PL87276B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego antybiotyku AT-125, o wzorze 1, przez szczep Streptomyees sviceus, hodowany na wodnym podlozu. Antybiotyk AT-125, pochodna kwasu L-(aS, 5S)-a-amino-3-cMoro-2-izoksazolinooctowego- -5, jest zwiazkiem amfoterycznym i istnieje w róz¬ nych postaciach jonowych, w zaleznosci od war¬ tosci pH srodowiska. Przy niskich wartosciach pH antybiotyk AT-125 tworzy sole addycyjne z kwasa¬ mi, przy wyzszych wartosciach pH wystepuje w postaci jonów obojnaczych, a przy jeszcze wyzszych wartosciach w pH w postaci soli z metalami. Anty¬ biotyk AT-125, wytwarzany przez szczep promie¬ niowców Streptomyees sviceus na podlozu wodnym, hamuje rozwój bakterii gram-dodatmich i gram- -ujemnych, takich jak Bacillus sutotilis i Escherichia coli. Dziala równiez przeciwko róznorodnym grzy¬ bom i drozdzom takim, jak: Saccharomyces pasto- rianus, Penicillium oxalicum, Candida albicans i Saccharomyces oerevisiae.Antybiotyk AT-125, w róznych warunkach, ha¬ muje wzrost lub zmniejsza ilosc bakterii, grzybów, drozdzy wymienianych wyzej, samodzielnie lub w polaczeniu z innymi substancjami zwalczajacymi drobnoustroje. Antybiotyk AT-125 mozna zastoso¬ wac naprzyklad do zahamowania lub zmniejszenia zakazenia hodowli gasienic jedwabników, spowodo¬ wanego drobnoustrojem Bacillus subtilis.Budowa antybiotyku AT-125, okreslona wzorem przedstawionym na rysunku, stanowi jego postac ao 29 S0 jonowa i jon obojnaczy pozostaje w zgodzie z da¬ nymi analitycznymi i spektralnymi. Widmo NMR, •nasyconego roztworu antybiotyku AT-125, wykonu¬ je sie na spektrometrze Varian-100. Widmo NMR przy 100 MHz nie jest widmem pierwszego rzedu, ale jasno wskazuje na obecnosc czterech nie zdol¬ nych do wymiany, protonów. Protony metylenowe przy C4 daja nieksztalcony 5 liniowy uklad AB z najsilniejszym sygnalem przy 350 Hz i pozornym dubletem, wystepujacym przy 359 Hz i 361 Hz.Proton przy C6 daje pozorny dublet trypietów przy 5,366 z odstepami liniowymi rzedu 3,5 Hz i 10 Hz.Proton grupy metinowej aminokwasu daje ostry dublet przy 4,125, J=3,5Hz. Widmo IR wykonuje sie w nujolu na spektrometrze Perkin Elmer 421.Glówne pasma znajduja sie przy 3030 (szerokie), 2730, 2620, 1620, 1590, 1495, 1425, 1325, 1307, 1293, 1275, 1145, 1127, 895, 870 cm"1. Strukture chemiczna krystalicznego antybiotyku AT-125 ustalono scisle za pomoca dyfrakcji promieni X. Krystaliczny AT- 125 jest kwasem LH(aS,5S)-a-amino-3-chloro-2-izo- ksazolino-octowym-5. Na podstawie badania twar¬ dymi promieniami X ustalono wzór czasteczkowy AT-125 na C5H7C1N208, a ciezar czasteczkowy na 178,6. Antybiotyk AT-125 rozpuszcza sie w H20, nie¬ znacznie rozpuszcza sie w octanie etylu, eterze, ben¬ zenie, chloroformie. Wlasnosci antybiotyczne anty¬ biotyku AT-125 okresla sie w nastepujacy sposób.Bada sie strefy zahamowan hodowli na standardo- 87 27fc3 wych plytkach, stosuje sie 13 mm krazki papierowe, stezenie antybiotyku AT-125 wynosi 1 mg/ml. Otrzy¬ muje sie nastepujace wyniki, przedstawione w tablicy la.Tablica la Drobnoustrój Bacillus subtilis (agar syntetyczny) Bacillus subtilis i(agar r odzywczy) Lactobacillus casei Sarlna lutea Staphylococus atfreus Mycobacterium avium Escherichia coli (agar i odzywkowy) Escherichia coli (agar syntetyczny) Salmonella schottmuelleri Proteus vulgaris Klebsiella pneumoniae Saccharomyces pastorianus Penicillium oxalicum Candida albicans (próba przy stezeniu 100 |xg/ml Saccharomyces cerevisiae (próba przy stezeniu 100 ng/ml) Strefa zaha¬ mowan wokól krazków o srednicy 1 13 mm 78 0 0 0 0 0 0 36 metna 0 0 0 53 32 38 Sposobem wedlug wynalazku antybiotyk AT-125 wytwarza sie przy uzyciu promieniowca Strepto- myces sviceus. Subkulture zywych drobnoustrojów zdeponowano w Northern Utilization and Research Division, Agrdioiditura, Pearia, Illinois, U.S.A., pod numerem kolejnym kolekcji NRRL 5439. Wymie¬ niony wyzej promieniowiec zbadala i opisala Alma Dietz z Upjohn Research Laboratory. Streptomyces sviceus (Dietz sp. n.) charakteryzuja nastepujace wlasciwosci: grzybnia powierzchniowa szara, mela- nina dodatnia, wzorzec barw wedlug Ektachrome) Dietz, A. 1954. Ektachrome transparencies as aids in actinomycete classification. Ann. N. Y. Acad. Sc. 60:152—154) podaje sie w tablicy 1. Hodowle za¬ licza sie do serii barw Gray (GY) i White (W) wed¬ lug Tresnera i Backusa (Tresner, H. D., i E. J. Bac- kus 1962. System of color wheels for streptomyce- te taxonomy. Appl. Microbiol. 