PL88098B1

PL88098B1 -

Info

Publication number: PL88098B1
Application number: PL16554973A
Authority: PL
Priority date: 1973-09-29
Filing date: 1973-09-29
Publication date: 1976-08-31

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia mieszaniny edein oraz jej rozdzialu na posz¬ czególne skladniki.Znana metoda otrzymywania mieszaniny edein polega na sorpcji tej mieszaniny z przesaczu brzecz¬ ki fermentacyjnej na kationicie karboksylowym i desorpcji antybiotyku ze zloza jonitowego rozcien¬ czonym roztworem kwasu mineralnego lub orga¬ nicznego, a nastepnie odbarwieniu uzyskanego elu- atu edeiny i demineralizacji (op. pat. nr 77182). Nie¬ aktywne peptydy towarzyszace mieszaninie edein usuwa sie podczas sorpcji na kationicie karboksy¬ lowym w formie cynkowej (op. pat. nr 77188).W wyodrebnionej wczesniej metodami analitycz¬ nymi mieszaninie edein stwierdzono obecnosc edein, A, B, C i D (Borowski E., Chmara H.^ Jereczek-Morawska E., Biochim. Biophys. Acta, 130, 560 (1966)). Edeina A sklada sie z pieciu amino¬ kwasów i alifatycznej dwuaminy sperymidyny, wystepujacych w nastepujacej sekwencji: N-/[3-ty- rozyl/-izoseryl-/a-a/-2,3-dwuaminopropionyl-/a-a/- -2,6-dwuamino-7-hydroksyazelail-/co-a/-glicyl- -NH(CH2)3-NH(CH2)4NH2. Edeina B rózni sie od ede¬ iny A tym, ze zamiast aminy sperymidyny zawiera N-/guanylo/-N'-/3-aminopropylo/-l,4-dwuamino- tan, czyli guanylosperymidyne (Hettinger T.P.,Craig L.C., Biochemistry, 9, 1224 (1970)). Edeiny A i B sa glównymi skladnikami mieszaniny i moga wy¬ stepowac w dwu formach izomerycznych, z których 2 Aj i Bj sa aktywne, natomiast A2 i B2 nie posiadaja aktywnosci biologicznej.Edeina D jest scislym analogiem edeiny A i rózni sie od niej rodzajem aminokwasu aromatycznego s (zamiast |3-tyrozyny, 0-fenylo-P-alanina), (Wojcie¬ chowska H., Ciarkowski J., Chmara H., Borowski E., Experientia, 28, 1423 (1972)). Budowy edeiny C nie zbadano, gdyz substancja wystepuje w mie¬ szaninie w tak malych ilosciach, ze przy zasto- io sowaniu analitycznych metod separacji nie zdola¬ no wyodrebnic jej w ilosciach, wystarczajacych do pelnej analizy. Opisane w literaturze metody roz¬ dzialu mieszaniny edein polegaja na ekstrakcji przeciwpradowej (Hettinger T.P., Kurylo-Borowska Z., Craig L.C., Biochemistry, 7, 4153 (1968)) oraz chromatografii bibulowej, cienkowarstwowej lub kationowymiennej (Borowski E., Chmara H. Jere¬ czek-Morawska E. Chemotherapia 12, 12(1967). Roz¬ dzialu edein A, B, C i D dokonano wylacznie dro- ga chromatografii bibulowej i cienkowarstwowej, pozostale metody dotycza wylacznie rozdzialu edein A i B.Znana metoda izolacji mieszaniny edein wymaga zastosowania szeregu zabiegów, które wydluzaja czas izolacji i obnizaja wydajnosc uzyskiwanego produktu. Znane metody rozdzialu mieszaniny edein sa skomplikowanymi i malo wydajnymi metodami analitycznymi, prowadzacymi do otrzymania edein o ograniczonej czystosci.Przedmiotem wynalazku jest efektywna metoda 880983 otrzymywania czystej mieszaniny edein, pozbawio¬ nej zanieczyszczen mineralnych i organicznych, oraz ilosciowego rozdzialu tej mieszaniny na po¬ szczególne skladniki w dowolnej skali.Sposobem wedlug wynalazku przeprowadza sie sorpcje mieszaniny edein z przesaczu brzeczki fer¬ mentacyjnej lub dowolnego innego roztworu na kationicie karboksylowym w formie soli, desorbuje sie antybiotyk ze zloza jonitowego roztworem zasa¬ dy w wodzie lub mieszaninie wody i rozpuszczal¬ nika organicznego w temperaturze —10 do +30°C, korzystnie w temperaturze 0 do +10°C. Do de¬ sorpcji antybiotyku stosuje sie rozpuszczalne w wo¬ dzie i rozpuszczalnikach organicznych zasady, cha¬ rakteryzujace sie stala dysocjacji Kb o wartosci 1X10—7 do 1X10—2, korzystnie o wartosci 1X10—6 do 1X10—8. Szczególnie korzystne jest zastosowanie do tego celu roztworów wodorotlenku amonowego i pierwszorzedowych amin alifatycznych,' zawiera¬ jacych w czasteczce 1—4 atomów wegla, jak mety¬ loamina, butyloamina. Bo elucji antybiotyku zasto¬ sowac mozna równiez aminy heterocykliczne, dwu- aminy oraz aminy alifatyczne II i III-rzedowe.Uzyskany eluat edeiny zobojetnia sie roztworem kwasu mineralnego lub organicznego do pH o war¬ tosci 4,0 do 7,0, korzystnie do wartosci 5,5 do 6,5, a nastepnie przeprowadza sie kolumnowa chroma¬ tografie jonowymienna otrzymanej mieszaniny ede¬ in wprost z roztworu lub po wyodrebnieniu w zna¬ ny sposób.Do chromatografii stosuje sie materialy ^aniono- wymienne w formie wodorotlenowej, np. takie, jak celulozy anionowymienne, usieciowane dekstrany anionowymienne sephadex'y oraz konwencjonalne anionity o róznym stopniu zasadowosci. Rozwija¬ nie kolumny prowadzi sie przy pomocy wody.Wyciek z kolumny zbiera sie frakcjami przy po¬ mocy automatycznego kolektora frakcji, zobojetnia sie rozcienczonym roztworem kwasu, korzystnie roz¬ tworem