i rozdziela chromatograficznie na 400 g zelu krzemionkowego, otrzymujac po eluacji mie¬ szanine octanu etylu i benzenu, w stosunku 1:1, okolo 1,5 g krysztalów antybiotyków B-5050-A oraz 0,65 g krysztalu antybiotyku B^5050-B. 2,22 g otrzymanych poprzednio krysztalów anty¬ biotyków B-5050-B oraz -C rozpuszcza sie w 20 ml acetonu, rozdziela chromatograficznie na 300 g zelu krzemionkowego i po eluacji mieszanina ben¬ zenu i acetonu, w stosunku 3: 1, otrzymuje sie 0,398 g krysztalów antybiotyku B-5050^B. Po ko¬ lejnej eluacji mieszanina benzenu i acetonu, w sto¬ sunku 2:1, otrzymuje sie 0,269 g krysztalów anty¬ biotyku B-5050-C. 0,90 g krysztalów, zawierajacych glównie anty¬ biotyk B-5050-C, rozpuszcza sie w 5 ml acetonu, rozdziela chromatograficznie na 100 g zelu krze¬ mionkowego, eluuje mieszanina octanu etylu i ben¬ zenu, w stosunku 2 :1 i otrzymuje 0,258 g kryszta¬ lów antybiotyku B-5050-C. 1,4 g krysztalów, zawierajacych mieszanine anty¬ biotyków B-5050-C oraz -B, rozpuszcza sie w 10 ml acetonu, rozdziela chromatograficznie na 150 g zelu krzemionkowiego, eluuje mieszanina (benzenu i ace¬ tonu, w stosunku 2 :1 i otrzymuje 0,596 g anty¬ biotyku B-5050-C oraz 0,187 g krysztalów anty¬ biotyku B-5050-D. 1,99 g krysztalów antybiotyku.B-5050-D oraz -E rozpuszcza sie w 30 ml acetonu, rozdziela chroma¬ tograficznie na 300 g zelu krzemionkowego, eluuje mieszanina benzenu i acetonu, w stosunku 2:1 i otrzymuje 0,304 g krysztalów antybiotyku B-5050-D oraz 0,187 g krysztalów antybiotyku B-5050-E. 2,09 g krysztalów, zawierajacych glównie anty¬ biotyk B-5050-F, rozpuszcza sie w 15 ml acetonu, rozdziela chromatograficznie na 250 g zelu krze¬ mionkowego, eluuje mieszanina octanu etylu i ben¬ zenu, w stosunku 3:1, otrzymujac 0,585 g krysz¬ talów antybiotyku B-5050-F.Otrzymanie a-propionianu B-5050. 120 czesci wagowych krysztalów antybiotyku B-5050 rozpuszcza sie w 480 czesciach objetoscio¬ wych pirydyny i w trakcie chlodzenia lodem oraz mieszania, dodaje sie stopniowo 40 czesci objeto¬ sciowych chlorku propionylu, Calosc miesza sie 40 45 50 55 6088 916 13 dalej w temperaturze 0°—5°C w ciagu 20 minut i "pozostawia w lodówce na 2 godziny. Nastepnie wlewa sie do 5000 czesci objetosciowych wody z lo¬ dem i ekstrahuje dwukrotnie porcjami po 25 000 czesci objetosciowych octanu etylu. Wyciag orga¬ niczny przemywa sie woda, 1% wodnym roztwo¬ rem kwasnego weglanu sodowego, ponownie woda, osusza i zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem.Pozostalosc rozpuszcza sie w 100 czesciach objeto¬ sciowych acetonu, dodaje 5000 czesci objetoscio¬ wych eteru naftowego i otrzymuje 108 czesci wa¬ gowych krystalicznego proszku, który rekrystali- zuje sie z mieszaniny acetonu i n-heksanu. Analiza elementarna dla C44H71N017 obliczono: C 59,65% H 8,08% N 1,58% znaleziono: C 59,39% - H 8,07% N 1,75% /o/D88=_61,4° /c=l% w chloroformie/ -68,6° /c=l% w etanolu/. 14 Krysztaly I Krysztaly II Uklad rozpusz¬ czalników benzen: aceton :1 4:1 3:1 :1 4:1 ' 3:1 Obje¬ tosc elue- ntu • 49,3 26 40 46,1 1 22 32 Skladnik (a-pro- pionian) B-5050-B -D -F B-5050-A -C Wy¬ daj¬ nosc g 4,0 23,5 1,0 ,8 16,2 3,3 W ten sposób otrzymane skladniki posiadaja wla¬ snosci fizykochemiczne podane ponizej. a-propionian B-5050 Temlp. topn. /°C/ /z rozfclaJdem/ rozpuszczalnik do rekry¬ stalizacji /b/d« w chloroformie Analiza elementarna /obliczono/ C H N /znaleziono/ C H N wzór sumaryczny ' -F 186—9° eter dwu- etylowy -67,0 58,79 i 7,87 1,63 58,89 8,05 1,49 C42H67 . N017 -E 179—81° eter dwu- etylowy- -n-heksan -63„9 c=l,00 59,23 1 7,98 1,61 59,14 7,81 1,59 C48H6g N017 -D 180—3° aceton -- -64,3 c=0,99 59,23 7,98 1,61 58,26 7,81 1,51 C4»H69 N017 -c IM—3° octan etylu- -n-heksan -61,3 c=l,00 59,66 8,02 1,58 59,75 8,20 1,57 ^44H7i N017 -B 140—2° eter dwu- etylowy-n- -heksan -66,3 c=l,01 60,03 8,1® 1,56 59,69 8,23 1,31 OsH^ N017 -A 198—201° eter dwu- etylowy -62,5 c=l,00 60,44 8,27 1,53 60,28 8,38 1,40 CifrHre N017 | Poszczególne skladniki reakcji odzyskuje sie w nastepujacy sposób. 4i50 ig a-propionianu B-5050, otrzymanego wyzej opisanym sposobem, rekrystalizuje sie z miesza¬ niny 500 ml acetonu oraz 1000 ml n-heksanu, otrzy¬ mujac 73,7 g krysztalów I. Lug macierzysty za¬ geszcza sie, rozpuszcza w 1,8 1 metanolu, pozosta¬ wia na pewien czas po dodaniu 1 1 wody. Otrzy¬ muje sie 159 g krysztalów II. Pozostaly lug ma¬ cierzysty ponownie zageszcza sie i pozostalosc re¬ krystalizuje z mieszaniny n-heksanu i eteru nafto¬ wego, uzyskujac 183 g proszku. 70 g krysztalów I oraz 70 g krysztalów II roz¬ puszcza sie w 300 ml benzenu i rozdziela chro¬ matograficznie na 6 kg zelu krzemionkowego (Merck, granulacja 0,05—0,2 mm) w benzenie, po czym eluuje mieszanina benzenu i octanu. 50 55 65 Wyzej opisanym sposobem, przy zastosowaniu innych czynników estryfikujacych, otrzymuje sie nastepujace zwiazki: 1. CHOctan B-5050 Czynnik estryfikujacy: chlorek acetylu Analiza elementarna dla C43H69N017 obliczono: C 59,23% H 7,98% N 1,61% znaleziono: C 58,94% H 8,04% N 1,86% /a/Da8=-62,6° /c=l% w chloroformie/ 2. a-n-maslan B-5050-- Czynnik estryfikujacy: kwas n-chloromaslowy AnaMza elementarna dla C^H^NO^ obliczono: C 60,05% H 8,18% N 1,56% znaleziono: C 60,05% H 8,15% N 1,75% / 3. a-izomaslan B-5050 Czynnik estryfikujacy: kwas i-chloromaslowy88 916 Analiza elementarna dla C45H73N017 obliczono: C 60,05% H 8,18% N 1,56% znaleziono: C 59,69% H 8,23% N 1,57% /a/D28= -62,8° /c=l% w chloroformie/ 4. a-n-walerianian B-5050 Czynnik estryfikujacy: chlorek n-waleroilu Analiza elementarna dla C46H75N017 obliczono: C 60,44% H 8,27% N 1,53% znaleziono: C 60,46% H 8,37% N 1.76% /a/D23= -59,9° /c=l% w chloroformie/ . a-i-walerianian B-5050 Czynnik estryfikujacy: chlorek i-waleroilu Analiza elementarna dla C46H75N017 obliczono: C 60,44% H 8,27% N 1,53% znaleziono: C 60,38% H 8,07% N 1,63% /a/D23= —58,0° /c=l% w chloroformie/ 6. a-octan B-5050-A Czynnik estryfikujacy: chlorek acetylu Analiza elementarna dla C45H73N017 obliczono: C 60,05% H 8,18% N 1,56% znaleziono: C 59,61% H 8,48% N 1,40% /a/D23 = —62,5° /c=l°/o w chloroformie/ 7. a-propionian B-5050-A Czynnik estryfikujacy: chlorek propionylu Analiza elementarna dla C46H75N017 obliczono: C 60,44% H 8,27% N 1,53% znaleziono: C 59,80% H 8,46% N 1,59% /a/D23 = —62,7°7c=l% w chloroformie/ 8. a-propionian B-5050-B Czynnik estryfikujacy: chlorek propionylu Analiza elementarna dla C45H73N017 obliczono: C 60,05% H 8,18% N 1,56% znaleziono: C 59,29% H 8,17% N 1,53% /a/D23 = —65,8° /c=l% w chloroformie/ 9. a-octan B-£050-A oraz -B Czynnik estryfikujacy: chlorek acetylu Analiza elementarna znaleziono: C 58,97% H 8,34% N 1,67% C 59,04% H 8,52% N 1,65% /a/D23 = —63,1° /c=l,02% w chloroformie/ . a-propionian B-5050-A oraz -B Czynnik estryfikujacy: chlorek propionylu Analiza elementarna: znaleziono: C 59,54% H 8,18% N 1,60% C 59,58% H 8,38% N 1,62% /a/D23= —61,2° /c =0,98% w chloroformie/ 11. a-propionian B-5050-C Czynnik estryfikujacy: chlorek propionylu Analiza