PL87267B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego utleniajacego metan szczepu bakteryjnego Ml 02 w postaci czystej kultury o wysokiej aktywnosci.Wiadomo, ze utleniajace metan bakterie, które w przemianie materii jako jedyne zródlo wegla zuzytkowuja metan wystepujacy w ogromnej ilosci w postaci gazu ziemnego, sa nie tylko interesujace z naukowego punktu widzenia, lecz maja równiez duze znaczenie gospodarcze. Zastosowanie ich do otrzymywania bialka spozywczego z metanu wobec zwiekszajacej sie liczby ludnosci stanowi wazna zalete. Od szeregu lat prowadzi sie badania nad otrzymywaniem utleniajacych metan bakterii z wodnych biotopów, w których panuja warunki korzystne dla pizemiany materii takich bakterii.Dotychczas nie udawalo sie jednak otrzymywac utleniajacych metan bakterii w postaci czystych kultur wysoko aktywnych, a jedynie kultury mieszane. Takie kultury mieszane im czysciejsze, tym sa mniej aktywne w warunkach, w jakich zachodzi przemiana materii bakterii, utleniajacych metan. Dalsza ich wada jest to, ze w warunkach, w jakich zachodzi przemiana materii ulegaja zróznicowaniu, jak równiez to, ze produktami przemiany materii sa zlozone mieszaniny trudnych do rozdzialu substancji. Tak wiec, np. w czasopismie „Mikrobiologija" 38 (1969) str. 251-257 opisano wyodrebnienie okolo 100 szczepów utleniajacych metan bakterii z róznych biotopów: z gleby, mulu i wody. Kultury te opisano jako czyste, jednak ich charakterystyka wskazuje jednoznacznie, ze sa to kultury mieszane, co wyraza sie miedzy innymi tym, ze do przemiany ich materii metan nie jest konieczny; wzrastaja one równiez na organicznych pozywkach pozbawionych metanu.Wada znanych szczepów bakteryjnych utleniajacych metan jest to, ze w warunkach typowych dla przemiany materii bakterii, utleniajacych metan, sa one mniej aktywne i mniej stabilne, niz uprzednio znane kultury mieszane, opisywane jako zlozone. Znane kultury wzbogacone i mieszane, z przyczyn wyzej opisanych, nie nadaja sie do zastosowan przemyslowych. « Celem wynalazku jest sposób wytwarzania utleniajacego metan szczepu bakterii, dajacego sie otrzymywac w postaci czystej kultury, o wysokiej aktywnosci, szybko wzrastajacego i stabilnego, praktycznie specyficznego2 87 267 w stosunku do metanu, to znaczy dla którego metan jest jedynym zródlem wegla równiez wówczas, gdy szczep jest czysty i w typowych warunkach przemiany materii mikroorganizmów* utleniajacych metan.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze utleniajace metan bakterie o pozadanej charakterystyce latwiej niz z naturalnego biotopu, w którym istnieja warunki do przemiany materii tych mikroorganizmów i wystepuja wystarczajace ilosci metanu i tlenu, mozna wyodrebnic z tak zwanych biotopów pogranicznych, w których z powodu braku tlenu, brak warunków do przemiany materii.Sposób wytwarzania nowego utleniajacego metan szczepu bakteryjnego Ml02 w postaci wysokoaktywnej, czystej kultury, wedlug wynalazku polega na tym, ze osad denny z wodnego biotopu, w którym z powodu braku tlenu brak warunków do przemiany materii utleniajacego metan szczepu bakteryjnego, wprowadza sie do mineralnej pozywki i zasila mieszanine metanu z powietrzem o ilosciowym udziale skladników 1:1, posiewy kultury bakteryjnej w pozywce mineralnej przenosi na pozywke mineralno-agarowa, z kolonii bakteryjnych na powyzszej pozywce wyodrebnia sie na pojedyncze