PL83710B2 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania kandycydyny o zwiekszonej trwalosci, czystosci i aktywnosci bilogicznej.Kandycydyna, antybiotyk, przeciwgrzybowy z podgrupy aromatycznych makrolidów polienowych, opisa¬ na zostala po raz pierwszy przez Lechevaliera w Mycologia, vol.XIV No 2, str. 155—171, March-April 1953.Otrzymywana jest na drodze biosyntezy ze szczepu Streptomyces griseus No 3570 oraz niektórych innych promieniowców na podlozu glikozowo-peptonowym w 60 godzinnej hodowli.Dotychczas znane metody izolacji kandycydyny polegaja na ekstrakcji mycelium lub calej brzeczki fermen¬ tacyjnej nizszymi alkoholami alifatycznymi a najczesciej butanolem po czym ekstrakt butanolowy zateza sie pod próznia i stracony osad saczy, suszy lub liofilizuje.Wedlug Lechevaliera i wspólautorów (opis patentowy St. Zjedn. Amer. Nr 2 992 162,) saczenie mycelium odbywa sie przy pH = 2-2,5 dla ulatwienia filtracji, po czym antybiotyk, który pozostaje w odsaczonej grzybni ekstrahuje sie n-butanolem, ekstrakt przemywa wodnym roztworem kwasnego weglanu sodu i kandycydyne otrzymuje sie wstanie stalym po odparowaniu pod próznia butanolu. Otrzymany preparat kandycydyny poddaje sie przemywaniu rozpuszczalnikami organicznymi takimi jak eter naftowy, aceton czy alkohol etylowy.W opisie patentowym St. Zjedn. Amer. Nr 2872373 podaje sie podobny sposób izolacji, uzyskujac wieksza aktywnosc preparatów od Lechevaliera i wspólautorów, przy czym po zakwaszeniu brzeczki kwasem solnym do pH = 3,5-4 odfiltrowuje sie mycelium, antybiotyk esktrahuje sie z mycelium n-butanolem, przemywa faze butanolowa roztworem kwasnego weglanu sodu i woda, wytraca antybiotyk do fazy wodnej przez dodatek pentanu i wyodrebnia sie preparat kandycydyny przez liofilizacje wodnej zawiesiny.Otrzymane wedlug znanych metod preparaty kandycydyny zawieraja pewne ilosci jonów metali ciezkich.Nie znany jest sposób iwuwania tych zanieczyszczen z preparatów kandycydyny. Opis patentowy polski Nr 43804 opisuje sposób usuwania jonów metali wielowartosciowych w trakcie oczyszczania antybiotyku oksyte¬ tracykliny na drodze kompieksowania tych jonów w roztworach wodnych z solami kwasu zelazocyjanowego lub zelazicyjanowego w niskich pH, mieszczacych sie w zakresie pH = 1,8—2,2.2 , 83710 Niedogodnoscia opisanych sposobów otrzymywania kandycydyny jest stosunkowo niska Jej czystosc, mala zawartosc antybiotyku okreslona na podstawie oznaczen bilogicznych i absorpcji w UV, oraz duza wrazliwosc na czynniki fizykochemiczne takie, jak temperatura, tlen, wilgoc, swiatlo oraz czas przechowywania, w wyniku czego otrzymane preparaty antybiotyku charakteryzuja sie mala trwaloscia.Jak wiadomo, zwiazki polienowe, do których nalezy kandycydyna sa szczególnie nietrwale z uwagi na obecnosc w czasteczce sprzezonych wiazan podwójnych. Wiazania te. latwo ulegaja autooksydacji w obecnosci tlenu, wilgoci, swiatla, co pociaga za soba utrate aktywnosci bilogicznej. Katalizatorami reakcji rozkladu sa kationy metali wystepujace w postaci soli nieorganicznych, jak tez prawdopodobnie zwiazków