PL80274B1 - - Google Patents

Description

Uprawniony z patentu: The Upjohn Company, Kalamazoo (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób otrzymywania odmetylowanych pochodnych linkomycyny Przedmiotem wynalazku jest sposób odmetylo- wania pochodnych linkomycyny, scislej odmetylo- wania 7-chloroiwco-7-dezoksylliinkomyic3rn, w celu otrzymania 7Hchlorowicx)-7^e^oil^y-lVdemeiyiloliinko- mycyn.Wedlug wynalazku 7-chlorowco-7^dezoksylinko- mycyne, np. 7/S/-chloro-7-dezoksylinkomycyne i 7/R/Hohloro-7-dezoksylinkDmycyne, ich analogi i odpowiednie sole addycyjne z kwasami poddaje sie dzialaniu zdolnych do odmetylowania mikro¬ organizmów, aby otrzymac odpowiednia, odmetylo- wana l'7-chilorowco-7^ezoksylinfcomycyne, np. od¬ powiednio, odmetylowane w pozycji l'7/S/.Jclliloro- -7-dezoksylinkomycyne i 7/R/-chloro-7-dezoksylin- komycyne, ich analogi i addycyjne sole z kwasami.Proces mikrobiologiczny wedlug wynalazku przedstawia schemat podany na rysunku. W po¬ danych w tym schemacie wzorach 1 i 2 R oznacza metyl lub etyl, Rt oznacza alkil o 2 do 8 atomach wegla, a X oznacza chlor lub brom.Przykladami alkilów o 1 do 8 atomach wegla sa: metyl, etyl, propyl, butyl, penlyl, hetosyl, hep- tyl, izooktyl, a takze ich formy izomeryczne.Falista linia przy pozycji 4' pierscienia piroU- dynowego oznacza tu, ze grupa Ri moze byc w polozeniu cis (pod plaszczyzna pierscienia) lub trans (nad plaszczyzna pierscienia) w stosunku do grupy kaiibonylowej, a falista linia przy pozycji 7 wskazuje na to, ze mamy do czynienia z dwoma 10 20 25 30 epimerami, to jest z konfiguracja (S), w któnf chlorowiec znajduje sie z prawej strony, tak jak na rysunku, lub z konfiguracja (R), w której chlo¬ rowiec znajduje sie po lewej stronie.Zwiazki o wzorach 1 i 2 wystepuja badz w for¬ mie protonowamej badz nieprotonowanej. Wolne zasady mozna przeprowadzic w trwale sole addy¬ cyjne z kwasami zgodnie ze znanymi w tej dzie¬ dzinie metodami, np. przez zobojetnienie wolnej zasady odpowiednim kwasem do wartosci pH po¬ nizej 7, korzystnie do wartosci pH od okolo 2 do 0.Do tego celu odpowiednimi sa takie kwasy, jak solny, siarkowy, fosforowy, octowy, bursztynowy, cytrynowy, mlekowy, maleinowy, fumarowy, 4,4'- ^metyleno-bis/3-hydiroksynaftoesowy-2/ (kwas pal¬ mowy), cholowy, palmitynowy, sluzowy, kamforo¬ wy, glutarowy, glikolowy, ftalowy, winowy, laury- nowy, stearynowy, salicylowy, 3-fenylosallcylowy, 5-fenylosalicylowy, 3-metyloglutarowy, o-sulfoben- zoesowy, 4-cyklopentanopropionowy, cykloheksa- nodwukarboksylowy-1,2, cykloheksenokarboksylo- wy-4, oktadekaenobuirsztynowy, oktenobursztyiio- wy, metanosulfonowy, benzenosulfonowy, helianto- wy, Reineckego, dwumetylodwufctokarbaminowy, cyikloheksyloamidosulfonowy, heksadecyloamidosul- fonowy, oki^ecyloamidosulfonowy, sorbowy, chlo- rooctowy, undecylenowy, 4'-hydroksyazobenzeno- sulfonowy, oktadecylosiairkowy, pikrynowy, benzo¬ esowy, cynamonowy i tym podobne. 80 27480 274 Otrzymane wedlug wjynalazku zwiazki odmety- lowane w pozycji 1', przedstawione wzorem 1 oraz ich addycyjne sole z kwasami, sa znanymi srodkami antybakteryjnymi o zwiekszonym w sto¬ sunku do odpowiednich zwiazków o wzorze 2, dzialaniu na bakterie gram ujemne. Co wiecej, odnaetyiowaina w pozycji 1' 7/S/-chloro-7-dezoksy- linkomycyna i zwiazki jej pokrewne sa srodkami o dzialaniu antymalarycznym.Zwiazki wyjsciowe o podanym wyzej wzorze 2 oraz ich addycyjne sole z kwasami sa znane z opi¬ su patentowego St. Zjedn. Amer. 3380992, opisów patentowych belgijskich nr 676202 i 705345, opisu francuskiego nr 1474237 oraz opisów patentowych poludniowoafrykanskich nr 66/0319 i nr 