PL84579B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia szczepionki przeciw ospie, polegajacy na tym, ze material wyjsciowy (tzw. miazga krowiankowa) jest wyjalawiany czynnikami chemicznymi przez stosunkowo dlugi okres czasu, a nastepnie podda¬ wany dzialaniu enzymów proteolitycznych, co za¬ pewnia otrzymanie szczepionki bezpiecznej, o na¬ lezytej skutecznosci i ekonomicznej w produkcji.Szczepienia przeciw ospie naleza do wazniejszych zabiegów profilaktycznych, zabezpieczajacych po¬ pulacje przed epidemiami tej choroby. Szczepienia byly stosowane w prymitywnej formie zapewne juz w zamierzchlych czasach, a w obecnej postaci da¬ tuja sie od przelomu 18 i 19 wieku.Szczepionki przeciw ospie stosowane obecnie na calym swiecie nie róznia sie zasadniczo od szcze¬ pionki, stosowanej w poczatkach 19 wieku. Szcze¬ pionka jest rozdrobniona zawiesina wykwitów chorobowych, powstalych na skórze zwierzat (naj¬ czesciej bydla rogatego, lecz równiez owiec, wiel¬ bladów i in.).Szczepionka ta wykazuje wiele niekorzystnych cech: jest nietrwala w przechowywaniu, zawiera domieszke zywych bakterii i nie stanowi jedno¬ rodnej zawiesiny. Obecnosc zywych bakterii w szczepionce wynika z faktu, ze wykwity chorobowe jako zbierane ze skóry zwierzat, nigdy nie sa wol¬ ne od zakazenia bakteryjnego.Wprawdzie obecnosc chorobotwórczych bakterii w szczepionkach przeciwospowych jest rygorystycz- 2 nie kontrolowana, ale nawet w przypadku nieobec¬ nosci tych bakterii inne drobnoustroje, nawet nie chorobotwórcze, sprawiaja, ze gojenie miejsca za¬ szczepionego u ludzi przebiega trudniej i czesto z komplikacjami.Niejednorodnosc zawiesiny, stanowiacej szcze¬ pionke, wynika z faktu, ze wirusowi, zawartemu w szczepionce, towarzysza produkty destrukcji tkanki skóry zwierzecia, uzytego do produkcji szczepionki.Dla usuniecia tych niekorzystnych cech szcze¬ pionki próbowano wielu sposobów. Jednym z nich jest namnazanie wirusa krowianki nie na zwierze^ tach, ale na hodowlach kurzych komórek zarodko¬ wych, w warunkach scisle jalowych. Jednak szcze¬ pionki takie maja nizsza wartosc uodporniajaca, niz szczepionki wyprodukowane na skórze zwie¬ rzecia.Inna droga dla usuniecia trudnosci przy zacho¬ waniu wlasciwosci uodporniajacych wirusa kro¬ wianki, jest wyodrebnienie wirusów, zawartych w skórnych wykwitach zwierzat za pomoca trakto¬ wania surowego materialu wyjsciowego niektórymi weglowodorami. Jest to jednak metoda klopotliwa, prowadzaca do duzych strat wirusów i budzaca PL

Claims (1)

1. zastrzezenia ze wzgledu na mozliwosc przetrwania w szczepionce sladowych ilosci weglowodorów, u- zytych w procesie produkcyjnym. Metoda bedaca przedmiotem wynalazku usuwa Ujemne cechy wyzej opisanych, dotychczas uzywa- 84 57984 579 nych sposobów. Materialem wyjsciowym jest pel¬ nowartosciowa pod wzgledem zawartosci wirusa i mocy immunogennej miazga krowiankowa, tzn. ze¬ brane i zhomogenizowane wykwity skórne zwie¬ rzat, naskórnie zakazonych wirusem krowianki, za¬ wierajace obok wirusów krowianki dosc znaczne ilosci produktów destrukcji tkanek oraz pewne ilosci bakterii. Ten material wyjsciowy w pierw¬ szym etapie jest poddawany wyjalowieniu chemicz¬ nemu, majacemu na celu zabicie towarzyszacych wirusom bakterii, co pozwala na ostateczne uzyska¬ nie szczepionki jalowej. Jako czynników wyjalawiajacych uzywa sie est¬ rów kwasu benzoesowego, azydku sodu lub ich mie¬ szaniny, jak równiez konwencjonalnych zwiazków wyjalawiajacych takich, jak fenol i krezole. Czyn¬ niki te nie dzialaja szybko na bakterie, a przy przedluzonym dzialaniu moga równiez uszkadzac wirusa. Zastosowanlejjednak wg wynalazku tem¬ peratury