elementarna dla C44H71N017 obliczono: C 59,66% H 8,02°(o N 1,58% znaleziono: C 59,34% H 8,23% N 1,59% /a/D23 = —60,8° /c=0,97% w chloroformie/ 12. a-octan B-5050-C Czynnik estryfikujacy: chlorek acetylu Analiza elementarna dla C43H69N017 obliczono: C 59,23% H 7,98% N.1,61% znaleziono: C 59,47% H 8,09% N 1,77%.Przyklad II. Otrzymywanie a-krotonianu B-5050. a-krotonian B-5050 otrzymuje sie sposobem, po¬ danym w przykladzie I.Analiza elementarna dla C45H71N017 obliczono: C 60,19% H 7,97% N 1,56% znaleziono: C 59,81% H 7,98% N 1,51% /a/D23= -73,l° /c=l,0% w chloroformie/ 16 Przyklad III. Otrzymywanie (3-octanu B-5050. czesci wagowych krysztalów antybiotyku B-5050 rozpuszcza sie w 30 czesciach objetosciowych ace¬ tonu i, w trakcie oziebiania lodem oraz mieszania, * dcdaje sie stopniowo 2 czesci objetosciowe bezwod¬ nika octowego. Mieszanine pozostawia sie w lodów¬ ce przez okres 17 godzin, dodaje ja do mieszaniny 500 czesci objetosciowych 3% roztworu kwasnego weglanu sodowego oraz 300 czesci objetosciowych io wody z lodem i doprowadza wartosc pH=7,5 wod¬ nym roztworem kwasnego weglanu sodowego. Mie¬ szanine te ekstrahuje sie dwukrotnie porcjami po 450 czesci objetosciowych octanu etylu, polaczone wyciagi organiczne przemywa sie woda, osusza i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Pozo¬ stalosc rozpuszcza sie w malej ilosci octanu etylu, dodaje 90 czesci objetosciowych n-heksanu i otrzy¬ muje 4,5 cze/sci wagowych. bialego krystalicznego proszku.Analiza elementarna dla C43H69N017 obliczono: C 59,23% H 7,98% N 1,61% znaleziono: C 59,01% H 8,07% N 1,67% /a/D23 = -92,2° /c=l% w chloroformie/.W ten sposób z innymi czynnikami estryfikuj a- cymi otrzymuje sie nastepujace zwiazki: 1. (3-propionian B-5050 Czynnik estryfikujacy: bezwodnik propionowy Analiza elementarna dla C44H71N017 obliczono: C 59,65% H 8,08% N 1,58% znaleziono: C 59,11% H 8,22% N 1,42% /a/D23= -87,0° /c=l% w chloroformie/ 2. (3-n-maslan B-5050 Czynnik estryfikujacy: bezwodnik n-maslowy Analiza elementarna dla C45H73N017 obliczono: C 60,05% H 8,18% N 1,56% znaleziono: C 59,89% H 8,74% N 1,40% /a/D25 = —90,9° /c=l% w chloroformie/ 3. (3-i-walerianian B-5050 Czynnik estryfikujacy: bezwodnik i-walerianowy Analiza elementarna dla C46H75N017 obliczono: C 60,44% H 8,27% N 1,53% znaleziono: * C 59,76% H 8,27% N 1,49% /a/D23 = -§9,2° /c=l% w chloroformie/ 45 4. (3-octan B-5050-A oraz -B Czynnik estryfikujacy: bezwodnik octowy Analiza elementarna znaleziono: C 58,21% H 8,07% N 1,37% C 58,42% H 8,11% N 1,50% 50 /a/D23 = -84,3° /c—1% w etanolu/ . (3-octan B-5050-A Czynnik estryfikujacy: bezwodnik octowy Analiza elementarna dla C45H73NQ17 obliczono: C 60,05% H 8,18% N 1,56% 55 znaleziono: C 59,78% H 8,32% N 1,52% /a/D24= -91,3° /c=l% w etanolu/ 6. (3-propionian B-5050-C Czynnik estryfikujacy: bezwodnik propionowy Analiza elementarna dla C44H71N017 60 Obliczono: C 59,66% H 8,02% N 1,58% znaleziono: C 58,82% H 8,81% N 1,60% C 58,85% H 8,66% N 1,95% /a/D23 = -93,5° /c=l,02% w etanolu/ 7. (3-octan B-5050-C 65 Czynnik estryfikujacy: bezwodnik octowy 4088 916 17 Analiza elementarna dla C^H^NO^ obliczono: C 59,23% H 7,98% N 1,61% znaleziono: C 58,88% H 8,12% N 1,66% /a/DM = —90,6° /c=l% w chloroformie).Przyklad IV. Otrzymywanie @-bursztynianu B-5Ó50. 