Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania peptydów zawierajacych cystyne oraz ich pochod¬ nych zawierajacych cysteine fragmentów peptydo- wych.W przyrodzie wystepuja rozmaite peptydy zawie¬ rajace cystyne, w których dwusiarczkowy mostek cystyny znajduje sie w pierscieniu takie, jak np. oksytocyna, wazopresyna, wazotocyna, izotocyna, mezotocyna, hormon wzrostowy, tyrokalcytonina, insulina. Z drugiej strony jednak dwusiarczkowy mostek cystyny moze równiez laczyc ze soba pro¬ stoliniowe aminokwasy, jak to ma miejsce np. dla obu mostków dwusiarczkowtych miedzy lancuchami A i B insuliny albo glutationu.Znane sa obecnie rózne metody syntezy takich peptydów zawierajacych mostki, dwusiarczkowe.Oprócz peptydów naturalnych z mostkami dwu¬ siarczkowymi obecnie zsyntezowano juz wieksza liczbe aktywnych analogów, np. dezamino-oksyto- cyne, Ser4-oksytocyne, Asn4-oksytocyne, Val8-oksy- tocyne, Tyr2-/0-metylo/-oksytocyne, Phe2-Arg8-wa- zopresyne, Ph2-Lys8-wazopresyne, Ph2^Orn8-wazo- presyne, Ile3-Arg8-wazopresyne, Asn4-Lys8-wazopre- syne.Zgodnie ze znanymi metodami wytwarzania most¬ ka dwusiarczkowego najpierw z zawierajacego obie przeznaczone do polaczenia reszty cysteinowe frag¬ mentu peptydowego o okreslonej sekwencji amino¬ kwasów, .w których grupy merkapto zabezpieczone sa np. grupami karbobenzoksylowymi, benzylowy- mi albo tritylowymi, odszczepia sie te grupy — oslaniajace, a wiec: grupe benzylowa np. sodem w cieklym amoniaku, tritylowa np. octanem olowia¬ nym i siarkowodorem ialbo 10%-owym kwasem sol¬ nym, a nastepnie peptyd z wolnymi grupami mer- kapto utlenia sie do dwusiarczku, np. za pomoca 1,2-dwujodoetanu albo tlenu. Opisany sposób po¬ siada te wade, ze wspomniane metody odszczepLa¬ nia grup ochronnych powoduja reakcje uboczne, zwlaszcza w przypadku bardziej wrazliwych pepty¬ dów, co z kolei powoduje obnizenie wydajnosci.Obecnie stwierdzono, ze peptydy zawierajace cy¬ styne oraz ich pochodne mozna wytwarzac w spo¬ sób prostszy i z duzo wieksza wydajnoscia.Sposobem wedlug wynalazku peptydy zawierajace cystyne oraz ich pochodne wytwarza sie z zawie¬ rajacych cysteine fragmentów peptydowych, w któ¬ rych grupy merkapto zabezpieczone sa grupami tri¬ tylowymi, jesli fragment peptydu zawierajacy dwie reszty cysteiny lub fragmenty peptydowe, z któ¬ rych kazdy zawiera reszte cysteiny traktuje sie jodem w rozpuszczalniku organicznym, w którym jod i peptyd przynajmniej czesciowo rozpuszczaja sie.Reakcje prowadzi sie w temperaturze 0—60°C, korzystnie w temperaturze pokojowej. Reakcje pro¬ wadzi sie korzystnie w rozpuszczalniku w którym jod i peptyd sa co najmniej czesciowo rozpuszczal¬ ne, korzystnie w alkoholu takim, jak np. nizszy alkanol, np. etanol albo zwlaszcza metanol albo w 88 87688 876 mieszaninie alkoholu z innym rozpuszczalnikiem organicznym, w którym peptyd jest rozpuszczalny, takim jak, octan etylu, dwumetyloformamid, chlo¬ rek metylenu albo lodowaty kwas octowy. Reakcje prowadzi sie celowo przy stalym nadmiarze jodu, np. w roztworze rozcienczonym, przy wprowadzeniu roztworu peptydu do roztworu jodu. W ten sposób otrzymuje sie wylacznie zadany monomer. Na¬ tomiast przy odwrotnym postepowaniu, tj. np. wkraplaniu roztworu jodu do roztworu peptydu, otrzymuje sie znaczna ilosc polimeru. Z otrzyma¬ nego roztworu nadmiar jodu mozna usuniac, np. tiosiarczanem.Grupy cysteinowe chronione grupami tritylowymi po odszczepieniu grup tritylowych i utworzeniu mostka dwusiarezkowego przeprowadza sie bez¬ posrednio w grupy cystynowe.W reakcji tej jako produkty wyjsciowe stosuje sie-peptydy, w których wolne grupy aminowe-zo¬ staly celowo zabezpieczone. W razie potrzeby mozna równiez zabezpieczac wolne grupy wodorotlenowe i karboksylowe. Jako grupy ochronne dla grupy ami¬ nowej mozna stosowac np. grupe benzylowa, trój- fluorometylowa, ftaliilowa, p-toluenosulfonylowa albo przede wszystkim grupy wywodzace sie z kwa¬ su weglowego, jak ewentualnie grupy karbobenzo- ksylowe podstawione w reszcie aromatycznej ato¬ mami chlorowca, grupami niskoalkilowymi, albo niskoalkoksylowymi lub niskokarboaJkoksylowymi, barwnik grupy benzylooksykarbonylowe, jak p-fe- nyloazobenzylooksykarbonyl i p-/-p'-metoksy-feny- loazo/benzylooksykarbonyl, tolilooksykarhonyl, 2- -fenylo-izopropylooksykarbonyl, 2-tolilo-izopropylo- oksykarbonyl, a przede wszystkim 2-p-dwufenylo- izopropylooksykarbonyl, /francuski opis patentowy nr 1 554 051/, nastepnie alifatyczne grupy oksykar- bonylowe, jak np. alliloksykarbonyr, cyklopent-ylo- oksykarbonyl, trzeciorzedowy anylooksykarbonyl, adamantylooksykarbonyl i przede wszystkim trze¬ ciorzedowa butylooksykarbonyl.Grupy karboksylowe mozna ewentualnie zabez¬ pieczyc np. przez amidowanie albo przez estry.fi- kacje. Jako estry mozna wymienic np. metanolo¬ we, etanolowe, estry benzylowe, p-metoksybenzylo- we, estry 2,4,5-trójchlorofenolu, estry N-hydroksy- imidu kwasu bursztynowego, N-hydroksyftaloimi- du, albo przede wszystkim estry III-rzed. butanolu.Grupy wodorotlenowe np. seryny albo tyrozyny mozna zabezpieczac, np. przez estryfikacje, np. al¬ koholem benzylowym albo korzystnie III-rzed.