66/0320 oraz z publikacji Magerleina et al. „Chemical Mo- difications of Lincomycin", Antibiotics and Che- motherapy (1966) str. 727—736.Sposób wedlug wynalazku polega na poddaniu 7-chlorowco-7^dezoksylinkomycyiny o wzorze 2 dzialaniu jednego z nastepujacych mikroorga¬ nizmów: Sfereptomyces punipalus sp. nov. NRRL 3529, Streptomyces venezuelae, NRRL 3528, Streptomyces venezuelae, NRRL 3527, Aspergillus ornatus, NRRL 2291, Scopulariopsis brevicaulis, ATOC 7903, Tiichoderma viride, NRRL 1762, Streptomyices spectabilis, NRRL 2494, i Streptomyces spectabilis, NRRL 2792, które mozna otrzymac ze znanych zródel, takich jak Northern Utilization Research and Develop- ment Branch, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois (NRRL) i American Type Culture Oollection (ATCC), Washington, D.C..W zastosowaniu w sposobie wedlug wynalazku najlepsze wyniki daje gatunek Streptomyces pu¬ nipalus, NRRL 3529.Mikroorganizm Streptomyices punipalus, sp. nov.NRRIj 3529 stosowany wedlug wynalazku, badala i opisala Alma Dietz z Upjohn Research Labora¬ tories. streptomyces punipalus sp. nov. NRRL 3529 Materialy i metody stosowane do charakteryzo¬ wania tej hodowli opisano w nastepujacych pu¬ blikacjach: Dietz, A., „Streptomyces steffiisburgen-. sis sp. nov." J. Bacteriol. 94: 2022—2026, 1967, Shirling, E. B. and D. Gottlieb, "Methods for cha- racterization of Streptomyces species." Intern. J.Syiste?m. Bacteriiol, 16: 3:13^340, 1966.Grzybnia powietrzna barwy rózowej do rózowo- hrunatnej. Wyglad na Ektachromie podano w ta¬ blicy 1.Charakterystyke barw na podlozach agarowych podano w tablicy 2. Hodowle mozna zaliczyc w szeregu zabarwien czerwonych (R) i zóltych (Y) wedlug Tresner and Backus (Appl. Microbiol. 11: 335—338, 1963).Sporofory posiadaja ksztalt otwartej spirali (RA) lub spirali (S) wedlug terminologii podanej przez 15 Pridham et. al. (Appl. Microbiol. 6; 52—79, 1&5$~ Sporofory sa zwykle ciasno skrecone przy koncu.Zarodniki w ilosci powyzej 50 w lancuchu sa gladkie czasem paliczkowate (J. Bacteriol. Slf" 5 1998—2005, 1966). Powierzchnia zarodnika jest po¬ marszczona i posiada silnie zróznicowana po¬ wierzchnie.Charakterystyka hodowli i biochemiczna poda- 10 na jest w tablicy 3.Zastosowanie zródla wegla. Zdolnosc wzrostu hodowli na zwiazkach wegla oznaczono na podlo¬ zu syntetycznym wedlug Pridham and Gottlieb (J. Bacteriol. 56: 107—114, 1948) i na podlozu opi¬ sanym przez tych autorów, a zmodyfikowanym przez Shirling and Gottlieb (Intern. J. System Bacteriol. 16: 313—340, 1966). Na podlozu synte¬ tycznym wzrost jest dobry na Dnksylozie, L-ara- 20 binozie, D-fruktozie, D-galatotozie, D-glukozie, D- Hmannozie, maltozie, cellobiozie, dekstrynie, roz¬ puszczalnej skrobi, glicerynie, inozytolu, octanie sodowym, cytrynianie sodowym, i bursztynie so¬ dowym. Sredni wzrost wystepuje na ramnozie, 25 sacharozie, laktozie, rafinozie, inulinie, dulcitolu, D-mannitolu, D-sorbdtolu i salicynie, slaby — na fenolu, krezolu, mrówczanie sodowym, winianie sodowym i salicylanie sodowym. Zaobserwowano brak wzrostu na szczawianie sodowym. Na dru- 30 gim podlozu obserwuje sie brak wzrostu na pod¬ lozu bez uzupelnien i dobry wzrost w próbie kontrolnej na glukozie. Lepszy wzrost niz w pró¬ bie kontrolnej z glukoza obserwuje sie na L^-ara- binozie, wzrost nieco gorszy niz w tej próbie stwierdza sie na D^ksylozie i inozitolu, a brak wzrostu na D-mannitolu, D-frufctozie, ramnozie, rafinozie i celulozie.Temperatura. Szybki wzrost i sporulacja zacho- 40 dzi w temperaturze 18—37°C na podlozu agaro¬ wym Benetta, sacharozowym podlozu agarowym Czapka i podlozu agarowym maltoza-trypton.Streptomyces