komórki, które namnaza sie w pozywce mineralnej, zasilanej mieszanina 1 :1 metanu z powietrzem, a nastepnie wyodrebnia wychowano czyste kultury bakteryjne. ¦ Nowy utleniajacy metan szczep bakteryjny Ml02 w postaci czystej kultury o,wysokiej aktywnosci, jest gram-ujemny, wrazliwy na dzialanie kwasów, bezrzeskowy i bezotoczkowy. Na pozywkach agarowych z solami nieorganicznymi tworzy niewidzialne nieuzbrojonym okiem, lecz wykrywalne pod mikroskopem, mikrokolonie.Jednostka metanu przerabiana jest na 0,8 jednostki wagowej bakterii (w przeliczeniu na substancje sucha). Nowy szczep bakteryjny jest, dla odróznienia go od innych znanych szczepów bakteryjnych, oznaczony symbolem M102. ¦ Dla wytwarzania nowego szczepu bakteryjnego sposobem wedlug wynalazku szczególnie uzyteczne okazaly sie osady z wodnych biotopów, w których obficie wystepuje metan, lecz w których z powodu bakteryjnej redukcji, tlen praktycznie nie wystepuje. Oznaczenie stezenia tlenu w biotopach tego rodzaju, jak równiez wykazanie obecnosci bakterii redukujacych mozna przeprowadzic zwyklymi sposobami. Biotopy podanego typu okresla sie jako biotopy pograniczne. Znaczenie biotopów pogranicznych jako zródla okreslone¬ go typu mikroorganizmów bylo dotychczas niedoceniane i dopiero przy realizacji sposobu, stanowiacego przedmiot niniejszego wynalazku, zostalo konsekwentnie wziete pod uwage.Odpowiednich biotopów pogranicznycn poszukiwano w róznych jeziorach w pólnocnej czesci RFN.Szczególnie odpowiednim okazal sie biotop polozony przy brzegu jeziora Schóhsee kolo Plon w Holsztynie, na terenie Instytutu Limnologicznego Maksa Plancka (Max-Planck Institut fur Umnologie). Sposobem wedlug wynalazku wpierw prowadzi sie hodowle wzbogacajaca na pozywce, zaszczepionej osadem z biotopu podanego typu. Hodowle prowadzono na plynnej pozywce mineralnej w zwyklym fermentorze, zasilanym mieszanina 1 :1 metanu z powietrzem.Odpowiednia pozywka mineralna okazala sie miedzy innymi opisana przez Kaserera, Zbl. Bakt., cz. 11^ 15 (1906) str 573-576, zawierajaca w 1 litrze 1 ml tak zwanego roztworu Hoagland A-Z. Roztwór ten opisany jest miedzy innymi w podreczniku E, G. Pringstein Algenreinkulturen, ihre Herstellung und. Erhaltung. Fischer-Verlag jena (1954) str. 1—109. Równiez odpowiednia pozywka okazala sie opisana przez Leadbettera i Fostera, Arch. f.- Mikrobiol., 30 (1958) str. 91-118.Powstawanie i wzrost wzbogaconych kultur bakteryjnych na pozywkach mineralnych okreslonego typu mozna stwierdzac i sledzic zwyklymi, znanymi sposobami, np. mierzac zmetnienie pozywek za pomoca zwyklych fotometrów, przy dlugosci fali 420 nm , Wyrazne zmetnienie daje sie na ogól stwierdzic po jednodniowym przepuszczaniu gazów przez zaszczepiona pozywke. Po kilku dniach obfity wzrost bakterii daje sie wykazac zarówno ] pomiarami zmetnienia, jak i mikro- i makroskopowo.Wnastepnym etapie realizacji sposobu wedlug wynalazku prowadzi sie hodowle posiewów ze wzbogaco¬ nych kultur bakteryjnych na pozywce mineralno-agarowej. Dobre wyniki uzyskuje sie, stosujac opisane powyzej pozywki mineralne z 1,5% zawartoscia agaru, przykladowo tak zwanego Bactoagaru. i Posiane na mineralno-agarowej pozywce bakterie tworza mikrokolonie, niewidzialne okiem nieuzbrojonym, lecz widzialne pod lupa lub mikroskopem. Ten niezwykly rodzaj wzrostu jest czesto typowy dla stanowiacego przedmiot wynalazku szczepu bakteryjnego Ml02. Wyglad