Przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy bialka z zastosowaniem nowego szczepu bakteryj¬ nego utleniajacego metan.Wiadomo, ze utleniajace metan bakterie, które w przemianie bakterii wykorzystuja metan, wy¬ stepujacy w ogromnej ilosci w postaci gazu ziem¬ nego, sa nie tylko interesujace z naukowego punk¬ tu widzenia, lecz maja równiez duze znaczenie gospodarcze. Umozliwiaja one wytwarzanie bialka spozywczego z metanu, co ma duze znaczenie ze wzgledu na stale zwiekszajaca sie liczbe ludnosci.W czasopismie „Mikrobiologija" 38 (1969) strona 251—257 opisano wyodrebnienie okolo 100 szcze¬ pów bakterii utleniajacych metan. Do wyodreb¬ nienia stosowano rózne biotopy, np. z gleby, mulu i wody. Wyodrebnione szczepy przedstawiono jako czyste kultury. Jednak ich charakterystyka wska¬ zuje, ze sa to kultury mieszane. Kultury te mozna stosowac do wytwarzania bialka z metanu.Wada zastosowania tych kultur do syntezy bial¬ ka jest to, ze w warunkach utleniajacych metan sa one malo 'aktywne i malo stabilne.Mikrobiologiczne przetwarzanie produktów po¬ chodzenia naturalnego w produkty zywnosciowe, a mianowicie przeprowadzenie frakcji ropy nafto¬ wej, szczególnie odpadów z przemyslu petroche¬ micznego, w bialko zywieniowe jest procesem zna¬ nym. W powyzszym procesie z reguly stosuje sie drozdze i algi.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu syn¬ tezy^ bialka z metanu, który charakteryzuje sie wysoka wydajnoscia i który to sposób móglby byc stosowany do celów przemyslowych.Obecnie stwierdzono, ze zastosowanie nowego utleniajacego metan szczepu bakteryjnego M 102 w procesie syntezy bialka charakteryzuje sie wy¬ soka wydajnoscia i moze byc stosowane do celów przemyslowych.Sposób syntezy bialka wedlug wynalazku polega na tym, ze sterylna lub nastepnie sterylizowana pozywke mineralna wprowadza sie do fermenta- tora, szczepi nowym utleniajacym metan szczepem bakteryjnym M102, przepuszcza przez zaszczepio¬ na pozywke mieszanine 1 : 1 metanu z powietrzem lub gazu ziemnego z powietrzem, wyodrebnia wy¬ hodowana kulture bakteryjna i ewentualnie oczy¬ szcza sie skladniki bialkowe.Utleniajacy metan szczep bakteryjny M 102 w postaci czystej kultury o wysokiej aktywnosci jest gram ujemny, wrazliwy na dzialanie kwasów, as- progenny, bezrzeskowy i bezotoczkowy. Na po¬ zywkach agarowych z solami nieorganicznymi two¬ rzy niewidzialne nieuzbrojonym okiem, lecz wy¬ krywalne pod mikroskopem, mikrokolonie. Z jed¬ nostki wagowej metanu wytwarza sie 0,8 jednost¬ ki wagowej bakterii (w przeliczeniu na sucha sub¬ stancje).Nowy szczep bakteryjny jest, dla odróznienia go 84 57584 5' 3 od innych znanych szczepów bakteryjnych, ozna¬ czonym symbolem M 102.Dla wyodrebnienia nowego szczepu bakteryjnego stosowanego w sposobie wedlug wynalazku szcze¬ gólnie uzyteczne okazaly sie osady z wodnych bio- 5 topów, w których obficie wystepuje metan, lecz w których, z powodu bakteryjnej redukcji, tlen praktycznie nie wystepuje. Oznaczenie stezenia tlenu w biotopach tego rodzaju, jak równiez wy¬ kazanie obecnosci bakterii redukujacych mozna io przeprowadzic zwyklymi sposobami. Biotopy da¬ nego typu okresla sie jako biotopy pograniczne.Znaczenie biotopów pogranicznych jako zródla