11:335—338). 1276 4 Badania mikroskopowe wykazuja: zarodniki owalne do prostokatnych, rzadko pokryte brodaw¬ kami lub krótkimi wyrostkami, wytwarzanymi na sporoforach, podobnych do kandelabrów; sporofory dlugie, proste, zagiete na koncach, mozna zaliczyc do grupy spiral (S) wedlug klasyfikacji podanej przez Pridhama, i wspólpracowników (Pridham, T. G., C. W. Hesseltine i R. G. Benedict. 1958.A guide for the classification of Streptomyces ac- cording to selected groups. Placement of strains in morphological sections. Appl. Microbiol. 6:52—79).Powierzchnie zarodników mozna zaliczyc do typu brodawkowego wedlug klasyfikcji podanej przez Dietz i Mathews (Dietz, A., i John Mathews, 1970.Classification of Streptomyces spore surfaces into five groups. Appl. Microbiol. 21:527—533).W tablicy 3 podaje sie charakterystyke hodowli i biochemii badanego szczepu. Wzrost szczepu na zwiazkach wegla okresla sie na podstawie sposobu Pridhama i Gottlieba (Pridham, T. G. i D. Gottlib. 1948. The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an ald for species determina- tion. J. Bacteriol. 56:107—114) i Shirlinga oraz Got¬ tlieba (Shirling, E. B. i D. Gottlieb. 1966. Methods for characterization of Streptomyces species. Int. J.Sys. Baeterdol. 16:313^340). W sposobie wedlug Pridhama i Gottlieba, S. sviceus wykazuje znaczny wzrost na podlozu podstawowym takim, jak dulci- tol, D-sorbitol, salicin i szczawian sodu, przy czym szczep wykazuje dobry wzrost na D-ksyiozie, L-al- abinozie, ramnozie, D-fruktozie, D-galaktozie, D-glu- kozie, D-mannozie, maltozie, sacharozie, laktozie, cellobiozie, rafinozie, dekstrynie, inulinie, rozpusz¬ czalnej skrobi, glicerolu, D-mannitolu, inositolu, oc- tanie sodu, cytrynianie sodu, bursztynianie sodu, slaby wzrost na fenolu, mrówczanie sodu, winianie sodu i nie wykazuje wzrostu na krezolu i salicyla¬ nie sodu.W metodzie Shirlinga i Gottlieba szczep nie roz- 40 wija sie na podlozu tylko podstawowym. Dobry wzrost wykazuje na podlozu podstawowym z glu¬ koza. Szczep wykazuje wzrost podobny lub wiek¬ szy niz na podlozu podstawowym z glukoza, gdy do * podloza podstawowego dodaje sie L-anahinoze, sa- 45 charoze, D-ksyloze, inositol, D-mannitol, D-frukto- ze, ramnoze oraz rafinoze i podwójnie szybki, gdy zamiast glukozy dodaje sie celuloze. Szczep rozwija sie dobrze w temperaturze od 18° do 28° na agarze z sacharoza Benetta i Czapka, zas w temperaturze 50 od 18° do 37° na agarze maltozowo-tryptonowym.W temperaturze od 45° do 55° szczep nie rozwija sie na wyzej wymienionych agarach* Antymetabo- liczny antybiotyk AT-125 jest wytwarzany przez omawiany szczep, wyodrebiony z gleby. 55 Streptomyces sviceus wykazuje cechy charakte¬ rystyczne dla rodzaju Streptomyces. Szczep ten, wyizolowany z gleby, rózni sie zasadniczo od ga¬ tunków Streptomyces z kolekcji szczepów firmy Upjohna, a równiez od opisanych w literaturze. go (np., Breed, Robert s., E. G. D. Murray, i Nathan R.Smdth. 1957. Bergey^ manual od determin«tive ba- cteriology, wydanie 7, the Williams i Wilkins Co., Baltimore, (2. Gauze, G. F. T. P. Preobrazenskaya, E. S. Kudrina N. O. Blinov, I. D. Ryabova i M. A. 65 Iveshinikowa 1957. Problems in the classification5 of antagonistic actinomycetes. State Publishing House for Medical Literature, Moscow, angielskie wydanie tlumaczone przez Fritz Danga, D. Gottlieb (ed.) The American Institue of Biological Sciencies, Washington, D. C.) 3. Hutter, R. 1967 Systematik der Streptomyceten unter besondere Berucksickig- ung der von ihnen gerbildeten Antibiotica. S. Kar- ger, Basel) 4. Krassilnikow N.A. 1949 Actinomycetes'. lin Guide to the identification of bacteria and Acti¬ nomycetes. Academy of Sciencies U.S.S.R. Moscow.J. B. Routien, Chas. Pfizer and Co. Inc. 1957 prze¬ tlumaczyl wydanie angielskie.) 5. Waksman, S. A. 1961. The actinomycetes, Vol. 2, Classification, iden¬ tification and description of genera and species.The Williams and Wilkins Co., Baltimore.) 