punipalus sp. nov. NRRL 3529 jest 45 gatunkiem rodzaju Streptomyces nalezacym do Actinomycetes, wyizolowanym z próbki gleby. Ho¬ dowla odróznia sie od znanych gatunków Strep¬ tomyces. Izolat z gleby posiada charakterystyczny typ rózowego zabacwienia, nie spotykany u zad- 50 nego ze zbadanych i opisanych, powszechnie do¬ stepnych Streptomyces, pozwalajacy na latwe od¬ róznienie jego sporoforów od innych, majacych rózowe spory, melandno dodatnich Streptomyce- tes, posiada on tez zdolnosc wzrostu i sporulacji w temperaturach od 18 do 37°C. Wyrózniajace sie wlasnosci hodowli sprawily, ze uznano ja za no¬ wy gatunek Streptomyces oznaczony nazwa Strep¬ tomyces punipalus sp. nov. NRRL 3529. Hodowla __ zostala nazwana zgodnie z International Code of bO Nomenclature of Bacteria (Intern. J. Bacteriol. 16: 459—490, 1966) i zlozona w Northern Utilizaifion Research and Development Bramch, U. S. De¬ partment of Agriculture, Peoria, Illinois, gdzie jest 65 dostepna, bez ograniczen jako NRRL 3529. 5580 274 Tablica 1 Wyglad Streptomyces punipalus na Efctachromie Podloze agarowe Bennetta Sacharoza Czapka Powierzchnia Bladorózowa Lekko rózowa (sladowe wy¬ stepowanie za¬ barwienia rózowego) Odwrotna strona Zóltobrunaitna Bezbarwna 10 Maltoza- -trypton Pepton-zelazo 0,1% tyrozyna Kazeina- -skrobia .. ... i Rózowobiala Brak wzrostu powierzchnio¬ wego Lekko rózowa (trace pink) Bladorózowa Brazowa Brazowa Bladozólto- brunatna Rózowobru- natna Tablica 2 Charakterystyka zabarwienia Streptomyces punipalus (nazwy zabarwien wedlug podanych zródel literaturowych) Podloze agarowe Bennetta Sacharoza Czapka Maltoza-ftrypton Wyciag z drozdzy Wyciag slodowy (ISP-2) Maka owsiana (ISP-3) Sole nieorga- i niczne Skrobia (ISP-4) GMceryna-aspa- raGina (ISP-5) 1 [ E. Jacobson, et al. Color Harmony Manual 3rd ed.S R P S R P S R P S R P S R P S R P S R P Container Corp. of Aimerica 5cb(g) (bez nazwy) 2gc kolor bambusowy chaniois 2ec(g) biskwitowy, nie bielonego plótna, owsianki, piaskowy 3cb(g) piaskowa 2ec(g) kolor biskwito¬ wy, niebielonego plót¬ na, owsianki, piaskowy 2ge(g) brunatny . griege 3ba(g) perlowa odcien muszli 2gc(g) kolor bambu¬ sowy chamods 2ge(g) brunatny griege 5cb(g) (bez nazwy) 2gc(g) kolor bambuso¬ wy chaniois 2ge(g) brunatny griege 5cb(g) (bez nazwy) 3ca(g) perlowo-rózowy odcien muszli 4ca(g) cieHsto-rózowy perlowo-rózowy, rózo¬ wy odcien muszli, rózy herbacianej 2ca(g) jasnej kosci slo¬ niowej, skorupki jaja 2ca(g) biskwitowy nie bielonego plótna, owsianki, piaskowy 4ca(g) cielisto-rózowy perlowo-rózowy, rózo¬ wy odcien muszli, rózy herbacianej 2ca(g) jasnej kosci slo¬ niowej, koloru sko¬ rupki jaja 2ec(g) biskwitowy nie bielonego plótna, owsianki, piaskowy | K. L. iKelly et al. ISCC-NBS method of desigmating colors and a dictionary of color nanies, 1955, U. S. Dept. of Cotmm. Circ. 553, 1955 90 gm szarawozólta 90 gm szarawozólty 90 gm szarawozólty 94 m jasnooliwkowo-brazowy, 109 jasnoszarawozólty 90 gm szarawozólty 94 m jasnooliwkowo-brazowy 109 gm jasnoszarawozólty | 90 gm szarawozólty 94 m jasnooliwkowo-brazowy [ 109 gm jasnoszarawozólty yellow [ 73 gm jasnopomaranczowo-zólty [ 28 g jasnozóltaworózowy l 31 gm jasnozóltaworózowy I 89 gm jasnozólty I 90 gm szarawozólty 28 g jasnozóltaworózowy 31 gm jasnozóltaworózowy | 89 gm jasnozólty [ 90 gm szarawozólty 1 S — powierzchnia P — barwnik R — odwrotna strona (g) = powierzchnia blyszczaca (lub matowa)80274 Tablica 3 Charakterystyka hodowli Streptomyces punipalus Podloze Podloza agarowe I Pepton-zelazo Jablczan wapnia GLukoza-ospa- 1 ragina 1 Mleko zbierane j Tyrozyna j Ksantyna ] Skrobia j odzywcza