Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych peptydów o wzorze X-Tyr-Ser-Met^Glu- -His^Fen-Arg-Trp-Gli-Liz-PronWal-Gli-Liz-Liz- -Arg-Arg-Pro-Wal-Liz-»Wal-Tyr^Pro-Y,w którym X oznacza reszte -O Gli, -O Ala, DO Ala; -O Ser, albo D-O Ser, a Y oznacza ugrupowanie -Asp-Ala- -Gli-Glu, albo -Asn^Gli-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala, oraz ich soli addycyjnych z kwasami, pochodnych i zwiazków zespolonych.Peptydy wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ ku wykazuja aktywnosc ACTH i zawieraja kwasy a-aminoksykarboksylowe w ich N-koncowym frag¬ mencie czasteczki Wiadomo, ze lancuch peptydowy hormonu adre- nokortykotroipowego /ACTH/ moze byc w znacznej mierze modyfikowany i nie powoduje to zaniku jego adrenokortykotropowej aktywnosci. W ten sipo- sób z C-koncowego fragmentu czasteczki moze byc usunieta wiecej niz jedna trzecia czesc lancucha aminokwasowego bez zmniejszenia specyficznej aktywnosci. Odszczepienie dalszych aminokwasów prowadzi do naglego spadku aktywnosci. Peptyd zawierajacy sekwencje aminokwasów 1—19 hormo¬ nu ACTH posiada 3(Wii aktywnosci oryginalnej czasteczki, podczas gdy aktywnosc fragmentu ACTH o sekwencji aminokwasów 1—16 wynosi zaledwie l#/§ w porównaniu ze zwiazkiem wyjsciowym. Z drugiej strony, usuniecie pierwszego aminokwasu z N-fconcowego fragmentu czasteczki prowadzi do 50*/t Spadku aktywnosci /E. iSohrotier, K. Luibke: 1S 2 The Pepitides, Academic Press, New York, 1966, str. 246—249/.Fragmenty ACTH, w których N-koncowa grupa seryny zastapiona jest przez D-aminokwas, nie¬ naturalny aminokwas lub grupe acylowa otrzyma¬ ne diroga odlaczenia grup funkcyjnych seryny /np. grup p-hydroksypropionylowej lub propionylowej/ wykazuja czasami aktywnosci przekraczajace aktywnosc naturalnego ACTH. Moze to byc przy¬ puszczalnie zwiazane z faktem, ze fragmenty ACTH 0 zmodyfikowanej budowie wykazuja opornosc na dzialanie enzymów typu aminopeptydazy i dlatego ich szybkosc rozpadu w organizmie jest mniejsza niz naturalnego ACTH.Dlatego tez zmodyfikowane fragmenty ACTH wykazuja znaczne adrenokortykotfopowe aktyw¬ nosci takze w tych przypadkach, gdy modyfikuja¬ ca gnipa nie moze calkowicie odgrywac roli N-kon- cowego serynowego fragmentu czasteczki natural¬ nego hormonu. Z podstawionych peptydów ACTH zostaly opisane pochodne D-seryny /brytyjskie opi¬ sy patentowe nr nr 1119 353 i 1163455/ pochodne sarkozyny, 0-alaniny i kwasu a-aminomaslowego /opublikowane niemieckie zgloszenie patentowe nr nr 2 055 151, 2 034 696, 2144300, 2124549 i 2112 533/ jak równiez pochodne P-hydroksypropio- nowe i propionowe /francuskie opisy patentowe nr 1 513 943 i nr 1 513 944 oraz brytyjski opis patento¬ wy nr ii 153 594/.Obecnie stwierdzono, ze zastapienie N-koncowej 87 72087720 3 4 grupy serynowej czasteczki ACTH luib jej frag¬ mentów kwasem zawierajacym ugrupowanie a-ami- nooksy pozwala otrzymac zwiazki o zwiekszonej opornosci na dzialanie czynników enzymatycznych.Szczególnie aktywne okazaly sie pochodne L- i D-a-aminooksypropiomylowe oraz L- i D-a-amino- oksy-fl-hydroksypropionylowe. Fakt ten ma znacze¬ nie z uwagi na to, ze jakkolwiek wymienione ami- nooksykwasy sa strukturalnie bardzo zblizone do glicyny, alaniny i seryny /róznica polega tylko na tym, ze aminoofcsykwasy zawieraja dodatkowy atom tlenu pomiedzy atomem wegla w pozycji a i grupa aminowa/ to jednak ich wlasciwosci fizyko- -chemiczne sa zupelnie odmienne.W zwiazku z powyzszym wynalazek dotyczy spo¬ sobu wytwarzania nowych peptydów, wykazujacych aktywnosc ACTH, majacych calkowita sekwencje ACTH od N-koncowego aminokwasu przynajmniej do szesnastego aminokwasu, ale zawierajacych in¬ ne dowolne aminokwasy w miejscu poszczególnych aminokwasów sekwencji ACTH i zawierajacych zawsze a-aminocksykwas w miejscu pierwszego aminokwasu. Wynalazek dotyczy równiez sposobu wytwarzania soli addycyjnych z kwasami, pochod¬ nych i zwiazków kompleksowych wymienionych peptydów.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie nowe zwiazki, które moga byc na przyklad podstawiony¬ mi peptydami, zawierajacymi za pierwszym amino- oksykwasem fragmenty od 2—16 do 2^39 natural¬ nej czasteczki ACTH. W podstawionych peptydadh poszczególne aminokwasy naturalnej sekwencji ACTH imoiga byc zastapione innymi aminokwasami pod warunkiem, ze zastapienie to nie spowoduje znacznego obnizenia aktywnosci w porównaniu z ACTH. W ten sjposóib, na przyklad drulgi aminokwas /tyrozyna/ moze byc zastajpiony fenyloalanina i/lulb trzeci aminokwas /seryna/ moze byc zastapiony lizyna i/ILuib czwarty aminokwas /metionina/ moze byc zastapiony leucyna, norwalina, norleucyna al¬ bo kwasem a-aminomaslowym i/lub piaty amino¬ kwas /kwas glutaminowy/ moze byc zastapiony glutamina i/lub aminokwasy pietnasty i szesnasty /lizyna/ moga byc zastapione omityna i/lub amino¬ kwasy siedemnasty i osiemnasty /arginina/ moga byc zastapione lizyna lub ornityna.Takie mozliwosci zastapienia istnieja przede wszystkim w odniesieniu do fragmentu aminokwa¬ sów 25—32, poniewaz nawet oryginalne czasteczki ACTH wykazuja róznice w budowie tego fragmen¬ tu. Najbardziej korzystnymi zwiazkami z uwagi na ich aktywnosci adrenokortykotropowe sa /L- lub D-OSer1, Asp*, Ala*«, Gli^-ai-^-ACTH i /D-OSer7- zentuje kwas a-aminooksy-P-hydroksypropionowy rózniacy sie od seryny tlko pojedynczym atomem tlenu pomiedzy atomem wegla w pozycji a i grupa aminowa. W czesci szczególowej opisu zostaly za¬ stosowane skróty dla oznaczenia a-aminooksykwa- sów majacych zblizona budowe do aminokwasów 1 tak na przyklad OGLy oznacza kwas a-amino- oksyoctowy. OAla oznacza kwas a-aminooksypro- pionowy itd."Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie nowe peptydy wykazujace aktywnosc ACTH, jak równiez ich sole addycyjne z 'kwasami, pochodne i zwiazki kompleksowe, stosujac jako produkt wyjsciowy chroniony peptyd, posiadajacy pelna sekwencje ACTH od N-koncowego aminokwasu przynajmniej do szesnastego aminokwasu, ale zawierajacy inne dowolne aminokwasy w miejscu poszczególnych aminokwasów sekwencji ACTH, zawsze zawiera¬ jacy a-aminooksykwas w miejscu aminokwasu pierwszego i niosacy grupy ochraniajace przynaj¬ mniej na ostatniej aminooksygrupie i na grupach aminowych lancuchów bocznych i dowolnie takze na koncowej grupie karboksylowej i grupach kar- boksylowych lancuchów bocznych, dajacy mozli¬ wosc ich odszczepienia w co najmniej jednym eta¬ pie i ewentualnie wytworzony zwiazek przeksztal¬ ca sie w sól addycyjna z kwasem, pochodna lub zwiazek kompleksowy.Chronione peptydy, stosowane w sposobie wedlug wynalazku jako zwiazki wejsciowe wytwarza sie z a-aminooksykwasów i aminokwasów droga czes¬ ciowej kondensacji lub stopniowego wprowadzania poszczególnych aminokwasów we wlasciwej sek¬ wencji. W tym ostatnim procesie stosuje sie me¬ tode mieszanych bezwodników, metoda azydkowa, metode aktywnych estrów luib metode z uzyciem cykloheksylokarlbodwuimidu /DCC/. Stosowana byc moze równiez metoda tzw. syntezy w fazie stalej w zaleznosci od tego, który peptyd w kontakcie z polimerem na jego koncowej grupie karboksylowej zostaje rozbudowany przez utworzenie wiazania C-koncowego aminokwasu polimeru z aminokwa¬ sami i z N-koncowym a-aminooksyfcwasem we Wlasciwej sekwencji.Reaktywne grupy, nie biorace udzialu w reakcji podstawione sa grupami chroniacymi, które moga byc w latwy sposób ponownie usuniete, np. droga hydrolizy, hydrolizy kwasowej, hydrazynólizy lub redukcji. Grupa karboksylowa jest korzystnie chro¬ niona w formie grupy estru metylowego, IH-rzed.