6. Shirl- ing, E. B. i D. Gottlieb. 1968 Cooperative descrip- tions of type cultures of Streptomyces. II. Species descriptions from first study. Int. J. Sys. Bacteriol. 18:69—189; Cooperative descriptions of type cultu¬ res of Streptomyces. III. (1968) Additional species descriptions from first and second studies. Iint. J.Sys. Bacteriol. 18:279—392, Cooperative description of type cultures of Streptomyces. IV. (1969) Species descrpitions from the second, third and fourth stu¬ dies. Int. J. Sys. Bacteriol. 19:391—512).Streptomyces sviceus wykazuje podobienstwo do Streptomyces hawaiiensis (Cron, M. Y., D. F. Whi- lehead, 'I. R. Hooper, B. Heinemann i J. Lein 9156.Bryamycin, a mew antibiotic. Antibiotisc and Che- motherapy 6:63—67). Oba szczepy wykazuja mela- nine dodatnia i w podobny sposób zuzywaja wegiel w syntetycznym podlozu Pridhama i Gottlieba.Otwarte, spiralne sporofory szczepu Streptomyces hawaiiensis sa krótsze i mniej wyrazne od sporo- forów nowego szczepu, dlugich i zagietych na kon¬ cach. Spory, obserwowane przez elektronowy mik¬ roskop transmisyjny, posiadaja ksztalt okragly do owalnego i powierzchnie pokryta wyrostkami, w przypadku S. hawaiiensis, a w przypadku S. svi- ces posiadaja ksztalt owalny do prostokatnego i po¬ wierzchnie od z rzadka usianej brodawkami do po¬ krytej wyrostkami. Dokladna charakterystyke •szczepu podaje sie w tablicy 4. Streptomyces svi- ceus latwo odróznia sie od opisanych gatunków Streptomyces z kolekcji szczepów firmy Upjohna i od szczepów opisanych w literaturze, dzieki jego charakterystycznemu zabarwieniu i szczególom mik¬ roskopowym.Cechy szczepów, które przytacza sie w tablicach podkreslaja jeszcze wyrazniej odrebnosc Strepto¬ myces sviceus. Drobnoustrój ten posiada unikalne wlasciwosci wytwarzania antybiotyku AT-125. Pro¬ ponuje sie, zeby opisywany drobnoustrój uwazano za nowy gatunek Streptomyces, nazywany Strep¬ tomyces sviceus (od svicem albo svice (czeski), tzn. od swiecy lub swiecznika, poniewaz sporofory ho¬ dowli sa podobne do kandelabra (Dietz sp. n. Typ gatunku zalicza sie do typu odmiany Streptomyces sviceus, odmiana sviceus, zgodnie z Miedzynarodo¬ wym Kodem (Imtemationai Code of Nomenolature of Bacteria. 1966. Wydany przez Bditiorial Board of the Judical Commission of Bacteria. Intrn. J. Sy¬ stem. Bacteriol. 16:459—490).W tablicy Ib przedstawiono wzorze barw szcze¬ pu Streptomyces sviceus wedlug Ektachromu.*) 276 6 Tablica Ib Podloze agarowe Bennetta Czapek z sacharoza Maltozowo- -tryptonowe pepton-iron 0,1% tyro¬ zyny krochmal kazeinowy Barwa grzybni powierzchniowej lawendowo- -szara lawendowo- -szara lawendowo- -szara brak wzrostu powierzchnio¬ wego jasno lawen- dowo-szara jasno lawen- dowo-szara Barwa grzybni podstawowej brazowa czerwono- -brazowa brazowa brazowa czerwono- -brazowa jasno- -brazowa *) Dietz, A., „Ektachrome Transparencies as Aids in Actinomycete 01assification,, Annals of the New York Academy of Sciences, 60:152—154, 1954.Tablica 2 Barwy grzybni Streptomyces sviceus Podloze agarowe Bennetta Czapek z sacharoza Maltozowo- tryptonowe Color Harmony Manual 3rd ed., 1948*) S 3fe srebrno- -szara R 3ni gozdzi- kowo-bra- zowa P 3ig bezowo- -brazowa S 31c burszty¬ nowa, szkoc¬ kiego masla R 2ge przycmio¬ ny zólto-bra¬ zowa, griege P 3ge bezowa, wielbladzia S a biala ISCC-NBS Me- 1 thod of Desig- nating Color and a Dictionary of Color Name Circular 553, 1955**) | 63 gm jasno i brazowo-szara 77 m umiarko¬ wanie zólto- -brazowa 95 g umiarko¬ wanie oliw- kowo-brazowa 80 m szaro-zólto- -brazowa 71 m slabo po¬ maranczowa 94 m jasno oliw- kowo-brazowa 109 gm jasno szaro-zólta 79 m jasno zólto-brazowa 263 gm biala87 276 c.d. tabl. 2 c.d. fiabi. 