okreslonego typu mikroorganizmów bylo dotych¬ czas niedoceniane i dopiero przy realizacji sposo- i5 bu stanowiacego przedmiot niniejszego wynalazku zostalo konsekwentnie wziete pod uwage.Odpowiednich biotopów pogranicznych poszuki¬ wano w róznych jeziorach w pólnocnej czesci RFN.Szczególnie odpowiednim okazal sie biotop polo- 2o zony przy brzegu jeziora Schóhsee kolo Plon w Holsztynie, na terenie Instytutu Limnologicznego Maksa Plancka (Max-Planck Institut fur Limno- logie).Powstawanie i wzrost wzbogaconych kultur bak- 25 teryjnych na pozywkach mineralnych okreslonego typu mozna stwierdzac i sledzic zwyklymi, zna¬ nymi sposobami, np. mierzac zmetnienie pozywek za pomoca zwyklych fotometrów przy dlugosci fali 420 mm. Wyrazne zmetnienie daje sie na ogól 30 stwierdzic po jednodniowym przepuszczeniu ga¬ zów przez zaszczepiona pozywke. Po kilku dniach obfity wzrost bakterii daje sie wykazac zarówno pomiarami zmetnienia jak i mikro- i makrosko¬ powo. 35 Hodowle posiewów ze wzbogaconych kultur bak¬ teryjnych prowadzi sie na pozywce mineralno-aga- rowej. Dobre wyniki uzyskuje sie stosujac opisane powyzej pozywki mineralne z 1,5% zawartoscia agaru, przykladowo tak zwanego Bactoagaru. 40 Posiane na mineralno-agarowej pozywce bakte¬ rie tworza mikrokolonie, niewidzialne okiem nie¬ uzbrojonym, lecz widzialne pod lupa lub mikro¬ skopem. Ten niezwykly rodzaj wzrostu jest typo¬ wy dla nowego szczepu bakteryjnego M 102. Wy- 45 glad mikrokolonii wskazuje na to, ze sa to poje¬ dyncze populacje.Z kolonii bakteryjnych wyodrebnia sie, znany¬ mi sposobami, np. za pomoca tak zwanego mi- kromanipulatora, pojedyncze komórki. Komórki te 50 nastepnie namnaza sie, umieszczajac je w kropel¬ kach pozywki, korzystnie pozywki mineralnej po¬ danego typu i zasilajac mieszanine 1:1 metanu z powietrzem. Wyhodowane w kropelkach pozywki czyste kultury bakteryjne mozna wyodrebnic zna- 55 nymi sposobami.Celowe jest kilkakrotne sprawdzenie, droga po¬ siewów, czystosci otrzymanych kultur bakteryj¬ nych. Utleniajacy metan szczep bakteryjny, jest, wedlug ogólnie stosowanych kryteriów, np. wzro- 60 stu powierzchniowego, testów biochemicznych, ob¬ razu w mikroskopie optycznym i elektronowym, kultura czysta.Utleniajacy metan szczep bakteryjny M 102, z uwagi na korzystna charakterystyke, szczególnie 65 4 nadaje sie do mikrobiologicznej syntezy bialek z metanu.Metan, wystepujacy w ogromnych ilosciach w postaci gazu ziemnego nie mógl byc dotychczas wykorzystany do celów zywieniowych, z powodu braku mikroorganizmów o odpowiedniej czystosci i stabilnosci, przetwarzajacych metan jako jedyne zródlo wegla do syntezy bialka komórkowego.Mikrobiologiczna synteze bialka z metanu za po¬ moca nowego szczepu bakteryjnego M 102 pro¬ wadzi sie w znanych, normalnie stosowanych do takich celów fermentorach, wyposazonych w urza¬ dzenia do ciaglego doprowadzania pozywki i od¬ prowadzania zawierajacych bialko produktów prze¬ miany materii.Mikrobiologiczna synteze bialek mozna przepro¬ wadzac w sposób ciagly lub periodyczny. Proces ciagly prowadzi sie przeplywowo, a zawartosc me¬ tanu w mieszaninie metan—powietrze kontroluje sie w sposób ciagly, np. za pomoca chromatografii gazowej. Na podstawie wyników oznaczen