-bu¬ tanolem. W resztach argininy grupa gwanidynowa moze byc zabezpieczona, np. grupa tozylowa. Te peptydy dwusiarczkowe wytworzone sposobem we¬ dlug wynalazku, które zawieraja grupy ochronne mozna stosowac bezposrednio do syntezy pepty- dów o dluzszym lancuchu aminokwasowym albo, jesli to jest pozadane, mozna grupy ochronne od- szczepiac w znany sposób za pomoca hydrolizy lub wodorolizy.Peptydy zawierajace cysteine albo ich pochodne sa znane albo tez mozna je wytwarzac znanymi metodami. Nazwa „pochodne peptydów" oznacza w szczególnosci w których grupy funkcyjne, np. jak np. grupy aminowe, karboksylowe, wodorotlenowe, zaopatrzone zostaly w wyzej wymienione ulb inne stosowane w syntezie peptydów grupy ochronne, dalej zwiazki zawierajace zamiast jednej lub obu przeznaczonych do polaczenia reszt cysternowych — reszty dezaminocysteinowe.Wynalazek ilustruja ale nie ograniczaja nizej po¬ dane przyklady, w których temperature podano w stopniach Celsjusza. W chromatografii cienkowar¬ stwowej stosowano nastepujace uklady: Uklad 43C: trzeciorzedowy alkohol amylowy — izopropanol-woda /100:40:10/ Uklad 43C: trzeciorzedowy alkohol amylowy, izo¬ propanol-woda 751:21:28/ Uklad 45: trzeciorzedowy butanol — 3°/o-owy wodny roztwór amoniaku /70:30/ Uklad 52: n-butanol — lodowaty kwas octowy — woda /75:7,5:21/ Uklad 53: n-butanol — kwas mrówkowy — woda /60:'0,75:39/ Uklad 70: octan etylu — pirydyna — woda /40:20:40/ Uklad 101: n-butanol — pirydyna — lodowaty kwas octowy — woda /38:24:8:30/ Uklad 102B: octan etylu — metyloetyloketon — lodowaty kwas octowy — woda /50:30:10:!0/ Uklad 121A: izopropanol — amoniak /26%/ — woda /85:5:1W W dalszym ciagu opisu stosuje sie nastepujace skróty: BOC oznacza trzeciorzedowy butylooksykar¬ bonyl. TRI oznacza trityl. iW przykladzie I opisa¬ no wytwarzanie zabezpieczonego . N-koncowego fragmentu o sekwencji 1—£ tyrokalcytoniny z piers¬ cieniem dwusiarczkowym, przyklady II i VIII przedstawiaja sposób wytwarzania wiazania dwu¬ siarezkowego miedzy zabezpieczonym fragmentem o sekwencji 20—21 lancucha A i zabezpieczonym fragmentem o sekwencji 18^21 lancucha B insuli¬ ny. Przyklady III, VII i IX podaja wytwarzanie 40 zabezpieczonych dimerów peptydowych z mostkiem dwusiarczkowym; w przykladach IV—VI opisano * wytwarzanie nowym sposobem oksytocyny, Lys8- -wazopresyny i Ph2-, Lys8-wazopresyny.Przyklad I. Sposób wytwarzania peptydu o wzorze 1. Do roztworu 3,73 g /14,78 mM/ jodu w 500 ml metanolu w czasie*mieszania w temperaturze pokojowej wkrapla sie w ciagu 45 minut, 2,50 g /l,478 mM/ BOC-Cys/TRI/-1Ser-/tBu/-Asn-Leu-Ser- Kn .-/tBu/-Thr/tBu/-Cys/TRI/-Val-Leu-OH w 50 ml me- 50 tanolu. Po skonczonym wkraplaniu miesza sie dalej w ciagu godziny i odbarwia roztwór w temperatu¬ rze 0° 26,05 ml wodnego 1 n roztworu tiosiarczanu.Przezroczysty roztwór zageszcza sie w temperaturze 55 30° do objetosci okolo 100 ml pod zmniejszonym cisnieniem, po czym dodaje 1,5 litra wody, wytra¬ cony produkt odsacza i przemywa woda. Po wy¬ suszeniu ponad stalym wodorotlenkiem potasowym surowy produkt wazy 2,32 g. Produkt ten uciera 60 sie dwukrotnie z eterem naftowym i w celu oczysz¬ czenia poddaje rozdzialowi przeciwpradowemu w ukladzie metanol-bufor-chloroform-czterochlorek wegla /l0:3:5:4/. [Jako bufor stosuje sie 28,6 ml lodowatego kwasu octowego, 19,25 g octanu amo- 65 nowego, dopelnione woda do 1 litra]. Po 135 prze-S8 876 6 niesieniach produkt glówny znajduje sie we frak¬ cjach 39—68 /rmax=53, K = 0,65/. Frakcje te odparo¬ wuje sie lacznie w wysokiej prózni do suchosci i usuwa octan za pomoca sublimacji. Otrzymuje sie 1,49 g peptydu o wzorze 1 co stanowi 83°/o wydaj¬ nosci teoretycznej. Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krzemionkowym wykazuje jednorodnosc wytworzonego produktu Rf45=0,42; Rf12lA= 0,70; Rf70= 0,75; Rf5l =0,43; Rf43A= 0,22 /a/D23=—16 /c= 2 w chloroformie/. Zabezpieczony nonapeptyd, uzyty jako produkt wyjsciowy, mozna równiez wytwarzac sposobem podanym ponizej: 1/ H-Thr/tBu/-OMe. 12,92 g /40 mM/ Z-Thr /tBu/-OMe w 200 ml lodowatego kwasu octowego uwodornia sie w temperaturze pokojowej wobec 3 g 10% palladu osadzonego na weglu. Pochlania¬ nie wodoru zostaje zakonczone po uplywie 1 go¬ dziny. Roztwór odsacza sie od katalizatora i odpa¬ rowuje w temperaturze 35°C pod zmniejszonym cisnieniem. Po wysuszeniu w wysokiej prózni w temperaturze 35°C otrzymuje sie 7,3 g oleju. Chro- matogram cienkowarstwowy wykazuje jednorodnosc otrzymanego produktu. Produkt ten bezposrednio stosuje sie do dalszych reakcji. 2/ DPC-Ser/tBu/-Thr/tBu/-OMe. 19,3 g /38,8 mM/ soli cykloheksyloaminowej DPC-Ser /tBu/-OH, roz¬ puszcza sie w 500 ml chloroformu i w temperaturze 0°C trzykrotnie wytrzasa sie z 25 ml 1-n kwasu cytrynowego i pieciokrotnie l 40 ml pólnasyconego roztworu soli kuchennej. Roztwór suszy siarcza¬ nem sodowym a nastepnie odparowuje przy czym otrzymana piane zalewa 250 ml octanu etylowego.Dodaje sie 5,36 ml /38,6 mM/ trójetyloaminy, roz¬ twór oziebia do —10°C i mieszajac zadaje go 5,13 ml /38,6 mM/ chloroweglanu izobutylowego. Miesza sie w ciagu 10 minut w temperaturze —10°C i na¬ stepnie wkrapla oziebiony do —12°C roztwór 7,3 g /38,i6 miM/ H-Thr/tBu/-OMe w 100 ml octanu etylu w taki sposób, zeby temperatura podczas reakcji ani na chwile nie wzrosla ponad —il0°C. Po skon¬ czonym wkraplaniu miesza sie jeszcze w ciagu go¬ dziny w temperaturze —10°C, a nastepnie w tem¬ peraturze pokojowej pozostawia na noc. Roztwór odsacza sie od wydzielonego chlorowodorku trój¬ etyloaminy, po czym w temperaturze 0°C przemywa sie go trzykrotnie 20 ml porcjami 1-n kwasu cy¬ trynowego i pieciokrotnie, nasyconym roztworem chlorku sodowego, suszy i odparowuje. Otrzymuje sie 22,07 g produktu surowego w postaci oleju. W celu oczyszczenia, 1 g otrzymanego oleju chroma- tografuje sie na kolumnie o wymiarze 2,5cmX30cm wypelnionej zelem krzemionkowym. Do eluowania stosuje sie mieszanine: eter naftowy — octan etylu /1:1/, po odcieku wstepnym o objetosci 110 ml eluuje sie 787 mg produktu czystego. Chromatogram cien¬ kowarstwowy na zelu krzemionkowym w ukladzie toluen — aceton /7:3/ wykazuje Rf 0,51. 