2 Podloze agarowe Maltozo- wo-tryip- tonowe Drozdzo- wo-slodo- we \ Owsiane (ISP-3) r Color Harmony Manual 3rd ed., 1948*) R 31g cynamo- nowo-brazo- wa P 3ig wielbla¬ dzia, koloru cukru klono¬ wego, zólto- -brazowa S 3fe srebrno- -szara R 4nJl czekola¬ dowa, ciem- no-brazowa P 31i bobrowa S 3fe srebmo- -szara R 2ig zólto-bra- zowy do 3ml szaro-bo- browego P 2ih ciemno przycmiona ISCC-NBS Me- 1 thod of Desig- nating Color and a Dictionary of Color Name Circular 553, 1955**) | 77 gm slabo zólto-brazowa 80 m szaro-zólto- -brazowa 95 g slabo oliw- kowo-brazowa 63 gm jasno brazowo-szara 64 m brazowo- -szara 81 g ciemno- -szaro-zólto- -brazowa 80 m szaro-zólto- -brazowa 95 g umiarkowa¬ nie oliwkowo- -brazowa 63 gm jasno bra¬ zowo-szara 110 g szaro-zólta 112 m jasno oliw- kowo-szara do ciemno oliwko¬ wo brazowej 266 m ciemno- -szarej 112 m jasno oliwkowo-szara 265 m srednio szara | IB Podloze agarowe Nieorga- niczne- skrobiowe (ISP-4) Aspara- ginowe z glicerolem (ISP-5) Color Hairmony Manual 3rd ed., 1948*) S R P S R P 3fe srebrno- szara 3ge bezowa, wielbladzia 3ge bezowa, wielbladzia C jasno szara 3ml bobro- wo-szara 3fe srebuno- -szara 1 ISCC-NBS Me- thod of Desig- nating Color and a Dictionary of Color Name Circular 553, 1955**) | 63 gm jasno oliwkowo-szara 79 m jasno szaro-zólto- -brazowa 79 m jasno szaro-zólto- -brazowa 94 m jasno oliwkowo-bra- zowa 264 gm jasno szara 96 g ciemno oliwkowo- -brazowa 63 gm jasno brazowo-szara 8| S — grzybnia powierzchniowa R — grzybnia podstawowa P — pigment Wszystkie odczyty sporzadzono na blyszczacej po¬ wierzchni.*) Jacobson, E., W. C. Granville, i CE. Foss. 1948.Color Harmony Manual, 3rd Edition, Container Corporation of America, Chicago, Illinois. 45 **) Kelly, K. L., i D. B. Judd. 1955. The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictonary of Color Names. U.S. Dept. Oammerce Circ. 553.Tablica 3 Hodowlana i biochemiczna charakterystyka drobnoustroju Streptomyces sviceus Podloze 1 Podloze agarowe Pepton-iron Jablczan wapniowy Asparaginowe z glukoza .Grzybnia powietrzna 2 lekko-szara slabo szaro-biala slabo lawendowo- -szara Grzybnia podstawowa 3 brazowa biala do kremowej oliwkowa Irme wlasciwosci 4 Pigment brazowy (melanina dodatnia) Jablczan rozpuszomy wokól wzrostu ^~ i87 276 c.d. tabi. 3 1 1 Mleko z lakmusem Tyrozynowe Ksantynowe Skrobia odzywkowa Drozdzowoslodowe (ekstrakt) Pepton-iron drozdze (ekstrakt) (ISP-6) Tyrozyna (ISP-7) Podloze zelatynowe Prasowane Odzywkowe Bulion azotany syntetyczne azotany odzywkowe Mleko z lakmusem | $ 1 . 2 szarawa lekko szara lekko szaro-biala jasno szaro-biala eiemno-szara — szara blonka lekko biala, na powierzchni — bezbarwna, blonka powierzchniowa bezbarwna blonka powierzchniowa brazowe pierscienie na powierzchni 1 3 zólto-brazowa brazowa zólto-brazowa brazowa kremowo-zólto- -brazowa kremowo-zólta brazowa brazowy brazowa — — — — — 4 1 Pigment zólto- zóltobrazowo-brazowy Kazeina nie rozpuszcza sie Pigment brazowy Tyrozyna rozpuszcza sie Pigment kremowo-zólto- brazowy Ksantyna rozpuszcza sie Pigment zólty. Skrobia ulega hydrolizie Pigment zólto-brazowo- -brazowy Pigment brazowy (malanina dodatnia) Pigment brazowy (melani- na dodatnia 50%) Brak pigmentu, (melanina ujemna) 50% Pigment zólty do oliwko¬ wego. Nie uplynnia Pigment oliwkowy zólto- -brazowy. Nie uplynnia.Pigment blado zólty.Zwarty wzrost denny.Azotainy nie redukuja sie Pigment brazowy. Zwarty wzrost denny. Azotany nie redukuja sie do azotynów Lakmus redukuje sie w 4 z 6 probówek. Peptonizacja nie zachodzi. pH=5,3 Tablica 4 Róznice pomiedzy Streptomyces sviceus i Streptomyces hawaiiensis ATCC 12236, UC 2504 Barwa grzybni podstawowej*) Sporofory**) Pwierzchnia zarodników***) Zelatyna (W plytkach i pozywkowa) Mleko lakmusowe Agar tyrozynowy (ISP-7) Wytwarzainie antybiotyku Streptomyces sviceus White (W) do Gray Dlugie, proste i zagiete przy kon¬ cu (S) (Wiele podobnych do kan¬ delabrów) Brodawki do wyrostków (Wy¬ rostki krótkie i rzadkie) Nie uplynnia pH=5.3 50% melaniny dodatniej i 50% melaniny ujemnej Wytwarza AT-125 Streptomyces hawaiiensis ATCC 12236, UC 2504 White (W) do Yellow (Y) do do Red (R) Umiarkowanie krótkie rozciag¬ niete spirale (RA) do spiral (S) Wyrostki (Wyrostki krótkie do dlugich) Calkowicie uplynnia pH=6,l Melanina ujemna Wytwarza bryamycyne *) Tresner, H. D., i E. J. Backus. 1962. System of color wheels for streptomycete taxonomy. Appl.Microbiol. 11:335-338.**) Pridham, T. G., W. C. Hesseltine, i R. G. Be- nedict. 1958. A guide for the classification of Streptomyces according to selected groups. 