j Wyciag z dróz- j dzy — wyciag j slodowy 1 Podloze Bennetta ] Sacharoza 1 Czapka j Maltoza-trypiton | Pepton - wyciag ] z drozdzy - zelazo (ISP-6) | Tyrozyna (ISP-7) Podloze selaty- j nowe Bez uHjpelnien I 1 Z uzupelnie- | niami J Podloza bulio¬ nowe 1 Azotan z natu- j ralnego zródla Azotan synte¬ tyczny Mleko zabarwio¬ ne lakmusem Powierzchnia Szatra Lekko szaro- rózowa Biala i lekko szara Szarobiala na obrzezu Szarorózowa Szarorózowa Szarorózowa Szarorózowa Rózowobrunatma Rózowobrunatna Bladorózowo- brunatna Brak wzrostu powierzchnio¬ wego Czerwonorózowa Bladorózowy po¬ wietrzny porost na pierscieniu powierzchnio¬ wym Bladorózowy po¬ wietrzny porost na pierscieniu powierzchnio¬ wym Lekko rózowo- bialy na pierscie¬ niu powierz¬ chniowym Szarorózowy po¬ rost powietrzny ma grubym sza¬ rozielonym piers¬ cieniu powierz¬ chniowym Odwrotna strona Brazowa Jasno- kremowa Zólta Oliwkowo- brunatna Brunatna Zólta Zólta Brunatna Zólta Zólta Zólta Brazowa Rózowobru¬ natna I Inne I Melamino- -dodatnla Brak barwnika Jablczan uplyn¬ niony Brak barwnika Barwnik oliwko¬ wo brunatny Kazeina nie uplynniona Barwnik bru¬ natny Tyrozyna uplyn¬ niona Barwnik blado- zóltobrazowy.Ksantyna uplyn¬ niana wokól ko¬ lonii Barwnik blado- oliwkowo-zólty 1 Skrobia nie zhy- drolizowana Barwnik blado- brunatny Barwnik blado- zólty Brak barwnika Zólty Brazowy Brak barwnika Barwnik bru¬ natny 1/4 Barwnik oliwko¬ wy 3/4 Calkowite uplyn¬ nienie Barwnik brunat¬ ny 1/4 Barwnik oliwko¬ wy 1/4 Calkowite uplyn¬ nienie Barwnik zólto- brunatny Porost klaczko- waty u podstawy Azotan zreduko¬ wany do azotynu Porost zwarty u podstawy Azotan zreduko¬ wany do azotynu Brak peptoni- zacji Brak redukcji Zabarwienie nie- bieskoszare pH 7.180274 M WarunM i sposoby prowadzenia sposobu prze- miany biochemicznej wedlug wynalazku sa takie, jak znane juz w tej dziedzinie i opisane przez Murraya i wspólpracowników, w opisach paten¬ towych St. Zjedn. Am. nr 2602769 i nr 2735800.W praktyce, przemiane te przeprowadz* sie za pomoca hodowli milkroorganizmu w stadium wzrostu lub spoczynku, lub za pomoca zarodni¬ ków, przemytych komórek, a takze enzymów izo¬ lowanych z mikroorganizmu.Hodowle mikroorganizmu do zastosowania wy¬ nalazku w praktyce prowadzi sie na lub w odpo¬ wiednim podlozu pozwalajacym na jego wzrost W podlozu hodowli powinny znajdowac sie sub¬ stancje bedace zródlem wegla i azotu, a w trakcie przemiany nalezy zapewnic doplyw odpowiedniej ilosci wyjalowionego powietrza, badz zwyklym sposobem, to jest przez odslanianie duzej czesci powierzchni podloza lub przez przepuszczanie po¬ wietrza poprzez hodowle zanurzona.Azot w przyswajalnej postaci mozna dostar¬ czac za pomoca zródel normalnie stosowanych w tego rodzaju procesach, takich jak wyciag z na- moku kukurydzy, maczka z nasion bawelny, maczka sojowa, wyciagi z drozdzy, pepton, roz¬ puszczalne lub nierozpuszczalne proteiny roslin¬ ne lub zwierzece, albumina mleka, kazeina, ser¬ watka, ciekle odpady gorzelniane, aminokwasy, azotany i zwiazki amonowe, takie jak winian amonowy, azotan, siarczan i podobne.Przyswajalny wegiel mozna dostarczac równiez ze zródel normalnie stosowanych w przemianach biologicznych, takich jak: glukoza, fruktoza, sa¬ charoza, laktoza, maltoza, dekstryny, skrobie, wy¬ ciagi miesne, peptony, aminokwasy, proteiny, kwa¬ sy tluszczowe, gliceryna, serwetka i podobne. Sub¬ stancje te mozna stosowac badz w stanie czystym jako koncentraty, takie jak koncentrat z serwatki, wyciag z namoku kukurydzy, papka z ziarna, maczka z nasion bawelny i podobne, badz jako ich mieszaniny. Wiele z powyzszych zródel wegla moze sluzyc równiez