sklad mieszanki reguluje sie tak, by stosunek objetosci obu skladników wynosil 1:1.Synteze ciagla wedlug wynalazku mozna pro¬ wadzic badz to na drodze chemostatycznej, prze¬ puszczajac pozywke przez fermentor ze stala szyb¬ koscia, badz tez na drodze turbidostatycznej, utrzy¬ mujac stala gestosc kultury bakteryjnej.W przypadku mikrobiologicznej syntezy prowa¬ dzonej w sposób nieciagly, doprowadzany do fer- mentatora w mieszaninie 1 : 1 metanu z powie¬ trzem, tlen moze byc prawie calkowicie wyko¬ rzystany.Nowy szczep bakteryjny stosowany wedlug wy¬ nalazku zilustrowany jest blizej na rysunkach, na których fig. 1 i 2 przedstawia obraz pojedynczych bakterii szczepu M 102 w mikroskopie elektrono¬ wym, fig. 3 i 4 — obraz bakterii szczepu M 102 w mikroskopie optycznym, a fig. 5 — graficzny wykres wyników testu wzrostu opisanego w przy¬ kladzie w próbie III.Fig. 1 i 2 przedstawiajace obrazy w mikrosko¬ pie elektronowym, wykazuja, ze bakterie szczepu M 102 maja postac paleczek otoczonych bardziej lub mniej wyrazna warstwa sluzu.Z przedstawionych na fig. 3 i 4 obrazów w mi¬ kroskopie optycznym wynika, ze w zaleznosci od grubosci warstwy sluzu, bakterie maja mozliwosc zmiany polozenia lub tez sa zlep;one. W przy¬ padku, gdy bakteria otoczona jest stosunkowo cien¬ ka warstwa sluzu (fig. 1), wtedy pojedyncze bak¬ terie maja mozliwosc zmiany polozenia (fig. 3).Natomiast jezeli bakteria otoczona jest stosunkowo gruba warstwa sluzu (fig. 2) wtedy pojedyncze bak¬ terie zlepiaja sie ze soba (fig. 4).Jak wynika z fotogramów mikroskopowych, dlu¬ gosc bakterii wynosi okolo 1,5 mikrona, a szero¬ kosc okolo 0,8 mikrona.Przebieg krzywej wzrostu przedstawiony na fig. omówiony jest w przykladzie III.Przebieg bakteryjny M 102 zostal w dniu 31 marca 1971 r. zlozony w kolekcji szczepów Oddzia¬ lu Mikrobiologicznego Instytutu Chemiczno-Fizjo- logicznego Uniwersytetu im. Johana Wolfganga84 575 Goethego we Frankfurcie nad Menem i oznaczony numerem PM 102/71.Nizej podane próby charakteryzuja nowy szczep bakteryjny stosowany w sposobie wedlug wyna¬ lazku.Próba I. Wyodrebnienie utleniajacego metan szczepu bakteryjnego M 102 dokonano z osadu dennego pobranego przy zachodnim brzegu jeziora Schóhsee na terenie instytutu Limnologicznego Maksa Plancka. 1 g osadu wprowadzono do 50 ml roztworu Kaserera zawierajacego w 1 litrze 1 ml roztworu Hoagland A—Z. Zaszczepiona pozywke wprowadzono do fermentatora o objetosci okolo 200 ml, który w temperaturze 27°C wstrzasano na wstrzasarce obrotowej przepuszczajac przez niego mieszanine 1 : 1 metanu z powietrzem. Wszystkie operacje przeprowadzano w warunkach sterylnych.Opis metodyki wyodrebniania przedstawiony jest w Z. f. allg. Mikrobiologie, 10 s. 17—36 (1970).Z zasilanej mieszaniny gazów pozywki pobiera¬ no 2 razy dziennie, rano i wieczorem, próby. Ozna¬ czano zmetnienie przy 420 nm, stosujac zwykly fotometr spektralny. Wyrazne zmetnienie stwier¬ dzano juz po pierwszym dniu prowadzenia hodo¬ wli. Po 3 dniach obfity wzrost bakterii byl nie tylko mierzony zmetnieniem, lecz równiez zauwa¬ zalny mikro- i makroskopowo.Wzbogacona hodowle posiewano pozywka mine- ralno-agarowa. Pozywke te stanowil opisany po¬ wyzej zel, zawierajacy obok skladników