- -foutylowego, benzylowego lub p-chlorobenzylowe- go lub droga przeksztalcenia w amid. Arninooksy- grupy i grupy aminowe chronione sa %a pomoca grupy tozylowej, tritylowej, formylowej, trójflu- oroacetylowej, o-nitrosulfenylowej, ftalilowej, ben- zylooksykarbonylowej, p-chlorofoenzylooksykarbo- nylowej i najczesciej Hl-rzed.^butylooksykairbonyr lowej. Grupa guanidynowa czasteczki argininy jest najkorzystniej chroniona grupa nitrowa, ale moze byc równiez chroniona w formie protonowej. Gru¬ pa aminowa histydyny moze byc chroniona grupa benzylowa, tritylowa lufo grupa dwunitrofenylowa.Grupy hydroksylowe znajdujace sie w lancuchach bocznych moga byc chronione droga tworzenia eteru, przy czym najkorzystniejsze jest tworzenie eterów HI-rzed.-foutylowego i benzylowego.Za pomoca prawidlowego doboru grup chronia¬ cych mozna uzyskac zwiazki latwo ulegajace selek¬ tywnemu odszczepieniu grup chroniacych lub ule¬ gajace odszczepieniu w jednym etapie za pomoca hydrolizy, hydrolizy kwasowej, hydrazynólizy lub redukcji.Sposobem wedlug wynalazku chroniony a-amino¬ oksykwas korzystnie kondensuje sie z estrem me¬ tylowym trójpeptydu o wzorze Tyr-Ser-Met-OCHt, otrzymany ester metylowy podstawionego peptydu 40 45 50 55 6087 720 przeksztalca sie w hydrazyd, a nastepnie w azy¬ dek i ten zwiazek stosuje sie do acylacji dekapep- tydu o wzorze Glu/OBut/-His^Phe-Arg-Trp-Gli- -Liz/BOC/-Pro-Wal-Gli. Tak otrzymany podstawio¬ ny tetradekapeptyd kondensuje sie z odpowiednio chronionym C-koncowym fragmentem. Np. podsta¬ wiony tetradekapeptyd kondensuje sie z 15—16 dwupeptydem, 15—18 tetrapeptydem, 15—28 tetra- dekapeptydem, 15—32 oktadekapeptydem lub 15—39 tetrakozapeptydem, uzyskujac odpowiednio podsta¬ wiony heksadekapeptyd, oktadekapeptyd, oktakoza- peptyd, dotriakontapeptyd lub nonatriakontapeptyd.W tej reakcji kondensacji korzystnie stosuje sie dwucykloheksylokarbodwuimid /DCC/ lub metode estrów aktywnych. W tej ostatniej metodzie, szczególnie gdy stosuje sie ester pieciochlorofeny- lowy lub pieciofluorofenylowy, aktywny ester nie musi byc tworzony oddzielnie ale moze powstawac bezposrednio w mieszaninie reakcyjnej z podsta¬ wionego tetradekapeptydu z piecioohlorofenolem lub pieciofluorofenolem i dwucykloheksylokarbo- dwuimidem /DCC/ /patrz brytyjski opis patentowy nr 1 201 053/.Chronione peptydy, zawierajace zawsze a-amino- oksykwas w pozycji 1 i stosowane jako zwiazki wyjsciowe wytwarza sie sposobem wedlug wyna¬ lazku opisanym ponizej.Wlasciwie chroniony C-koncowy fragment acy- luje sie za pomoca chronionego 5^14 dekapepty- du, N-koncowa^ chroniaca grupa tak otrzymanego podstawionego peptydu zostaje usunieta, a uzyska¬ ny zwiazek poddaje sie acylowaniu za pomoca od¬ powiednio podstawionego 1—4 tetrapeptydu. Tym sposobem tetrapeptyd zawierajacy a-aminooksy- kwas jako N-koncowe ugrupowanie zostaje prze¬ ksztalcony bezposrednio w chroniony peptyd za¬ wierajacy N-koncowy a-aminooksykwas, uzytecz¬ ny jako substancja wyjsciowa w sposobie wedlug wynalazku.Przy koncu syntezy grupy III-rzed-butylooksy- kairbonylowe, zwiazane z N-koncowa grupa a-arni- nooksykwasu i z grupami aminowymi lancuchów bocznych, estrowe grupy Ill-rzed.-butylowe zwia¬ zane z grupami karboksylowymi lancuchów bocz¬ nych, a takze z C- jesli nie przeprowadzono jej w amid, "jak równiez eterowe grupy Ill-rzed.-butylowe zwiazane z gru¬ pami hydroksylowymi lancuchów bocznych od- szczepia sie na drodze hydrolizy kwasowej, np. dzialaniem kwasu trójfluorooctowego. Pozbawiony grup chroniacych produkt koncowy oczyszcza sie za pomoca rozdzialu przeciwpradowego lub chro¬ matografii kolumnowej, a takze za pomoca chro¬ matografii na zywicach jonowymiennych z uzy¬ ciem róznych typów karboksymetylocelulozy.Biologiczne aktywnosci nowych zwiazków wy¬ mienionych w przykladach równe sa w pewnych przypadkach aktywnosciom poszczególnych frag¬ mentów ACTH, nie zawierajacych czasteczek a-ami- nooksykwasu. Ocene przeiprowadzono za pomoca testu Sayersa-Saffrana.Zaleznie od metod preparowania i warunków re¬ akcji nowe zwiazki otrzymuje sie/ w postaci wol¬ nych zasad lub ich soli. Sole moga byc przeksztal¬ cone w wolne zasady za pomoca ogólnie znanych metod, natomiast wolne zasady moga byc prze¬ ksztalcone w dopuszczalne do stosowania w lecz¬ nictwie sole addycyjne z kwasami przez dzialanie na nie kwasami organicznymi lub mineralnymi, takimi jak kwas solny, siarkowy, fosforowy, mrów¬ kowy, octowy, mlekowy, winowy, cytrynowy oraz wyzsze kwasy tluszczowe.Pochodnymi nowych zwiazków, których sposób wytwarzania wchodzi w zakres wynalazku sa estry, amidy, N-podstawione amidy, szczególnie amidy peptydów, zawierajace grupy amidowe w C-kon- cowej grupie karboksylowej oraz zawierajace wol¬ ne grupy karboksylowe w lancuchach bocznych.Zwiazki kompleksowe do stosowania w lecz- nictwie wytwarza sie przez polaczenie nowych pep¬ tydów z pewnymi organicznymi lub mineralnymi substancjami gwarantujacymi przedluzenie dziala¬ nia peptydów. Takimi organicznymi zwiazkami sa pewne typy zelatyny, rózne karboksymetylocelulo- zy, aliginaty, poliifloretynofosforany, spolimeryzowa- ne aminokwasy oraz inne polimery lub kopolime¬ ry. Sposród zwiazków mineralnych moga byc bra¬ ne pod uwage pewne pochodne metali, w pierw¬ szym rzedzie wodorotlenki i trudno rozpuszczalne sole jak fosforany lub pirofosforany cynku. W celu uzyskania przedluzonego dzialania moga byc rów¬ niez stosowane pewne krzemiany, które tworza z peptydami nierozpuszczalne zwiazki kompleksowe o blizej nieokreslonej budowie.J0 Nowe peptydy i ich sole, jak równiez pochodne i kompleksy moga byc stosowane w lecznictwie w postaci róznych form farmaceutycznych. Prepa¬ raty farmaceutyczne zawieraja czynne skladniki ewentualnie w mieszaninie z organicznymi lub mi- neralnymi domieszkami w zaleznosci od potrzeby . ich stosowania. Formami ^farmaceutycznymi moga byc stale liofilizaty, zawierajace zwiazki obojetne w stosunku do peptydów jak mannitol, laktoza lub skrobia. 40 Zawiesiny lub emulsje moga zawierac oprócz skladników czynnych równiez dodatki zabezpiecza¬ jace i stabilizujace. Wiekszosc korzystnych produk¬ tów farmaceutycznych zawiera nowe peptydy w formie wymienionych wyzej zwiazków komplekr 45 sowych zapewniajacych przedluzenie ich dzialania.Postacie farmaceutyczne moga zawierac skladni¬ ki czynne w ilosciach powszechnie stosowanych dla hormonów adrenokortykotropowych, to jest w ste¬ zeniu 0,5—5 mg/ml. Postacie te moga byc poda- 50 wane 1—7 razy dziennie podskórnie, domiesniowo lub dozylnie.Ponizsze przyklady szczególowo ilustruja sposób wedlug wynalazku.Skróty uzyte w przykladach dla oznaczenia po- 55 chodnych aminokwasów i peptydów sa zgodne z zaleceniami IUPAC-IUB [J. Biol. Chem. 247, 977, /1972/]. a-aminooksykwasy oznaczono symbolami OGli, OAla, OSer. co Jesli nie podano inaczej skróty te odnosza sie do konfiguracji L z wyjatkiem Gli i OGli. Po¬ nadto w przykladach oznaczono symbolem PCPOH — pieciochlorofenol, PFPOH — pieciofluorofenol, DCC — dwucykloheksylokarbodwuimid, DCU — g:» dwucykloheksylomccznik, BOC — Ill-rzed.-butylo-87 720 8 oksykarbonyl, Btu=IlI-rzed.-butyl ONSu — N-suk- cynimidylooksy, Z — karbobenzylooksy. Tempera¬ tury topnienia wytworzonych zwiazków oznaczono za pomoca aparatu typu Dr Tottoli /Biichli, Swiit- zerland/. Badania chromatograificzne metoda chro¬ matografii cienkowarstwowej przeprowadzono z uzyciem zelu krzemionkowego wedlug Stania, sto¬ sujac nastepujace mieszaniny rozpuszczalników: 1. octan etylu:/pirydyna:kwas octowy:woda= =20:6:4/=8:2 2. octan etylu:/pirydyna:kwas octowy:woda = =20:6:11/^6:4 3. octan etylu:pirydyna:kwas mrówkowy:woda = =50:l20:i6:6,5 4. chloroform:metanol=08:'2 . chloroform:metanol=95:5.Przyklad I. OGli-Tyr-Ser-MetnGlu-His-fen- -Arg-Trp-Gli-Liz-Pro-Wal-Gli-Liz-Liz-Arg-Arg- -Pro-Wal-Liz-Wal-Tyr-Pro-Asip-.Ma-GliHGtLu.