3/ Z-Val-Leu-OMe. 19,9 g /HO mM/ chlorowo¬ dorku H-Leu-OMe rozpuszcza sie w 120 ml dwu- metykyformamidu i do otrzymanego roztworu w temperaturze 0°C dodaje sie l4y6 ml /105 mM/ trój¬ etyloaminy. Wydzielony chlorowodorek trójetylo¬ aminy odsacza sie, przesacz wprowadza do roztworu ,1 g AOO mM/ Z-Val-OH w 200 ml dwumetylo- formamidu /0°C/, po czym do otrzymanego roztwo¬ ru dodaje sie 22,6 g /HO mM/ suchego dwucyklo¬ heksylokarbodwuimidu. Po mieszaniu w ciagu 1 godziny w temperaturze 0°C i pozostawieniu przez noc w chlodni saczy sie i przesacz odparowuje w wysokiej prózni w temperaturze 40°C. Oleista po¬ zostalosc rozpuszcza sie w 30 ml octanu etylowego roztwór oziebia do 0°C i odsacza od wydzielonego dwucykloheksylo mocznika. Po dodaniu n-heksanu produkt krystalizuje z przesaczu w ciagu kilku- nastu godzin: Otrzymuje sie produkt o temperaturze topnienia 102—105QC /a/D20:—41° /c=2,88 w meta¬ nolu/. Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krzemionkowym w ukladzie chloroform — metanol /98:2/ wykazuje Rf=0,55; a w ukladzie toluen — aceton /7:3/; Rf=0,60. 4/ DPC-iSer/tBu/Thr/tBu/-NH-NH2.4,253 g /7,4 mM/ DPC-Ser/tBu/-Thr/tBu/-OMe w 18 ml meta¬ nolu zadaje sie 5,55 ml /okolo 110 mM/ wódziami hydrazyny i pozostawia na okres 10 godzin w tem- peraturze pokojowej, po czym w ciagu 2 godzin utrzymuje sie w temperaturze 40°C. Nastepnie mieszanine reakcyjna zalewa sie 450 ml octanu, etylowego i czterokrotnie przemywa pólnasyconym roztworem soli kuchennej, suszy siarczanem sodo- wym, zageszcza do objetosci okolo 15 ml i zadaje okolo 5 ml eteru naftowego. W ciagu kilkunastu godzin wykrystalizowuje 3,17 g hydrazydu o tem¬ peraturze topnienia 132—134°C.Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krze- mionkowym w ukladzie toluen — aceton /7:3/ wy¬ kazuje Rf=0,40./ Chlorowodorek H-Val-Leu-OMe. 5,66 g /15 mM/ Z-Val-Leu-OMe uwodornia sie w temperaturze po¬ kojowej w 75 ml metanolu w obecnosci 15 miM kwasu solnego i 850 mg palladu osadzonego na weglu /10°/o/. Pochlanianie wodoru ustaje po uply¬ wie 3 godzin. Roztwór odsacza sie od katalizatora i przesacz zageszcza do objetosci okolo 15 ml. W wyniku dodania eteru produkt wydziela sie w po- 40 staci krystalicznej. Temperatura topnienia 136— —139°C. Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krzemionkowym w ukladzie chloroform — metanol /9:1/ wykazuje Rf=0,45; w ukladzie toluen — ace¬ ton /l:l/ Rf=0,43. 45 6/ TRI-Cys/TRI/-Val-Leu-OMe. 7,13 g /10 mM/ soli dwuetyloaminowej TRI-Cys/TRI/-OH w chlo¬ roformie w temperaturze 0°C przemywa sie 1-n kwasem cytrynowym i pólnasyconym roztworem soli kuchennej. Przemyty roztwór suszy, odparo- 50 wuje, a wytworzona piane rozpuszcza w 50 ml octanu.etylowego. W miedzyczasie przygotowuje sie ' roztwór 3,22 g /10 mM/ chlorowodorku H-Val-Leu- -OMe w 40 ml octanu etylowego, roztwór ten za¬ daje sie 1,4 ml /10 mM/ trójetyloaminy, odsacza 55 wydzielony chlorowodorek trójetyloaminy, a prze¬ sacz w temperaturze 0°C wprowadza do powyzej sporzadzonego roztworu octanowego zawierajacego drugi fragment peptydu. Nastepnie do mieszaniny reakcyjnej w temperaturze 0°C dodaje sie 2,26 g 6iS /U mM/ suchego dwucykloheksylokarbodwuimidu, miesza \w ciagu 2,5 godziny w temperaturze 0°C i pozostawia na okres kilkunastu godzin w chlodni.Wydzielony dwucykloheksylomocznik odsacza sie, przesacz przemywa w temperaturze 0°C 1 n kwa- 65 sem cytrynowym, 1 n wodoroweglanem sodu i pól-7 88 876 8 nasyconym -roztworem soli kuchennej, po czym suszy siarczanem sodu. Roztwór zageszcza sie do objetosci okolo 20 ml, oziebia do 0°C i odsacza od dalszych ilosci wydzielonego dwucykloheksylomocz- nika. Po odparowaniu do sucha otrzymuje sie 8,53 g estru. W celu oczyszczenia chromatografuje sie surowy produkt na kolumnie /5 cm; 55 cm/ wypelnionej zelem krzemionkowym. Po odcieku wstepnym; 400 ml produkt glówny eluuje sie w stanie czystym 300 ml ukladu eter naftowy — octan etylu /1:1/, chromatogram cienkowarstwowy na zelu krzemionkowym w ukladzie chloroform — metanol /99:lAwykazuje Rf=0,43. 7/ H-Cys/TRI/-Val-Leu-OMe. 11,08 g /13,3 mM/ TRI-Cys/TRI/-Val-Leu-OMe rozpuszcza sie w 75 ml octanu etylowego i . do otrzymanego roztworu wkrapla 12,3 ml wody, w ten sposób aby roztwór byl stale przezroczysty. Po mieszaniu w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej do przezroczy¬ stego roztworu dodaje sie 64 ml wody, osad odsacza i przemywa zimnym 50% kwasem octowym. Prze¬ sacz zageszcza sie w wysokiej prózni w tempera¬ turze 40°C do postaci oleju,' który rozpuszcza sie w 2§0 ml octanu etylowego iw temperaturze 0°C przemywa roztworem 1 n wodoroweglanu sodowe¬ go i nasyconym roztworem soli kuchennej. Po wy¬ suszeniu siarczanem sodowym rozpuszczalnik odpa¬ rowuje sie, otrzymujac 7,07 g bialego produktu.Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krzemion¬ kowym w ukladzie chloroform- — metanol /i98:2/ przy spryskaniu odczynnikiem Reindel-Hoppego wykazuje plame o wartosci Rf=0,30. 8/ DPC-Ser/tBu/-Thr/tiBu/-Cys/TRI/-Val-Leu-OMe.