mikrokolonii wskazuje na to, ze sa to pojedyncze populacje. « Z kolonii bakteryjnych wyodrebnia sie, znanymi sposobami, np. za pomoca tak zwanego mikromanipulato- ra, pojedyncze komórki. Komórki te nastepnie namnaza sie, umieszczajac je w kropelkach pozywki, korzystnie pozywki mineralnej podanego typu i zasilajac mieszanina 1 :1 metanu z powietrzem. Wyhodowane w kropelkach pozywki czyste kultury bakteryjne mozna wyodrebnic znanymi sposobami.Celowe jest kilkakrotne sprawdzenie droga posiewów czystosci otrzymanych kultur bakteryjnych. Utlenia¬ jacy metan szczep bakteryjny, otrzymany sposobem wedlug wynalazku, jest, wedlug ogólnie stosowanych87267 3 kryteriów, np» wzrostu powierzchniowego, testów biochemicznych, obrazu w mikroskopie optycznym i elektry¬ cznym, czyita kultura.Utleniajacy metan szczep bakteryjny Ml02, z uwagi na korzystna charakterystyke, szczególnie nadaje sie do mikrobiologicznej syntezy bialek z metanu. Metan, wystepujacy w ogromnych ilosciach w postaci gazu ziemnego nie mógl byc dotychczas wykorzystywany do celów zywieniowych z powodu braku mikroorganizmów o odpowiedniej czystosci i stabilnosci, przetwarzajacych metan jako jedyne zródlo wegla do syntezy bialka komórkowego. - Mikrobiologiczne przetwarzanie produktów pochodzenia naturalnego w produkty zywnosciowe, a mianowi¬ cie przeprowadzanie frakcji ropy naftowej, szczególnie odpadów z przemyslu petrochemicznego, w bialko zywieniowe jest procesem znanym. W powyzszym procesie z reguly stosuje sie drozdze i algi.Mikrobiologiczna synteze bialka z metanu za pomoca wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku szczepu bakteryjnego Ml 02 przeprowadza sie w znanych, normalnie stosowanych do takich celów fermentorach, wyposazonych w urzadzenia do ciaglego doprowadzania pozywki i odprowadzania zawierajacych bialko produk¬ tów przemiany materii. « Mikrobiologiczna synteze bialek mozna przeprowadzac w sposób ciagly lub periodycznie. Proces ciagly prowadzi sie przeplywowo, a zawartosc metanu w mieszaninie metan-powietrze kontroluje sie w sposób ciagly, np. za pomoca chromatografii gazowej. Na podstawie wyników oznaczen sklad mieszanki reguluje sie tak, by stosunek objetosci obu skladników wynosil 1 :1.Synteze ciagla mozna przeprowadzac badz to na drodze chemostatycznej, przepuszczajac pozywke przez fermentor ze stala szybkoscia, badz tez na drodze turbidostatycznej, utrzymujac stala gestosc kultury bakteryjnej. W przypadku mikrobiologicznej syntezy, prowadzonej w sposób nieciagly, doprowadzany do fermentora w mieszaninie 1 :1 metanu z powietrzem tlen moze byc prawie calkowicie wykorzystany.Nowe bakterie, wytworzone sposobem wedlug wynalazku ilustruja rysunki, na których fig. 1»i 2 przedstawiaja obraz pojedynczych bakterii szczepu Ml02 w mikroskopie elektronowym, fig. 3- i 4 — obraz bakterii szczepu M102 w mikroskopie optycznym, a fig. 5 — graficzny wykres wyników testu wzrostu, opisanego w próbie II.Fig. H2 przedstawiajace obrazy w mikroskopie elektronowym wykazuja, ze bakterie szczepu M102 maja postac paleczek, otoczonych bardziej lub mniej wyrazna warstwa sluzu* ; Z przedstawionych na fig. 3 i 4 obrazów w mikroskopie optycznym wynika, ze w zaleznosci od grubosci warstwy sluzu, bakterie maja mozliwosc zmiany polozenia lub tez sa zlepione. W przypadku, gdy bakteria otoczona jest stosunkowo cienka warstwa sluzu (fig. 1), to pojedyncze bakterie maja mozliwosc