kompleksowych z antybiotykiem. Szczególnie duzy wplyw na stabilnosc preparatów kandycynydy maja jony zelaza, miedzi, chromu, kobaltu, niklu, manganu. Inne kationy takie, jak wapn i magnez, znajdujace sie w brzeczce fermentacyj¬ nej, poprzez tworzenie kompleksu z antybiotykiem, sa trudne do oddzielenia w czasie izolacji i zwiekszaja zawar¬ tosc popiolu w koncowym produkcie.Obecnosc jonów metali wielowartosciowych w preparatach kandycydyny otrzymywanych wedlug znanych sposobów jest istotnym powodem tego, ze nie mozna bylo uzyskac preparatów o wysokim stopniu czystosci i aktywnosci biologicznej, zas otrzymane preparaty byly bardzo nietrwale.Opisana w opisie patentowym polskim Nr 43804 metoda usuwania jonów metali wielowartosciowych z pre¬ paratów oksytetracykliny nie moze byc zastosowana dla oczyszczania kandycydyny, poniewaz metoda ta nadaje sie tylko dla rozpuszczalnych w wodzie antybiotyków zas kandycydyna w wodzie sie nie rozpuszcza. Ponadto stosowane w tej metodzie bardzo niskie pH nie jest tolerowane przez kandycydyne. Antybiotyk ten jest bardzo wrazliwy na kwasne srodowisko i w zakresie pH, wymaganym w tej metodzie, nastepuje bardzo szybki rozklad kandycydyny. Równiez stosowane w omawianej metodzie czynniki kompleksujace, jakimi sa sole kwasu zelazo- cyjanowego i zelazicyjanowego, nie sa obojetne dla kandycydyny. Antybiotyk ten z uwagi na bardzo wrazliwa na dzialanie róznych substancji strukture reaguje z obiema wspomnianymi substancjami, w wyniku czego nastepuje jego rozklad i inaktywacja.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu otrzymywania kandycydyny o zwiekszonej trwalosci, czys¬ tosci i aktywnosci biologicznej który riie bedzie posiadal opisanych wyzej niedogodnosci.Sposób otrzymywania kandycydyny, polegajacy na przemywaniu roztworu antybiotyku wodnymi roztwo¬ rami zwiazków kompleksujacych jony metali wielowartosciowych wedlug wynalazku charakteryzuje sie tym, ze na kandycydyne z brzeczki fermentacyjnej lub z odsaczonej uprzednio grzybni wzglednie z preparatów o niskiej zawartosci antybiotyków, w srodowisku rozpuszczalnika organicznego nie mieszajacego sie z woda jak nasycony woda butanol, dziala sie wodnym roztworem soli kwasu etylenodwuamino-czterooctowego o pH od 4,5 do 9,0 korzystnie od 4,5 do 5,2 i od 8,0 do 8,6 a nastepnie izoluje sie ja z mieszaniny reakcyjnej znanymi sposobami.Zaleta sposobu wedlug wynalazku jest mozliwosc otrzymania kandycydyny, charakteryzujacej sie wysoka ekstynkcja E^^ 700-860 przy dlugosci fali 378 nm., duza aktywnoscia biologiczna od 56.000 do 70.000 rozcienczeniowych jednostek biologicznych w stosunku do Saccharomyces cerevisiae, mala wilgotnoscia okolo 2,5% oraz niska zawartoscia popiolu od 0,2 do 2,0%. Na tak otrzymanych preparatach kandycydyny obserwo¬ wano wplyw wspomnianych wyzej czynników fizykochemicznych na proces obnizania sie aktywnosci bilogicznej i ekstynkcji w UV w czasie. Otrzymane wyniki, obrazujace trwalosc preparatów kandycydyny przedstawiono na rysunku, na którym fig. 1 ilustruje krzywa zmiany aktywnosci preparatu kandycydyny, otrzymanego