jako zródla azotu.Przed zaszczepdeniem (inokulacja) wartosc pH podloza powinna, w zasadzie, zawierac sie w gra¬ nicach od okolo 4 do okolo 8, jednakze dopusz¬ czalne sa wyzsze i nizsze wartosci pH. Najko¬ rzystniejsza dla wzrostu mikroorganizmu jest tem¬ peratura pomiedzy 25 a 32°C, ale moze sie ona wahac w stosunkowo szerokich granicach zarów¬ no powyzej, jak i ponizej tego zakresu.Substrat, to jest zwiazek o wzorze 2, mozna dodawac dlo hodowli w okresie 'wzrostu mi¬ kroorganizmu od razu w calosci luib okresowo w trakcie przemiany, mozna go tee dodac do pod¬ loza przed sterylizacja lub po sterylizacji lub ino- kulacji wprowadzajac odpowiednie poprawki war¬ tosci pH lub pH i temperatury zaleznie od ich wplywu na trwalosc uzytego substratu. Najlep¬ szym, lecz nie stanowiacym ograniczenia, zakre¬ sem stezen substratu w podlozu hodowli jest 50— —500 mg/litr. W praktycznym zastosowaniu wy¬ nalazku korzystnie jest dodawac substrat do pod¬ loza w formie rozpuszczalnej w wodzie addycyj¬ nej soli z kwasem.Temperatura w czasie fermentacji mote byc t* sama jak ta, która uzneno za i^jkorzystniejsza dla wzrostu alfcrtorgiPigoni, Powinna owi byc utrzymywana w zakresie potrzebnym do podtrzy- 6 mania zycia, aktywnego wzrostu lub aktywnosci enzymatycznej mikroorganizmu. Korzystnie zakres ten wynosi od 20 do 35*C. Najbardziej odpowied¬ nimi wartosciami pH dla wzrostu mikroorganiz¬ mu w czasie przemiany biologicznej sa pfl od oko¬ lo ló 6 do 8. Dostep powietrza mozna zapewnic sto¬ sujac hodowle powierzchniowa, lub lepiej, stosujac fermentacje wglebna ze sztucznym napowietrze¬ niem, zgodnie ze znanymi w tej dziedzinie meto¬ dami. 15 Czas potrzebny do odmetylowania za pomoca ukladu enzymatycznego uzytego mikroorganizmu moze zmieniac sie w szerokich granicach. Sto¬ suje sie czasy od 2 do 120 godzin, co nie stano- 20 wi jednak ograniczenia, zwykle wystarczy 24—72 godzin. Stopien przemiany oraz moment je} za¬ konczenia daja sie latwo oznaczyc za pomoca pas¬ kowej chromatografii bibulowej lub chromatografii cienkowarstwowej ((Heftman, Chromatography 25 (1901) Reinold BuhUshing Co., New York).Odmetylowanie wybranego substratu mozna rów¬ niez przeprowadzic poddajac go dzialaniu enzymów otrzymanych z mikroorganizmu, dzialaniu zarod¬ ników mikroorganizmu, a takze dzialaniu wyizolo¬ wanych komórek tego mikrooi-ganimitt. Frcfum- ty z wyizolowanych enzymów mozna otrzymac wedlug ogólnej metody opisanej przez Zcridwtg et al., Biochem. Biopy. Acta. M» 131—1*3 <19*2).^ Przemiane biochemiczna mozna przeprowadzic a pomoca zarodników wedlug ogólnej metody opi¬ sanej w opisach patentowych St Zjedn. Amer. nr 3031379 i nr 3031382. Sposób wyodrebnienia przemytych komórek ze srodowiska fermentacyj- 40 nego jest dobrze znany i opisany np. w opisie pa¬ tentowym St. Zjedn. Amar. nr 2831789.Termin „odmetylowanie" oznacza w opisie enzy¬ matyczne dzialanie rosnacej lub spoczynkowej ho¬ dowli mikroorganizmu prowadzace do usuniecia, 45 w warunkach fermentacji, grupy metylowej z cza¬ steczki substratu.Po zakonczeniu fermentacji, powstaly produkt o wzorze 1 wyodrebnia sie z brzecrfd pofermenta- 60 cyjnej za pomoca znanych metod. Brzeczke mozna np. ekstrahowac w calosci nie mieszajacym sie z woda rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak chlorek metylenu, chloroform, czterochlorek wegla, chlorek etylenu, trójchloroetylen, eter, octan amy- 55 lu, benzen i podobne, lub mozna oddzielic od sie¬ bie brzeczke i grzybnie za pomoca znanych me¬ tod, takich jak odwirowanie lub odsaczenie i ekstrahowac je osobno odpowiednimi rozpusz¬ czalnikami. Grzybnie mozna ekstrahowac zarów- 60 