Sposób wytwarzania glikozy przez enzymatyczne rozszczepianie niskoczasteczkowych polisacharydów Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia glikozy droga enzymatycznego rozszczepiania polisacharydów, przede wszystkim zas oligomerów glikozy, a zwlaszcza produktów otrzymywanych przez czesciowe rozszczepienie skrobi.Znane sposoby wytwarzania glikozy ze skrobi po¬ legaja badz to na klarowaniu zawiesiny skrobi w wysokiej temperaturze za pomoca a-amylazy lub kwasów, badz tez na traktowaniu otrzymanego roztworu amyloglikozydaza hydrolizujaca oligosa- charydy na glikoze.Wada tych procesów jest fakt, ze czynnosci zwia¬ zane ze stosowaniem amyloglikozydazy sa klopo¬ tliwe, a enzym ten rozproszony w srodowisku reak¬ cyjnym nie moze byc odzyskiwany i stosowany po¬ nownie. Z faktem tym wiaze sie jeszcze inna wa¬ da, polegajaca na ograniczeniu stopnia konwersji do pewnych okreslonych wartosci, po osiagnieciu których amyloglikozydaza nie wykazuje dalszego dzialania katalitycznego i zamiast znajdowac za¬ stosowanie w nastepnych cyklach produkcji jest zazwyczaj tracona przy wyodrebnianiu produktu.Sposób wedlug wynalazku umozliwia wytwarza¬ nie krystalicznej glikozy lub syropów o wysokiej zawartosci glikozy droga enzymatycznego rozszcze¬ piania oligomerów glikozy z uniknieciem wyzej opisanych niedogodnosci. Sposób ten polega na kon¬ taktowaniu 30—40% zawiesiny skrobi sklarowanej za pomoca a-amylazy lub kwasów, z materialami wlóknistymi zawierajacymi amyloglikozydaze. Umo- 10 15 20 30 zliwia to unikanie przeciekania i rozpraszania en¬ zymu w masie reakcyjnej i mozliwego zanieczy¬ szczania produktu reakcji.Materialy wlókniste nadajace sie do stosowania w procesie prowadzonym sposobem wedlug wyna¬ lazku i sposób wprowadzania enzymów do tych materialów omówiono we wloskim opisie paten¬ towym nr 836 462. Wlókna zawierajace enzym moz¬ na wytwarzac sposobem podanym w tym opisie ze zdolnych do tworzenia wlókien roztworów polime- rycznych zawierajacych enzymatyczne zwiazki roz¬ proszone w postaci bardzo malych kropelek o wiel¬ kosci zblizonej do emulsji. Uzyskana tym sposobem emulsje mozna przasc na mokro lub na sucho w celu uformowania wlókna zawierajacego puste przestrzenie o bardzo malych wymiarach, miesz¬ czace wewnatrz enzymy oddzielone od otoczenia bardzo cienka przepona. Przepona ta zapobiega rozdrabnianiu i rozpraszaniu sie enzymu w masie reakcyjnej, nie przeszkadzajac równoczesnie wy¬ wieraniu przezen dzialania katalitycznego na prze¬ bieg procesu.Polimery stosowane w procesie prowadzonym sposobem wedlug wynalazku powinny w tempera¬ turze zapewniajacej trwalosc enzymu stanowic roz¬ twór w zasadzie nie mieszajacy sie z rozpuszczal¬ nikiem uzytym do rozpuszczenia lub zdyspergowa- nia enzymu. Rozpuszczalnik polimeru nie powi¬ nien oddzialywac w szkodliwy sposób na trwalosc i chemiczna aktywnosc enzymu. 82 7943 82794 4 Czynnik koagulujacy, w przypadku przedzenia na mokro powinien mieszac sie z rozpuszczalnikiem polimeru i miec wyzej okreslone wlasciwosci. Spo¬ sród polimerów nadajacych sie do wprowadzania do nich enzymów wymienic mozna polimery nitro¬ celulozowe, estryfikowana i eteryfikowana celulo¬ ze, póliolefiny, polimery i kopolimery wytwarzane z akrylonitrylu, akrylany, metakrylany, estry wi¬ nylowe, chlorek winylu, chlorek winylidefou, sty¬ ren oraz poliamidy, poliwinylobutyral i inne. W procesie prowadzonym sposobem wedlug wynalaz¬ ku korzystne jest stcsowac polimeryczne estry ce¬ lulozowe.Zachowujac wszystkie zalety wynikajace ze sto¬ sowania enzymów do wytwarzania glikozy, sposób wedlug wynalazku daje powazne korzysci. Pomia¬ ry aktywnosci enzymu wbudowanego w polimer, prowadzone w okresie dluzszym niz 1 rok, nie wy¬ kazaly zadnego spadku aktywnosci. Ta niezwykla trwalosc katalizatora wywiera powazny wplyw na ekonomike procesu. Dalsza korzyscia plynaca z in¬ korporacji enzymów jest to, ze usuwanie enzymu z produktu nie nastrecza zadnych trudnosci. Ula¬ twia to ekstrakcje krystalicznej glikozy. Inna za¬ lete sposobu wedlug wynalazku stanowi moznosc prowadzenia procesu systemem ciaglym, co upra¬ szcza konstrukcje instalacji przemyslowej i umozli¬ wia automatyzacje procesu.Sposobem wedlug wynalazku mozna proces pro¬ wadzic równiez systemem periodycznym przez kon¬ taktowanie substratu z enzymem w ciagu czasu niezbednego dla uzyskania zadanego stopnia prze¬ miany w dekstroze, wyrazonego jako „D. E.", to znaczy zawartosc cukru redukujacego w hydroli- zowanym zwiazku w przeliczeniu na dekstroze w procentach wagowych suchej substancji. Poddany hydrolizie substrat mozna nastepnie usunac i za¬ stapic swiezym, stosujac to samo wlókno enzyma¬ tyczne w nieograniczonej liczbie cykli roboczych.Sposobem wedlug wynalazku korzystnie jest pro¬ wadzic proces stosujac wlókno enzymatyczne w procesie ciaglym, umieszczone w jednej lub kilku kolumnach, przez które przepuszcza sie roztwór a-polisacharydów. Regulujac odpowiednio nateze¬ nie przeplywu, ilosc wlókna i stezenie enzymów, mozna osiagac zadana wartosc stopnia konwersji w wycieku z kolumny.Wynalazek jest zilustrowany nastepujacymi przy¬ kladami, omawiajacymi niektóre inne parametry robocze.Przyklad I. 27 g trójoctanu celulozy (pro¬ dukcji firmy FLUKA) rozpuszcza sie mieszajac w 273 g chlorku metylenu (produkcji firmy CARLO ERBA). Roztwór oziebia sie nastepnie do tempe¬ ratury 0°C. Oddzielnie przygotowuje sie roztwór enzymu, a mianowicie 3 g pylu dwuazymowego (firmy TAKAMINE) rozpuszcza sie w mieszaninie 55 czesci wagowych gliceryny z 45 czesciami wody.Roztwór saczy sie dla usuniecia nierozpuszczalnego nosnika enzymu, dopelnia do objetosci 50 ml ¦i oziebia do temperatury 0°C. 45 ml tego roztworu dodaje sie do roztworu polimeru i miesza emulsje intensywnie w ciagu 30 minut w temperaturze 0°C.Otrzymana emulsje umieszcza sie w malej odle- warce i wytlacza przez filiere za pomoca azotu o cisnieniu 1,2 atmosfery.Wlókno koagulowane w toluenie w temperatu¬ rze 0°C odbiera sie na przewijarce. W celu usu- 5 niecia toluenu wlókno suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem. Maly motek uzyskanego wlókna o ma¬ sie 5 g umieszcza sie w szklanej kolumnie o sred¬ nicy 1,2 cm i dlugosci 40 cm wyposazonej w ter¬ mostat. Kolumne zasila sie za pomoca pompy pe- io rystaltycznej strumieniem o natezeniu 10 litrów/ /godzine. Proces prowadzi sie w obiegu zamknie¬ tym.Roztwór substraktu utrzymuje sie za pomoca ter¬ mostatu w temperaturze 45°C i wprowadza do dol- 15 nej kolumny równiez utrzymywanej w tej tempe¬ raturze. Czesciowo zhydrolizowany roztwór wyply¬ wa wierzchem kolumny i jest zawracany do na¬ czynia wejsciowego. W kazdym cyklu stosuje sie substrat zlozony z 500 ml 36% roztworu skrobi 20 traktowanego wstepnie a-amylaza do uzyskania wartosci D.E. 16—22%. Zawartosc skladników cuk¬ ru okresla sie metoda somoggi. W razie potrzeby stosuje sie oznaczenie glikozy metoda enzymaty¬ czna. 25 Próby prowadzi sie w ciagu pelnego okresu 3 miesiecy. Po osiagnieciu maksymalnej wartosci stopnia konwersji w koncowym okresie kazdego cyklu, to jest po