mineral¬ nych tak zwany Bacto-Agar, w ilosci 1,5%. Po 5 dniach przepuszczania nad hodowla mieszaniny me¬ tanu z powietrzem utworzyly sie mikrokolonie bakteryjne, widzialne pod silnie powiekszajaca lu¬ pa lub w mikroskopie.Wyglad mikrokolonii wskazywal na to, ze two¬ rza je jednorodne populacje. Z powyzszych popu¬ lacji w zwykly sposób, za pomoca tak zwanych mikromanipulatorów, wyodrebniano pojedyncze ko¬ mórki. Komórki te wprowadzono do kropelek mi¬ neralnej pozywki opisanego typu i doprowadzano do nich mieszanine 1 : 1 metanu z powietrzem. Pc okolo 5 dniach z pojedynczych komórek wprowa¬ dzonych do kropelek pozywki wzrosly czyste kul¬ tury bakteryjne, które wyodrebniono znanym spo¬ sobem. Na podstawie analiz przeprowadzonych me¬ toda chromatografii gazowej stwierdzono, ze z 1 czesci wagowej metanu powstalo 0,8—0,9 czesci wagowych substancji komórkowej.Próba II. Dla oznaczenia charakterystyki wzrostu szczepu bakteryjnego otrzymanego sposo¬ bem opisanym w próbie I sporzadzono pozywki mineralne z 1% zawartoscia jednego z substratów podanych w tabeli I Pozywki szczepiono kultura utleniajaca metan szczepu bakteryjnego M 102, a wzrost bakterii badano sposobem opisanym przez Skermana w podreczniku „A t^uide to the Idenli- fication of the Genera of Baceria (1959), Baltimore, Williams and Wilkins.Wyniki oznaczono w ponizszej tabeli 1 nastepu¬ jaco: -^ — brak przyswajania, — — slabe przyswa¬ janie, -f- — wyrazne przyswajanie. 6 Tabela 40 Substrat 1 Weglowodany: glukoza fruktoza galaktota mannoza ryiboza arabinoza laktoza maltoza sacharoza skrobia inulina celuloza Alkohole: metanol etanol propanol butanol alkohol izoamy- lowy alkohol benzylowy 1 Aldehydy: formaldehyd acetaldehyd benzaldehyd 1 Kwasy tlusz¬ czowe: mrówkowy octowy propionowy 1 Aminokwasy: glicyina cystyna alanina fenyloalanina 1 Reakcje ogól¬ ne: tworzenie indolu próba z czerwienia metylenowa katalaza oksydaza bulion McConkey'a mleko lakmusowe uplynnianie zela- [ tyny | 3 dni — — — — — — 7 dni — — — — — 1 II-III | 21 dni — — II I-I- -j- — — Jak wynika z powyzszej tabeli, sposród bada¬ nych substratów: weglowodanów, alkoholi, alde¬ hydów, kwasów tluszczowych i aminokwasów, je¬ dynie badane kwasy tluszczowe wyraznie ulegaja przyswajaniu. Pozostale substraty albo w ogóle84 575 nie sa przyswajane, albo tez przyswajane sa jedynie w nieznacznym stopniu. Tak wiec szczep bakteryjny M 102 wykazuja wyrazna specyficz¬ nosc substratowa, przerabiajac poza metanem je¬ dynie niewielka liczbe substratów stanowiacych zródlo wegla.Próba III. W celu dalszego oznaczenia cha¬ rakterystyki wzrostu szczepu bakteryjnego M 102 sporzadzono pozywki mineralne wyzej opisanego typu z 1% zawartoscia zwiazków organicznych.Pozywki zaszczepiono czysta kultura szczepu M 102 a hodowle prowadzono w zwyklym fermen- torze (optymalne pH 7, optymalna temperatura 27°C, wstrzasarka).W celach porównawczych przeprowadzono test zmetnienia pozywki, mierzonej przy 420 nm, w próbach pobieranych po 3,5 i 7 dniach hodowli.Otrzymane wyniki przedstawiono graficznie krzy¬ wa wzrostu na fig. 5.Substraty organiczne. uzyte w próbach i nume¬ racje odpowiadajacych im krzywych przedstawio¬ no w ponizszej tabeli. 