no mieszajacymi sie, jak i nie mieszajacymi sie z woda rozpuszczalnikami, badz tez w przypadku, gdy nie zawiera ona produktu, lub zawiera go bardzo niewiele, mozna ja tylko przemyc woda, a wode z przemycia dolaczyc do przesaczu 65 z brzeczki. Wolna od grzybni brzeczke, mozna na-80 ii rft^priie Ekstrahowac nie mieszajacymi sie z woda Ticrpixszc^lTakakrnt takimT jak wyzej wymienione.Ekstrakty laczy sie, stis^ riad" srodldem suszacym, takdin jak bezwodny siarczan sodoiwy, a rozpusz¬ czalnik usuwa sie znanymi sposobami, takimi jak odparowanie lub destylacja pod cisnieniem nor- malriyim lub zmniejszonym. 1 Mozna takze zaadsorbowac produkt z brzeczki, na niejonowej zywicy adsorbcyjnej lub na weglu i wyimyc go polarnym rozpuszczalnikiem, takim jak metanol, etanol, aceton, octan etylu, keton metylo-etylowy, ich wodne mieszaniny i podobne.Odmetylowane w pozycji 1' produkty o wtzo^ rze 1 otrzymane badz przez ekstrakcje, badz przez wymywanie mozna wyodrebnic i bardziej jeszcze oczyscic w znany sposób, np. przez chromatogra¬ fie, krystalizacje iitp. Produkty o wzorze 1 otrzy¬ muje sie jako wolne zasady lub addycyjne sole z kwasami Nastepujace przyklady maja na celu wyjasnie¬ nie sposobu wedlug wynalazku, przez przedsta¬ wienie praktycznego wykorzystania wynalazku i podanie dalszych szczególów dotyczacych pro¬ wadzenia procesu. Przyklady te jednak nie sta¬ nowia jednoczesnie zadnych ograniczen zakresu wynalazku.Przyklad I. Odimetylowana w pozycji l' 7/S/-.chloro-7HdezókBylinkomycyna.Wegetatyiwna forme hodowli Streptomyces pu- riipalus, NRRL 3529, otrzymano przez kultywacje tej hodowli przez 3 dni, w temperaturze 28°C w poruszanych ruchem posuwisto-zwrotnym kol¬ bach do wyitrzasania (250 obrotów/minuta, skok 21/2 cm), na podlozu zawierajacym 25 g na litr monohydratu glukozy (Cerelose) i 25 g na litr maczki z nasion bawelny — Pharmamedia (Cotton Seed Meal, Traders Protein Oil Mili Co., P.O. Box 1837, Fort Worth, Texas, 76100) w wodzie wodo¬ ciagowej. Podloze poddano sterylizacji pirzed zssz- czepieniem.Otrzymana wegetatywna forme hodowli uzyto do zaszczepienia na podlozu zawierajacym 20 g na litr ciemnej melasy, 30 g na litr dekstryny, 15 g na litr maczki rybnej i 15 g na litr Pharma¬ media. Wartosc pH podloza doprowadza sie do 7,2 i rozlewa po 100 ml do 120 kolb do wytrzasania, o pojemnosci 500 ml. Kolby te sterylizuje sie (pH po sterylizacji 6,2) i zaszczepia 5 mililitrami we¬ getatywnej formy hodowli (przygotowanej jak wy¬ zej) na 100 ml podloza.Pozwala sie nastepnie na swobodny wzrost ho¬ dowli przez 48 godzin, na trzesaiwce obrotowej (250 obrotów na minute, skok 2,5 cm) w tempera¬ turze okolo 28°C. Pod koniec 48 godzinnego okre¬ su wzrostu, do kazdej kolby dodaje sie 5 mg chlorowodorku 7/S/-chloro- 7-dezoksylinkomycyny i kontynuuje sie fermentacje przez okolo 24 go¬ dziny. Zawartosc kolb laczy sie nastepnie (okolo 10 litrów), dodaje ziemi okrzemkowej i oddziela brzeczke od grzybni przez odsaczenie. Odfiltro¬ wana pozostalosc przemywa sie na saczku 1 litrem wody, która laczy sie nastepnie z klarowna brzeczka. 2*4 12 Tak otrzymana klarowna brzeczke podaje sie- na kolumne zawierajaca zywice Amberlite XAD-2 : (Rohm and Haas Oo., PhiladelpHia, Penn. 19105)„ kolumne przygotowuje sie na mokro, uzywajac 5 350 g zywicy, która opada swobodnie pod wplywem sily ciezkosci. Objetosc wypelnienia kolumny wy¬ nosi 500 ml. Klarowna brzeczke podaje sie na wierzcholek kolumny i przepuszcza przez zywice z szybkoscia przeplywu równa 4% pojemnosci 10 wypelnienia kolumny. Kolumne eluuje sie na¬ stepnie 3^5 litrami mieszaniny ketonu metylowo- -etylówego z woda w stosunku