0,5 czesci wagowych krysztalów antybiotyku B-5050 rozpuszcza sie w 4 czesciach objetosciowych acetonu i, w trakcie mieszania w temperaturze pokojowej, dodaje sde stopniowo 0,175 czesci wago¬ wych,bezwodnika^bursztynowego. Calosc miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu 5 godzin, od¬ parowuje pod zmniejszonym cisnieniem, pozosta¬ losc ekstrahuje sie 130 czesciami objetosciowymi octanu etylu, wyciag ten przemywa woda, osusza, zageszcza i pozostawia na pewien czas. Otrzymane krysztaly odsacza sie, przemywa octanem etylu i eterem. Otrzymuje sie 0,375 czesci wagowych krysztalu: Analiza elementarna dla C45H71N019 • CH8C0002H5 • H20 C 56,81% H 7,83% N 1,35% znaleziono: C 57,15% H 7,92% N 1,55% M/D28=-811,7° /c=l% w chloroformie/.Przyklad V. 0,9 czesci wagowych kryszta¬ lów antybiotyku B-5050 rozpuszcza sie w 5 czes¬ ciach objetosciowych pirydyny i, w trakcie ozie¬ biania lodem, dodaje sie stopniowo 0,4 czesci wa¬ gowych bezwodnika bursztynowego.Mieszanine pozostawia sie w temperaturze poko¬ jowej na przeciag 16 godzin, dodaje 200 czesci wody z lodem i ekstrahuje trzykrotnie porcjami .po 100 czesci octanu etylu. Polaczone wyciagi orga¬ niczne przemywa sie woda, osusza i zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymana pozostalosc rozpuszcza sie. w 1'0 czesciach mieszaniny octanu e- tylu i chloroformu, w stosunku 1 :1 i dodaje 100 czesci objetosciowych n-heksanu. Otrzymuje slie 0,704 czesci wagowych krystalicznego proszku, któ¬ rego dane (fizykochemiczne sa zgodne z próbka, o- trzymama w przykladzie IV.W i&n sam sposób, stosujac inny czynnik estry¬ fikujacy, otrzymuje sie: p-benzoesan B-5050 Czynnik estryfikujacy: bezwodnik benzoesowy Analiza elementarna dla C^H^NO^ obliczano: C 61,72% H 7,66% N 1,50% znaleziono: C 61,55% H 7,59% N 1„45% 18 MeOH max 230 mu /E 13600/ /a/G** 76,7° /c=l% w chloroformie/ Przyklad VI. Otrzymywanie a, |3-dwuoctanu B-5050. czesci wagowych krysztalów antybiotyku B-5050 rozpuszcza sie w 10 czesciach objetosciowych piry¬ dyny i, w trakcie mieszania w temperaturze po¬ kojowej, dodaje sie 5 czesci objetosciowych bez¬ wodnika octowego. Mieszanine pozostawia sie przez okres 15 godzin i wlewa do 300 czesci objetoscio¬ wych wody z lodem. Wytracony osad usuwa sie przez saczenie i przemywa go woda. Lug macie¬ rzysty laczy sie z woda z przemycia i ekstrahuje dwukrotnie porcjami po 200 czesci objetosciowych octanu etylu. Polaczone wyciagi organiczne prze¬ mywa sie woda, 2n wodnym roztworem kwasnego weglanu sodowego, ponownie woda, osusza i za¬ geszcza pod zmniejszonym cisnieniem. Poprzednio wytracony osad rozpuszcza sie w chlorku mety- lenu, osusza i zageszcza pod zmniejszonym cisnie¬ niem. Oba powyzsze zageszczone wyciagi laczy sie i krystalizuje z mieszaniny chlorku metylenu oraz n-heksanu, z mieszaniny acetonu oraz n-heksanu lub z mieszaniny chlorku metylenu, n-heksanu i e- io teru naftowego. Otrzymuje sie 4,65 czesci wago¬ wych zwiazku wymienionego w tytule o tempera¬ turze topnienia 127—132°C /z rozkladem/.Analiza elementarna dla C45H71N018 obliczono: C 59,13% H 7,83% N 1,50% znaleziono: C 59,25% H 7,93% N 1,49% /a/D^=-84,9° /c=l% w chloroformie/.W ten sam sposób, z innymi czynnikami estry¬ fikujacymi, otrzymuje sie nastepujace zwiazki: 1. a, (3-dwupropionian B-5050 Czynnik estryfikujacy: bezwodnik propionowy Temperatura topnienia 132°C /z rozkladem/ Analiza elementarna dla C47H75N018 obliczono: C 59,92% H 8,02% N 1,49% znaleziono: C 60,01% H 8,31% N 1,46% /a/D28=—81,7° /c=l% w chloroformie/ 2. a, P-dwukrotonian B-5050 Czynnik estryfikujacy: bezwodnik krotonowy Analiza elementarna dla C49H75N018 obliczono: C 60,92% H 7,82% H 1,45% znaleziono: C 60,55% H 7,76% N 