^ Do 13,6 g /23,8 miM/ DPC-Ser/tBu/-Thr/tBu/-NH2 w 220 ml dwumetyloformamidu dodaje sie w tem¬ peraturze ^12GC 32,26 ml kwasu solnego w octanie etylowym /1,84-n, 59,25 mM/ i 3,26. ml /28,i55 mM/ trzeciorzedowego butylowego azotynu. Po uplywie minut w temperaturze —10°C dodaje sie ozie¬ biony do —10°C roztwór 14,03 g /23,8 mM/ H-Cys- /TRI/-Val-Leu-OMe i 8,315 ml /59,25 mM/ trójety- loaminy w 100 ml dwumetyloformamidu w taki sposób zeby temperatura mieszaniny reakcyjnej ani przez chwile nie przekraczala —9°C. Nastepnie mie¬ sza sie jeszcze w ciagu godziny w temperaturze —10°C, po czym pozostawia sie na okres kilkuna¬ stu godzin- w temperaturze pokojowej. Wydzielony chlorowodorek trójetyloaminy odsacza sie, przesacz zageszcza w wysokiej prózni w temperaturze 40°C, a oleista pozostalosc rozpuszcza w 500 ml octanu etylowego, przemywa 1 n kwasem cytrynowym, 1 n wodoroweglanem sodowym i nasyconym roztwo¬ rem soli kuchennej, suszy, zageszcza do objetosci okolo 40 ml i zadaje okolo 10 ml eteru naftowe¬ go. W ciagu kilkunastu godzin wykrystalizowuje zabezpieczony ester pentapeptydu o temperaturze topnienia 177^178°C.Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krze¬ mionkowym w ukladzie chloroform — metanol /98:2/ wykazuje Rf=0,45,.w ukladzie toluen — ace¬ ton /7:3/ Rf=0^7. &/ DPC-Ser/tBu/-Thr/tBu/-Cys/TRI/-Val-Leu-OH. 2,830 g /2 mM/ DPC-Ser-/tBu/-Thr/tBu/-Cys/TRI/- -Yial-Leu^OMe rozpuszcza sie 60 ml 75% dwuoksa- nu i zadaje 3 ml /6 mM/ 2 n lugu sodowego. Mie¬ szanine reakcyjna utrzymuje sie 1,5 godziny w temperaturze pokojowej% po czym oddestylowuje dwuoksan pod zmniejszonym cisnieniem w tempe- raturze 40°, dodaje octanu etylowego i wody i w temperaturze Ó°C za pomoca 1 n kwasu cytryno¬ wego doprowadza sie pH do wartosci 3. Ekstrakt octanowy przemywa sie roztworem soli kuchennej, suszy i odparowuje. io Chromatogram na zelu krzemionkowym wykazuje jednorodnosc otrzymanego produktu, Rf w ukladzie chloroform-metanol /7:3/=0,40; Rf=45, R*=0,55./ H-iSer/tBu/-Thr/tBu/-Cys/TRI/-ValHLeuOH. 2,22" g /? mM/ DPC-Ser-/tBu/-Thr/tBu/-Cys/TRI/- -Val-Leu-OH rozpuszcza sie w 20 ml chlorku me¬ tylenu i dodaje 12 ml wodnego roztworu k^asu chlorooctowego /75 g kwasu chlorooctowego i 25 ml wody/. Przezroczysty roztwór miesza sie w ciagu minut w temperaturze pokojowej, oziebia do 0°C ?o i zadaje 70 ml wody. Stezonym roztworem amonia¬ ku doprowadza sie pH roztworu do wartosci 6,5 przy czym nastepuje, wytracenie produktu. Dekan- tuje sie wodny roztwór,, a pozostalosc rozciera- trzykrotnie z woda i' nastepnie liofilizuje. Po trzy- krotnym roztarciu produktu z eterem otrzymuje sie bezbarwny proszek. Chromatogram cienkowarstwo¬ wy wskazuje na jednorodnosc wytworzonego pro¬ duktu. W tej postaci produkt stosuje sie do dalszej syntezy.Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krze¬ mionkowym Rf45=0,48, Rf10i=0,65, Rf52=0,75. 11/ Z-Asn-leu-QMe. 16,7 g H-Leu-OMe i 46,0 g Z-Asn-ONP rozpuszcza sie w 100 ml swiezo prze¬ destylowanego dwumetyloformamidu. "Roztwór po- zostawia sie .na okres 10 godzin w temperaturze °C. Nastepnie dodaje 1,2 litra wody i krystaliczny osad odsacza na nuczy. Pochodna dwupeptydu su¬ szy sie w temperaturze 40°C pod zmniejszonym cis¬ nieniem a nastepnie krystalizuje sie dwukrotnie z 40 mieszaniny metanolu z woda. Otrzymuje sie pro¬ dukt o temperaturze topnienia 180—181°C /a/D20= = +9° /c= 210$ w chloroformie/. 12/ H-Asn-Leu-OMe 15,0 g Z-AsmOMe rozpusz7 cza sie w 400 ml mieszaniny trzeciorzedowej buta- 45 nolu i wody /9:1/ i uwodornia sie w obecnosci 2 g palladu osadzonego na weglu /10°/o Pd/. Po skonczo¬ nym wodorowaniu katalizator odsacza sie na nuczy i odparowuje przesacz w temperaturze 40°C. Pozo¬ stalosc stosuje sie bezposrednio do dalszej syntezy. 50 13/ Z-Ser*/tBu/-Asn-Leu-QMe. 8,90 g H-Asn-Leu- -OMe i 11.0 g Z-iSer-/tiBu/-OH rozpuszcza sie w 100 ml swiezo przedestylowanego dwumetyloforma-- midu. Do oziebionego do temperatury 0°C roztwo¬ ru wprowadza sie 3,90 g N-hydroksysuksynoimidu, " a nastepnie 8,70 dwucykloheksylokarbodwuimidu.Mieszanine reakcyjna utrzymuje sie w ciagu 30 mi¬ nut w temperaturze 0°C a nastepnie 18 godzin w temperaturze 25°C, po czym wydzielony dwucyklo- heksylomocznik odsacza sie na nuczy i przesacz wylewa do 800 ml wody z lodem. Wypadajacy przy tym krystaliczny osad suszy pod zmniejszonym cis¬ nieniem w temperaturze '40°C, a nastepnie przekry- stalizowuje z mieszaniny metanolu z woda. Otrzy- 65 many w ten sposób ZnSer/tBu/-Asn-Leu-OMe oS8 876 9 analitycznym stopniu czystosci topnieje w tempe¬ raturze 202^205°C, /a/D20=—18° /c=l,05 w lodowa¬ tym kwasie octowym/. .- 14/ H-Ser/tBu/-Asin-leu-OMe. 6,3 g Z-Ser/tBu/- -Asn-Leu-OMe rozpuszcza sie w 600 ml metanolu i uwodornia w obecnosci 1,2 g palladu osadzonego na weglu /10% Pd/. Po uplywie 1,25 godziny odsacza sie katalizator na nuczy i przesacz pod zmniejszo¬ nym cisnieniem odparowuje sie do sucha w kapieli °. Otrzymuje sie krystaliczna pochodna trójpep- tydu której chromatogram cienkowarstwowy na zelu krzemionkowym w ukladzie chloroform — me¬ tanol /90:10/ wykazuje Rf=0,11./ BOC-Cys/TRI/-Ser/tBu/-Asn-Leu-OMe. 5,0 g H-Ser/tBu/-Asn-Leu-OMe i 6,7 g BOC-Cys/TRI/- -ONP rozpuszcza sie w 30 ml swiezo przedestylo¬ wanego dwumetyloformamidu, zólty roztwór pozo¬ stawia sie w spokoj-u w ciagu 42'godzin w tempe¬ raturze 26°C nastepnie dodaje 500 ml wody z lo¬ dem i odsacza wytracony produkt. Produkt ten roz¬ puszcza sie w octanie etylu przemywa sie roztwór % roztworem kwasu Cytrynowego i woda. Nastep¬ nie w celu usuniecia p-nitrofenolu, roztwór octa¬ nowy przemywa sie piec razy mieszanine 1 czesci objetosciowej 5% roztworu weglanu potasowego z i czescia objetosciowego 5°/o roztworu wodorowe¬ glanu potasowego a nastepnie woda. Po wysusze¬ niu ekstraktu octanowego, rozpuszczalnik odparo¬ wuje sie otrzymujac zywicowaty produkt, który oczyszcza sie przez 4 krotne rozpuszczenie w aceto¬ nie i wytracenie eterem -naftowym. Pochodna czte- ropeptydu otrzymana przy tym w postaci stalego proszku wykazuje temperature topnienia 181—4182°; /a/D20=—1'1°C /c=2,09 w metanolu/. Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krzemionkowym Rf^A wynosi 0,57; Rf w octanie etylu 0,10; Rf w miesza¬ ninie toluenu — aceton /7:3/=0,05; Rf w mieszani¬ nie chloroform —metanol /9:l/=0,45; 16/ BOC-Cys/TRI/-Ser/tBu/-Asn-CLeu-NH-NH2. 7,0 g BOC-Cys/TRI/-Ser/tBu/-Asn-Leu-OMe roz¬ puszcza sie w 70 ml metanolu i roztwór oziebiony do 0°C, zadaje sie 7 mililitrami wodzianu hydrazy^- ny. Po uplywie 16 godzin w temperaturze 2°C do¬ daje sie 600 ml lodowato zimnego roztworu 2 n kwasu octowego, galaretowaty osad dobrze sie roz¬ ciera, odsacza na nuczy i przemywa duza iloscia 'wody az do obojetnego odczynu przesaczu. Otrzy¬ many proszek suszy sie w temperaturze 40°C pod zmniejszonym cisnieniem, a nastepnie zawiesza sie w 100 ml acetonitrylu. Po roztarciu odsacza sie na nuczy i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w tem¬ peraturze 40°C. Otrzymany hydrazyd BOC-Cys- /TRI/-Ser/tBu/-Asn-Leu wykazuje temperature top¬ nienia 216—218°C.Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krze¬ mionkowym wykazuje nastepujace, wartosci Rf; Rf=0,55 w mieszaninie dwuoksan— woda /98:2/; Rf=0,52 w mieszaninie chloroform-metanol /8:2/ Rfio2E=0,70. * 17/ BOC-Cys/TRI/-Ser/tBu/-AsnHLeu-Ser/tBu/- -Thr/tBu/-Cys/TRI/-Val-L,eu-OH. Do 1,075 g /1,26 mM/ BOC-Cys/TRI/-Ser/tBu/-Asn-Leu-NH-CNH2 w ml dwumetyloformamidu dodaje sie w tempe¬ raturze —15°C 1,71 ml kwasu solnego w octanie etylu /l ,84 n, 3,15 mM/ i 0^174 ml /1,51 mM/ azo- " tynu trzeciorzedowego butylu /z roztworu 1 ml azo¬ tynu trzeciorzedowego butylu dopelnionego do 10 ml dwumetylofofmamidem/. Do roztworu mieszanego w ciagu 15 minut w temperaturze — 10°C, wkrapla sie oziebiony do —12°C roztwór zlozony z 1,104 g /1,26 .mM/ H-Ser/tBu/-Thr/tBu/-Cys/TRI/-Val-Leu- -OH i 0,61 "ml /4,4l milimoli/ trójetyloaminy w ml dwumetyloformamidu. Mieszanine reakcyjna io miesza sie w ciagu godziny w temperaturze —10°C, a nastepnie w ciagu 4 godzin w temperaturze po¬ kojowej. Po zageszczeniu roztworu do malej obje¬ tosci w wysokiej prózni i dodaniu wody otrzymuje sie produkt w postaci proszku, który dwukrotnie rozciera sie z woda, a" potem suszy w wysokiej prózni stalym wodorotlenkiem potasowym. Produkt surowy oczyszcza sie przez rozpuszczenie i wydzie¬ lenie z metanolu. Z metanolowego roztworu nasy¬ conego w temperaturze 50°C^ydziela sie, w ciagu kilkunastu godzin, w. temperaturze 0°C bialy pro¬ szek jednorodny w chromatogranie cienkowarstwo¬ wym, i Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krze¬ mionkowym Rf43c=0,54; Rf121A=0fG5; Rf45=0,50; Rf70=0,75; Rf w'mieszaninie Chloroform — metanol /8:2/=0,40.Przyklad II. Sposób wytwarzania peptydu o wzorze 2. Do 172 mg /0,2 mM/ BOC-ValJCys/TRI/- -GLy^Glu/OtBu/2 i 128 mg BOC-Cys/'TRI/-Asn- -OtBu w 5 ml octanu etylowego i 2 ml metanolu dodaje sie 254 mg /l mM/ jodu w 5 ml metanolu i pozostawia roztwór w ciagu godziny w tempera¬ turze pokojowej. Nastepnie w temperaturze 0°C roztwór odbarwia sie 1 n roztworem tiosiarczanu, mieszanine reakcyjna zadaje w 200 ml octanu ety¬ lowego i roztwór trzykrotnie przemywa woda. Pod¬ czas zageszczania wysuszonego siarczanem sodowym roztworu w octanie etylu wytraca sie krystaliczny /BOC-Cys-Asn-OtBu/2 otrzymuje sie 3i2 mg produk- 40 ' tu o temperaturze topnienia 194—196°C Produkt ten odsacza sie. Przesacz odparowuje sie do sucha i pozostalosc uciera z eterem naftowym. Nieroz¬ puszczalna pozostalosc chromatografuje na kolum-, nie wypelnionej zelem krzemionkowym otrzymujac 45 90 mg zwiazku o wzorze 1. Chromatogram cienko¬ warstwowy na zelu krzemionkowym w ukladzie chloroform — metanol 795:5/ wykazuje Rf=0,25 a w ukladzie toluen — aceton /lrl/ Rf=0,30. v Jako drugi produkt w chromatografii kolumnowej - 50 otrzymuje sie 54 mg /BOC-VaK!ysHGly-Glu/OtBu/2; Rf /na zelu krzemionkowym/ w ukladzie chloro¬ form — metanol /9:l/=0;55. Wyzej wymieniony^kry¬ staliczny dimer o temperaturze topnienia 194—196°C wykazuje nastepujace wartosci Rf /na zelu krze- 55 mionkowym/: w ukladzie chloroform — metanol /9:1/ Rf=0,25; w ukladzie toluen — aceton /1:1/ Rf=0,18.. Oba peptydy wyjsciowe mozna wytworzyc, jak • nizej: 60 1/ Z-Asn-OtBu. 32 g /120 mM/ Z-Asn-OH roz- - puszcza sie 600 ml dwuoksanu i do otrzymanego roztworu wprowadza sie w temperaturze —30°C ml izobutylenu. Po 'dodaniu 12 ml stezonego kwasu 65 siarkowego zamyka sie kolbe i wstrzasajac od cza^88 876 11 jsu do czasu, pozostawia sie na okres 20 godzin, w temperaturze 0°C otrzymujac w rezultacie klarow¬ ny roztwór. Roztwór teaw temperaturze pokojowej uwalnia sie w znacznym stopniu od nadmiaru izo- butylenu, a nastepnie w temperaturze 0°C zadaje sie wodnym roztworem 44 g wodoroweglanu pota¬ sowego, po czym odparowuje do malej objetosci i zalewa octanem etylu. Faze organiczna przemywa sie 1 n roztworem wodoroweglanu, a nastepnie woda az do odczynu obojetnego. Podczas zageszcza¬ nia wysuszonego siarczanem sodowym roztworu w octanie etylowym, produkt zaczyna krystalizowac.Dodaje sie jeszcze n-heksanu i odsacza. Tempera¬ tura topnienia produktu 100—102°C. M/d23:—16° /c = 2 w metanolu/. Chromatogram cienkowarstwo¬ wy na zelu krzemionkowym w ukladzie toluen — aceton /7:3 wykazuje Rf =0,27; w octanie etylu R£=0,43. 2/ H-Asn-OtBu. 23,6 g /73,2 mM/ Z-Asn-OtBu w 200 ml octanu etylowego uwodornia sie w obec¬ nosci 2 g palladu osadzonego na weglu /10°/o/. Po¬ chlanianie wodoru ustaje po uplywie godziny. Ka¬ talizator odsacza sie. Podczas zageszczenia prze¬ saczu wykrystalizowuje produkt o temperaturze topnienia 96—98°C, Ax/d: +2° /c =2,l w metanolu/.Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krzemion¬ kowym wykazuje Rf52 =0,30; Rf45=0,50. 