objetosciowym 95 :5. r Zbiera sie kolejne frakcje o objetosci 20 ml i mala próbke kazdej z nich nakrapla na podlo¬ za agarowe zaszczepione Sarcina lutes. Frakcje,, które inhibituja wzrost S. lutea, laczy sie i od¬ dziela warstwe górna od dolnej. Górna warstwe, zateza sie do sucha i oznacza jako preparat A, dolna warstwe wodna doprowadza sie do wartosci pH" za pomoca 20 g weglanu sodu na 100 ml warstwy dolnej. Tak otrzymany alkaliczny roztwór ekstrahuje sie nastepnie chlorkiem metylenu, roz¬ twór w chlorku -metylenu odparowuje sie do su¬ cha i oznacza jako preparat B. Chromatografia cienkowarstwowa (silikazel G, keton metyIowo- -etylowy: aceton: woda w stosunku objetosciowym 140: 40: 22 (wykazuje obecnosc 7/S/-chloro-7-de- _ zoksylinkomycyny i odmetylowanej w pozycji l' 7/S-cMoro-7-dezóksylinkomycyny w obu prepara¬ tach.Preparaty A i B (6 g) laczy sie, rozpuszcza w okolo 10 ml mieszaniny chloroform: metanol (6 :1 35 stosunek objetosciowy), miesza sie z 24 g silika— zelu (Merck-Darmstadt No 7734) i odparowuje do sucha. Tak otrzymana sucha substancje podaje sie na wierzcholek napelnionej na mokro kolumny (chloroform : metanol 6 :1 Obj/obj) zawierajacej 40 600 g tego samego silikazelu. Na otrzymana war¬ stwe wypelnienia naklada sie dodatkowa porcje silikazelu i eluuje sie kolumne 12,8 litrami mie¬ szaniny chloroform-metanol (6:1 obj/obj). Zbiera sie frakcje po 20 ml i bada ich aktywnosc biolo- 45' giczna na plytkach agarowych z hodowla S. lutea.,.Frakcje, w których chromaitografla cienkowar¬ stwowa wykazuje obecnosc odmetyiowanej w po¬ zycji r 7/S/-chloro-7^dezoiklsyliinkomycyny laczy sie, a zwiazek ten identyfikuje sie przez porównanie- z próbka wzorcowa stosujac chromatografie cien¬ kowarstwowa i bibulowa, a takze przez porówna¬ nie widm masowych produktu przemiany bio¬ chemicznej i wzorcowej próbki odmetyiowanej w pozycja 1' 7/S/-chloro-7-dezoksylinfcomycyny. 55 W ten sam sposób, takie mikroorganizmy jak: Streptomyces venezuelae, NRRL 3528, Streptomyces venezuelae, NRRL 3527, Streptomyces spectabilis, NRRL 2494, — 60 Streptomyces spectabilis, NRRL 2792, Aspergillus ornatus, NRRL 2291, Scopulariopsis brevicaulijs, ATCC 7903, i Trichoderma viride, NRRL 1762 stosuje sie zamiast Streptomyces punipalus, NRRL.. 65 3529, w celu otrzymania odmetyiowanej w po-13 zycji 1' 7/S/-chlorp-7-dezoksylinkomycyny lub jej soli addycyjnych,.g kwasami.W ten sam sposób, wedlug przyfeladu I, uzyto innych 7-^l0ro-7vdezok^linto o wzorze 2 zamiast 7/S/Hrfiilo»-de^^ w celu otrzymania odpowiednich, odmetyiowanych w po- zycji 1' 7-chloro-7-dezoksylinkoinyeyn o wzorze 1* W nastepujacych przemianach jak© substraty wystepuja zwiazki o wzorze 2, w postaci wolnych zasad lub soli addycyjnych z kwasami, otrzymuje sie zas odpowiednie, odmetyllowane w pozycji r zwiazki o wzorze 1.Ri Tfrans^etyi trans^etyl «¦ cis-etyl cis-etyl trans-n^propyl trans-n^propyl trans-nHpropyl < cis-n^propyl trans-izopropyl trans-n-butyl trans-n-butyl transnn-butyl •cis-n-btttyl trans-n-pentyl transnn-pentyl trans-n-pentyl *cis-n^pentyl trans-n-hexyl trans-n-hexyl trans-n-hexyl cis-n-hexyl trans-dzoheptyl trans-m-heptyl trans-n-heptyl -cisHn-heptyl cis-n-heptyl trans-n-oktyl trans-n-oktyl trans-n-oktyl trans-izooktyl cis-njoktyl 7-X /S/-C1 7R/-C1 /S/-Br '. /R/-C1 /S/-C1 /S/-Br /R/-C1 /s/-a /S/-C1 /S/-C1 /S/-Br /R/-Br /S/-C1 /S/-C1 /S/-C1 /R/-C1 /S/-Br /S/-C1 /S/-Br /R/-C1 /S/-Br /S/-CI /S/-GL /R/-C1 /S/-C1 /R/-Br /S/-C1 /S/-C1 /R/-C1 /S/-Br /S/-Br R metyl - metyl metyl metyl metyl metyl metyl metyl metyl metyl etyl metyl metyl metyl etyl metyl metyl metyl etyl metyl metyl metyl metyl metyl metyl metyl