1,41% / 3. a, P-dwu-n-maslan B-5050 Czynnik estryfikujacy: bezwodnik n-maslowy Analiza elementarna dla C49H79N018 obliczono: C 60,66% H 8,21% N 1,44% znaleziono: C 60,37% H 8,30% N 1,53% /a/D28=—74,9° /c=l% w chloroformie/ ' 4. a, 0-dwuoctan B-5050-A oraz -B Czynnik estryfikujacy: bezwodnik octowy 40 Temperatura topnienia 131—135°C /z rozkladem/ Analiza elementarna: znaleziono: C 59,01% H 8,05% N 1,58% C 59,26% H 7,91% N 1,68% /o/D28=—83,7° /c=l% w chloroformie/ 45 5. a, (3-dwupropionian B-5050-A oraz -B Czynnik estryfikujacy: bezwodnik propionowy Temperatura topnienia 104—107°C /z rozkladem/ Analiza elementarna: obliczono: C 60,09% H 8,24% N 1,45% 50 C 60,26% H 8,32% N 1,63% /a/D«8=-70l,7o /c=l% w chloroformie/ 6. a, (3-dwuoctan B-5050-A Czynnik estryfikujacy: bezwodnik octowy Analiza elementarna dla C47H75N018 55 obliczono: C 59,92% H 8,02% N 1,49% znaleziono: C 59,49% H 8,21% N 1,62% /a/D22=-77,4° /c=l% w etanolu/ 7. a, 0-dwupropionian B-5050-A Czynnik estryfikujacy: bezwodnik propionowy 60 Analiza elementarna dla C49H79N018 obliczono: C 60,66% H 8,21% N 1,44% znaleziono: C 60,58% H 8,34% N 1,51% /a/D22=-83,20 /c=l,02% w etanolu/ 8. a, 0-dwuoctan B-5050-D 65 Czynnik estryfikujacy: bezwodnik octowy88 916 19 Analiza elementarna dla C46H^N018 obliczono: C 58,53% H 7,93% N 1,51% " znaleziono: C 59,47% H 8,10% N 1,51% 9. a, 0-dwuoctan B-5050-C Czynnik estryfikujacy: bezwodnik octowy Analiza elementarna dla C45H71N018 obliczono: C 59,13% H 7,48% N 1,53% znaleziono: C 58,89% H 8,10% N 1,65% C 59,02% H 8,07% N 1,57% /«yD«8=—81,5° /c=l% w chloroformie/ . a, P-dwupropionian B-5050-C Czynnik estryfikujacy: bezwodnik propionowy , Analiza elementarna dla C47H75N018 obliczono: C 59,92% H 8,02% N 1,49% znaleziono: C 59„54% H 8,20% N 1,50% / Pr z y k l a d VII. Otrzymywanie a-acetylo-0- -monopropionianu B-5050. 6 czesci wagowych 0-propionianu B-5050 roz¬ puszcza sie w 12 czesciach objetosciowych pirydy¬ ny iw temperaturze pokojowej oraz w trakcie mieszania dodaje sie 1,5 czesci objetosciowych bez¬ wodnika octowego. Mieszanine pozostawia sie przez okres 14 godzin i wlewa do 500 czesci objetoscio¬ wych wody z lodem. Wytracony osad odsacza sie i ekstrahuje dwukrotnie porcjami po 200 czesci objetosciowych octanu etylu. Wyciag ten laczy sie z poprzednio otrzymanym osadem, zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem, dodaje 300 czesci obje¬ tosciowych n-heksanu i otrzymuje 5,45 czesci wa¬ gowych krystalicznego proszku.Analiza elementarna dla C46H75N018 obliczono: C 59,53% H 7#3% N 1,51% znaleziono: C 58,84% H 7,85% N 1,57% /a/D»=-82,3° /c=l% w chloroformie/ Przyklad VIII. Otrzymywanie a^propionylo- -P-octanu B-5050. 2 czesci wagowe a-propionianu B-5050 rozpusz¬ cza sie w 10 czesciach objetosciowych pirydyny i, w trakcie mieszania w temperaturze pokojowej, dodaje sie 5 czesci bezwodnika octowego. Miesza¬ nine pozostawia sie przez okres 15 godzin i wlewa do 300 czesci objetosciowych wody z lodem. Wy¬ tracony osad odsacza sie, przemywa woda, roz¬ puszcza w 100 czesciach objetosciowych octanu etylu, osusza, zageszcza pod zmniejszonym cisnie¬ niem i dodaje eteru naftowego. Otrzymuje sie 1,8 czesci wagowych krystalicznego proszku.Analiza elementarna dla C4«H78N018 obliczono: C 59,53% H 7,93% N 1,51% znaleziono: C 59,58% H 7,92% N 1,51% i /o/D»=-82,8° /c=l% w chloroformie/ Przyklad IX. Otrzymywanie 0-octanu cztero¬ wodoro-B-5050.Otrzymywanie czterowodoro-B-5050. 