©OC^OGli-Tyr-Ser^Met-Glu/OBut/-His-Fen-Arg- -Trp-Gli-Liz/BOC/-Pro-Wal-Gli-Liz-/iBOC/-Liz- /BOC/-Arg-Arg-Pro-Wal-Liz/BOC/-Wal-Tyr/But/- -Pro-Asp/OBut/-Ala-Gli-Glu-/OBut/-OBut. 3HC1 w ilosci 0,600 g /0yl43 mola/ rozpuszcza sie w mieszaninie sporzadzonej z 4,8 ml kwasu trój- fluorooctowego, 0,6 ml wody i 0,6 ml anizolu i roz¬ twór pozostawia sie w temperaturze pokojowej na godzine. Po tym czasie dodaje sie 60 ml eteru, a wydzielony osad odsacza, przemywa sie eterem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem nad pieciotlen¬ kiem fosforu i wodorotlenkiem potasowym. Trój- fluorooctan odpowiednio podstawionego oktakoza¬ peptydu otrzymuje sie w ilosci 0^538 g /87%/. Tak otrzymany surowy produkt w postaci trójfluoro- octanu rozpuszcza sie w 10 ml wody, a nastepnie jony trójfluorooctanowe wymienia sie na jony oc¬ tanowe stosujac wymieniacz jonowy Dowex 1X8.Otrzymany roztwór octanu podstawionego oktako¬ zapeptydu przenosi sie na kolumne z wymienia¬ czem jonowym Whatman OM—52 i eluuje za po¬ moca Ibuforów sporzadzonych z octanu amonowego 0,01 molarnego /pH—4,5/ i 0,4 molarnego /pH—6,7/.Zabrane wlasciwie frakcje laczy sie, a nastepnie liofilizuje uzyskujac 0,22 g /34°/o/ oktakozapeptydu.Analiza w oparciu o absorpcje w nadfiolecie wy¬ kazuje zawartosc peptydu=72—73%, zawartosc Met-sulfotlenku=l,3°/o i stosunek Tyr/Trp=2,05.Analiza zawartosci aminokwasów /teoretyczne wartosci w nawiasie/ Liz: 4,05 /4/, His: 0,93 /l/, Arg: 3,08 /3/, Ser: 0,79 /l/, Glu: 2,01 /Sf/, Pro: 3,09 /3A GOi: 3^04 /3/, Ala: 0,92 /l/, Wal: 3,12 /3/, Met: 0,60 /l/, Tyr: 1,88 /2/, Fen: 0,85 /l/.Trójchlorowodorek podstawionego i chronionego oktakozapeptydu, stosowany jako zwiazek wyjscio¬ wy wytwarza sie sposobem opisanym ponizej: Etap 1. Kwas Hl-rzed.-butylooksykaribonylo-ami- nooksyoctowy /lBOC-OGli/. 316,0 g /2,37 mola/ Ill-rzed.^butylooksykarbony- lohydroksyloaminy rozpuszcza sie w 2680 ml eta¬ nolu, po czym przy chlodzeniu dodaje sie do roz¬ tworu 207,8 g /5,19 mola/ wodorotlenku sodowego i 350,4 g /2,52 mola/ kwasu monobromooctowego.Mieszanine reakcyjna ogrzewa sie pod chlodnica zwrotna w stanie wrzenia w ciagu 20 minut, a nastepnie odparowuje sie rozpuszczalnik do sucha.Pozostalosc rozpuszcza sie w 1940 ml wody i roz¬ twór zakwasza stezonym kwasem solnym do war¬ tosci pH—3. Mieszanine reakcyjna chlodzi sie i miesza w ciagu 2 godzin, po czym odsacza wydzie¬ lone krysztaly. Otrzymuje sie 419 g surowego pro¬ duktu. Po rekrystalizacji z mieszaniny chlorofor¬ mu i n-heksanu otrzymuje sie kwas Ill-rzed.-bu- tylooksykarbonyloaminooksyoctowy w ilosci 388,8 g 1Q /86°/o/ o temperaturze topnienia 115—116°C.Analiza elementarna: dla wzoru C7H18NOB /191,18/ obliczono — C:44,0%, H:6,8%, N:7,2°/o, oznaczono — C:43,9%, H:6,9%, N:7,l°/o.Etap 2. BOCHOGli-Tyr-Ser-Met-iNdH8 1,72 g /9,0 mmoli/ BOC-OGli i 4,5 g /10,0 mmoli/ Tyr-Ber-Met-OCH8. HC1 rozpuszcza sie w 10 ml dwumetyloformamidu i po ochlodzeniu roztworu do temperatury 0°C dodaje sie 1,11 ml /10 mmoli/ N-metylomorfoliny i 1,85 g /9,0 mmoli/ dwucyklo- heksylokarbodwuimidu /DCC/. Mieszanine reakcyj¬ na miesza sie w temperaturze 0°C w ciagu godziny, a nastepnie pozostawia w temperaturze pokojowej do nastepnego dnia. Wydzielony dwucykloheksylo- mocznik /DCU/ odsacza sie, przesacz odparowuje do sucha, a otrzymana pozostalosc rozpuszcza sie w 200 ml octanu etylu. Uzyskany roztwór przemy¬ wa sie dwukrotnie In kwasem solnym /2X100 ml/ i dwukrotnie 8% wodnym roztworem wodorowegla¬ nu sodowego /2X100 ml/, po czym suszy sie i od- parowuje do sucha. Otrzymany, surowy ester me¬ tylowy podstawionego i chronionego tetrapeptydu w ilosci 4,5 g rozpuszcza sie w 45 ml metanolu, do roztworu dodaje sie 1,26 ml /260 mmoli/ wó¬ dziami hydrazyny i calosc pozostawia do nastep¬ nego dnia w temperaturze pokojowej. Po tym cza¬ sie roztwór odparowuje sie do sucha, a do otrzy¬ manej pozostalosci dodaje sie octan etylu. Wy¬ dzielony osad odsacza sie, przemywa octanem etylu i eterem, a nastepnie suszy nad stezonym kwasem siarkowym. Otrzymuje sie 3,30 g /62,5%/ odpo¬ wiednio podstawionego i chronionego tetrapeptydu w postaci hydrazydu. Po rekrystalizacji z wody zwiazek wykazuje temperature topnienia 137°C, Rip=0i36.Analiza elementarna: dla wzoru C24H38N60„S 45 /586,66/ obliczono — C:494°/o, H:6,5°/o, N:14,4°/o, oznaczono — C:49,0°/o, H:i6,6%, N:14,4P/o.Etap 3. BOC-OGli-Tyr-Ser-Met-Glu/OBuV-His- -Fen-Arg/Tip-Gli-Liz/BOC/^Pro-Wal-Gli.HCl 0,41 g /0,70 mmola/ BOC-OGli-Tyr-Ser-Met-N^H, rozpuszcza sie w 5 ml dwumetyloformamidu, roz¬ twór oziebia sie do temperatury —20°C, a nastep¬ nie dodaje sie kroplami 4,4n roztwór chlorowodo¬ ru w octanie etylu w ilosci 0,64 ml /2,8 mmola/.Po zakonczeniu wkraplania dodaje sie 0,105 ml /0,85 mmola/ azotynu Hl-rzed.-butylowego i calosc miesza w ciagu 5 minut w temperaturze —10°C.Po ponownym oziebieniu roztworu do tempera¬ tury —20°C dodaje sie nastepnie 0,96 g /0,70 mmola/ 6o Glu/OBut/-His-Fen-Ang-Trp-Gli-Liz/iBOC/-Pro- -Wal-Gli /patirz brytyjski opis patentowy nr 1 201053/ i 0,48 ml /2,8 mmola/ dwuizopropyloety- loaminy rozpuszczonej uprzednio w 8 ml dwumety¬ loformamidu. Zawartosc naczynia miesza sie w M ciagu 1 godziny w temperaturze —5—0°C i pozo- 40 5587 720 9 stawia w (temperaturze 0°C do nastepnego dnia.Po t^m czasie mieszanine reakcyjna odparowuje sie do sucha, a pozostalosc zadaje 8°/o wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego. Osad odsacza sie, przemywa woda i suszy. Otrzymany, podsta¬ wiony i chroniony tetradekapeptyd w ilosci 0,93 g /69%/ zawiesza sie w 6 ml metanolu. Do zawiesiny dodaje sie mieszanine 1,35 ml pirydyny i 1,35 ml stezonego kwasu solnego. Uzyskany roztwór roz¬ ciencza sie 50 ml wody, a wydzielony osad w po¬ staci chlorowodorku odsacza sie, przemywa woda i suszy. Otrzymuje sie 0,78 g /57%/ produktu o tem¬ peraturze topnienia 202—204°G i ogólnym wzorze C90H132N21O24CIS /1959,66/.Etap 4. BOC-OGli-Tyr-SerHMet/Glu/OBuV-His- -Fen-Arg-Trp-Gli-Liz/BOC/^Pro-Wal/Gli-Liz- /B'OC/HLiz/BOC/-Arg-Arg^Pro-Wal^Liz/BOC/-Wal- -Tyr/BuV^Pro-Asp/OIBut/-Ala-Gli-Glu/OB:ut/-OIBut- 3HCL 0,345 g /0,176 mmola/ BOC-OGli-Tyr-Ser-Met- -Glu-/OButy-His-Fen-Arig-Ti^-Gli-Liz/BOC/JPro- -Wal-Gli. HC1, 0,400 g /0y176 mmola /Liz/BOC/-Liz- /BOC/-Arg-A]ig-Pro-Wail-iLizyi'BOC/^Waa-Tyr/But/- -Pro-Asp/OBuV-Ala^GU-Glu/OBuV^Obu^..- 3 HC1 /patrz brytyjski opis patentowy nr 1 201 053/ i 0,281 g /1,05 mmola/ PCPOH rozpusz¬ cza sie w 3,3 ml dwumetyloformamidu, a nastepnie dodaje sie 0,025 ml /0,18 mmola/ trójetyloaminy i 0,074 g /0,36 mmola/ DCC. Po przetrzymaniu mie¬ szaniny reakcyjnej w temperaturze pokojowej w ciagu dwóch dni wydzielony DCU odsacza sie, a przesacz rozciencza 30 ml eteru. Wydzielony osad odsacza sie, (przemywa eterem i suszy. Otrzy¬ muje sie 0,640 g /87%/ produktu o wzorze Ci94H811N44049CljS /4182,29/, o temperaturze topnie¬ nia 208—212°C i Rf8=0,22.Przyklad II. OAla-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Fen- -Arg-Trp-iGli-Liz-Pro-Wal^GlWLiz-Liz-Arg-Arg- -Pro^Wal-Liz-Wal-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gli-Glu. 0,000 g /0,142 mmola/ BOC-OAla-Tyr-Ser-Met- -Glu/OBuV-His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz/BOC/^Pro- -WaHGli-Liz/BOC/-Liz/HOC/-Ang-Arg-Pro-Wal- -Liz/BOCMWal-Tyr/But/-Pro-Asp-/OBut/-Ala-Gli- -Glu/OBuy-OBu*. 