65 Placement of strains in morfological sections.Appl. Microbiol. 6:52-79.***) Dietz, A., i John Mathews, 1970. Classification of Streptomyces spore surfaces into five groups. Appl. Microbiol. 21:527-533.Uwaga: skrót UC w tablicy 4 oznacza kolek¬ cje szczepów firmy Upjohn.11 Nowy zwiazek otrzymuje sie sposobem wedlug wynalazku przy uzyciu opisanego powyzej drob¬ noustroju, na wodnym podlozu, w warunkach na¬ powietrznej hodowli glebinowej. W celu otrzyma¬ nia malych ilosci zwiazku mozna zastosowac ho¬ dowle powierzchniowa lub w, butli. Drobnoustrój wzrasta na podlozu, zawierajacym zródlo wegla, latwo przyswajalne zwiazki azotu oraz materialy proteinowe. Jako zródlo wegla korzystnie stosuje sie glukoze, cukier' brunatny, sacharoze, glicerol, skrobie, skrobie zbozowa, laktoze, dekstryne, mela¬ se i podobne. Jako zródla azotu korzystnie stosuje sie wyciagi z ziarna zbozowego, drozdze, samoroz- puszczalne drozdze browarnicze z sucha masa mle¬ ka, maczke sojowa, maczke nasienia bawelny, ma¬ ke zbozowa, sucha mase mleka, trzustkowy wyciag kazeiny, pozostalosci gorzelnicze, roztwory zwierze¬ cych peptonów, skrawki miesa i kosci, itp.Korzystnie stosuje sie mieszanine wyzej' wymie¬ nionych . substancji, stanowiacych zródlo wegla i azotu. Do podloza fermentacyjnego nie dodaje sie metali sladowych takich, jak cynk, mangan, mag¬ nez, kobalt, zelazo, jezeli sporzadzono je z nieoczy- szczonych skladników i wody wodociagowej. Zwia¬ zek, sposobem wedlug wynalazku, wytwarza sie w temperaturze, sprzyjajacej wzrostowia drobnoustro¬ ju, w zakresie temperatur od 18° do 40°C, korzyst¬ niej w zakresie temperatur od 20° do 30°C. Ogólnie, optimum produkcji omawianego zwiazku osiaga sie w ciagu 2 do 10 dni. W czasie fermentacji podloze wykazuje zazwyczaj odczyn slabo kwasny (pH= =5,5—7,0). Koncowa wartosc pH podloza zalezy, czesciowo od obecnosci buforu (jezeli takiego uzy¬ to), czesciowo od wyjsciowej wartosci pH hodowli, która przed wyjalowieniem doprowadza sie korzy¬ stnie do okolo 7.Jezeli hodowle prowadzi sie w duzych naczyniach lub tankach, to korzystnie stosuje sie do inokulacji postacie wegetatywne, a nie zarodnikowe drobno¬ ustrojów, co skraca czas wytwarzania nowego \_ zwiazku i zmniejsza zuzycie surowców. Wejgetatyw- ne inokulum korzystnie otrzymuje sie na podlozu bulionowym, za pomoca inokulacji tego podloza drobnoustrojem, otrzymanym z gleby lub z hodow¬ li na plytkach. Otrzymane w ten sposób mlode, ak¬ tywne inokulum przenosi sie aseptycznie do duze¬ go naczynia lub tanku. Podloze, na którym otrzy¬ muje sie wegetatywne inokulum moze byc takie samo, albo rózne od tejjo, którego uzywa sie przy wytwarzaniu omawianego zwiazku, dopóki zapew¬ nia ono korzystny rozwój drobnoustroju.Antybiotyk AT-125 posiada charakter amfote- ryczny, rozpuszcza sie w wodzie i nieznacznie w metanolu. W celu izolacji i oczyszczenia antybioty¬ ku AT-125 stosuje sie wiele metod takich, jak: elu- owanie korzystnym rozpuszczalnikiem, metody chromatografii kolumnowej i chromatografii po¬ dzialowej oraz. krystalizacji z rozpuszczalników.Korzystny proces izolowania antybiotyku AT-i25 polega na przesaczeniu podloza poprzez porowata ziemie okrzemkowa, na przyklad FW-40 firmy Eagle Picher lub inne rodzaje ziemi okrzemkowej, dostepne w handlu pod nastepujacymi nazwami: Super Cel (John Marvilles), Dicalite 4200 (Great Lakes), Miraflo 40 (Eagle Picher). 276 12 Czysty filtrat przeprowadza sie przez kolumne chromatograficzna, wypelniona styrenem typu zy¬ wicy kwasu sulfonowego.Korzystnie stosuje sie Dowex-50 w postaci zre- dukowanej, dogodnie wysokousieciowany, na przy¬ klad Dowex-50X16, oraz odpowiednie zywice do¬ stepne w handlu to: Amberlite IR-120, Nalcite HCR, Chempro C-20, Permutit Q oraz Zeokarb 225. Po przeprowadzeniu filtratu przez kolumne antybiotyk io wymywa sie zasada, korzystnie NH4OH.Frakcje zawierajace aktywny antybiotyk laczy sie i zateza. Otrzymany, wodny koncentrat o pH obo¬ jetnym i(6,2—7,8) korzystnie oczyszcza sie przepro¬ wadzajac przez kolumne wypelniona slaba zasada styrenowa, typu zywicy poliamidowej lub zywica¬ mi: Amberlit IR 4B, nalcite WBR, DeAcidite E, Duolite A.2. Kolumne przemywa sie woda, pozba¬ wiona jonów, 50% wodnym