kwasu organicznego, a nastepnie identyfi¬ kuje sie poszczególne skladniki i kolekcjonuje frak¬ cje jednorodne (np. przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej). Proces chromatografii jonowy¬ miennej przeprowadza sie w temperaturze 0—|- +30°C, korzystnie w temperaturze +5—|-150C.Frakcje, zawierajace dane skladniki zageszcza sie do sucha w prózni lub liofilizuje. Otrzymane pre¬ paraty oczyszcza sie metoda filtracji molekularnej na nosniku sephadex LH-20 w rozpuszczalniku or¬ ganicznym, korzystnie w metanolu. Proces pro¬ wadzi sie w kolumnie w temperaturze pokojowej.Z frakcji zawierajacych dana edeine usuwa sie cze¬ sciowo rozpuszczalnik, a nastepnie wytraca sie sól edeiny z kwasem mineralnym przy pomocy odpo¬ wiedniej soli aminy takiej, jak trójetyloamina. Mo¬ zna równiez usunac rozpuszczalnik calkowicie, uzy¬ skujac sól edeiny z kwasem organicznym.W wyniku zastosowania procedury rozdzialu mie¬ szaniny edein wedlug wynalazku uzyskuje sie roz¬ dzial tej mieszaniny na co najmniej piec skladni¬ ków, sposród których zidentyfikowano edeiny A, B, C, D i nowa substancje nazwana edeina E. Sklad mieszaniny edein i ilosciowe proporcje miedzy poszczególnymi skladnikami zaleza od sposobu pro¬ wadzenia fermentacji edeiny. 1098 4 Przykladowy rozdzial edein sposobem wedlug wynalazku przedstawiono na chromatografii (fig.).Chromatogram wykonano metoda chromatografii wystepujacej na cienkiej warstwie DC-Alufolien Kieselgel 60F254 firmy Merck w ukladzie rozpusz¬ czalników n-propanol : woda amoniakalna : woda = = 6:4:3. Czas wykonania chromatogramu 3 go¬ dziny w temperaturze 20°C.Nizej przytoczone przyklady ilustruja sposób we- dlug wynalazku: Przyklad I. 150 1 roztworu edeiny o akty¬ wnosci 244 j/ml i pH = 6,8 przepuszcza sie przez szeregowo polaczony uklad kolumn (2 sztuki) z plaszczem wodnym, zawierajacych po 900 ml ka- tionitu karboksylowego Wofatit CP w formie sodo¬ wej. W momencie zakonczenia sorpcji aktywnosc antybiotyku w wyciekach wynosi odpowiednio : 98 j/ml po pierwszej kolumnie i 0 j/ml po drugiej ko¬ lumnie. Kolumne pierwsza przemywa sie woda de- mineralizowana, a nastepnie wlacza chlodzenie wo¬ da (temperatura +12°C) i eluuje sie 0,5 N woda amoniakalna, oziebiona do temperatury +10°C.Zebrany eluat (27125 ml, aktywnosc 9850 j/ml) umieszcza sie w wyparce obrotowej i usuwa pod zmniejszonym cisnieniem nadmiar eluenta w tem¬ peraturze 20°C, a nastepnie zobojetnia sie 25%-wym H2S04 do pH = 6,2 i odbarwia weglem aktywowa¬ nym. Otrzymany roztwór siarczanu edeiny liofili¬ zuje sie do otrzymania 133 g preparatu o aktywnosci 198 j/mg, nie zawierajacego zanieczyszczen mineral¬ nych. Chromatografia cienkowarstwowa (uklad roz¬ puszczalników n-propanol : woda amoniakalna : wo¬ da = 6 :4 : 3, cienka warstwa DC-Alufolie Kieselgel 60F254) oraz bibulowa (bibula Whatman 3, uklad rozpuszczalników n-propanol : woda amoniakalna : : woda = 60 : 35 : 5) w polaczeniu z wywolaniem biologicznym (B. subtilis ATCC6633) wskazuja na obecnosc w preparacie siarczanu edeiny duzych ilosci edein A, B i D oraz sladów edein C, E. 40 Przyklad II. 4 g siarczanu edeiny, uzyskanego w przykladzie I rozpuszcza sie w 12 ml wody de¬ stylowanej i wprowadza sie na kolumne chromato¬ graficzna, zawierajaca 250 g dwuetyloaminoetylo- celulozy DE-32 (firma Whatman), zregenerowanej 45 na forme wodorotlenowa. Rozwijanie kolumny pro¬ wadzi sie woda destylowana o pH = 6,85 w tempe¬ raturze +8°C. Wyciek z kolumny zbiera sie przy pomocy automatycznego kolektora frakcji z przy¬ stawka czasowa (firma Premed, typ 301B) we frak- 50 cjach 15-minutowych. Frakcje zobojetnia sie 0,1 N roztworem kwasu siarkowego do pH = 6,0, a na¬ stepnie bada sie chromatograficznie w ukladach rozpuszczalników, przytoczonych w przykladzie I.Edeiny znajduja sie w nastepujacych frakcjach : nr 55 37—48 edeina. E, nr 61—72 edeina C, nr 85—10T edeina D, nr 120—138 edeina B, nr 166—280 ede¬ ina A. Wymienione frakcje laczy sie grupami, za¬ geszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem 20-krotnie i liofilizuje. Otrzymuje sie 7,5 mg edeiny E, 40 mg 60 edeiny C, 150 mg edeiny D, 320 mg edeiny B i 1,6 g edeiny A.Przyklad III. 100 mg p-toluenosulfonianu edeiny A, zawierajacego niewielkie ilosci zanie¬ czyszczen organicznych, rozpuszcza sie w 2 ml me- 65 tanolu i wprowadza sie na kolumne chromatografia88 098 6 czna, zawierajaca 25 g sephadex'u LH—20, specznia- lego w metanolu. Kolumne rozwija sie metanolem, zbierajac wyciek frakcjami. Frakcje, zawierajace edeine A, indentyfikuje sie chromatograficznie, la¬ czy, podgeszcza 10-krotnie i wytraca siarczan ede- 5 iny przez dodanie nadmiaru siarczanu trójetylo- aminy w 50% roztworze wodnym. Osad saczy sie, przemywa kolejno metanolem f acetonem, i suSzy.Otrzymuje sie 38 mg siarczanu edeiny A o akty¬ wnosci 240j/mg. io PL