3 HC1 rozpuszcza sie w miesza¬ ninie 4,8 ml kwasu trójfluorooctowego, 0,6 ml wody i 0*6 ml anizolu. Roztwór pozostawia sie na godzine w temperaturze pokojowej, a nastepnie rozciencza sie 60 ml eteru. Wydzielony osad odsacza sie, prze¬ mywa eterem i suszy pod zmniejszonym cisnie¬ niem nad pieciotlenkiem fosforu i wodorotlenkiem poitasowym. Otrzymuje sie 0,532 g /86,5%/ podsta¬ wionego oktakozapeptydu w postaci trójfluorooc- tanu.Produkt ten rozpuszcza sie w 10 ml wody i jony trójfluoroootanowe wymienia sie na jony octanowe stosujac zywice jonowymienna Dowex 1X6 w for¬ mie octanowej. Otrzymany roztwór nanosi sie na¬ stepnie na kolumne z wymieniaczem -jonowym Whatman GM^52 i eluuije za pomoca roztwo¬ rów (buforowych — 0,01 molarnego /pH—4,5/ i 0,4 molarnego /pH—6,7yi octanu amonu. Wlasciwe re¬ akcje laczy sie i liofilizuje. Otrzymuje sie 0,23 g /42°/c/ produktu o zawartosci peptydu=85yl%, za¬ wartosci Met-sulfotlenku 2,7°/o i stosunku Ty /Trp=2,l.Analiza zawartosci aminokwasów /teoretyczne wartosci w nawiasie/.Liz: 3,89 /4/, His: 0,97 /l/, Arg: 3,00 /3/, Asp: 1,10 /l/, Ser: 0,97 /l/, Glu: 1,94 /2/,3 Pro: 3,10 /3/, Gli: 3,06 /3/, Ala: 1,15 /l/, Wal: 2,84 /3/, Met: 0,68 /l/, Tyr: 1,04 /2/, Fen: 1,06 /l/.Podstawiony i chroniony trójchlorowodorek okta¬ kozapeptydu uzyty jako zwiazek wyjsciowy otrzy¬ muje sie w sposób nastepujacy: Etap 1. Kwas IH-rzed.^utylooksykatfbonylo^l-a- -aminooksypropionowy /BOC-OAla/ 4,0 g /29 mmoli/ kwasu D-a^brómopropionowego poddaje sie dzialaniu 3,612 g /65 mmoli/ wodoro¬ tlenku potasowego i 4y39 g'/33 mmola/ III-rzed.- -butylooksykarbonylohydroksyloaminy jak podano w przykladzie I, etap 1. Otrzymany surowy produkt rozpuszcza sie w eiterze, a nastepnie dodaje sie 6,3 ml /32 mmole/ dwucykloheksyloaminy.Otrzymuje sie tym sposobem 6,7 g /60%/ kwasu III-raed.-butylooksykarbonylo-L-a-aminooksypro- pionowego w postaci dwucykloheksyloaminowej soli o temperaturze topnienia 157°C. Zwiazek ten za¬ wiesza sie w eterze, wytrzasa z 0,2 n kwasem siarkowym, a nastepnie faze eterowa odparowuje 2s sie do sucha. Otrzymuje sie 3,05 g /50%/ produk¬ tu o temperaturze topnienia 110—112°C. [a]D80= =—91° /c =l w etanolu/.Analiza elementarna: dla wzoru C8H15N05 /N =205,21/ obliczono: C: 4»6,4%, H: 7,4%, N: 6,8%, 31 oznaczono — C: 46,6%, H: 7,5%, N: 6,8%.Etap 2. BOC-OAla-Tyr-SerHMet-NjHa 1,44 g /7,0 mmoli/ BOC-OAla i 3,50 g /7,8 mmola/ Tyir-Ser^Met-OCH3. HC1 rozpuszcza sie w 12 ml dwumetyloformamidu. Roztwór chlodzi sie do tem- peratury 0°C, a nastepnie dodaje sie 0,85 ml /7,8 mmola/ N-metylomorfoliny i 1,46 g /7,2 mmola/ DCC. Po godzinnym mieszaniu w temperaturze 0°C pozostawia sie mieszanine reakcyjna w temperatu¬ rze pokojowej do nastepnego dnia, po czym odjparo- 4« wufie sie metanol, a pozosltalosc zadaje sie octanem etylu. Wydzielony osad odsacza sie, przemywa octa¬ nem etylu i eterem, a nastepnie suszy nad stezo¬ nym kwasem siarkowym.Otrzymuje sie 2,1 g/50%/ produktu, który po 45 rekrystalizacji z wody topnieje w 147°C. Rf1=0,43.Analiza elementarna: dla wzoru C25H4eNfi09S /M=600,69/ obliczono — C: 50,0%, H: 6,7%, ozna¬ czono — C: 49,6%, H: 6,7%.Etap 3. BOC-OAla-Tyr-SernMet-Glu-/OBuV-His- 50 -Fen-Arg-TrpHGli-Liz/BOC/-ProJWal-Gli. HC1 0,266 g /0,44 mmola/ BOC-OAla-Ty r-Ser-Met- -N2H3 rozpuszcza sie w 3,2 ml dwumetylofarmami- du i po ochlodzeniu do temperatury —20°C do¬ daje sie 0,41 ml /1£ mmola/ 4,4n cMorowodoru w 55 octanie etylu i 0,07 ml /0,59 mmola"/ azotynu III- -rzed.-butylowego. Po 5 minutowym mieszaniu w temperaturze —10°C calosc chlodzi sie do tempe¬ ratury -^20°C, po czym dodaje sie 0,600 g /0,438 mmola/ Glu/OBuV-His-lFen-Arg-Trp-Gli-Liz/BOC/- eo -Pro-Wal-iGli i 0,31 ml /1,8 mmola/ dwuizopropy- loetyloaminy rozpuszczonej uprzednio w 5 ml dwu¬ metyloformamidu. Po godzinnym mieszaniu w tem¬ peraturze —5^0°C calosc pozostawia sie do na¬ stepnego dnia w temperaturze 0°C. Po odparowa¬ li niu dwumetyloformamidu pozostalosc zadaje sie11 87 720 12 8% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego, a wydzielony osad odsacza sie, przemywa woda i suszy. Otrzymany podstawiony i chroniony tetra- dekapeptyd w ilosci 0,70 g /81%/ zawiesza sie w ml metanolu, po czym dodaje sie mieszanine 1 ml stezonego kwasu solnego i 1 ml pirydyny.Nastepnie roztwór rozciencza sie 50 ml wody, a wydzielony osad odsacza, przemywa woda i suszy.Otrzymuje sie gotowy produkt o wzorze C91H1MN21Q24CIS /1973,68/ o temperaturze topnienia 200—202°C. Rf2=0,19.Etap 4. BOC-OAla-Tyr-Ser-Met-Glu/OBuV-His- -fen-Arg-Trp-Gli-Liz-/BOC/-Pro-Wal-Gli-Liz/BOC/- -Liz-/BOC/-Arg-Arg-Pro-Wal-Liz-/BOC/-Wal-Tyr- /BuV-Pro-Asp-/OBut/-Ala-Gli-Glu/OBuV-OBut. 3 HCl 0,348 g /0,176 mmola/ BOC-OAla-Tyr-Ser-Met- -Glu/OBut/-His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz/BOC/-iPlro- -Wal-Gli-.HCl, 0,400 g /0,176 mmola/ Liz/BOC/-Liz- /BOC/-Arg-Arg-Pro-Wal-Liz/BOC/-Wal-Tyr/Bu7- Pro-Asip/DBut/-Ala-Gli-Gilu/OBut/-OBuVl. 3 HCl i 0,281 g /1,05 mmola/ PCPOH rozpuszcza sie w 3,3 ml dwumetyloformamidu, po czym do roztworu dodaje sie 0,025 ml /0,18 mmola/ trójetyloaminy i 0,074 g /0,36 mmola/ DCC. Mieszanine reakcyjna pozostawia sie w ciagu dwóch dni w temperaturze pokojowej. Wydzielony osad DCU odsacza sie, a przesacz rozciencza sie 30 ml eteru. Wydzielony osad gotowego produktu odsacza sie, przemywa eterem i suszy. Uzyskuje sie 0,658 g /89°/o/ zwiazku o wzorze C195H318N44049C1«S /4196,36/ o temperaturze topnienia 175-h177°C. Rf8=0,25.Przyklad III. D-OAla-Tyr-Ser-Met-Glu-His- -Fen-Arg-Trp-Gli-Liz-Pro-Wal-Gli-Liz-Liz-Arg- -Arg-Pro-Wal-Liz-Wal-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gli-Glu 0,600 g /0,142 mmola/ BOC-D-OAla-Tyr-Ser^Met- -Glu/OBuV-His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz/BOC/^Pro, Wal-Gli-Liz/BOC/-Liz/BOC/«Arg-Arg-Pro-Wal-Liz- /BOC/-Wal-TymBuV-Pro-Asp/OBut/Ala-Gli-Glu-' /OBuV-0But. 3 HCl rozpuszcza sie w mieszaninie 4,8 ml kwasu trójfluorooctowego, 0,6 ml wody i 0,6 ml anizolu, a nastepnie pozostawia na godzine w temperaturze pokojowej. Po rozcienczeniu 60 ml eteru wydzielony osad odsacza sie, przemywa ete¬ rem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem nad pie¬ ciotlenkiem fosforu i wodorotlenkiem potasu.Otrzymuje sie 0,546 g /88,5%/ podstawionego oktakozapeptydu w .postaci trójfluorooctanu, który rozpuszcza sie w 10 ml wody i przeprowadza w octan za pomoca zywicy jonowymiennej Dowex 1X8 w postaci octanowej.Otrzymany roztwór wiprowadza sie na kolumne wypelniona wymieniaczem jonowym Wihatman GM—&Z i eluuje za .pomoca roztworów buforowych — 0,01 molarnógo /pH—4,5/ i 0,4 molarnego /pH— -^6,7/ octanu amonu. Po polaczeniu wlasciwych frakcji poddaje sie je procesowi liofilizacji. Uzy¬ skuje sie 0,245 (g /39tyo/ produktu o zawartosci pep- tydu^7l5%. Oznaczenie wykonane za pomoca ab¬ sorpcji w nadfiolecie wykazalo zawartosc Met-sul- fotlenku=E,57% i stosunek Tyr/Trp=2,07.Analiza zawartosci aminokwasów /teoretyczne wartosci w nawiasach/: Liz: 4,35 /4/, His: 0,97 /l/, Arg: 3,13 /3/, Asp: 1,06 /!/, Ser: 1,00 /!/, Glu: 1,92 /2/, Pro: 2,90 /3/, Gli: 3,00 /3/, Ala: 1,00 /l /,Wal: 2,92 /3/, Met: 0,87 /l/, Tyn 2,21 /2/, Fen: 1,06 /l/.Trójchlorowodorek podstawionego i chronionego oktakozapeptydu jako zwiazek wyjsciowy otrzy- muje sie w sposób nastepujacy: Etap 1. Kwas III-rzed.-butylooksykarbonylo-D-a- -aminooksyfrropionowy /BOC-D-OAla/. 7,04 g /51 mmoli/ kwasu L-a-bromopropionowego poddaje sie dzialaniu 6,3 g /l 12 mmoli/ wodoro- tlenku potasowego i 7,71 g /58 mmoli/ III-rzed.- -butylooksykarlbonylohydroksyloaminy, jak podano w przykladzie I etap 1. Surowy produkt rozpuszcza sie w eterze, a nastepnie dodaje sie 11,0 ml /56 mmoli/ dwucykloheksyloaminy.Tym sposobem otrzymuje sie 14,85 g /75°/o/ kwa¬ su III-rzed.