zmiany polozenia (fig. 3). Natomiast, jezeli bakteria otoczona jest stosunkowo gruba warstwa sluzu (fig. 2), to pojednycze bakterie zlepiaja sie ze soba (fig. 4).Jak wynika z fotogramów mikroskopowych, dlugosc bakterii wynosi okolo 1,5 mikrona, a szerokosc okolo 0,8 mikrona. Przebieg krzywej wzrostu przedstawiony na fig. 5 omówiony jest w próbie II.Szczep bakteryjny M102 wedlug wynalazku zostal w dniu 31 marca 1971 r. zlozony w kolekcji szczepów Oddzialu Mikrobiologicznego Instytutu Chemiczno-Fizjologicznego Uniwersytetu im. Johanna Wolfganga Goe¬ thego we Frankfurcie nad Menem i oznaczony numerem PM 102/7 U Przedmiot wynalazku blizej wyjasnia nizej podany przyklad.Przyklad. Wyodrebnienia utleniajacego metan szczepu bakteryjnego Ml 02 dokonano z osadu dennego, pobranego przy zachodnim brzegu jeziora Schohsee na terenie Instytutu Limnologicznego Maksa Plancka. 1 g osadu wprowadzono do 50 ml roztworu Kaserera, zawierajacego w 1 litrze 1 ml roztworu Hoagland A-Z.Zaszczepiona pozywke wprowadzono do fermentora o objetosci okolo 200 ml, który w temperaturze 27°C wstrzasano na wstrzasarce obrotowej, przepuszczajac przez niego mieszanine 1 :1 metanu z powietrzem. « Wszystkie operacje przeprowadzano w warunkach sterylnych. Opis metodyki wyodrebniania przedstawiony jest wZ.f.allg. Mikrobiologie, 10, str. 1*7—36 (1970). Z zasilanej mieszanina gazów pozywki pobierano 2 razy dziennie, rano i wieczorem, próby- Oznaczano zmetnienie przy 420 nm, stosujac zwykly fotometr spektralny. - Wyrazne zmetnienie stwierdzano juz po pierwszym dniu prowadzenia hodowli. Po 3 dniach obfity wzrost bakterii byl nie tylko mierzony zmetnieniem, lecz równiez zauwazalny mikro- i makroskopowo. Wzbogacona hodowla posiewano pozywke mineralno-agarowa. Pozywke te stanowil opisany powyzej zel, zawierajacy obok skladników mineralnych tak zwany Bacto-Agar w ilosci 1,5%. Po 5 dniach przepuszczania nad hodowla mieszaniny metanu z powietrzem utworzyly sie mikrokolonie bakteryjne, widzialne pod silnie powiekszajaca lupa w mikroskopie. Wyglad mikrokolonii wskazywal, na to, ze tworza je jednorodne populacje.Z powyzszych populacji w zwykly sposób za pomoca tak zwanych mikromanipulatorów, wyodrebniono pojedyncze komórki. Komórki te wprowadzono do kropelek mineralnej pozywki opisanego typu i doprowadzano4 ' 87 267 do nich mieszanine 1 : 1 metanu z powietrzem. Po okolo 3 dniach z pojedynczych komórek, wprowadzonych do kropelek pozywki, wzrosly czyste kultury bakteryjne, które wyodrebniono znanym sposobem. Na podstawie analiz, przeprowadzonych metoda chromatografii gazowej, stwierdzono, ze w 1 czesci wagowej metanu powstalo 0,8-0,9 czesci wagowych substancji komórkowej.Nizej podane próby charakteryzuja nowy szczep bakteryjny, wytworzony sposobem wedlug wynalazku.Próba I. Dla oznaczenia charakterystyki wzrostu szczepu bakteryjnego, otrzymanego sposobem, opisanym w przykladzie I, sporzadzono pozywki mineralne z 1% zawartoscia jednego zsubstratów podanych w tabeli 1, Pozywki szczepiono*kultura utleniajacego metan szczepu bakteryjnego Ml02, a wzrost bakterii badano sposobem opisanym przez Skarmana w podreczniku „A Guide to the Indentification of the Genera of Bacteria" (1959), Baltimore, Williams and Wilkins. Wyniki oznaczono w ponizszej tabeli i nastepujaco: - brak przyswajania, ± — slabe przyswajanie, + wyrazne przyswajanie. b Tabela I Substrat 3 dni 7 dni 21 dni