8 Substrat metan wyciag miesny wyciag z drozdzy metanol peipton gliceryna Nr krzywej wzrostu na fig. 5 1 2 3 4 6 | Jak wynika z krzywych przedstawionych na fig. , szczep M 102 jest specyficzny w stosunku do metanu.Próba IV. W celu dalszego scharakteryzowa¬ nia utleniajacego metan szczepu bakteryjnego M 102 przeprowadzono, w zwykly sposób, podane w tabeli II próby wybarwiania. Opis tych prób za¬ warty jest np. w ksiazce autorów Janke i Drek- schert „Handbuch der mikrobiologischen labora- toriumstechnik", Verl. Th. Steinkopf, Dresden, 1957, s. 128. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeliII. ~ ' Próba Barwienie metoda Grama barwienie za kwasoodpornosc barwienie na obecnosc przetrwalni- ków barwienie na obecnosc rzesek barwienie na obecnosc otoczek Wynik ujemny ujemny ujemny ujemny ujemny | Jak wynika z powyzszego zestawienia, w komór¬ kach bakteryjnych brak akceptorów uzytych w próbach barwników.Próba V. W celu okreslenia aktywnosci utle¬ niania metanu szczepu bakteryjnego M 102, do fermentora o pojemnosci 5 litrów wprowadzono 1 litr pozywki mineralnej podanego typu i za- 39 40 45 50 55 60 65 szczepiono ja testowanym szczepem bakteryjnym.Przez zaszczepiona pozywke, utrzymywana w tem¬ peraturze 27°C przepuszczano mieszanine 1 : 1 me¬ tanu z powietrzem. Po 5 dniach obfita kulture bakteryjna wyodrebniono z pozywki. Wydajnosc wyniosla, w przeliczeniu na sucha substancje, 1,5 g.Na jednostke wagowa metanu powstalo 0,8 je¬ dnostek wagowych suchej masy bakteryjnej.Straty metanu w gazowych wylotowych wynio¬ sly okolo 20%, tak wiec przeprowadzenie wegla metanowego w bialko komórki jest praktycznie ilosciowe.Nizej podany przyklad ilustruje przedmiot wy¬ nalazku.Przyklad. Mikrobiologiczna synteze bialka z gazu ziemnego przeprowadzono przy uzyciu utle¬ niajacego metan szczepu bakteryjnego M 102, któ¬ rym zaszczepiono, w sposób podany w próbie V, 1 litr sterylnej pozywki mineralnej podanego ty¬ pu, zawierajacej w 1 litrze 1 ml tak zwanego roz¬ tworu Hoagland A—Z. Przez zaszczepiona pozyw¬ ke wprowadzona do fermentora o pojemnosci 5 li¬ trów, wstrzasanego na wstrzasarce obrotowej prze¬ puszczano, w temperaturze 27°C mieszanine 1 : 1 g.izu zierrnego z powietrzem.Wzrost bakterii juz po uplywie jednego dnia doprowadzil do wyraznego zmetnienia pozywki. Po dniach wzrost kultury osiagnal okolo 1,5 g su¬ chej substancji. Wyodrebnienia bakterii dokonano zwyklym sposobem. Okolo 70% masy bakterii, w przeliczeniu na sucha substancje stanowily bialka a na pozostalosc skladaly sie glównie weglowoda¬ ny, lipidy i skladniki scian komórkowych. Wy¬ odrebnienia skladników bialkowych dokonano zwy¬ klym sposobem.Odpowiednim sposobem wyodrebniania jest np. opisany w Z. f. allg. Mikrobiologie, 10 (1970) s. 17—36. Zawartosc bialek w wyodrebnionych ko¬ mórkach mozna oznaczac np. sposobem Lowry'ego i Lopeza opisanym miedzy innymi w podreczniku G. Drewsa „Mikrobiologische Praiktikum fiir Na- turwissenschaften" Springer Verlag, Berlin—Heil- derberg—New York, 1968, s. 110.Jak wynika z obliczen, z jednostki wagowej me¬ tanu powstaje okolo 0,8 jednostek suchej masy bakteryjnej i tylko 20% metanu uchodzi w ga¬ zach wylotowych. Jest to najwyzsza wydajnosc asymilacji alkanów, jaka udalo sie dotychczas osia¬ gnac. PL