-butylooksykafrbonylo^D-a-bromopropio- nowego w postaci dwucykloheksyloaminowej soli o temperaturze topnienia 157°C. Zwiazek ten za¬ wiesza sie w eterze, wytrzasa z 0,2n roztworem kwasu siarkowego i faze eterowa po jej oddziele¬ niu odparowuje sie do sucha. Otrzymuje sie 6,55 g /62*/o/ produktu o wzorze C8H15(N05 /205,21/ i tem¬ peraturze topnienia 110—ill'l°C. [a]£=+90,0° /c=l w etanolu/.Etap 2. BOC-D-OAla-Tyr-Ser-Met-N2H, 1,85 g /9,0 mmoli/ BOC-D-OAla i 4,50 g /10 mmoli/ Tyr-Ser^Met-OCH8.HCl rozpuszcza sie w ml dwumetyloformamidu, roztwór chlodzi sie do temperatury 0°C, a nastepnie dodaje sie 1,11 ml /10 mmoli/ N-metylomorfoliny i 1,90 g /9,2 mmola/ DCC. Po godzinnym mieszaniu w temperaturze 0°C pozostawia sie mieszanine reakcyjna do na¬ stepnego dnia w temperaturze pokojowej. Wydzie¬ lony w tym czasie DCU odsacza sie, przesacz od- parowuje do sucha, a uzyskana pozostalosc roz¬ puszcza sie w 200 ml octanu etylu. Roztwór ten wytrzasa sie dwukrotnie z In kwasem solnym /2X100 ml/ i dwukrotnie z 8% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego /2X100 ml/, a nastepnie 40 suszy sie i odparowuje.Otrzymuje sie 3,65 g zelowatej pozostalosci, która rozpuszcza sie w 40 ml metanolu, a nastepnie do¬ daje 1,02 ml /21,2 mmola/ wódziami hydrazyny i pozostawia do nastepnego dnia w temperaturze po- 45 kojowej. Po tym czasie odparowuje sie metanol, a pozostalosc rozciera z octanem etylu, osad odsacza, przemywa octanem etylu i eterem, a nastepnie suszy nad stezonym kwasem siarkowym. Otrzy¬ muje sie 1,90 g /35°/o/ produktu, który po rekry- 50 stalizacji z wody ma temperature topnienia 184— —185°C. R^-0,43.Analiza elementarna: dla wzoru CjsH^eOcS /600,i69/ obliczono — C: 50,0*/o, H: 6,7Vo, N: 14,0«/o, oznaczono — C: 49,6%, H: 6,68f/o, N: l4,l#/o. os Etap 3. BOC-D^OAla-Tyr-Ser-Met-Glu/OBuV- -His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz-/BOC/^Pro-Wal-Gli. HCl 0,381 g /0,635 mmola/ BOC-D-OAla-Tyr-Ser^Met- -N2H3 rozpuszcza sie w 4,5 ml dwumetyloforma¬ midu i po ochlodzeniu do temperatury —20°C, 60 przy mieszaniu dodaje sie kroplami 0,58 ml /2,65 mmola/ 4,4n roztworu chlorowodoru w octanie etylu oraz 0,095 ml /0,80 mmola/ azotynu III-irzed- -butylowego. Po mieszaniu w temperaturze —10°C w ciagu 5 minut mieszanine reakcyjna chlodzi sie 65 ponownie do temperatury —20°C, po czym dodaje13 87 720 14 sie roztwór 0,86 g /0,628 mmola/ Glu/OBuV-His- -Fen-Arg-Trp-Gli-Liz/BOC/-Pro-Wal-Gli i 0,43 ml /2,50 mmola/ dwuizopropyloetyloaminy w 7,2 ml dwumetykrformamidu.. Mieszanine reakcyjna utrzy¬ muje siew ciagu godziny w temperaturze od -^5 5 do 0%, a nastepnie pozostawia do nastepnego dnia w temperaturze 0°C. Po itytm czasie dwuimetylofor- mamid odparowuje sie, a pozostalosc wytrzasa z Styi wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego.Osad odsacza sie, przemywa woda i suszy. Otrzy- 10 many, podstawiony i chroniony tetradekapeptyd w ilosci 0,95 g /TT'/*/ zawiesza sie w 6 ml meta- nolu i do zawiesiny dodaje sie mieszanine 1,35 ml stezonego kwasu solnego i 1,35 ml pirydyny. Na¬ stepnie powstaly roztwór rozciencza sie 50 ml wody. 15 Wydzielony osad odsacza sie, przemywa woda i suszy. Otrzymuje sie 0,78 g l§&l*l produktu o wzo¬ rze C91H18^N21024CIS /1973,68/ o temperaturze top¬ nienia 2O4-S10°C iRf*-0,20. / Etap 4. BOC-D-OAla-Tyr-Ser-Met^Glu/OBuV-His- 2° -Fen-Arg-Trp-Gli-Liz-/BOC/-Pro-Wal-Gli-Liz- /BOC/-!Liz/BOC/-Arg-Arg-Pro-Wal^Liz/BOC/-Wal- -Tyr-/BuV-Pro-Asp/OBut/-Ala-Gli-Glu-/OBuV- -OBut. 3 HQ. 0,348 g /0,l78 mmola/ BOC-D-OAla-Tyr-Ser-Met- 25 -Glu/OBuV-His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz/BOC/-Pro- -Wal-Gli. HC1, 0,400 g /0,176 mmola/ Liz/BOC/-Liz- /BOC/-Arg-Arg^Pro-Wal-Liz/BOC/-Wal-Tyr/[BuV- -Pro-Asp/OBuV-Ala-Gli-Glu/OBut/OBut. 3 HC1 i 0,281 g /1,05 mmola/ PCPOH rozpuszcza sie w 30 3,3 ml dwumetyloformamidu, po czym do roztworu dodaje sie 0,025 ml /0,18 mmola/ trójetyloaminy i 0,074 g /0,36 mmola/ DCC. Mieszanine reakcyjna pozostawia sie na okres dwóch dni w temperaturze pokojowej, po czym odsacza sie wydzielony DOU, 35 a przesacz (rozciencza 30 ml eteru. Wydzielony osad '-. odsacza sie, przemywa eterem i suszy. Otrzymuje sie 0^647 g /87,5°/o/ produktu o wzorze C195H3t8N44- O^CliS /4196,32/ i temperaturze topnienia 166— —107°C.Rf«=0,25. 40 Przyklad IV. OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Fen- -ATg-Trp^Gli-Liz-Pro-Wal-Gli-Liz-Liz-Arg-Arg- ^Pro-Wal-Liz-Wal-Tyr-Pro-Asp-AlaHGli-Glu. 0,68 g /0,142 mmola/ BOCnOSer-Tyr-SerHMet- -GlU/OBu^/-His-Fen-Arig-TrpHLiz-Liz/BOC/-Pro- 45 JWal^Gli-Liz/BOC/-Liz/BOC/-Arg-Arg-^ProHWal- rLiz/BOC/-'Wal-Tyr/Eut/-'Pro-Asp-/OBuV-Ala-Gli- -Glu/OBut/^PBut. 3 HC1 rozpuszcza sie w miesza¬ ninie 4,8 ml kwasu trójfluorooctowego, 0,6 ml wody i 0,6 ml anizolu, a nastepnie pozostawia calosc w 50 temperaturze pokojowej na godzine. Po tym czasie dodaje sie 60 ml eteru, a wydzielony osad saczy sie, przemywa eterem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem nad pieciotlenkiem fosforu- i wodorotlen¬ kiem potasowym. Otrzymany trójtfluoroootan pod- 55 stawionego oktakozapeptydu w ilosci 0,400 g /65%/ rozpuszcza sie w 8 ml wody, a nastepnie jony trój- fluorooctanowe wymienia sie na jony octanowe sto¬ sujac zywice jonowymienna Dbwex 1X8 w octa¬ nowejpostaci. so iRoztwór zawierajacy peptyd w postaci octanu nanosi sie nastepnie na kolumne wypelniona wy¬ pelniaczem jodowym Whatman CM-^58 i eluuje za pomoca roztworów buforowych — 0,01 molame¬ go /pH—4,5/ i 0,4 molamego /pH—6,7/ octanu amo- a nu. Zebrane, wlasciwe frakcje laczy sie i poddaje procesowi liofilizacji. Otrzymuje sie 0,240 g /41,5°/t/ produktu o zawartosci peptydu=81,6°/o /oznaczenie wykonane w oparciu o absorpcje w nadfiolecie/, zawartosci Met-sulfotlenku=4,4e/o i stosunku Tyr- /T\rp=2,13.Analiza zawartosci aminokwasów /teoretyczne wartosci w nawiasie/.Liz: 3,92 W, His: 1,00 /l/, Arg: 3,15 /3/ Asp: 0,90 /!/, Ser: 0,83 /l/, Glu: 1,94 Fll9 Pro: 3,00 /3/, GH: 3,05 /3/, Ala: 1,04 /l/, Wal: 2,92 /3/, Met: 0,79 /l/, xTyr: 1,83 /2/, Fen: 0,97 /l/.Trójchlorowodorek podstawionego i chronione¬ go oktakozapeptydu, stosowany jako zwiazek wyj¬ sciowy otrzymuje sie sposobem opisanym ponizej.Etap 1. Kwas t-butylooksykarbonylo-L^a-amino- oksy-pHbenzylooksypropionowy. 48,4 g /0,364 mola/ III-rzed.-butylooksykarbony- lohydroksyloaminy, 40,7 g /0,728 mola/ wodorotlen¬ ku potasu i 94,0 g /0,364 mola/ kwasu DL-a-bromo- -P^benzylooksypropionowego irozpuszcza sie w 360 ml wody i miesza w ciagu trzech godzin w temperaturze pokojowej. Po zakwaszeniu do war¬ tosci pH 3 mieszanine reakcyjna ekstrahuje sie trzykrotnie eterem /3X720 nil/. Polaczone fazy ete¬ rowe przemywa sie woda w ilosci 720 ml i po osuszeniu srodkiem suszacym dodaje sie 78 ml /0,40 mola/ dwucykloheksyloaminy. Otrzymuje sie sól dwucykloheksyloaminowa kwasu Ill-rzed.nbu- tylooksykarbonylo-DL-a-aminoóksy-P-benzylóoksy- propionowego o temperaturze topnienia 144—146°C w ilosci 43,61 g.Produkt ten zawiesza sie w 500 ml eteru, a nastepnie zawiesine wytrzasa sie pieciokrotnie z 0,2n roztworem kwasu siarkowego /5X100 ml/. Roz¬ twór eterowy suszy sie, a nastepnie odparowuje do sucha, po czym uzyskana pozostalosc rozpuszcza sie w 700 ml etanolu i dodaje 6,56 g /48,5 mmola/ zasady /+/-amfetaminy. Mieszanine reakcyjna chlodzi sie i pozostawia do nastepnego dnia. Wy¬ dzielone krysztaly odsacza sie, a lugi pokrystalicz- ne odparowuje sie uzyskujac 9,33 g /16,5°/o/ konco¬ wego produktu o wzorze C1BH21N06 /311,34/ i tem¬ peraturze topnienia 95—07°C. [a]£=—36° w etanolu/.Etap 2. Kwas HI-rzed.-butylooksykarbanylo-L- -a-aminooksy-p-hyd ,0 g /16,1 mmola/ kwasu L-a-IH-rzed.