nieznacznie powyzej 0°C, korzystnie 2— —6°C, umozliwia stosowanie przez okres 3 i wiecej dni stosunkowo duzego stezenia czynnika bez nie¬ pozadanego efektu na aktywnosc wirusa. W drugim etapie, wyjalowiony ale zawierajacy produkty destrukcji tkanek material wyjsciowy, poddaje sie trawieniu za pomoca enzymów pro¬ teolitycznych, a zwlaszcza proteaz serynowych ta¬ kich, jak trypsyna, chymotrypsyna, elastaza lub ich mieszaniny. W wyniku trawienia, wielkocza¬ steczkowe, a czesciowo nierozpuszczalne produkty destrukcji tkanek staja sie materialem rozpuszczal¬ nym, co nastepnie umozliwia oddzielenie od nich wirusa przez wirowanie szybkoobrotowe, pozwala¬ jace na uzyskanie przyspieszenia nie mniej niz 40 000 g. W trzecim etapie, jednorodna zawiesine wirusów, pozbawiona przez wirowanie zarówno zde- polimeryzowanych produktów rozpadu tkanki, jak i enzymów proteolitycznych, liofilizuje sie w am¬ pulkach, stanowiacych ostateczne opakowanie szcze¬ pionki. Przyklad: 10,0 g miazgi krowiankowej o mia¬ nie 108 PFU/g zhomogenizowano w 90 ml zbuforo- wanego fosofranami 10% roztworu NaCl. Do uzys¬ kanej zawiesiny dodano 20 ml 5°/o roztworu feno¬ lu. Calosc odstawiono do chlodni o temperaturze 4°C. Po czterech dniach zawiesine poddano wiro¬ waniu z sila 40 000 g przez 60 minut w tempera¬ turze 4°C. Supernatant usunieto, a osad zawieszo¬ no, poslugujac sie homogenizatorem w 90 ml 0,29% roztworu try^syny w ^buforowanym roztworze NaCl. Zawiesine wirusa w roztworze trypsyny in- kubowano wsród ciaglego mieszania w temperatu¬ rze 37°C przez trzy godziny. Nastepnie zawiesine ochlodzono do 4°C i wirusy odwirowano z sila 5 40 000 g przez 60 minut w temperaturze 4°C. Supernatant usunieto, a osad wirusa zawieszono, poslugujac sie homogenizatorem w 90 ml zbuforo- wanego roztworu NaCl. Z zawiesiny usunieto wiek¬ sze agregaty przez wirowanie z sila 2000 g przez io 10 minut w temperaturze 4°C. Opalizujacy ale wykazujacy cechy jednorodnej zawiesiny superna¬ tant, zlano znad osadu i dodano do niego 10 ml 50% roztworu sacharozy. Tak uzyskana zawiesine wirusa rozlano do ampulek a 0,3 ml i poddano 15 liofilizacji. Po calkowitym usunieciu wody ampul¬ ki zatopiono w warunkach prózniowych; kazda ampulka zawierala nie mniej niz 0,5X107 PFU wi¬ rusa krowianki. Wytworzona tym sposobem szczepionka wykazy- 20 wala wszystkie cechy wymagane w stosunku do szczepionki przeciwospowej w badaniach zarówno in vivo, jak i in vitro, wlacznie z trwaloscia mia¬ na przy przedluzonym przechowywaniu w tempe¬ raturze 37°C. Zastosowana u ludzi dawala prawi- 25 dlowy obraz pozytywnego wyniku szczepienia, bez zakazenia przyszczepiennego i z bardzo dobrze go¬ jacym sie ubytkiem skórnym. 30 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania szczepionki przeciw os¬ pie, znamienny tym, ze zhomogenizowane wykwity 35 skórne zwierzat naskórnie zakazonych wirusem kro¬ wianki wyjalawia sie wstepnie za pomoca czyn¬ ników chemicznych takich, jak fenol, krezol, est¬ ry kwasu benzoesowego, azydek sodu, po czym traktuje sie enzymami proteolitycznymi z grupy 40 proteaz serynowych, a nastepnie oddziela wirusy od roztworu czynników wyjalawiajacych, od enzy¬ mów proteolitycznych i od zdepolimeryzowanych produktów destrukcji tkanki zwierzecej, stosujac wirowanie z sila nie mniejsza niz 40 000 g. 2. « 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wyjalowienie przeprowadza sie w temperaturze 2— —6°C w czasie co najmniej 72 godzin. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako enzymy proteolityczne stosuje sie trypsyne, 50 chymotrypsyne, ilastaze lub ich mieszaniny. Bltk 1539/76 r. 105 egz. A4 Cena 10 zl PL