Claims

Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania i rozdzielania miesza¬ niny edein droga sorpcji z roztworu na kationicie i5 karboksylowym w formie soli, znamienny tym, ze mieszanine edein A, B, C, D i E desorbuje sie z ka- tionitu karboksylowego roztworem zasady, charak¬ teryzujacej sie stala dysocjacja Kb w zakresie 1 X 10-7 do 1 X 10-2, korzystnie 1X10"6 do 20 1 X 10—3, w temperaturze —10—|-30oC, korzystnie w temperaturze 0—|-10oC, odpedza sie z eluatu nadmiar eluenta, zobojetnia sie eluat do wartosci pH równej 4,0—7,0, korzystnie do wartosci pH rów¬ nej 5,5—6,5, roztworem kwasu mineralnego lub or- 25 ganicznego, przeprowadza sie chromatografie otrzy¬ manej mieszaniny edein przy zastosowaniu nosnika anionowymiennego w formie wodorotlenowej i wo¬ dy jako eluenta w temperaturze 0—1-30°, korzyst¬ nie w temperaturze +5—|-150C, wydziela sie frakcje, zawierajace poszczególne skladniki mieszaniny edein i w koncu przeprowadza sie kolumnowa filtracje molekularna soli dowolnej z uzyskanych edein w rozpuszczalniku organicznym i wyodrebnia sie czyste edeiny w postaci soli.
2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze do elucji mieszaniny edein z kationitu karboksylo¬ wego stosuje sie roztwory wodorotlenku amono¬ wego, amin alifatycznych lub heterocyklicznych.
3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze do chromatografii jonowymiennej stosuje sie celu¬ lozy anionowymienne, usieciowane dekstrany anio- nowymienne oraz syntetyczne anionity o róznym stopniu zasadowosci.
4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze do neutralizacji frakcji, uzyskanych w procesie chro¬ matografii jonowymiennej, stosuje sie roztwór kwa¬ su organicznego.
5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze do rozwijania kolumny w procesie filtracji moleku¬ larnej stosuje sie usieciowane dekstrany przysto¬ sowane do pracy w rozpuszczalnikach organicznych. Poic/aal edein fr. Qrld <9-?02h?6 16+712tedbM2m73-£lS3-&D 3H00 M&\ PL