uplywie 72 godzin, substrat za¬ stepuje sie nowym. Przed rozpoczeciem nowego 30 cyklu kolumne zasila sie odmineralizowana woda w ciagu okolo 1 godziny, w celu odmycia wlókien i usuniecia ewentualnych sladów substratu i pro¬ duktu. W temperaturze 45°C przeprowadza sie 30 cykli roboczych. Osiagane wydajnosci procesu kon- 35 wersji wahaja sie w granicach 102—105%, przy czym maksymalna wydajnosc teoretyczna wynosi 111%, poniewaz w czasie procesu hydrolizy naste¬ puje przylaczenie wody do produktu.Jakosc ostatecznego produktu sprawdza sie me- 40 todami chromatograficznymi. W procesie otrzymuje sie 5,5 kg glikozy.Przyklad II. Stosujac kolumne o wymiarach podanych w przykladzie I, taka sama ilosc wlókna i takie same warunki doswiadczalne, prowadzi sie 45 24 godzinne cykle robocze. W wyniku procesu pro¬ wadzonego sposobem wedlug wynalazku wartosc D.E. w 500 ml 40% roztworu skrobi traktowanego' wstepnie a-amylaza wzrasta z 16—22% do 55—65%, Przyklad III. W sposób omówiony w przy- 50 kladzie I przeprowadza sie kilka 36-godzinnych cy¬ kli roboczych, stosujac 500 ml substratu stanowia¬ cego 18% roztwór skrobi zhydrolizowanej w kwa¬ snym srodowisku do wartosci D.E. 15—20%. Mak¬ symalny stopien konwersji D.E. = 88—100% osiaga 55 sie po uplywie 36 godzin.Przyklad IV. W sposób omówiony w przy¬ kladzie I wytwarza sie wlókno zlozone z poli-y-me- tylo-1-glutaminianu, (stosujac produkt firmy KYO- WA HAKKO KOGYO CO oznaczony symbolem co PLG 30) i stanowiacy polimeryczny roztwór w sy¬ metrycznym dwuchloroetanie. Przy zastosowaniu kolumny opisanej w poprzednich przykladach uzy¬ skuje sie takie same wyniki procesu.Przyklad V. Dwuazymowy produkt rozpusz- 65 cza sie w odmineralizowanej wodzie, a otrzymana82794 6 mieszanine saczy w celu usuniecia nierozpuszczal¬ nego nosnika. Nastepnie wytraca sie enzym za po¬ moca acetonu w temperaturze 0°C i osad rozpu¬ szcza ponownie w minimalnej ilosci wody, zwiek¬ szajac tym sposobem 20-krotnie aktywnosc enzy¬ mu w porównaniu z aktywnoscia poczatkowa. Zwia¬ zek ten wprowadza sie do wlókna z trójoctanu celulozy, otrzymujac wlókno o aktywnosci odpo¬ wiadajacej aktywnosci 2 000 mg pylu dwuazymu na 1 g wlókna. Postepujac dalej w sposób opisany w przykladach I, II, III i prowadzac proces w oiagu 72 godzin z zastosowaniem 5 g tego wlókna, osiaga sie maksymalna wartosc stopnia konwersji D.E. = 10'2^105°/o dla 5 litrów 40% roztworu skrobi.Przyklad VI. Produkt dwuazymowy rozpusz¬ cza sie w wodzie i poddaje w ciagu 24 godzin dializie za pomoca wody oczyszczonej na wymie¬ niaczach jonowych. Roztwór enzymatyczny nastep¬ nie oczyszcza sie na kolumience wypelnionej celu¬ loza DEAE, przy czym frakcje odbierane przy war¬ tosci pH 4,5—5,2 zawieraja glikoamylaze. Za po¬ moca acetonu straca sie osad i ponownie rozpu¬ szcza go w wodzie, w celu otrzymania pochodnego enzymu o aktywnosci 50-krotnie wiekszej niz w przykladzie I i II. 100 g wlókna z trójoctanu celulozy o aktywnosci równej aktywnosci 5 g pylu dwuazymu na 1 g wlókna, umieszcza sie w szklanej kolumnie o sred¬ nicy 3,2 cm i 125 cm dlugosci, wyposazonej w termostat. Kolumne zasila sie za pomoca pompy beztlokowej, strumieniem o natezeniu 10 litrów/ /godzine. W procesie stosuje sie substrat zlozony z . 30% roztworu skrobi, traktowanej wstepnie a-amylaza do uzyskania wartosci D.E. = 18%. U wy¬ lotu kolumny otrzymuje sie roztwór o wartosci D.E. = 55^65%. 5 Przez zmniejszenie natezenia przeplywu do 3 li¬ trów/godzine osiaga sie maksymalna wartosc sto¬ pnia konwersji, D.E. = 102—105%." 10 PL PL