roztworem metanolu i 90% wodnym roztworem metanolu, a nastepnie eluoiije slie 0,1 N kwasem octowym w 90% roztwo¬ rze metanolu. Frakcje, zawierajace aktywne sub¬ stancje, laczy sie i oddestylowuje z nich rozpusz-r czalniki pod zmniejszonym cisnieniem. Metanol mozna zastapic woda. Pozostalosc rozpuszcza sie w 26 dolnej warstwie mieszaniny rozpuszczalników, skla¬ dajacej sie z n-butanolu, benzenu, metanolu i wo¬ dy, pozbawionej jonów, w stosunku (2:1:1:1).Otrzymany roztwór homogenizuje sie z porowata ziemia okrzemkowa, na przyklad Eagle Pichers FW 40, i z górna faza mieszaniny rozpuszczalników, opisanych powyzej. Otrzymana jednorodna zawie¬ sine umieszcza sie na szczycie kolumny, wypelnio¬ nej porowata ziemia okrzemkowa, która przygoto¬ wuje sie w ten sposób, ze poczatkowo miesza sie ja z górna faza opisanej powyzej mieszaniny rozpusz¬ czalników, a nastepnie starannie z dolna faza po¬ danej mieszaniny. Tak przygotowana mase wlewa sie do kolumny i przemywa górna faza mieszaniny rozpuszczalników, co powoduje dokladne ulozenie 40 sie wypelnienia. Aktywne eluaty z kolumny zbie¬ ra sie, laczy i oddestylowuje rozpuszczalnik, sucha pozostalosc krystalizuje sie z dogodnego rozpusz¬ czalnika, korzystnie z metanolu i otrzymuje sie an¬ tybiotyk AT-125 w postaci krystalicznej- Do kry- 45 stalizacji uzywa sie równiez 95% etanol, uwodnio¬ ny butanol i wode.Alternatywnie, antybiotyk AT-125 odzyskuje sie z przesaczu brzeczki fermentacyjnej przez absorp¬ cje na korzystnym wymieniaczu jonowym, na 50 przyklad na wymieniaczu Dowex 1 (OAc) przy war¬ tosciach pH=9—10 albo na IR 45 (OH") przy war¬ tosciach pH=6—7. Po przemyciu zywica wody an¬ tybiotyk odzyskuje sie, eluujac kolumne wodnym lub metanolowym roztworem NH4OH lub HOAc. 55 Ewentualnie odsaczona, czysta brzeczke fermen¬ tacyjna poddaje sie absorpcji na weglu, a nastep¬ nie antybiotyk eluuje sie, korzystnie mieszanina rozpuszczalników, na przyklad uwodnionym aceto¬ nem. 60 Antybiotyk AT-125 sposobem wedlug wynalazku izoluje sie za pomoca chromatografii na zelu krze¬ mionkowym, stosujac do eluowania mieszanine metanolu w chloroformie lub w CH2C12, albo mie¬ szanine benzenu, albo toluenu z kwasem octowym 65 i z 95% etanolem. Stezenie antybiotyku AT-125 w87 276 13 róznych stadiach izolowania oznacza sie za pomo¬ ca prób ma plytkach, stosujac hodowle Bacillus sub¬ tilis na pozywce syntetycznej o podanym nizej skladzie: Na2HP04-7H20 KH2P04 (NH4)2S04 MgS04 Glukoza Bacto Agar*) Woda destylowana Roztwór soli nieorganicznych**) 1,7 g 2,0 g 1,0 g 0,1 g 2,0 g ,0 g 1 litr lml .*) Bacto Agar firmy Difco Laboratories **) Roztwór soli metali nierozpuszczalnych o na¬ stepujacym skladzie: NaMo04-2H20 CoCl2 CuS04 MnS04 CaOlj FeCl24H20 ZnCl2*) 200 lig/ml 100 fig/ml 100 tig/ml 2 mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml *) ZnCl2 rozpuszcza sie osobno, uzywajac kropli 0,1 N HCL na 10 ml wody. Roztwór soli nieorga¬ nicznych ogrzewa sie do chwili calkowitego roz¬ puszczenia skladników, nastepnie przechowuje sie w ciagu 24 godzin i przesacza sterylnie.Tak otrzymane podloze inokuluje sie zawiesina zarodników B. subtilis f(l,5X1010 komórek/ml, za¬ chowujac stosunek 0,5 ml/litr. Próbki brzeczki na¬ klada sie na papierowe, chlonne krazki o srednicy 12,5 mm (w ilosci 0,08 ml) krazek. Uklad testowy inkubuje sie przez noc w temperaturze 37°C, a na¬ stepnie mierzy sie strefy zahamowania. Aktywnosc próbki jest proporcjonalna do powierzchni strefy zahamowania, co jest zgodne z krzywymi standar¬ dowymi. Podloza zaszczepionego drobnoustrojem B. subtilis uzywa sie równiez do wykrywania AT-125 w nastepujacy sposób: kawalki bibula nasyca sie górna warstwa mieszaniny rozpuszczalników o skla¬ dzie: n-butanol, metanol, benzen, woda w stosun¬ ku (2:1:1:1). Nastepnie skrawki papieru suszy sie w ciagu 20 minut, przetrzymuje na przezroczystych tackach, zawierajacych zaszczepione podloze. Tacki te inkubuje sie przez noc w temperaturze 37°C, a nastepnie obserwuje strefy zahamowania wzro¬ stu drobnoustroju.Antybiotyk AT-125 jako zwiazek amfoteryczny, tworzy sole z kwasami, metalami alkalicznymi (rów^ niez sole amonowe), z metalami ziem alkalicznych (równiez sole z