dotychczas znanym sposobem i kandycydyny, otrzymanej proponowanym sposobem, przechowywanych w temperaturze pokojowej z bezposrednim dostepem swiatla slonecznego, fig. 2 — krzywe zmiany aktywnosci preparatu kandy¬ cydyny, otrzymanej znanym sposobem, i kandycydyny, otrzymanej proponowanym sposobem, przechowywanej w temperaturze 0°C bez dostepu swiatla, fig. 3 - krzywe zmiany aktywnosci preparatu kandycydyny, otrzyma¬ nego sposobem znanym przechowywanej w temperaturze pokojowej przy swietle rozproszonym, fig. 4 — krzywe zmiany aktywnosci preparatu kandycydyny, otrzymanego znanym sposobem, i kandycydyny otrzymanej pro¬ ponowanym sposobem, przechowywanej w temperaturze pokojowej w ciemnej fiolce. Literami a i b oznaczono krzywe, dotyczace odpowiednio preparatu kandycydyny, otrzymanego znanym sposobem i proponowanym spo¬ sobem. Poza tym kandycydyna otrzymana sposobem wedlug wynalazku i przechowywana przez dluzszy okres czasu, w znacznie mniejszym stopniu zmienia polozenie maksimum absorpcji w UV w porównaniu z preparatami kandycydyny otrzymywanymi dotychczas znanym sposobem, a tym samym posiada wieksza trawlosc.Sposób otrzymywania kandycydyny wedlug wynalazku ilustruja podane nizej przyklady.Przyklad I. 1000 litrów schlodzonej do temperatury pokojowej brzeczki fermentacyjnej o zawartosci antybiotyku 500 mcg/mi. okreslonej na podstawie widma UV, przyjmujac E^m ".1100 przy 378 nm, dla czystej . kandycydyny, zakwasza sie 25% roztworem wodnym kwasu siarkowego do pH - 5 i dodaje 500 litrów n-buta- nolu i 50 litrów metanolu. Po intensywnym mieszaniu wciagu 1 godziny przefiltrowuje sie zawiesine, dodajac83710 3 kg ziemi okrzemkowej jako pomoc filtracyjna. Mycelium na filtrze przemywa sie 300 litrami 80% wodnego butanolu z 10% dodatkiem metanolu, a nastepnie 200 litrami wody dejonizowanej. Grzybnie odrzuca sie, prze¬ sacz rozdziela a nastepnie przemywa faze butanolowa kolejno 300 litrami 0,5% wodnego roztworu soli sodowej kwasu etylenodwuaminoczterooctowego o pH = 4,5 do 4,7 woda dejonizowana, 200 litrami roztworu wodnego kwasu etylenodwuaminoczterooctowego o pH = 8,5 i ponownie woda dejonizowana. Po kazdym przemyciu roz¬ dziela sie fazy, uzyskujac w koncowym efekcie okolo 600 litrów ekstraktu butanolowego kandycydyny. Po przeprowadzeniu zatezenia azeotropowego pod obnizonym cisnieniem wytracony podczas zateienia osad wiruje sie przemywajac 5 litrowymi porcjami butanolu i trzykorotnie suchym acetonem. Otrzymany preparat kandycy¬ dyny w postaci zóltobrunatnego placka suszy sie w temperaturze pokojowej w prózni. Uzyskuje sie 650 g osadu o aktywnosci 60.000 rozcienczonych jednostek biologicznych. Widmo UV preparatu posiada maksima absorpcji przy dlugosciach fali 358, 779 i 399 nm i odpowiadajace wartosci E^ cm 545 , 760 i 660. Zawartosc wilgoci w preparacie wynosi 3%, a popiolu 1,5%.Przyklad II. Do 500 litrów'brzeczki o aktywnosci 720 mcg/ml., zakwaszonej kwasem solnym do pH = 4,5 dodaje sie 10 kg ziemi okrzemkowej i grzybnie wraz z antybiotykiem odsacza sie. Osad mycelium przemywa sie na filtrze 1000 litrami