metyl etyl metyl metyl metyl Przyklad II. 4* -Despropylo^-ftrans-n-pen- tylo- 7 -dezoksy-7/S/HchloroHnkomycyna odmetylo¬ wana w pozycji 1' (Despropylo- bez propylu).Powtarza sie przemiane biochemiczna i sftoso- by wyodrebnienia produktu z przykladu I stosu¬ jac ten sam mikroorganizm, ale jako substrat uzy¬ wa sie chlorowodorek 4,-despropylo-4,-trans-in- -pentylo-7-dezoksy-7/S/-chloroldnkomycyny w celu ¦-otrzymania odmetylowanej w pozycji 1* 4,-despro- pyito-4'-itoa'nis-n^ mycyny.Przyklad III. 7/S/-chloro-7-dezoksyMnkomy- «cyna odmetylowana w pozycji 1\ Przygotowuje sie podloze rozcienczajac do 100 ml mieszanine 2 g wyciagu slodowego, 0,1 g pepto¬ nu i 2 g Cerelose. Piec 20 miliMtrowych porcji tego podloza w kolbach o pojemnosci 125 ml wy¬ jalawia sie i kazda z nich zaszczepia wzrastajaca 10 15 20 25 30 40 50 55 60 14 juz ,od 72 godzan wegetatywna forma jednego znaste^jac}^ .a Aspergillus ornatu^ NJtRL 2291,;, h.: -...;* Scopulariopsis brewcaulis, ATCC li$$, ; ; kx Trichoderma vinide, ,NRRL 17^ ;;'.-.„ Streptomyces spectajaduSj NRRL 248fyi; ;r a: Strepbomyices spectabtiliSi NRRL 2792. ^ Po 2 do 5 dniach kiedy ukazuje sie ge»ta grzyb¬ nia, dodaje sie do kazdej z kolb 50^100 mg chlo¬ rowodorku 7/S/. - chloro - 7 - dezoksylinkomycyny i kontynuuje sie inkubacje tych kolb przez dalsze 3 do 5 dni _...¦,- Stopien przemiany substratu okresla sie gadajac próbki z koljb za pomoca wstepujacej chromajto- graflii bibulowej. Na bibule (Whatman No. 3 HR, 18X13 mm) nanosi sie próbki 2 do 5 |il przesaczo¬ nej brzeczki z kazdej z kolb. Produkty przemiany, oddziela sie od substancji wyjsciowej za pomoca chromatografii wstepujacej w ukladzie octan ety¬ lu : aceton : woda (8:5:1 obj/obj). Porównanie tych chromatogramów z chromatogramami otrzyma¬ nymi w ten sam sposób z wzorcowej mieszaniny 7/S/^chloro-7-dezoksylinkomycyny i jej pochodnej odmetylowanej w pozycji 1' wskazuje na to, ze produktem kazdej z badanych przemian jest 7/S/- -chloro-7jdezoksylinkomycyna odmetylowana w po¬ zycji 1'.W podobny sposób, przy uzyciu podanych wy¬ zej mikroorganizmów, inne analogi 7/S/K:hloro- -7jdezoksylinikomycyny i 7/R/^chloro-7-dezoksylim- komycyny o wzorze 2, taMe jak np. te, które po¬ dano w przykladzie 1, przeksztalca sie w odpo¬ wiednie, odmetylowane w pozycji 1' zwiazki o wzorze 1.Przyklad IV. 7/S/-chloro-7-dezoksyldnkomy- cyna odmetylowana w pozycji 1'.Dwie 20 mililitrowe porcje podloza o skladzie opisanym w przykladzie 1, umieszcza sie w kolbach o pojemnosci 125 ml i wyjalawia. Jedna z nich zaszczepia sie Streptomyces venezuelae NRRL 3528, druga zas Streptomyces venezuelae NRRL 3527. Po okolo 3 dniach gdy ukazuje sie gesta grzybnia, dodaje sie do kazdej kolby 1 mg chlo¬ rowodorku 7/S/-chloro-7-dezoksylinkomycyny i kon¬ tynuuje fermentacje przez nastepne 3 dni.Stopien konwersji bada sie za pomoca chroma¬ tografii bibulowej w sposób podany w przykla¬ dzie III. W obu kolbach jako produkt przemia¬ ny powstaje 7/S/K:hloro-7-dezoksylinkomycyna od¬ metylowana w pozycji 1'. PL PL

Claims (1)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób otrzymywania odmetylowanych po¬ chodnych linkomycyny o wzorze 1, w którym R oznacza metyl lub etyl, Ri oznacza alkil o 2 do 8 atomach wegla, a X oznacza chlor luib brom, zna¬ mienny tym, ze zwiazek T-metylo o wzorze 2, w którym R, Ri i X maja wyzej podane znacze¬ nie, lub jego addycyjna sól z kwasem, poddaje sie odmetylawujacemu dzialaniu: Streptomyces pu- nipalus, NRRL 3529, Streptomyces venezuelae NRRL 3528, Streptomyces venezuelae, NRRL 3527, Streptomyces spectabilis, NRRL 2494, Streptomy-80 274 -NH CH9 H ^X CH, H X SCHEMAT PL PL