40 g krysztalów antybiotyku B-5050 rozpuszcza sie w 400 ml etanolu i poddaje redukcji w obec¬ nosci 12 g katalizatora, zawierajacego 10% palladu osadzonego na weglu /firmy Enjgelhard/. W trakcie katalitycznej redukcji okolo 2M wodoru zostaje zaabsorbowane w ciagu 7 godzin. Mieszanine re¬ akcyjna saczy sie, zageszcza pod zmniejszonym 40 45 50 55 65 cisnieniem, dodaje n-heksanu i otrzymuje 36,6 g krysztalów.Analiza elementarna dla C41H71NOi6 obliczono: C 59,05% H 8,58% N 1,68% znaleziono: C 58,88% H 8,72% N 1,60% /a/D28=—57,0° /c=l% w chloroformie/. 0,2 czesci wagowych czterowodoro-B-5050 roz¬ puszcza sie w 1„2 czesci objetosciowych acetonu i w temperaturze 0°C oraz w trakcie mieszania, dodaje sie 0,1 czesci objetosciowych bezwodnika octowego. Mieszanine pozostawia sie w temperatu¬ rze 0°C w ciagu 18 godzin, po czym wlewa do 50 czesci objetosciowych wody 'z lodem. Po do¬ prowadzeniu do wartosci pH=8 wodnym 5% roz¬ tworem kwasnego weglanu sodowego, mieszanine ekstrahuje sie dwukrotnie porcjami po 20 czesci objetosciowych octanu etylu. Polaczone wyciagi organiczne przemywa woda, osusza i zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem. Do pozostalosci dodaje sie n-heksanu i otrzymuje 0,161 czesci wagowych zwiazku, podanego w tytule, w postaci proszku.Analiza elementarna dla C48HwN018 obliczono: C 58,97% H 8,34% N 1,60% znaleziono: C 58,62% H 8,34% N 1,59% C 58,57% H 8,46% ,N 1,53% /a/D* = -68,2° /c=l%'w etanolu/.W ten sam sposób stosujac inny czynnik estry¬ fikujacy otrzymuje sie p^propionian czterowodoro- -iB-5050.Czynnik estryfikujacy: bezwodnik propionowy Analiza elementarna dla C44H75N017 obliczono: C 59,37% H 8,49% N 1,37% znaleziono: C 59,48% H 8,59% N 1,39% /a/D**=-76,2° /c=l% w etanolu/.Przyklad X. ro-B-5050. czesci wagowych czterowodoro-B-5050 rozpusz¬ cza sie w 20 czesciach objetosciowych pirydyny i w temperaturze 0°C oraz w trakcie mieszania dodaje sie 2 czesci objetosciowe chlorku propio- nylu. Mieszanine pozostawia sie przez okres 2 go¬ dzin, po czym wlewa do 500 czesci objetosciowych wody z lodem. Calosc ekstrahuje sie dwukrotnie porcjami po 250 czesci objetosciowych octanu ety¬ lu. Polaczone wyciagi organiczne przemywa woda, % wodnym roztworem kwasnego weglanu sodo¬ wego oraz ponownie woda, osusza i zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem.Do pozostalosci tej dodaje sie mieszanine n-he¬ ksanu i eteru naftowego i otrzymuje 3 czesci wa¬ gowe zwiazku wymienionego w tytule.Analiza elementarna dla C47H7^N018 obliczono: C 59,66% H 8,42% N 1,45% znaleziono: C 58,96% H 8,40% N 1,82% /a/D»=-53,5° /c=l% w chloroformie/ W ten sam sposób, stosujac inny czynnik estry¬ fikujacy, otrzymuje sie a, ydwu-n-maslan cztero¬ wodoro-B-5050.Czynnik estryfikujacy: kwas n-chloromaslowy Analiza elementarna dla C49H88N018 obliczono: C 60,44% H 8,59% N 1,44% znaleziono: C 60,62% H 8,4i9% N 1,50% /a/D88=-52,9° /c=l% w chloroformie/.88 916 21 Przyklad XI. a, (3, y-trójoctan czterowodoro- -B-5050. 8 czesci wagowych czterowodoro-B-5050 rozpusz¬ cza sie w 30 czesciach objetosciowych pirydyny i, w trakcie mieszania w temperaturze pokojowej, dodaje sie 15 czesci objetosciowych bezwodnika octowego. Mieszanine pozostawia sie przez okres godzin, po czym wlewa do 800 czesci objeto¬ sciowych wody z lodem. Calosc ekstrahuje sie dwu¬ krotnie porcjami po 270 czesci octanu etylu. Po¬ laczone wyciagi organiczne przemywa woda, 5% wodnym roztworem kwasnego weglanu sodowego, ponownie woda, osusza i zageszcza pod zmniejszo¬ nym cisnieniem do objetosci okolo 200 