magnezem i glinem) i z aminami.Sole z metalami przygotowuje sie, rozpuszczajac AT-125 w wodzie i dodajac rozcienczony roztwór zasady w zakresie pH=7—8. Jako sole z metalami stosuje sie sole z jonami sodowymi, potasowymi lub wapniowymi. Sole z zasadami organicznymi taki¬ mi, jak: aminy pierwszo-, drugo-, trzecio-rzedowe oraz mono-, dwu- i poliaminy, otrzymuje sie, sto¬ sujac podane wyzej lub inne ogólnie stosowane sposoby. Sole amonowe otrzymuje sie ogólnie zna- 14 nymi sposobami. Inne sole otrzymuje sie z terapeu¬ tycznie czynnych zasad, przez co powieksza sie dzia¬ lanie terapeutyczne nowego zwiazku. Takimi zasa¬ dami sa: teofilina, teobromina, kofeina lub ich po- chodne zasady antyhistaminowe, które sa zdolne do tworzenia soli ze slabymi kwasami, zwiazki piry¬ dynowe takie, jak: amid kwasu nikotynowego, hydrazyd kwasu izonikotynowego i podobne, fenylo- alkiloaminy takie, jak: adrenalina, efedryna i inne io oraz cholina i inne.Sole adycyjne z kwasami otrzymuje sie, zobojet¬ niajac antybiotyk AT-125 odpowiednim kwasem do wartosci pH okolo 7, a korzystnie do wartosci pH od okolo 2 do okolo 6. Uzywanymi do tego celu kwasami sa: kwas chlorowodorowy, siarkowy, fosr forowy, sulfamowy, bromowodorowy i inne. Sole zasadowe i kwasowe antybiotyku AT-125 stosuje sie do tych samych "celów biologicznych, co antybiotyk wyjsciowy. AT-125 wykazuje aktywnosc przeciwko Escherichia coli i stosuje sie go do ograniczania lub zniszczenia sluzu, powstajacego w mlynach przy produkcji papieru. Antybiotyk AT-125 przedluza zy¬ cie hodowlom: Trichomonas foetus, Trichomonas ho- minis, Trichomonas vaginalis oswobodzajac je od zakazenia Escherichia coli. Antybiotyk AT-125 sto¬ suje sie jako czynnik przeciwgrzybiczny do chole¬ wek butów, jak opisano w patencie St. Zjedn.Ameryki o numerze 3130505. AT-125 wykazuje ak¬ tywnosc przeciwko Bacilius* subtilis i moze zmniej- szyc lub zlikwidowac zapach ryb lub skrzyn na ry¬ by, wywolany przez ten antybiotyk; albo mozna go uzyc do dezynfekcji pólek i sprzetu w Laboratoriach mykologicznych. Jest on równiez aktywny przeciw¬ ko L-1210 murine leukemia u myszy laboratoryj- nych.Podany nizej przyklad ilustruje przedmiot wy¬ nalazku, nie ograniczajac jego zakresu. O ile ina¬ czej nie zaznaczono, procenty oznaczaja procenty wagowe, a mieszaniny rozpuszczalników podano w 40 stosunku objetosciowym.Przyklad. Kolonie Streptomyces sviceus NRRL 5439, wyobrebniona z gleby, inkuluje sie w kolbie Erlenmeyera o pojemnosci 500 ml, zawierajacej 45 100 ml sterylnego podloza o nastepujacym skladzie: 50 Dextroza Pharamamedia*) Woda wodociagowa *) produkcji Traders Worth, Texas. 55 g/ml g/ml do 1 litra Oill Mili Company, Forth Wartosc pH zakazonego podloza, uprzednio wy- sterylizowanego, wynosi 7,2. Inokulum pozostawia sie w ciagu dwóch dni, w temperaturze 28°C, na wytrzasarce rotacyjnej, typu Gump o 250 obrotach na minute. Inokulum, przygotowane, jak opisano powyzej, uzywa sie do inokulacji 500 ml kolby Er- lenmayera, zawierajacej 100 ml sterylnego podloza fermentacyjnego o nastepujacym skladzie: 65 Weglan wapnia Chlorek sodu Skrobia g/l 2 g/l g/l/ 87 276 16 Mannitol Phytone*) Kaysoy**) Tluszcz plynny Woda wodociagowa g/l g/l g/l 1 ml/100 ml do 1 litra *.) wyciag z maki sojowej **) dobrze zmielony ekstrakt tluszczowy maki so¬ jowej.Przed sterylizacja pH podloza doprowadza sie za pomoca 4N NaOH do wartosci pH=7,2. Kolbe fermentacyjna inokuluje sie stosujac, na 100 ml pod¬ loza fermentacyjnego, 5 ml inokulum. Kolby fer¬ mentacyjne pozostawia sie w ciagu 2 do 3 dni, w temperaturze 32°C, na rotacyjnej wytrzasarce typu Gump, o 250 obrotach na minute. Zasadniczo, mak¬ symalne wytwarzanie antybiotyku AT-125 naste¬ puje w ciagu dwóch dni. Ponizej podano krzywa wytwarzania fermentacyjnego antybiotyku w wy¬ trzasanej kolbie: Czas w godzinach 48 72 96 120 Bu/ml dla AT-125 56 22 26 16 Jednostki aktywnosci biologicznej Bu okresla sie jako ilosc antybiotyku potrzebna do otrzymania strefy zahamowania o srednicy 20 mm. Strefa za¬ hamowania powstaje wokól krazka papierowego o srednicy okolo 13 mm, który nasyca sie 0,08 ml badanego roztworu. Cechy plytki opisano powyzej.Cala brzeczke o objetosci 