-butylo:- oksykarbonyloaminooksy-(3-benzylooksypropionowe- go rozpuszcza sie w 100 ml metanolu i roztwór poddaje sie uwodornieniu w obecnosci 2,5 g 10*/« palladu na weglu aktywowanym jako katalizatora.Pó trzech godzinach katalizator odsacza sie, a prze¬ sacz odparowuje. Oleista pozostalosc zalewa sie ete¬ rem naftowym i pozostawia w spokoju na kilka godzin. Wydzielona substancje krystaliczna odsacza * sie i suszy. Otrzymuje sie 3,2 g /90%/ produkt o wzorze C8H15NOfl /221,22/, o temperaturze topnie¬ nia 94^95°C i Rf1=0,27.Etap 3. BOC^OSer-TyrHSer-Met-N2H8 2,2 g /10 mmoli/ BOC^OSer- i 4,50 g /10 mmoli/ Tyr-Ser-Met-OCH8.Hd rozpuszcza sie w 15 ml dwumetyloformamidu, roztwór chlodzi sie do tem¬ peratury 0°C, a nastepnie dodaje sie 1,11 ml /10 mmoli/ N-metylomorfoliny i 1,00 g /9,2 mmola/87 720 DCC. Po mieszaniu w ciagu godziny w tempera¬ turze 0°C, mieszanine reakcyjna pozostawia sie do nastepnego dnia w temperaturze pokojowej. Wy¬ dzielony osad DCU odsacza sie, przesacz odparo¬ wuje, a uzyskana pozostalosc rozpuszcza sie w 200 ml octanu etylu. Roztwór przemywa sie dwu¬ krotnie In kwasem solnym /2X100 ml/ i dwukrot¬ nie 8% wodnym roztworem wodoroweglanu sodo¬ wego /2X100 ml/, po czym osusza i odparowuje do sucha. Otrzymany w ilosci 3,7 g ester tetrapep- tydu rozpuszcza sie w 40 ml metanolu, dodaje 1,0 ml /20,4 mmola/ wodzianu hydrazyny i pozo¬ stawia w temperaturze pokojowej do nastepnego dnia. Po tym czasie metanol odparowuje sie, a po¬ zostalosc rozciera z octanem etylu. Wydzielony osad ^cza sie, przemywa octanem etylu i eterem, a nastepnie suszy nad stezonym kwasem siarkowym.Obrzymuje sie 2,5 g /44% zwiazku o temperaturze topnienia 141QC i R/=0,30.Analiza elementarna dla wzoru C25H4dNcO10S '616,69/ obliczono — C: 48,7%, H: 6,55%, N: 13,6%, aczono — C: 43,3%, H: 6,7%, N: 13,3%.Etap 4. BOC-OSer-Tyr-Ser^Met-Glu/OBut/-His- e^-Arg-Trp-Gli^Liz/BOC/-Pro-Wal-Gli. HC1 0,274 g /0,446 mmola/ BOC-OSer-Tyr-Ser-Met- -N2H8 rozpuszcza sie w 3,2 ml dwumetyloformami- du i po ochlodzeniu roztworu do —20°C, mieszajac dodaje sie kroplami 0,41 ml /lfi mmola/ 4,4n roz¬ tworu chlorowodoru w octanie etylu oraz 0,-07 ml /0,59 mmola/ azotynu III-rzed.Jbutylowego. Zawar¬ tosc naczynia miesza sie w ciagu 5 minut w tem¬ peraturze —10°C, ponownie chlodzi do temperatu¬ ry —20^ i dodaje roztwór 0^600 g /0,438 mmola/ Glu/OBuV-His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz/BOC/-Pro- -Wal-Gli i 0,31 ml /lfi mmola/ dwuizopropyloety- loaminy w 5 ml dwumetyloformamidu. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu godziny w tempera¬ turze od —5 do 0°C, a nastepnie pozostawia do na¬ stepnego dnia w temperaturze 0°C.Po tym czasie rozpuszczalnik odparowuje sie, a pozostalosc rozciera sie z 8% wodnym roztworem wodoroweglanu sodu. Osad odsacza sie, przemywa woda i suszy. Otrzymuje sie 0,69 g /79%/ podsta¬ wionego i chronionego tetradekapeptydu, który za¬ wiesza sie w 5 ml metanolu. Do zawiesiny dodaje sie mieszanine 1 ml stezonego kwasu solnego i 1 ml pirydyny, po czym uzyskany roztwór rozcien¬ cza sie 50 ml wody i odsacza wydzielony osad. Po przemyciu osadu woda i wysuszeniu otrzymuje sie 0,471 g /54%/ produktu o wzorze Cg^^^OigCLS /1989,68/, o temperaturze topnienia 198—202°C i Rf*=0,16.Etap 5. BOC-OSer-Tyr-SerHMelt-Glu/OBut/-His- -Fen-Arg-Trp-Gli^Liz/BOC/-Pro-IWal-Gli-Liz- /BOC/^Liz/BOC/-Arg-Arg-ProHWal-Liz/BOC/-Wal- -Tyr/BuV^Pro-Asp/OBut/-Ala-Gli-Glu/OBut/-OBut. .3 HC1 0,350 g /0,176 mmola/ ®OCOSer-Tyr-Ser-Met- -Glu/OBut/-His-Fen-Arg-Trp-Gli^Liz/BiOC/^Pro- -Wal-Gli. HC1, 0,400 g /0,176 mmola/ Liz/BOC/- -Liz/BOC/-Arg-ArgjPro-Wal-Liz/BOC/-Wal-Tyr- /BuV-Pro-Asp/OBuV-Ala-Gli^Glu/OBut/-OBu*. 3 Hd i 0,281 g /1,05 mmola/ PCPOH rozpuszcza sie w 3,3 ml dwumetyloformamidu i dodaje sie 0,025 ml /0,18 mmola/ trójetyloaminy, a nastepnie 16 0,074 g /0,36 mmola/ DCC. Mieszanine reakcyjna pozostawia sie w -temperaturze pokojowej na dwa dni, po czym wydzielony DCU odsacza sie, a prze¬ sacz rozciencza 30 ml eteru. Wydzielony produkt odsacza sie, przemywa eterem i suszy. Otrzymuje sie 0,659 g /88,5%/ zwiazku o wzorze C195H81»N44- O50CI4S /421i2,33/, o temperaturze topnienia 160— ^1G6°C i Rf»=0y22.Przyklad V. D-OSer-Ty r-SerjMet-Glu-His- -Fen-Ang-Trp-Gl^-Liz-Pro-Wal^Gli-Liz-Liz-Arg- -Arg-Pro-Wal-Liz-Wal-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gli-Glu 0,600 g /0,142 mmola/ BOC^D-OSer-Tyr-Ber-Met- -Glu/OBut/-His^Fen-Arg-Trp-Gli-Liz-/BOC/-Pro- -Wal-Gli-Uz-/BOC/-Liz/BOC/Arg-Arg-Pro-Wal- ^Liz/BOC/-Wal-Tyr-y,But/-Pro-Asp-/OBuV-Ala-Gli- -Glu/OButZ-OBut. 3 HC1 rozpuszcza sie w miesza¬ ninie 4,8 ml kwasu trójfluorooctowego, 0,6 ml wody i 0,6 'ml anizolu. Mieszanine reakcyjna .pozostawia sie na godzine w temperaturze pokojowej, a na- stepnie rozciencza 60 ml eteru.Wydzielony osad odsacza sie, przemywa eterem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem nad piecio¬ tlenkiem fosforu i wodorotlenkiem .potasu. Otrzy¬ muje sie 0,533 g /86,5%/ trójfluorooctanu podsta- wionego oktakozapeptydu. Zwiazek ten rozpuszcza sie w 10 ml wody, a nastepnie przeprowadza w octan stosuijac zywice jonowymienna Dowex 1X8 w octanowej postaci. Uzyskany roztwór peptydu w postaci octanu wprowadza sie na kolumne z 80 wymieniaczem jonowym Whatman CM—52 i eluuje za pomoca roztworów buforowych — 0,01 molar- nego /pH—4,5/ i 0,4 molarnego /pH-^6,7/ octanu amonu. Wlasciwe frakcje zbiera sie, laczy i pod¬ daje procesowi liofilizacji. Otrzymuje sie 0,250 g w /43%/ produktu o zawartosci peptydu —8il,0% (oznaczenie wykonane w oparciu o absorpcje w nadfiolecie), zawartosci Me^t-sulfoitlenku=4,4% i stosunku Tyr/Trp—2,05.Analiza zawartosci aminokwasów /teoretyczne wartosci w nawiasie/: Liz: 3,76 /4/, His: 0,8 /l/, Arg: 3,05 /3/, Asp: 1,00 /l/, Ser: 0,73 /!/, Glu: 1,94 /2/, Pro: 3,00 /3/, Gli: 2,95 /3/, Ala: 1,05 /l/, Wal: 2,82/3/, Met: 0,78 /l/, Tyr: 1,6/2/, Fen: 0^3 /l/.Trójchlorowodorek podstawionego i chronionego oktakozapeptydu, stosowany jako zwiazek wyjs¬ ciowy otrzymuje sie w sposób opisany ponizej.Etap 1. Kwas III-rzed.-butylooksykarbonylo^D- 50 -a-aminooksy-pnbenzylooksypropionowy.Sól /+/-amfetaminowa kwasu Ill-rzed.-butylo- oksykarbonylo-D-a-aminooksy-f3-benzylooksypro- pionowego otrzymana wedlug przykladu IV etap 1 rekrystalizuje sie z etanolu. Otrzymuje sie 13,27 g 55 czystej substancji o temperaturze topnienia 188— —191°C i [a]£ = +54° /c=0,5 w metanolu/. Po rozlozeniu uzyskuje sie 7,9 g /14%/ soli kwasu III-rzed.4)utoksykarbonylo-D-a-aminooksy-|3-ben- zyloksypropionowego o temperaturze topnienia 60 96—98°C [a] ^+38° /c=l w etanolu/.Etap 2. Kwas HI-rzed.-butylooksykarbonylo-D- -a-nminooksy-P-hydroksypropionowy /BOC-D-OSer/ ,5 g /17,7 mmola/ kwasu D-a-IH-rzed.-butylo- oksykarbonyloaminooksy-P-benzylooksypropiono- 65 wego rozpuszcza sie w 110 ml metanolu i roztwór87 720 17 poddaje sie uwodornieniu w obecnosci 2,75 g 10°/o palladu na weglu aktywowanym jako katalizatora.Po trzech godzinach reakcji katalizator odsacza sie, przesacz odparowuje, a oleista pozostalosc zadaje sie eterem naftowjjp. Wydzielona po kilku godzi¬ nach krystaliczna substancje odsacza sie i suszy.Otrzymuje sie 3,65 g /96°/o/ kwasu D-a-III-rzed.