Weglowodany: glukoza — — — fruktoza — — ± galaktoza - — - mannoza - — — ryboza — ± ± arabinoza ± + + laktoza — — — maltoza — —' — sacharoza - — — skrobia ± ± ± innulina - — — celuloza — — — Alkohole: metanol ± ± ± etanol — — - propanol - — — butanol - - — akoholizoamylowy — — — alkoholbenzylowy - — — Aldehydy: formaldehyd - — ± acetaldehyd — - — benzaldehyd - — — Kwasy tluszczowe: mrówkowy ± ± + octowy + + + propionowy + + + Aminokwasy: glicyna - - - cystyna - - - alanina fenyloalanina — — — Reakcje ogólne Tworzenieindolu ± — — Próba z czerwienia metylenowa — — — katalaza + + + oksydaza + + + bulionMcConkey'a - - — mlekolakmusowe - — — uplynnianie zelatyny. _ _ _87 267 5 Jak wynika z powyzszej tabeli, sposród badanych substratów: weglowodanów, alkoholi, aldehydów, kwasów tluszczowych i aminokwasów, jedynie badane kwasy tluszczowe wyraznie ulegaja przyswajaniu.Pozostale substraty albo w ogóle nie sa przyswajane, albo tez przyswajane sa jedynie w nieznacznym stopniu. Tak wiec szczep bakteryjny M102 wykazuje wyrazna specyficznosc substratowa, przerabiajac poza metanem jedynie niewielka liczbe substratów, stanowiacych zródlo wegla* Próba II. W celu dalszego oznaczenia charakterystyki wzrostu szczepu bakteryjnego Ml 02 sporzadzono pozywki mineralne wyzej opisanego typu z 1% zawartoscia zwiazków organicznych. Pozywki zaszczepiono czysta kultura szczepu M102, a hodowle prowadzono w zwyklym fermentorze (optymalne pH = 7, optymalna temperatura 27°C, wstrzasarka).W celach porównawczych przeprowadzono test wzrostu na pozywce mineralnej bez dodatku substancji organicznej, zasilanej natomiast strumieniem mieszaniny 1 :1 metanu z powietrzem. - Wzrost bakterii sledzono pomiarami zmetnienia pozywki przy 420 nm, w próbach pobieranych po 3,5 i 7 dniachhodowli. Otrzymane wyniki przedstawiono graficznie krzywa wzrostu na fig. 5.Substraty organiczne uzyte w próbach i numeracje odpowiadajacych im krzywych wzrostu przedstawiono w tabeli 2.Tabela 2 Nr krzywej wzrostu Substrat na fig. 5 * Metan 1 Wyciagmiesny 2 Wyciag z drozdzy 3 Metanol 4 Pfepton 5 Gliceryna 6 Jak wynika z krzywych, przedstawionych na fig. 5,' szczep Ml02 jest praktycznie specyficzny w stosunku do metanu. < Próba III. W celu dalszego scharakteryzowania utleniajacego'metan szczepu bakteryjnego M102 przeprowa¬ dzono w zwykly sposób podane w tabeli 3 próby wybarwiania. Opis tych prób zawarty jest np. w ksiazce autorów Janke i Drekschert „Handbuch der mikrobiologischen Laboratoriumstechnik", Verl. TV Steiakppff, Dresden, 1957, str. 128. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 3.Tabela 3 Próba Wynik Barwienie metodaGrama ujemny Barwienie na kwasoodpornosc ujemny Barwienie na obecnosc prze trwalników ujemny Barwienie na obecnosc otoczek ujemny Jak wynika z powyzszego zestawienia, w komórkach bakteryjnych brak akceptorów, uzytych w próbach barwników.Próba IV. W celu okreslenia aktywnosci utleniania metanu otrzymanego sposobem wedlug wynalazku szczepu bakteryjnego Ml 02, do fermentora o pojemnosci 5 litrów wprowadzono 1 litr pozywki mineralnej podanego typu i zaszczepiono ja testowanym szczpem bakteryjnym- Przez zaszczepiona pozywke, utrzymywana w temperaturze 27°C, przepuszczano mieszanine 1 :1 metanu z powietrzem., Po 5 dniach obfita kulture bakteryjna wyodrebniono z pozywki. Wydajnosc wyniosla, w przeliczeniu na sucha substancje, 1,5 g. Na jednostke wagowa metanu powstalo 