czesci. Do pozostalosci tej dodaje sie 8 czesci wagowych aktywowanego wegla, ogrzewa do temperatury u- miarkowanej, saczy i przesacz zageszcza.Do pozostalosci tej dodaje sie mieszanine chlor¬ ku metylenu i n-heksanu i otrzymuje 4,2 czesci wagowych wytwarzanego produktu w postaci bez¬ barwnych plytek. Po dodaniu do lugów macierzys¬ tych eteru naftowego otrzymuje sie dalsze 2,5 cze¬ sci wagowych tego produktu.Temperatura topnienia 110—113°C /z rozkladem/.Analiza elementarna dla C4-/H77N019 obliczono: C 58,80% H 8,08% N 1,46% znaleziono: C 58,33% H 8,08% N 1,49%^ /a/D*=-76,3° /c=l% w chloroformie/. fikujacy, otrzymuje sie a, |3, y-trójpropionian czte¬ rowodoro-B-5050, którego temperatura topnienia wynosi 118—122°C /z rozkladem/.Czynnik estryfikujacy: bezwodnik propionowy Analiza elementarna dla C5tfH8^N019 obliczono: C 59,92% H 8,35% N 1,40% znaleziono: C 60,24% H 8,54% N 1,35% /a/D*»=—70,1° /c=l% w chloroformie/.Przyklad XII. Otrzymywanie a, P, ytrój- propionianu czterowodoro-B-5050.Jedna czesc wagowa |3-propionianu czterowodoro- -B-5050 rozpuszcza sie w 4 czesciach objetoscio¬ wych pirydyny i, w trakcie oziejbiania woda z lo¬ dem, dodaje sie kroplami 1 czesc objetosciowa bez¬ wodnika propipnoTtfego. Mieszanine 'pozostawia sie w temperaturze pokojowej przez okres 20 godzin, po czym wlewa do 150 czesci objetosciowych wody z lodem. Wytracony osad odsacza sie, przemywa woda, suszy i otrzymuje 1,04 czesci wagowych zwiazku, wymienionego w tytule.Analiza elementarna dla C5(jH.djNOig obliczono: C 59,92% H 9,35% N 1,40% znaleziono: C 59,66% H 8,42% N 1,51% /a/D&= — 12,l° /c=l% w chloroformie/.Przyklad XIII. Otrzymywanie a, P, Y-trój- octanu czterowodoro-B-5050.Otrzymywanie "a, 0-dwuestrów czterowodoro- -B-5050. 1,9 g a, P-dwupropionian-B-5050 rozpuszcza sie w 60 ml etanolu i dodaje 600 mg katalizatora, zawierajacego 10% palladu osadzonego na weglu.Podczas katalitycznej redukcji okolo 2M wodoru zostaje absorbowane w ciagu okolo 7 godzin. Mie¬ szanine reakcyjna saczy sie, przesacz odparowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, pozosta- 22 losc rozpuszcza w malej ilosci acetonu, dodaje -fcrotna objetosc n-heksanu i zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymuje sie 1,53 g a, P-dwupropionian-czterowodoro-B-5050.Analiza elementarna dla C4^H79N018 obliczono: C 59,68% H 8,36% N 1,48% znaleziono: C 59,98% H 8,88% N 1,86% /a/D* 77,2° /c=0,99% w etanolu/. . , W podobny sposób otrzymuje sie inne a, 0-dwu- estry czterowodoro-B-5050. 0,3 czesci wagowych a, 0-dwuoctanu czterowodo¬ ro-B-5050 rozpuszcza sie w 3 czesciach objetoscio¬ wych pirydyny i, w trakcie oziebiania woda z lo¬ dem, dodaje sie kroplami 0,3 czesci objetoscio-, wych bezwodnika octowego. Mieszanine pozosta¬ wia sie w temperaturze pokojowej przez okres godzin, po czyim wlewa do 80 czesci objetoscio¬ wych wody z lodem. Wytracony osad odsacza sie, przemywa woda, suszy i otrzymuje 0,25 czesci wa¬ gowych zwiazku wymienionego w tytule.Analiza elementarna dla CA1H17T^019 obliczono: C 58,80% H 8,08% N 1,46% znaleziono: C 58,45% H 8,26% N 1,43% /a/D28=—74,9° /c=l% w chloroformie/.W ten sam sposób otrzymuje sie a," 0, y-trój- octan czterowodoro-B-5050 przez estryfikacje a, 0- -dwuoctanu czterowodoro^B-5050.Przyklad XIV. a, (3, a-trójpropionian cztero- wodoro-B-5050.Otrzymywanie a-estrów czterowodoro-B-5050. 