3/ BOC-Cys/TRI/-Asn-OtBu. Do 18,52 g /40 mM/ BOC-Cys/TRI/-OH i 5,6 ml /40 mM/ trójetyloaminy w 200 ml czterohydrofuranu w temperaturze —10°C dodaje sie 5,32 g /40 mM/ chloroweglanu izobutylu i miesza w tej temperaturze w ciagu 10 minut.Nastepnie do otrzymanej mieszaniny reakcyjnej wkrapla sie oziebiony do —10°C roztwór 7,52 g /40 mM/ H-Asn-OtBu w 150 ml czterohydrofuranu i pozostawia sie mieszanine w ciagu 1 godziny w temperaturze —10°C, a nastepnie w ciagu kilku¬ nastu godzin w temperaturze pokojowej. Wydzie¬ lony chlorowodorem trójetyloaminy odsacza sie, przesacz odparowuje do sucha, pozostalosc roz¬ puszcza w octanie etylu i przemywa roztworem l n kwasu cytrynowego, 1 n wodoroweglanu sodowego i woda. Podczas zageszczania octanowego roztworu i dodawania don eteru naftowego produkt wydziela sie w postaci krystalicznej. Otrzymuje sie produkt o temperaturze topnienia 155—157°C. M/d23: + 34° /c=2,l w chloroformie/. Chromatogram cienkowar¬ stwowy na zelu krzemionkowym w ukaldzie toluen — aceton /1:1/ wykazuje Rf=0,45; w ukladzie chlo¬ roform — metanol /95:5/ Rf=0,33; Rf43A=0,65. 4/ Z-Cly-Glu/OtBu/2. Do roztworu 23,2 g /0,11M/ Z-Gly-OH i 15,54 ml /0,11 M/ trójetyloaminy w 200 ml czterohydrofuranu w temperaturze —10°C dodaje sie 14,07 ml /0,11 M/ chloroweglanu izobu¬ tylu i pozostawia w spokoju w ciagu 10 minut w temperaturze 10°C. Mieszanine 28,52 g /96,5 mM/ chlorowodorku H-Glu/OtBu/2 i 13,5 ml /96,5 mM/ chlorowodorku trójetyloaminy w 300 ml czterohy-- drofuranu odsacza sie od chlorowodorku trójetylo¬ aminy, oziebia przesacz do —10°C i nastepnie w temperaturze —10°C wkrapla do powyzszego roz¬ tworu i miesza sie jeszcze w ciagu 1 godziny w temperaturze —10°C i w ciagu 2 godzin w tempe¬ raturze pokojowej. Wydzielony chlorowodorek trój- T2 etyloaminy odsacza sie i przesacz odparowuje do suchosci. Otrzymany olej rozpuszcza sie w octanie etylu i przemywa roztwór 1 n roztworem kwasu cytrynowego, 1 n roztworem wodoroweglanu sodu i woda. Po odparowaniu octanu etylu otrzymuje sie pochodna peptydu, krystalizujaca z mieszaniny octanu etylowego z n-heksanem. Temperatura top¬ nienia 74—76°C; M/d23:—17° /c = 2,2 w metanolu/.Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krzemion- kowym w ukladzie toluen — aceton /7:3 wykazuje Rf= 050./ H-Gly-Glu/OtBu/2 2,7 g /6 mM/ w 30 ml octanu etylu uwodornia sie w obecnosci 250 mg palladu osadzonego na weglu /10°/o/. Po uplywie 4 godzin ib pochlanianie wodoru zostaje zakonczone. Odsacza sie katalizator i odparowuje przesacz. Otrzymuje sie produkt w postaci oleju. Chromatogram cienko¬ warstwowy na zelu krzemionkowym wykazuje je¬ dnorodnosc, przy czym w ukladzie toluen — aceton /7:3/ Rf = 0,27; w ukladzie chloroform — metanol /9:1/ Rsf=0,37 i Rf43A = 0,50. 6/ TRI-Cys/TRI/-Gly-Glu/OtBu/2. Do 26,6 g /44 mM/ TRI-Cys-/TRI/-OH i 13,9 g /44 mimimole/ H-Gly-Glu/OtBu/2 w 350 ml octanu etylowego w temperaturze 0°C dodaje sie 9,06 g /44 mM/ dwu- cykloheksylokarbodwuimidu, po czym miesza w ciagu 2 godzin w temperaturze 0°C i pozostawia na ' kilkanascie godzin w chlodni. Nastepnie odsacza sie wydzielony dwucykloheksylomocznik, przesacz przemywa 1 n kwasem, cytrynowym, 1 n wodoro¬ weglanem sodu i woda, roztwór suszy i odparo¬ wuje. Produkt krystalizuje sie z mieszaniny octanu etylowego z n-heksanem. Temperatura topnienia 107—110°C. /a/D23:+8° /c = 2,0 w metanolu/. Chro- matogram cienkowarstwowy na zelu krzemionko¬ wym w ukladzie toluen — aceton /7:3/ Rf=0,70; w ukladzie chloroform — metanol /98:2/ Rf=0,78.II H-Cys/TRI/-Gly-Glu/OtBu/2. Do 3,156 g /3,5 mM/ TRI-Cys/TRI/-Gly-Glu/OtBu/ w 20 ml lodowa- 40 tego kwasu octowego dodaje sie w temperaturze pokojowej 5 ml wody, w ten sposób aby powstajacy przy tym osad stale rozpuszczal sie ponownie. Po uplywie okolo 10 minut wystepuje zmetnienie i powstawanie osadu. Roztwór miesza sie w ciagu 1 godziny, nastepnie dodaje 15 ml wody i odsacza.Przesacz odparowuje sie w wysokiej prózni w tem¬ peraturze 40°C, pozostalosc rozpuszcza sie w octa¬ nie etylu i przemywa w temperaturze 0°C 0,5 n roztworem wodoroweglanu sodowego i woda. Piane otrzymana po odparowaniu rozciera sie z eterem naftowym. Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krzemionkowym w ukladzie chloroform — metanol /95:5/ wykazuje Rf=0,40; w ukladzie toluen — ace¬ ton /1:1/ Rf= 0,55 i RfA43=0,60. 8/ BOC-Val-Cys/TRI/-Gly-Glu/OtBu/2. Do roztwo¬ ru zlozonego z 7,17 g /33 mM/ BOC-Val-OH oraz 4,6-2 ml /33 mM/ trójetyloaminy w 80 ml octanu etylowego w temperaturze —10°C'dodaje sie 4,4 ml /33 mM/ chloroweglan izobutylu i roztwór miesza sie w ciagu 10 minut w temperaturze —10°C. Na¬ stepnie do mieszaniny wkrapla sie oziebiony do —10°C roztwór 21,92 g /33 mM/ H-Cys/TRI/-Gly- -Glu/OtBu/2 w 400 ml octanu etylu i pozostawia 65 sie mieszanine, w ciagu 1 godziny w temperaturze 45 55 6088 876 13 —10°Coraz w ciagu 10 godzin w temperaturze po¬ kojowej. Nastepnie odparowuje sie do sucha, pozo¬ stalosc rozciera dwukrotnie z dwiema kolejnymi 200 ml porcjami wody i suszy nad pieciotlenkiem fosforu. Pozostalosc rozpuszcza sie w 450 ml go¬ racego metanolu. Produkt wykrystalizowuje w ciagu kilkunastu godzin w temperaturze 0°C. Tempera¬ tura topnienia 213—215°C Ax/d23 = + 19°; /c = 2,2 w chloroformie/. Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krzemionkowym w ukladzie cykloheksan — octan etylu /l31/ wykazuje Rf= 0,18; w ukladzie toluen — aceton /,1:1/ Rf=0,65.Przyklad III. 172 mg /0,2 miM/ BOC-Val- -Cys/TRI/-Gly-Glu/OtBu/2 w 5 ml octanu etylowe¬ go i 2 ml metanolu zadaje sie 127 mg /0,5 mM/ jodu w 2,5 ml metanolu i pozostawia mieszanine reakcyjna w ciagu 1 godziny w temperaturze po¬ kojowej. Nastepnie w temperaturze 0°C odbarwia sie roztwór 1 ,n roztworem tiosiarczanu, dolewa 200 ml octanu etylowego i trzykrotnie przemywa roztwór woda. Po odparowaniu octanu etylowego otrzymany produkt rozciera sie dwukrotnie z ete¬ rem naftowym. Otrzymuje sie nierozpuszczalny w eterze naftowym [BOC-Val-Cys-Gly-Glu/OtBu/2]2.Chromatogram cienkowarstwowy wykazuje jedno¬ rodnosc. Otrzymuje sie 123 mg produktu, co od¬ powiada 100% wydajnosci.Przyklad IV. Sposób wytwarzania peptydu o wzorze 3. Do roztworu 620 mg jodu w 150'ml metanolu przy energicznym mieszaniu wkrapla sie w temperaturze 25°C w ciagu 45 minut, 500 mg BOC-Cys/TRI/-Tyr/tBu/-Ile-Glin-Asn-Cys/TRI/- -Procleu-Gly-BH2 rozpuszczonego w 100 ml meta¬ nolu. Roztwór miesza sie jeszcze 1 godzine, po czym ochladza do 5°C i odbarwia za pomoca dodania 1 n wodnego roztworu tiosiarczanu sodowego. Nastep¬ nie zageszcza sie roztwór pod zmniejszonym cis¬ nieniem do objetosci okolo 5 ml i wytracony duza iloscia wody produkt odsacza na nuczy i suszy pod zmniejszonym cisnieniem nad wodorotlenkiem sodu. W celu przeprowadzenia w wolna oksytocyne produkt zawiesza sie w 5 ml lodowato zimnego stezonego kwasu solnego i rozpuszcza podczas mie¬ szania. Po uplywie 10 minut roztwór rozciencza sie ml wody z lodem i po dodaniu 5 ml lodowatego kwasu octowego saczy przez kolumne slabo zasa¬ dowego wymieniacza jonowego Nr II firmy Merck /w postaci octan/ i przemywa 20°/o kwasem octo¬ wym. Nastepnie przesacz odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem w temperaturze 30°C, pozosta¬ losc rozpuszcza w wodzie i liofilizuje. Otrzymana w ten sposób surowa oksytocyne mozna ewentual¬ nie jeszcze oczyscic metoda Yamashiro /Nature 201, 76 /1964/.Uzyta jako produkt wyjsciowy zabezpieczona po¬ chodna nonapeptydu BOC-Cys/TRI/-Tyr/tBu/-Ile- -Glin-Asn-Cys/TRI/-Pro-LeuHGly^NH2 mozna wy¬ twarzac wedlug nizej podanego sposobu: 1/ TRI-Cys-/TRI/-Pro-Leu-Gly-NH2. 30 g H-Pro- -L,eu-Gly-NH2 rozpuszcza sie w 500 ml swiezo przedestylowanego dwumetyloiformamidu i do roz¬ tworu oziebionego do 5°C wprowadza 70 g TRI- -Cys/TRI/-OH, 20 g N-hydroksyimidu kwasu bur¬ sztynowego oraz 30 g dwucykloheksylokarbodwu- imidu. Po uplywie 30 minut utrzymywania roztwo- 14 ru w temperaturze 0°C roztwór ogrzewa sie do temperatury pokojowej i pozostawia sie w spokoju w ciagu 18 godzin. Nastepnie wydzielony dwucyklo- heksylomocznik odsacza sie na nuczy, przesacz od¬ parowuje w wysokiej prózni w temperaturze 40°C i pozostalosc zadaje 1 litrem eteru naftowego. Po dokladnym roztarciu nierozpuszczonego produktu w eterze naftowym, eter dekantuje sie a pozosta¬ losc nie rozpuszczona w eterze naftowym, rozpusz¬ cza sie w octanie etylu, roztwór przemywa w tem¬ peraturze 0°C rozcienczonym roztworem kwasu cytrynowego, woda, roztworem wodoroweglanu so¬ dowego i woda, suszy siarczanem sodu i odparo¬ wuje do sucha. Otrzymana przy tym pochodna czteropeptydu TR'I/Cys/rRI/-Pro-Leu-Gly-NH2 w celu oczyszczenia rozpuszcza sie w metanolu i saczy przez kolumne Sephadex'u LH-20. Otrzymane frak¬ cje odparowuje sie i bada ich czystosc za pomoca chromatografii cienkowarstwowej na plytkach z zelu krzemionkowego w ukladzie chloroform — me¬ tanol /99:1/. Frakcje czyste laczy sie, odparowuje i suszy. 2/ Z-Tyr/tBu/-Ile-Gin-Asn-OH. 4,05 g H-Ile-Glin- -Asn-OH rozpuszcza sie w 70 ml wody i 1,5 ml trójetyloaminy, po czym do roztworu dodaje 200 ml dwumetyloformamidu a nastepnie 8 g estru p-ni- trofenylowego Z-Tyr-/tBu/, /wytworzonego z Z-Tyr/tBu/-OH i p-nitrofenolu za pomoca dwu- cykloheksylokarbodwuimidu. Temperatura estru 88—89°C po krystalizacji z mieszaniny metanolu z woda/ i pozostawia w temperaturze pokojowej na okres 72 godzin. Mieszanine reakcyjna zageszcza sie • pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40°C do objetosci okolo 20 ml, nastepnie dodaje 100 ml 0,5 n roztworu wodoroweglanu sodowego i 200 ml eteru, oddziela roztwór eterowy^ a faze wodna oziebia w lodzie. Po zakwaszeniu 2 n kwasem sol¬ nym wydzielony Z-Tyr-/tBu/-Ile-Gln-Asn-OH od¬ sacza sie na nuczy i przemywa woda z lodem. W celu oczyszczenia zwiazek ten jeszcze raz poddaje sie wytraceniu .eterem z roztworu w dwumetylo- form amidzie. 3/ H-Tyr/tBu/-Ile-Glin-Asn-OH. 1,2 g pochodnej czteropeptydu otrzymanej wedlug podanego powy¬ zej sposobu /3/ rozpuszcza sie w 50 ml 90% kwasu octowego i uwodornia w obecnosci 0,5 g palladu osadzonego na weglu /10°/o/. Po skonczonym uwo¬ dornianiu odsacza sie katalizator, przesacz odpa¬ rowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc suszy w wysokiej prózni w tempera- turze40°C. 4/ BOC-Cys/TRI/-Tyr/tBu/-Ile-Glin-Asn-OH. Pro¬ dukt otrzymany wedlug powyzszego sposobu /3/ zawiesza sie w mieszaninie zlozonej z 35 ml dwu¬ metyloformamidu i 0,5 ml trójetyloaminy i za po¬ moca dodania wody przeprowadza do roztworu.Nastepnie do roztworu wprowadza sie 1,0 g estru p-nitrofenylowego BOC/Cys/TRI/ i pozostawia mie¬ szanine reakcyjna w spokoju w ciagu 48 godzin w temperaturze 28°C, po czym zageszcza w wysokiej prózni w temperaturze 35°C, pozostalosc zadaje 100 ml lodowato zimnego 1 n kwasu solnego i odsacza na nuczy surowa pochodna pentapeptydu.Po przemyciu woda z lodem i wysuszeniu produkt 65 poddaje sie oczyszczaniu, stosujac kilkakrotne roz- 50 55 6088 876 puszczanie w dwumetyloformamidzie i- wytrzasa¬ nie roztworu eterem. W celu dalszego oczyszcze¬ nia produkt rozpuszcza sie w metanolu i chroma¬ tografuje na kolumnie stosujac Sephadex LH-20./ BOC^Cys/TRI/-Tyr/tBu/-Ile-Glin-Asn-Cys/TRI/- -Pro-Leu-fGly-NH2. 