0,8 jednostek wagowych suchej masy bakteryjnej. Straty metanu w gazach wylotowych wyniosly okolo 20%, tak wiec przeprowadzenie wegla metanowego w bialko komórki jest praktycznie ilosciowe., Próba V. Nizej podana próba omawia zastosowanie nowego szczepu bakteryjnego, wytworzonego sposobem wedlug wynalazku, do syntezy bialka. W sposób, podany w próbie IV, 1 litr sterylnej pozywki mineralnej podanego typu, zawierajacej w 1 litrze 1 ml tak zwanego roztworu Hoagland A-Z zaszczepiono szczepem bakteryjnym Ml02. Przez zaszczepiona pozywke wprowadzona do fermentora o pojemnosci 5 litrów, wstrzasane¬ go na wstrzasarce obrotowej, przepuszczano w temperaturze^7°C mieszanine 1 :1 gazu ziemnego z powietrzem. » Wzrost bakterii juz po uplywie jednego dnia doprowadzil do wyraznego zmetnienia pozywki. P© 5 dniach wzrost kultury osiagnal okolo 1,5 g suchej substancji. Wyodrebnienia bakterii dokonano zwyklym sposobem.Okolo 70% masy bakterii, w przeliczeniu na sucha substancje, stanowily bialka, a na pozostalosc skladaly sie glównie weglowodany, liptydy i skladniki scian komórkowych. Wyodrebnienia skladników bialkowych dokona¬ no zwyklym sposobem.6 87 267 Wzrost bakterii juz po uplywie jednego dnia doprowadzil do wyraznego zmetnienia pozywki. Po 5 dniach wzrost kultury osiagnal okolo 1,5 g suchej substancji. Wyodrebnienia bakterii dokonano zwyklym sposobem. ¦ Okolo 70% masy bakterii, w przeliczeniu na sucha substancje, stanowily bialka, a na pozostalosc skladaly sie glównie weglowodany, lipidy i skladniki scian komórkowych. Wyodrebnienia skladników bialkowych dokona¬ no zwyklym sposobem.Odpowiedni sposób wyodrebniania jest np. opisany w Z. fallg. Mikrobiologie, 10 (1970) str. 17—36.Zawartosc bialka w wyodrebnionych komórkach mozna oznaczyc na przyklad sposobem Lowry'ego i Lopeza opisanym miedzy innymi w podreczniku O. Drewsa „Mikrobiologische Praktikum fur Naturwissenschaften", Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 1968, str. 110.Jak wynika z obliczen, z jednostki wagowej metanu powstaje okolo 0,8 jednostki suchej masy bakteryjnej i tylko 20% metanu uchodzi w gazach wylotowych. Jest to najwyzsza wydajnosc asymilacji alkanów, jaka udalo sie dotychczas osiagnac. PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego utleniajacego metan szczepu bakteryjnego Ml02 w postaci wysokoaktyw- nej czystej kultury, znamienny tym, ze osad denny z wodnego biotopu, w którym z powodu braku tlenu nie ma warunków do przemiany materii bakterii, utleniajacych metan, wprowadzony do pozywki mineralnej, przedmuchuje sie mieszanina 1 :1 metanu z powietrzem, wzbogacona kultura bakteryjna posiewa pozywke mineralno-agarowa, z kolonii bakteryjnych wyhodowanych na tej pozywce wyodrebnia pojedyncze komórki, namnaza je na pozywce mineralnej, przedmuchiwanej mieszanina 1 :1 metanu z powietrzem, a nastepnie wyodrebnia wyhodowana kulture bakteryjna.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako pozywke mineralna stosuje sie roztwór Kaserera, zawierajacy w 1 litrze 1 ml roztworu Hoagland A-Z.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1,- znamienny tym, ze jako pozywke mineralna stosuje sie roztwór Leadbettera.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako pozywke mineralno-agarowa stosuje sie roztwór Kaserera, zawierajacy w 1 litrze 1 ml roztworu Hoagland A-Z, z 1,5% zawartoscia Bacto-Agaru.Fig. 2 f ;' FigA 87 267 / / ¦^ PL