- -.butylooksykarbonyloaminooksy-p-hydroksypropio- nowego o wzorze C8Hi5N06 /221,22/ o temperaturze topnienia 94—95°C i Rf1=0,27.Etap 3. iBOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-NgHa 4,4 g /20 mmoli/ BOC^D-OSer- i 9,0 g /20 mmoli/ Tyr^Ser-iMet^OCHg rozpuszcza sie w 30 ml dwu- metyloformamidu. Po ochlodzeniu roztworu do temperatury 0°C dodaje sie 2,22 ml /20 mmoli/ N-metylomorfoliny i 3,8 g /18,4 mmola DCC. Po mieszaniu w ciagu godziny w temperaturze 0°C mieszanine reakcyjna pozostawia sie do nastepnego dnia w temperaturze pokojowej.Wydzielony DCU odsacza sie, a przesacz odparo¬ wuje do sucha. Otrzymana ipozostalosc rozpuszcza sie w 400 ml octanu etylu, uzyskany roztwór przemywa dwukrotnie In kwasu solnym /2Xl'00ml/ i dwukrotnie 8% wodnym roztworem wodorowe¬ glanu sodowego /2X100 ml/, po czym suszy sie i odparowuje do sucha. Otrzymane 8,li0 g estru pod¬ stawionego i chronionego tetrapeptydu rozpuszcza sie w 85 ml metanolu, dodaje 2,2 ml /46 mmoli/ wodzian hydrazyny i mieszanine reakcyjna pozo¬ stawia w temperaturze pokojowej do nastepnego dnia. Po tym czasie metanol odparowuje sie, po¬ zostalosc rozciera z octanem etylu, a wydzielony osad odsacza sie, przemywa octanem etylu i ete¬ rem, a nastepnie suszy nad stezonym kwasem siar¬ kowym. Otrzymuje sie 7,21 g /63%/ produktu, któ¬ ry ,po rekrystalizacji z wody ma temperature top¬ nienia 174^175°C i 11^=0,30.Analiza elementarna: dla wzoru C25H40N6O10S /616,69/ obliczono — C: 48,7%, H: 6,55%, N:13,6%, oznaczono — C: 48,3%, H: 6,6%, N: 13,8%.Etap 4. BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met^Glu/OBut/- -His-Fen-Arg-Trp-Gli^Liz/BOC/-Pro-Wal-Gli- . HC1 1,25 g /2,13 mmola/ BOCnD-OSer-Tyr-Ser-Met- -N2HS rozpuszcza sie w 15 ml dwumetyloformami- du, roztwór chlodzi sie do temperatury —20°C, a nastepnie mieszajac dodaje sie kroplami 2,08 ml /8,32 mmola/ 4n roztworu chlorowodoru w octanie etylu i 0,312 ml /2,70 mmola/ azotynu Ill-irzed.-bu- tylowego. Po mieszaniu w temperaturze —10°C w ciagu 5 minut, mieszanine reakcyjna chlodzi sie ponownie do temperatury —20°C, a nastepnie do¬ daje roztwór 2,78 g Glu/OBuV-His-Fen-Arg-Trp- -Gli-Liz/iBOC/-Pro-Wal^Gli i 1,4 ml fSfl.3 mmola/ dwuizopropyloetyloaminy w 23 ml dwumetylofor- mamidu, miesza sie w ciagu godziny w tempera¬ turze od —5 do 0°C i pozostawia w temperaturze pokojowej do nastepnego dnia.Po odparowaniu rozpuszczalnika pozostalosc roz¬ ciera sie z 8% wodnym roztworem wodorowegla¬ nu sodu, wydzielony osad odsacza sie, przemywa woda i suszy. Otrzymuje sie 3,49 g /94%/ podsta¬ wionego i chronionego tetradekapeptydu, który za¬ wiesza sie w 24 ml metanolu, po czym dodaje sie mieszanine 4,75 ml stezonego kwasu solnego i 4,75 ml pirydyny. Otrzymany roztwór rozciencza sie 1S 240 ml wody, a wydzielony osad odsacza sie prze¬ mywa woda i suszy. Otrzymuje sie 2,95 g /73%/ produktu o wzorze C91H184N21025CIS /1089,68/ o tem¬ peraturze topnienia 200—202°C i \Rf2=0,25.Etap 5. BOC-D-OSer-Tyr-Ser^Met-Glu-/OBuV- -His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz/BOC/-Pro-Wal-Gli-Liz- /BOC/^Liz/BOC/-Arg-Arg-Pro-Wal-L,iz/BOC/-Wal- -Tyr/BuV-Pro-Asp/OBuV-Ala-Gli-Glu/OBuV-OBut. .3 HC1 0,350 g /0,176 mmola/ BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met- -Glu/OBuV-His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz/BOC/-Pro- -Wa'1-Gli. HO, 0,400 ;g /0,176 mmola/ Liz/BOC/-Liz- /BOC/-Arg-Arg-Pro-Wal-Liz/BOC/^Wal-Tyr/BuV- -Pro-Asp/OBuy-Ala-Gli-Glu/OBuy-OBut # 3 HC1 i 1B 0,281 g /1,05 mmola/ PCPCH rozpuszcza sie w 3,3 ml dwurnetyloformamidu, a nastepnie dodaje sie 0,025 ml /0,18 mmola/ trójetyloaminy i 0,074 g /0,36 mmola/ DCC. Mieszanine reakcyjna pozosta¬ wia sie w ciagu dwóch dni w temperaturze pokojo- wej, odsacza wydzielony osad DCU, a przesacz roz¬ ciencza 30 ml eteru. Wydzielony za pomoca eteru produkt odsacza sie, przemywa eterem i suszy.Otrzymuje sie 0,673 g /90,7%/ zwiazku o wzorze Gi95H8i3N4405oCl3S /4212,33/, o temperaturze topnie- nia 158—162°C i Rf»=0,25.Przyklad VI. D-OSer-Tyr-Ser-iMet-Glu-His- -Fen-Arg-Trp-Gli-Liz-Pro-Wal-Gli-Liz-Liz-Arg- -Arg^Pro-Wal-Liz-Wal-Tyr-Pro-Asn-Gli-Ala-Glu- -Asp-Glu-Ser-Ala 1,00 g /0,214 mmola/ BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met- Glu/OBut/JHis-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz/BOC/-Pro- -Wal-Gli-iLiz/BOC/-ljiz/BOC/-Arg-Arg-Pro-Wal- -Liz/BOC/-Wal-Tyr/But/^Pro-Asn-Gli-Ala-Glu- /OBut/-Asp/OBuV-Giut-Ser-Ala-OBut. 3 HC1 roz- puszcza sie w mieszaninie "8 iml kwasu trójiflluoro- octowego, 1 ml wody i 1 ml anizolu, po czym roz¬ twór pozostawia sie na godzine w temperaturze po¬ kojowej a nastepnie rozciencza 200 ml eteru. Wy¬ dzielony osad 0'dsacza sie, przemywa eterem i suszy 40 pod zmniejszonym cisnieniem nad pieciotlenkiem fosforu i wodorotlenkiem potasowym.Otrzymuje sie 0,90 g /88%/ trójfluorooctanu .pod¬ stawionego dotriakontapeptydu, który po rozpusz¬ czeniu w 20 ml wody przeprowadza sie w octan za 45 pomoca wymieniacza jonowego Dowex 1X8 w octa¬ nowej postaci. Uzyskany roztwór wprowadza sie nastepnie na kolumne z wymieniaczem jonowym Whatman OM—52 i eluuje za pomoca roztworów buforowych, a mianowicie 0,01 molarnego /pH—4,5/ 50 i 0,4 molarnego /pH—6,7/ octanu amonu. Wlasciwe, zebrane frakcje laczy sie i poddaje procesowi lio¬ filizacji. Otrzymuje sie 0,46 g /46%/ prpduktu.Trójchlorowodorek podstawionego i chronionego dotriakontapeptydu, stosowany jako zwiaztsk wyjs- 55 ciowy otrzymuje sie w sposób opisany ponizej.Etap 1. ZHGlu/OBuV-Ser-Ala-OBut 23,9 g /100 mmoli/ Z-Ser i 14,5 g'./IDO mmoli/ Ala-OBu* rozpuszcza sie w 150 ml chlorku mety¬ lenu, po czym po chlodzeniu roztworu do tempe- 60 ratury —10°C wkrapla sie 20,6 g /100 mmoli/ DCC rozpuszczonego w 100 ml chlorku metylenu. Za¬ wartosc naczynia miesza sie w ciagu 2 godzin w temperaturze 0°C, a nastepnie pozostawia w tem¬ peraturze pokojowej do nastepnego dnia. Wydzie- 65 lony osad DGU odsacza sie, a przesacz przemywa87 720 19 sie trzykrotnie In kwasem solnym /3X70 ml/ i trzykrotnie 5% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego /3X70 ml/. Oddzielona faze organiczna suszy sie i nastepnie odparowuje, po czym oleista pozostalosc rozpuszcza sie w 50 ml octanu etylu i pozostawia na 4 godziny w temperaturze 0°C.Wydzielony DCU odsacza sie, przesacz ponownie odparowuje, a oleista pozostalosc zadaje sie n-hek- sanem. Otrzymany tym sposobem surowy Z-Ser- -AlaOBu* w ilosci 30,0 g /82%/ rozpuszcza sie w ©00 ml metanolu i poddaje sie roztwór uwodor¬ nieniu w obecnosci 2 g 10% palladu na weglu aktywowanym jako katalizatora. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, a przesacz odpa¬ rowuje sie do sucha. Otrzymany Ser-Ala-OBu* rozpuszcza sie w 220 ml octanu etylu i do roz¬ tworu dodaje sie 33,0 g /76 mmoli/ Z-Glu/OBu*/- -ONSu. Nastepnego dnia mieszanine reakcyjna przemywa sie trzykrotnie In kwasem solnym /3X50 ml/ i trzykrotnie wodnym roztworem wo¬ doroweglanu sodowego /3X50 ml/, suszy sie i od¬ parowuje, a uzyskana pozostalosc rozciera sie z eterem naftowym. Surowy produkt rozpuszcza sie w octanie etylu i wytraca oczyszczony zwiazek przez dodanie eteru naftowego. Otrzymuje sie 31,5 g /75%/ zwiazku o temperaturze topnienia 72—74°C i Rf4=0,6.Analiza elementarna: dla wzoru CayH^^Og /551,84/ obliczono — C: 58,8%, H: 7,5%, N: 7,65%, oznaczono — C: 58,8%, H: 7,7%, N: 7^8%.Etap 2. Glu/OBuV^Ser-Ala-OBut 16,0 g /29,0 mmoli/ Z^Glu/OBut/-Ser-Ala^QBut rozpuszcza sie w 350 ml metanolu i roztwór pod¬ daje sie uwodornieniu w obecnosci 1,6 g 10% pal¬ ladu na weglu aktywowanym jako katalizatora.Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie i po odparowaniu rozpuszczalnika pozostalosc rekrysta- lizuje sie z mieszaniny metanolu i eteru. Otrzy¬ muje sie- 9,0(6 g /75%/ zwiazku o temperaturze top¬ nienia 135—136°C, [a]r*5=—25,9° /c=l w etanolu/ i Rf4=0,15.Analiza elementarna: dla wzoru C^HgsiN^Oy /417,80/ obliczono — C: 54,0%, H: 8,5%, N:10,l%, oznaczono — C: 54,5%, H: 8,4%, N: 9,8%.Etap 3. Z-Asp/OBuV-Glu/OiBuV-Ser-Ala-OBut 8,2 g /10,6 mmola/ Glu/OBuV-Ser-Ala-OBut i 8,0 g /19,0 mmoli/ Z-Asp/OBut/-ONSu rozpuszcza sie w 80 iml octanu etylu i pozostawia roztwór do nastepnego dnia. Nastepnie roztwór przemywa sie trzykrotnie In kwasem solnym /3X20 ml/ i trzykrotnie 5% wodnym roztworem wodorowegla¬ nu sodowego /3X2i0 ml/, suszy sie i odparowuje, po¬ zostalosc rozciera z eterem naftowym. Otrzymuje sie 12,88 g /G5,5%/ zwiazku o temperaturze top¬ nienia 85—87°C i Rf4=0,55.Analiza elementarna: dla wzoru C^H^N^j /72S,8l/ obliczono—N: 7,3%, oznaczono —N: 7,8%.Etap 4. Asp/OBut/-Glu/OBuV-Ser-Ala-OBut l0£ g /14,5 mmola/ Z-Asp/OBut/-Glu/OBut/-Ser- -Ala-OBu* rozpuszcza sie w 130 ml metanolu i roztwór poddaje sie uwodornieniu w obecnosci 1 g % palladu na weglu aktywowanym jako kata¬ lizatora. Po zakonczeniu reakcji katalizator od¬ sacza sie, odparowuje rozpuszczalnik, a pozosta¬ losc zawiesza sie w eterze naftowym i saczy. Otrzy- muje sie 8,35 g /97,5%/ zwiazku o wzorze C27H48N4O10 /588,68/ o temperaturze topnienia 60— —81°C, [a]£=—24,3° /c=l w etanolu/ i Rf4=0,l.Etap 5. lZ-Glu/OBut/-Asp/OBut/-Glu/OBuV-Ser- -Ala-OBu* * ,0 g /1H,5 mmola/ ZnGlu/aBut/-ONSu i 6,60 g /lil,2 mmola/ Asp-/OBuV-Glu/OBuV-Ser-Ala-OBu* rozpuszcza sie w 100 ml chloroformu i pozostawia do nastepnego dnia. Roztwór przemywa sie trzy- krotnie 1 n kwasem solnym /3X30 ml/ i trzy¬ krotnie 5% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego /3X#0 mil/, po czym roztwór suszy sie, odparowuje chloroform, a zelowata pozostalosc rozciera z eterem naftowym. Otrzymany surowy produkt rozpuszcza sie w octanie etylu i wytraca oczyszczony zwiazek przez dodanie eteru naftowe¬ go. Otrzymuje sie 8,45 g /83%/ preparatu o tempe¬ raturze topnienia 166—169°C, [ w etanolu/ i Rf4=0,5.Analiza elementarna: dla wzoru C44He^N6015 /908,07/ obliczono — C: 56,'2%, H: 7,7%, N: 7,7%, oznaczono — C: 58,4%, H: 7,7%, N: 7,5%.Etap 6. Glu/OBuV-Asp/OBut/-Glu/OBuy-Ser- -Ala-OBut 8,0 g /8,8 mmola/ Z-Glu/OBuV-Asp/OBuV-Glu- /OBuy-Ser-Ala-OBut rozpuszcza sie w 160 ml me¬ tanolu i roztwór poddaje sie uwodornieniu w obec¬ nosci 1 g 10% palladu na weglu aktywowanym jako katalizatora. Po zakonczeniu reakcji katali¬ zator odsacza sie, roztwór odparowuje, a pozosta¬ losc zawiesza w mieszaninie eteru etylowego i eteru naftowego. Wydzielony osad odsacza sie.Otrzymuje sie i6,40 g zwiazku o temperaturze top- nienia 136^138°C, [a]D2s=—29,7° /c=l w etanolu/, Rf6=0,l i wzorze ogólnym C36HMN5018 /773,94/.Etap 7. Z-Ala^Glu/OBut/-Asp/OBut-Glu/OBuV- -Ser-Ala-OBut ,20 g /6,7 mmola/ Glu/OBut/-Asp/OBuV-Glu- 40 /OBut/-Ser-Ala^OBut i 2,15 g /6,7 mmola/ Z-Ala- -ONSu rozpuszcza sie w 50 ml chloroformu i pozo¬ stawia do nastepnego dnia. Po tym czasie roztwór przemywa sie trzykrotnie In kwasem solnym /3X10 ml/ i trzykrotnie 5% wodnym roztworem 45 wodoroweglanu sodowego /3X10 ml/, po czym suszy sie i odparowuje. Otrzymana zelowata pozostalosc rozciera sie z eterem naftowym. Otrzymuje sie 6,10 g /93%/ zwiazku o wzorze C47H74N(y016 /979,14/, temperaturze topnienia 194—105°C, [a]D=—30,9° 50 /c=4 w etanolu/ i Rf6=0,5.Etap 8. Ala-Glu/OBuV-Asp/OBuV-Glu/OBut- -Ser-Ala-OBu* 6,10 g /6,2 mmola/ Z-Ala^Glu/OBut/-Asp/OBuV- -Glu/OBuV-Ser-Ala-OBu* rozpuszcza sie w 120 ml 50 metanolu i roztwór poddaje sie uwodornieniu w obecnosci 1 g 10% palladu na weglu aktywowanym jako katalizatora. Po zakonczeniu reakcji kataliza¬ tor odsacza sie, a krystaliczna pozostalosc rekry- stalizuje sie z mieszaniny etanolu i eteru. Otrzy- 60 muje sie 4,35 g /I83%/ zwiazku o tem(peraturze top¬ nienia 19i2—I194°C oraz Rt6=0,25, Rf1=0,l i Rf*=0,65.Analiza elementarna: dla wzoru C89H^N6014 2,45 g 7113,3 mmola/ PiPPOH, il^il g /4,02 immola/ 65 oznaczono — C: 55,2%, H: 7,8%, N: 9,6%.87 720 21 Etap 9. Z-As.n-Gli-Ala-Glu/OBuV-Asp/OBuV 2,45 g /13,3 mmola/ PEPOH, \1,31 g /4y02 mmola/ Z-Asn^Gli i 3,40 g /4,02 mmola/ Ala^Glu/OBuV- -Asp/diBuV-Glu/OBuV-Ser-Ala-OBut rozpuszcza sie w 24 ml suchego dwumetyloformamidu, roztwór chlodzi sie do temperatury 0°C, po czym dodaje sie 0,915 g /4,43 mmola/ DCC. Zawartosc naczynia miesza sie w temperaturze 0°C w ciagu 30 minut, nastepnie w temperaturze pokojowej w ciagu 2,5 godziny, po czym odsacza sie wydzielony DCU, a przesacz odparowuje do sucha. Otrzymana pozo¬ stalosc rozciera sie z octanem etylu i odsacza. Su¬ rowy produkt ogrzewa sie we wrzacym octanie etylu w ilosci 120 ml, odsacza, przemywa dwukrot¬ nie wrzacym octanem etylu /2X10 ml/ i suszy.Otrzymuje sie 4,12 g /89%/ zwiazku o ogólnym wzorze C58H83N^019 /l 150,30/, o temperaturze top¬ nienia 200-^201°C i 11^=0,60.Etap 10. Asn-Gli-Ala-Ghi/OBuV-Asp/OBuV-Glu- /OBuV-Ser-Ala-OBut 4,-0 g /3,48 mmola/ Z-As'n-Gli-Ala-Glu/OBuV- -Asp/OBuiy-Ser-Ala-OBut rozpuszcza sie w 140 ml metanolu i roztwór poddaje sie uwodornieniu w obecnosci 0,5 g 10|fr palladu na weglu aktywowa¬ nym jako katalizatora. Po zakonczeniu reakcji ka¬ talizator odsacza sie, przesacz odparowuje do sucha, a pozostalosc rozciera z eterem. Otrzymuje sie 3,40 g /96%/ zwiazku o ogólnym wzorze C45H77N9017 /1016,17/, o temperaturze topnienia 188—190°C, [a]D=—6,6° /c=0,89 w dwumetyloformamidzie/ i Rf2=0,5, Etap 11. Z-Liz/BOC/-Liz/BOC/-Arg/N02/-Arg- /N02/-Pro-iWal-Liz/[BOC/^Wal-Tyr-/BuV-Pro-Asn- ^GHi-Ala-Glu/OBuV-Asp/OBuV-Glu/OBut/-Ser-Ala- -OBut 3,0 g /2,95 mmola/ Asn-Gli-Ala-Glu/OBu7-Asp- /OBut/-Glu/OBut/-,Ser-Ala-OBut i 6,46 g /2,95 fmmola/ Z-Liz/BOC/-Liz/BOC/-Arg/N02/-Arg/N02/- jPro-Wal-Liz-/BiOC/-,'Wa'l-Tyr/aBut/lHPro/ patrz bry¬ tyjski opis patentowy nr 1 201 053/ rozpuszcza sie w 33 ml dwumetyloformamidu, chlodzi do tempe¬ ratury 0°C, a nastepnie dodaje 3,35 g /4,42 mmola/ DCIC-hFCTPIOH — kompleks [J. Kovacs i wspólaut.J. Am. Chem. Soc. 89, 185, /1967/]. Po 15 minutach mieszania w temperaturze 0^C pozostawia sie w ciagu 6 godzin w temperaturze pokojowej, a na¬ stepnie odsacza wydzielony DCU i przesacz wlewa do 450 ml suchego eteru. Otrzymana zawiesine przechowuje sie w chlodni do nastepnego dnia.Wydzielony osad odsacza sie, rozpuszcza w me¬ tanolu i ponownie wytraca przez dodanie octanu etylu. Otrzymuje sie 7,18 g /854%/ zwiazku o wzo¬ rze C131H214N30O40 /2849,34/, skrecalnosci wlasciwej [a]D=—26,4° /c=0,42 w dwumetyloformamidzie/ i Rf1=0,35.Etap 12. Liz/BOC/-Liz/BOC/nArg-Arg-Pro4Wal- -Liz/BOC/-Wal-Tyr/lBuV-Pro-Asn-Gli-Ala-Glu- /OBuV-Asp/OBuV-Glu/OBut/-Ser-Ala-OBut. 3 HC1 6,5 g /2,28 mmola/ Z-Liz/BOC/-Liz/BOC/-Arg- /N02/-Arg/N02/-Pro-Wal-Liz/BOC/-Wal-Tyr-/But/- ^Pro-Asn-Gli-Ala^Glu/OBuV-Asp/OBut/-Glu/OBut/- -Ser^Ala-OBut rozpuszcza sie w 85 ml kwa¬ su octowego i roztwór poddaje uwodornieniu w obecnosci 2,0 g 10% palladu na 'weglu aktywowa¬ nym jako katalizatora. Po zakonczeniu reakcji ka- 22 talizator odsacza sie, przesacz odparowuje, a oleista pozostalosc rozciera sie z suchym eterem. Pow¬ staly osad odsacza sie, rozpuszcza w 70 ml wody i zakwasza do pH—4 za pomoca rozcienczonego 9 kwasu solnego i rozciencza 30% wodnym roztwo¬ rem chlorku sodu. Wydzielony osad odsacza sie, rozpuszcza w mieszaninie etanolu i chloroformu, ponownie saczy, a przesacz odparowuje sie i uzy¬ skana pozostalosc rozciera sie z eterem. Otrzymuje io sie 5,6 g /89,5%y zwiazku o wzorze C123H218N28Oa4- Cl3 /2734,60/, [ mamidzie/ i Rf2=0,35.Etap 13. BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu/OBut/- -His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz/BOC/-Pro-Wal-Gli-Liz- /BOC/-Liz/BOC/-Arg-Arg-Pro-Wal-Liz/BOC/-Wal- -Tyr/But/-Pro-Asn^Gli-Ala-Glu/OBuV-Asp/OBuV- -Glu/OBuV-Ser-Ala-OBut. 3 HC1 0,525 g /0,264 mmola/ BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met- -Glu/OBuV-His-Fen-Arg-Trp-GlinLiz/BOC/-Pro- -Wal-Gli.HCl i 0,720 g /0,264 mmola/ Wz/BOC/- -Liz/BOC/-Arg-Arg-Pro-Wal-Liz/BOC/-Wal-Tyr- /BuV-Pro-Asn-Gli-Ala-Glu/OBut/-Asp/OBuV^Glu- /OButy-Ser-Ala-OBut. 3 HO rozpuszcza sie w 4 ml dwumetyloformamidu, a nastepnie dodaje sie 0,03 ml /0,270 mmola/ N-metylomorfoliny i 0,23 g /0,40 mmola/ kompleksu DCC-PFPOH. Mieszanine reakcyjna pozostawia sie w temperaturze pokojo¬ wej w ciagu dwóch dni, nastepnie wydzielony osad DCU odsacza sie, a przesacz rozciencza 40 ml eteru.Wydzielony osad saczy sie, przemywa eterem i suszy. Otrzymuje sie 1,10 g /89%/ zwiazku o wzo¬ rze ogólnym C214H344N49059O^S /4669,77/, o tempera¬ turze topnienia 182—186°C i R*f=0,27. PL