2,1 g pochodnej czteropepty- du otrzymanej wedlug sposobu 2 i 3,3 g BOC-Cys- /TRI/-Tyr/fcBu/-Ile-Gln-Asn^OH rozpuszcza sie w dwumetyloformamidzie przy dodaniu 1 g N-hydro- ksyimidu kwasu bursztynowego. Nastepnie roztwór, oziebiony do temperatury —20°C, zadaje sie 0,9 g dwucykloheksylokarbodwuimidu i pozostawia w ciagu 2 godzin w temperaturze —#0°C, a nastepnie w ciagu 48 godzin w temperaturze pokojowej, przy czym po uplywie 6, 12 i 18 godzin kazdorazowo dodaje sie po 200 mg dwucykloheksylokarbodwu¬ imidu. Po odsaczeniu wydzielonego dwucyklokarbo- dwuirnidu przesacz zageszcza sie do malej objetos¬ ci w wysokiej prózni, stosujac laznie o tempera¬ turze 40°C i dodajac eter wytraca pochodna no¬ napeptydu. Proszek odsacza sie na nuczy, suszy, rozciera z woda, znowu odsacza na nuczy i suszy.Tak otrzymany surowy BOC-Cys/TRI/iTyr/tBu/- -Ile-Gln-Asn-Cys/TRI/-Pro-LreuHGly-NH2 w celu oczyszczenia poddaje sie przeciwpradowemu roz¬ dzialowi wedlug sposobu podanego w przykladzie I.Przyklad V. Sposób wytwarzania peptydu o wzorze 4. Do roztworu 1120 mg jodu w 500 ml metanolu utrzymywanego w temperaturze pokojo¬ wej wkrapla sie w ciagu 45 minut w czasie ener¬ gicznego mieszania roztwór 800 mg BOC-CysyTRI/- -Tyr/tBuHPhe^Gln-Asn-Cys/TRI/-Pro-[LysyBOC/- . -Gly-iNH2 w 500 ml metanolu. Mieszanine reakcyjna oziebiona do 2°C, odbarwia sie dodajac kroplami 1 n wodny roztwór tiosiarczanu sodowego. Nastep¬ nie roztwór zageszcza sie do malej objetosci pod zmniejszonym cisnieniem, stosujac laznie o tempe¬ raturze 30°C i duza iloscia wody wytraca produkt.Po odsaczeniu na nuczy, produkt suszy sie w eksy- katorze prózniowym. W celu przeprowadzenia w Lys8 — wazopressyne rozpuszcza sie mieszajac w ml lodowato zimnego stezonego kwasu solne¬ go. Po uplywie 10 minut rozciencza sie w tempe¬ raturze 0°C 50 ml wody z lodem i dodaje 5 ml lodowatego kwasu octowego. Nastepnie saczy sie przez kolumne slabo zasadowego /postac octanu/ wymieniacza jonów Nr II firmy Merck i odparo¬ wuje eluat do sucha.Zabezpieczona pochodna nonapeptydu BOC-Cys- /TRI/-Tyr/tJBu/-Phe-Gln-Asn-Cys/TRI/^Pro-Lys- /BOC/-Gly-NH2 mozna wytwarzac w sposób ana¬ logiczny do sposobu wytwarzania zabezpieczonego nonapeptydu, opisanego w przykladzie- IV, za po¬ moca kondensacji BOC-Cys/TRI/-Tyr/tBu/-Phe-Gln- -Asn-OH z H-Cys/TRI/-Pro-Lys/BOC/-Gly-NH2 w obecnosci dwucykloheksylokarbodwuimidu i N-hy- 'droksy-sukcynodwuimidu. W podobny sposób mozna wytwarzac produkty posrednie.Przyklad VI. Zwiazek ten mozna wytworzyc wedlug sposobu podanego w przykladzie V synte¬ tyzujac z BOC-Cys/TRI/-Phe^Phe-Gln^Asn-Cys- 7TRI/-Pro-Lys/BOC/-Gly-NH2 a nastepnie wytwo¬ rzyc mostek otrzymujac Phe2, Lys8-wazopressyne. 16 Przyklad VII. 1,524 g BOC-Cys/TRI/nGly- -Glu/OtBu/2 i 508 mg jodu poddaje sie reakcji w ml metanolu w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Nastepnie roztwór odbarwia sie przez wkroplenie wodnego 1 n roztworu tiosiarczanu so¬ dowego w temperaturze 0°C, po czym dodajac 50 ml wody wytraca produkt. Po wysuszeniu surowy produkt trzykrotnie rozciera sie z trzema 10 ml porcjami eteru ftalowego. Po przekrystalizowaniu pozostalosci'z mieszaniny octanu etylowego z ete¬ rem naftowym otrzymuje sie 945 mg /BOC-Cys- -Gly/OtBu/2/2 o temperaturze topnienia 150—152°C.Wydajnosc Rf=0,<50 w ukladzie chloroform — me¬ tanol /9:1/.Przyklad VIII. Postepuje sie wedlug sposobu podanego w przykladzie VII, stosujac 762 mg /1,0. mM/ BOC-Cys/mi/-Gly-Glu/OtiBu/2, 634 mg /1,0 mM/ BOC-Cys/TRI/-Asn-/OtBu/ i 508 mg /2,0 mM/ jodu. Chromatogram cienkowarstwowy na zelu krzemionkowym surowego produktu w ukla¬ dzie chloroform — metanol /9:1/ wykazuje trzy plamy: o. Rf=0,60 /BOC-Cys-Gly-Glu/OtBu/2/2 /zwiazek I/, Rf=0,25 /BOC-Cys-Asn-OtBu/2 /zwia¬ zek 11/ i Rf=0,45 odpowiadajace zwiazkowi III przedstawionemu wzorem 6, Produkty wyodrebnia sie stosujac rozdzial prze- ciwpradowy w ukladzie metanol — 0,1 n octan amonu — chloroform — czterochlorek wegla /4:2:i:3/. Po 100 przeniesieniach zwiazek II znaj- duje sie we frakcjach 56—76 /rmax=65, K=1,85A Frakcje te usuwa sie, doprowadza nowa faze dolna i przeprowadza dalsze 100 przeniesien. Zwiazek III znajduje sie we frakcjach 8—25 /rmax=16, K=0,09/, a zwiazek I — we frakcjach 0—5. Z frakcji tych przez odparowanie i odsublimowanie octanu amo¬ nowego otrzymuje sie wszystkie trzy zwiazki o stopniu czystosci odpowiadajacy 1 chromatografii cienkowarstwowej. Zwiazek I po przekrystalizowa¬ niu z mieszaniny octanu etylu z eterem naftowym 40 topnieje w temperaturze 150—152°C; wydajnosc 225 mg /statystyczna 260 mg/, zwiazek II przekry- stalizowany z mieszaniny metanolu z eterem wy¬ kazuje temperature topnienia 194—1&6°C, wydaj¬ nosc — 162 mg /statystyczna 195 mg/. Zwiazek III 45 jest bezpostaciowy, wydajnosc 463 mg.Po przeprowadzeniu reakcji 1 mM BOC-Cys- /TRI-GlyiGlu/OtBu/2 z 2 mM BÓC-Cys/TRI/-Asn- -OtBu i 3 mM jodu, otrzymuje sie 580 mg zwiazku III /statystycznie 606 mg/.Przyklad IX. Do 254 mg /l mM/ jodu w ml lodowatego kwasu octowego dodaje sie roz¬ twór 380 mg /0,5 mM/ BOC-Cys/TRI/-Gly-Glu- /OtBu/2 i 45 mg /0,55 mM/ octanu sodowego /bez¬ wodnego/ w 5 ml lodowatego kwasu octowego i miesza w ciagu godziny w temperaturze pokojo¬ wej. Brunatny roztwór odbarwia sie za pomoca 1,7 ml 1 n rotworu tiosiarczanu sodowego i liofi¬ lizuje. Otrzymany proszek zalewa sie woda, roztwór saczy, a pozostalosc na saczku dobrze przemywa woda. Po wysuszeniu nad pieciotlenkiem fosforu i przekrystalizowaniu z mieszaniny octanu etylu : i eterem naftowym otrzymuje sie 205 mg /80%/ - /BOC-Cys-Gly-iGlu/OtBu/2/2 o temperaturze tppnie- 65 nia 151—162°C. 5088 876 17 PL