2501, otrzymana pod¬ czas fermentacji, w sposób opisany powyzej, saczy sie przez porowata ziemie okrzemkowa. Otrzymany czysty przesacz doprowadza sie do wartosci pH= —1—8 i przeprowadza przez kolumne chromatog¬ raficzna, wypelniona 25 litrami swiezo zregenero¬ wanego Dowex 50X16 (H+). Kolumne przemywa sie 50 litrami wody, pozbawionej jonów, a nastepnie eluuje 120 litrami lNNH4OH. Zbiera sie frakcje 6 litrowe. Najbardziej aktywne frakcje (strefa zaha¬ mowania 50 mm) oznacza sie metoda krazków, zamoczonych w badanej frakcji, a nastepnie suszo¬ nych na powietrzu i metoda tacek, zawierajacych Bacillus subtilis (wzrost tego drobnoustroju na syn¬ tetycznym podlozu opisano powyzej). Frakcje akty¬ wne laczy sie i oddestyiowuje rozpuszczalnik oraz nadmiar amoniaku ipod zmniejszonym cisnieniem.Otrzymany wodny koncentrat zawiera 2950 g, zas aktywne eiuaty 244 g. Ciala stale w aktywnych elua- tach sa okolo 13 razy bardziej aktywne, niz ciala stale w przesaczu, otrzymanym z brzeczki (ozna¬ czone metoda testu z B. subtilis).Przygotowany, jal^ podano wyzej, aktywny eluat zatezony na Dowex-50, przesacza sie przy pH o war¬ tosci od 7 do 7,5, przez kolumne, wypelniona 4 lit¬ rami Amberlitu IR-45 (Oft~). Kolumne przemywa sie 8 litrami wody, pozbawionej jonów, 4 litrami 50% wodnego roztworu metanolu i 8 litrami 90% wodnego roztworu metanolu, a nastepnie kolumne eluuje sie 0,5 N kwasem octowym w 90% metanolu.Zbiera sie frakcje 2 litrowe. Najbardziej aktywne 40 50 55 60 65 frakcje, oznaczone za pomoca testu na B. subtilis, laczy sie oddestylowuje rozpuszczalnik pod zmniej¬ szonym cisnieniem i otrzymuje sie 9,40 g suchej po¬ zostalosci o aktywnosci (oznaczenie wykonuje sie przy uzyciu testu na B. subtilis) 28 razy wiekszej od aktywnosci eluatu, otrzymanego z Dowex-50.Mieszanine n-butanolu, benzenu, metanolu i wo¬ dy, pozbawionej jonów, w stosunku (2:1:1:1) wy¬ trzasa sie, a nastepnie warstwy rozdziela sie. Po¬ rowata ziemie okrzemkowa (2340 g) zawiesza sie w górnej warstwie i wytrzasa starannie z porcja war¬ stwy dolnej o objetosci 900 ml. Powstala zawiesine wypelnia sie warstwa mieszaniny, co powoduje dobre osadzenie sie wypelnienia. Otrzymana po oczyszczeniu sposobem opisanym powyzej na jonicie IR-45 substancje rozpuszcza sie w 25 ml dolnej war¬ stwy mieszaniny i homogenizuje z 75 g porowatej ziemi okrzemkowej oraz z 50 ml górnej warstwy mieszaniny. Otrzymana, jednorodna mase naklada sie na szczyt wypelnionej kolumny i przemywa gór¬ na warstwa mieszaniny. Zbiera sie 500 ml frakcje.Z frakcji, posiadajacych najwiecej substancji ak¬ tywnej i(wedlug testu na B. subtilis) odestylowuje sie rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem i otrzymuje 3,93 g pozostalosci o aktywnosci wobec B. subtilis 2,9 razy wiekszej, niz aktywnosc pozo¬ stalosci, otrzymanej po oczyszczeniu na jonicie IR- -45.Sole antybiotyku* AT-125 otrzymuje sie sposobem opisanym powyzej. Sole te stosuje sie do tych sa¬ mych celów, co antybiotyk wyjsciowy. PL

Claims (5)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego antybiotyku AT- -125, znamienny tym, ze hodowle drobnoustroju Streptomyces sviceus zdeponowanego pod numerem kolekcji NRRL 5439 prowadzi sie na wodnym pod¬ lozu, zawierajacym zródla przyswajalnego weglo¬ wodanu \ przyswajalnego azotu, w warunkach tle¬ nowych, dopóki wzrasta aktywnosc biologiczna w podlozu, spowodowana produkcja antybiotyku AT- -125 i otrzymany antybiotyk wydziela sie.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze podloze fermentacyjne saczy sie, przesacz adsorbu- je sie na wymieniaczu jonowym, antybiotyk AT-125 eluuje sie z wymieniacza, a eiuaty podaje sie oczy¬ szczaniu.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze jako wymieniacz jonowy stosuje sie wysokousiecio- wany styren typu zywicy kwasu sulfonowego.
4. 4. Sposób wedlug zastra. 3, znamienny tym, ze stosuje sie zywice Dowex 50X16 w postaci zredu¬ kowanej.
5. 5. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze antybiotyk AT-125 oczyszcza sie metoda chromato¬ grafii na slabej zasadzie styrenowej typu zywicy po¬ liamidowej, metoda chromatografii podzialowej oraz przez krystalizacje.87 276 N2 15CH-CH-C0 ^NH3 PL