900 mg a-propionianu-©-5050 rozpuszcza sie w 40 ml etanolu i dodaje 300 mg katalizatora, za¬ wierajacego 10% palladu osadzonego na weglu (fir- my Merck). Podczas katalitycznej redukcji 2 M wo¬ doru jest absorbowane w ciagu okolo 8 godzin.Mieszanine reakcyjna saczy sie, przesacz zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem, pozostalosc rozpusz¬ cza w benzenie, dodaje n-heksanu i otrzymuje 40 465 mg a-propionianu-czterowodoro-B-5050 w po¬ staci proszku.Analiza elementarna dla C44H75iN017 obliczono: C 59,37% H 8,49% N 1,58% znaleziono: C 59,05% H 8,57% N 1,55% 45 /a/D28=-64,4° /c=l% w etanolu/.W ten sam sposób otrzymuje sie inne a-esttry czterowodoro-B-5050. a-estry czterowodoro^B-5050 mozna takze otrzymac w nastepujacy sposób: 900 mg a-propionianu-B-;5050 rozpuszcza sie w 40 ml etanolu i redukuje katalitycznie wodorem w obecnosci 90 mg tlenku platyny. W sposobie tym 2M wodoru sa absorbowane w czasie okolo ,5 godziny.Mieszanine reakcyjna saczy sie, przesacz odpa¬ rowuje pod zmniejszonym cisnieniem, pozostalosc rozpuszcza w malej ilosci eteru i dodaje n-heksa¬ nu. Otrzymuje sie 547 mg a-propionian-czterowo- 60 doro-B-5050 w postaci proszku. 0,3 czesci wagowych a-propionianu czterowodoro¬ -B-5050 rozpuszcza sie w 2 czesciach objetoscio¬ wych pirydyny i, w trakcie oziebiania lodem oraz mieszania, dodaje sie kroplami 0,3 czesci objeto- 65 sciowych bezwodnika propionowego. Mieszanine po- 50 5588 916 23 zostawia sie w temperaturze pokojowej przez okres godzin, po -czym wlewa do 100 czesci objeto¬ sciowych wody z lodem. Wytracony osad odsacza sie, przemywa woda, suszy i otrzymuje 0,25 czesci wagowych zwiazku, wymienionego w tytule w po¬ staci proszku. Wartosc RF chromatografia cienko¬ warstwowa na zelu krzemionkowym oraz inne wla¬ snosci tego zwiazku sa zgodne z danymi dla zwiaz¬ ku, otrzymywanego w przykladzie XI.Przyklad XV. Otrzymywanie a, (3-dwupro- pionianu czterowodoro-B-5050. czesci wagowych a-propionianu czterowodoro- -B-5050 rozpuszcza sie w 30 czesciach objetoscio¬ wych acetonu i, w trakcie oziebiania lodem, do¬ daje sie 'kroplami 2 czesci objetosciowe bezwod¬ nika protonowego. Mieszanine pozostawia sie w lodówce przez okres 18 godzin, po czym wlewa do 100 czesci objetosciowych 2% wodnego roztworu kwasnego weglanu sodowego. Wytracony osad eks¬ trahuje sie dwukrotnie octanem etylu, przemywa, osusza i zageszcza ipod zmniejszonym cisnieniem.Pozostalosc o konsystencji syropu zadaje sie 200 czesciami objetosciowymi n-heksanu i otrzy¬ muje 4,6 czesci wagowych zwiazku, wymienionego w tytule, w postaci bialego proszku.Analiza elementarna dla C47H7^N18 obliczono; C 59,66% H 8,42% N 1,45% znaleziono: C 59,38% H 8,29% N 1,36% /a/Ds8=—78,5° /c=l% w chloroformie/.Przyklad XVI. Otrzymywanie a, y-dwupro- pionianu czterowodoro-B-5050. 3 czesci wagowe a-propionianu czterowodoro- -B-5050 rozpuszcza sie w 15 czesciach objetoscio¬ wych pirydyny i, w trakcie oziebiania lodem, do¬ daje sie 1 czesc objetosciowa chlorku propionylu, po czym miesza sie w ciagu 2 godzin. iMieszanine reakcyjna wlewa sie do 300 czesci objetosciowych wody z lodem x ekstrahuje dwu¬ krotnie porcjami po 300 czesci objetosciowych octanu etylu. Polaczone wyciagi organiczne prze¬ mywa sie dwukrotnie 5% wodnym roztworem kwasnego weglanu sodowego, woda, osusza i za¬ geszcza pod zmniejszonym cisnieniem. Nastepnie dodaje sie do pozostalosci n-heksanu i otrzymuje 2,4 czesci wagowe zwiazku, wymienionego w ty¬ tule, w postaci proszku.Analiza elementarna dla C4TH7gN018 obliczono: C 59,86% H 8,42% N 1,45% znaleziono: C 59,41% H 8,53% N 1,47% /a/D28=—54,7° /c=l% w chloroformie/. PL