wody dejonizowanej, a nastepnie 500 litrami wodnego roztworu kwasu etylenodwuaminoczterooctowego o pH okolo 5 i stezeniem 0,3% oraz 500 litrami 0,6% roztworu wodnego kwasu etylenodwuaminoczterooctowego o pH = 8,5. pH roztworów doprawia sie uzywajac 40% roztworu wod¬ nego wodorotlenku sodu. Na koniec przemywa sie woda i grzybnie ekstrahuje dwukrotnie 200 litrowymi porcja¬ mi mieszaniny rozpuszczalników o skladzie 150 litrów butanolu 20 litrów metanolu i 30 litrów wody. Polaczone ekstrakty rozdziela sie odrzucajac wode, natomiast faze butanolowa zateza pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 60 litrów. Wytracony osad antybiotyku oddziela sie i nastepnie przemywa butanolem, na koniec bezwodnym acetonem. Po wysuszeniu osadu przy obnizonym cisnieniu, otrzymuje sie 402 gramów antybiotyku o Ei cm = 790 PrzV 378 nm., co stanowi 80% wydajnosci w przeliczeniu na antybiotyk oznaczony w brzeczce fermentacyjnej.Przyklad III. 50 g kandycydyny o wartosci Ej cm = 200 przy 383 nm i aktywnosci biologicznej 14.000 rozcienczeniowych jednostek biologicznych rozpuszcza sie w 10 litrach mieszaniny butanolu, metanolu i wody w stosunku 10:1 :2, miesza przez 1 godzine nierozpuszczony osad odsacza i przesacz przemywa 10 litrami 0,5% roztworu soli sodowej kwasu etylenodwuaminoczterooctowego opH = 5,1. Po oddzieleniu fazy wodnej powtórnie przemywa lOJitrami 0,5% roztworu soli sodowej kwasu etylenodwuaminoczterooctowego w wodzie o pH ¦ 8,6 rozdziela sie fazy i faze organiczna przemywa sie na koniec woda dejonizowana. Roztwór butanolowy zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem do momentu calkowitego usuniecia wody. Zawiesine zóltego osadu kandycydyny w butanolu ochladza sie odwirowuje i przemywa 2 litrami butanolu i trzykrotnie acetonem, uzywajac do przemycia 3 litry. Dokladnie odwirowany osad zawiesza sie w wodzie i liofilizuje. Uzys¬ kuje sie 10,36g kandycydyny o Ei cm = 870 i aktywnosci biologicznej 69000 rozcienczeniowych jednostek bilogicznych, co stanowi okolo 90% wydajnosci. Wilgotnosc preparatu wynosi 1%.Jsw fozc.j. biol. 6. ktjndyajdipct tytanona sposobem md. wynalazku ff%, 770 pfZiJ JTOmm 60000 rozaf M- ta 100% Prac. Poligraf. UP PRL. Naklad 120 + 18 egz.Cena 10 zl PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania kandycydyny o zwiekszonej trwalosci, czystosci i aktywnosci biologicznej, polegaja¬ cej na przymywaniu roztworu antybiotyku wodnymi roztworami zwiazków kompleksujacych jony metali wielo- , wartosciowych, znamienny tym, ze na kandycydyne z brzeczki fermentacyjnej lub z odsaczonej uprzed¬ nio grzybni, wzglednie z preparatów kandycydyny o niskiej zawartosci antybiotyku, w srodowisku rozpuszczal¬ nika organicznego nie mieszajacego sie z woda, jak nasycony woda butanol, dziala sie wodnym roztworem soli kwasu etylenodwuaminoczterooctowego o pH od 4,5 do 9,0, korzystnie od 4,5 do 6,2 i od 8,0 do 8,6, a nastep¬ nie izoluje sie antybiotyk z mieszaniny reakcyjnej znanymi sposobami. CZYTELNIA) Urzedu FWrfwago I83710 a tcanducuduna HyLonana £/%»3l0pfiy óeomm »g doiijcAcjas znanych sposób* PL