Sposób wytwarzania nowego antybiotyku Przedmiotem wynalazku jest wytwarzanie no¬ wego antybiotyku o wzorze podanym na rysunku, nazwanego antybiotykiem 66-40 lub sizomycyna.Antybiotyk 66-40 ma szeroki zakres dzialania i wy¬ kazuje hamujacy wplyw na rozwój bakterii Gram — dodatnich i Gram — ujemnych. W zakres wy¬ nalazku wchodzi sposób wytwarzania antybiotyku 66-40 na drodze mikrobiologicznej, zarówno w wol¬ nej postaci, jak i w postaci jego dopuszczalnyci: w lecznictwie pochodnych funkcjonalnych.Antybiotyk 66-40 jest biosyntetycznym produk¬ tem, otrzymywanym na drodze aerobowej hodowli w pozywce wodnej nowego szczepu Micromonospo- ra inyoensis. Szczep ten wyosobniono z próbki gle¬ by pobranej w Inyo National Forest w White Mountains w Kalifornii. Jedna z cech tego szczepu jest zdolnosc wytwarzania antybiotyku 66-40. Kul¬ ture tego szczepu zlozono w zbiorze The Northern Utillization and Research Division, Agriculture Re¬ search Service, U. S. Departament of Agriculture, Peoria, Illinois, za numerem NRRL 3292. Jest to mikroorganizm aerobowy i rozwija sie dobrze na powierzchni róznych stalych i cieklych pozywek, jednak szczególnie dobrze rozwija sie i wytwarza antybiotyk w zanurzeniu, w warunkach aerobo¬ wyeh.M. inyoensis odróznia sie od innych gatunków Micromonospora wieloma parametrami taksono¬ micznymi. W wyniku hodowli, prowadzonej w cia¬ gu 14 dni w temperaturze 24—26°C na pozywce 10 15 20 25 30 agarowej zawierajacej 1,5% agaru, l°/o dekstrozy i 3% NZ Amine Type A (preparat produkowany przez przedsiebiorstwo Sheffield Chemical Compa¬ ny, Norwich, New York), obserwuje sie wzrost dostateczny lub nikly. Mikroskopowe badanie nie wykazuje grzybni. W niektórych miejscach po¬ wierzchni zaszczepionej pojawiaja sie nastepnie dobrze rozwiniete kolonie i na niektórych plyt¬ kach widoczne jest w miejscu kolonii slabe, czer- wonobrazowe zabarwienie. Przy okresleniu tej bar¬ wy, jak i w innych podanych w opisie, stosuje sie dwa okreslenia. Pierwszym z nich jest nazwa bar¬ wy wedlug „Descriptive Color Name Dictionary", Taylor, Knoche i Granville 1950, z numerem od¬ powiadajacym tej barwie wedlug „The Color Har- mony Manual" wydanie 4, 1958, zas drugie okre¬ slenie sklada sie z nazwy barwy i numeru, który odnosi sie do barwy identycznej lub prawie iden¬ tycznej wedlug National Bureau of Standards, Sta¬ ny Zjednoczone Ameryki, okólnik nr 553, 1 listo¬ pada 1955 r. Barwa tej kolonii powierzchniowej waha sie od ceglasto-brazowej g 5 ne czyli bra¬ zowej 55 do mahoniowo-brazowej m 6 pi. Pod mikroskopem z zastosowaniem kontrastu widac dluga, rozgaleziona grzybnie regularna, bez prze¬ gród. Srednica grzybni wynosi okolo 0,5 mikrona.Zarodniki tworza sie pojedynczo w torebkach za¬ rodnikowych o srednicy 1,0—1,5 mikrona. Zarodni¬ ki sa w przyblizeniu walcowate i jajowate lub prawie kuliste. 8011380113 M. inyoensis rozwija sie dobrze w temperaturze 28—37°C, natomiast nie obserwuje sie wzrostu w temperaturze 50°C. Na pozywce asparaginowo-aga- rowej wzrost jest nikly. Rozwijajaca sie kolonia M. inyoensis hydrolizuje zelatyne, mleko, skrobie i przy zastosowaniu metody Gordona i in. (J. Ba- cteriology 69, 147 (1965) i 73, 15 (1957) redukuje azotan do azotynu. Jako zródlo wegla przy ho¬ dowli tego mikroorganizmu mozna tez stosowac sacharoze. Inne cechy charakterystyczne M. iny¬ oensis sa podane w tablicy A.Tablica A dalszy ciag tablicy B Pozywka Agar Bennetfa Agar Emersona Pasta pomi¬ dorowa maczka owsiana — agar Glikoza — aspargina agar Glikoza — wyciag drozdzowy — agar Platki ziem¬ niaczane Agar Czapka Agar tyro- zynowy Pepton — ze¬ lazo— agar Cechy charakterystyczne Wzrost mierny, barwa rdza- wo-brazowa g 5 pg^lub mocno brazowa 55 Wzrost dobry, barwa ceglasto- -czerwona g 6 ng lub nieco czerwono-brazowa 43 Wzrost dobry Wzrost slaby Wzrost dobry, barwa rózowo- -brazowa g 7 n i lub ciemno- szaro-czerwona 20 w niektó¬ rych koloniach slabe zabarwie¬ nie kasztanowe.Wzrost slaby, poprawia sie po dodaniu weglanu wapniowego Wzrost dobry Wzrost dobry, brak rozpusz¬ czalnego barwnika Wzrost dobry, brak rozpusz¬ czalnego barwnika | M. inyoensis moze wykorzystywac rózne zródla wegla i azotu, a tablica B uwidacznia wzrost tego mikroorganizmu na róznego rodzaju weglowoda¬ nach. Ocene wzrostu przeprowadzono wzrokowo na pozywkach zawierajacych' 0,5°/o wyciagu droz¬ dzowego, 1% weglowodanu i 1,5% agaru w wodzie destylowanej.Tablica B Weglan w pozywce Próba porównawcza L-arabinoza D-glikqza I}-gaiaktoza fl-laktoza | D-lewuloza Wzrost mierny mierny dobry dostateczny lub mierny dostateczny lub mierny mierny | 10 20 25 30 35 40 45 50 55 Weglan w pozywce rafinoza L-ramnoza skrobia sacharoza D-ksylpza inozytol D-mannit d(—)-arabinoza dulcyt d-ryboza a-melibioza D(+)-melicytoza glicerol Wzrost mierny mierny dobry dobry dostateczny lub mierny mierny mierny mierny mierny dostateczny mierny mierny mierny W tablicy C podano wzrost M. inyoensis na róz¬ nych pozywkach azotowych, okreslany wzrokowo na plytkach agarowych w srodowisku zawie¬ rajacym 1% glikozy, 1,5% agaru i podana w tab¬ licy pozywke azotowa w wodzie destylowanej.Tablica C Zródlo azotu l°/o aminy NZ typ A 0,5% drozdzy 1% asparaginy 1% kwasu glutami¬ nowego 1% azotanu amono¬ wego Wzrost dostateczny lub slaby dobry mierny 1 mierny mierny Antybiotyk 66-40 jest zasadowym pseudo-oligo- sacharydem, który od innych pseudo-oligosachary- dów odróznia sie wyraznie wlasciwosciami biolo¬ gicznymi, fizycznymi i chemicznymi, jak to opi¬ sano nizej. Widmo absorpcyjne antybiotyku 66-40 w podczerwieni w oleju mineralnym (nujol) po¬ dano na fig. 1 rysunku, a wyrazniejsze pasma ab¬ sorpcyjne podano w tablicy D. W tablicy tej po¬ dano dlugosc fali swietlnej w mikronach, a w nawiasach okreslono poszczególne pasma, stosujac nastepujace skróty: S — wyrazne, M — srednie, W — slabe, brd — szerokie, VS — bardzo wyrazne i VW — bardzo slabe.Tablica D 2,98 (M-S) 3,05 (M-S) 3,16 (M-S) 3,3 5-3,50 (nujol) 5,93 (W-M) 6,25 (M) 6,82 (nujol) | 7,25 (nujol) 8,77 (M-S) 9,00 (M-S) 9,47 (S) 9,72-10,07 (S, brd) 10,46 (M-S) 11,97 (M) 12,75 (VW, brd) 13,45-13,90 (W, brd) | 65 Na fig. 2 rysunku uwidoczniono charakterystycz¬ ne widmo jadrowegp rezpnansu magnetycznego (NME) antybiotyku 66t4Q. Wt pomoca spektrometru AdR-A wytwarzanego przjez8(J 113 Varian Associates, Kalifornia, stosujac okolo 0,4 ml roztwórii antybiotyku w tlenku dettteru o stezeniu okolo 20 mg/ml. Jest ono wyrazone w czesciach na 1 milion, przy uzyciu soli sodowej kwasu 3- -(trójmetylósilo)-propanosulfonowego jako miedzy¬ narodowego wzorca.W tablicy E podano wyniki badan jakosciowych i stale fizyczne antybiotyku 66-40 w postaci wol¬ nej zasady.Tablica E a) Reakcje barwne Sakaguchi — ujemna skrobia —jodek potasowy —dodatnia Ninhydryna — dodatnia Chlorekcynowy — ujemna Molisch — ujemna Biuretowa — dodatnia b) Stale fizyczne [a]D26 (C = 0,3Vo w H20) +188,9° Temperatura topnienia jednowodzianu 185-190°C 6 io 20 Równowaznik wagowy PKa Analiza elementarna: znaleziono C 49,80 H 8,20 N 14,95 O (z róznicy 27,05 dla 92 8,0 obliczono jednowodzianu 49,02 8,44 15,04 27,50 Wyniki analizy elementarnej odpowiadaja oblicze¬ niom dla wzoru C19H37N507 • H20.Ciezar czasteczkowy (spektrometrycznie) 447,26 Absorpcja w swietle pozafioletowym przy dlugosci fali 220—400 milimikronów c) Rozpuszczalnosc antybiotyku 66-40 jako za- 30 35 sady, okreslona zgodnie z tJ.S. Pharmacópia XVIII, stf. 8.Rozpuszczalnik Rozpuszczalnosc metanol slaba aceton nierozpuszczalny chloroform nikla eter nierozpuszczalny benzen nierozpuszczalny woda bardzo dobra W tablicy F podano widmo masowe antybiotyku 66-40 jako wolnej zasady, przy czym kolumny m/e oznaczaja stosunek: masy do ladunku, a kolumny Rei. Int. oznaczaja natezenie szczytowe róznych stosunków masy do ladunku m/e w stosunku do szczytu m/e = 118.Jak wspomniano wyzej, antybiotyk 66-40 wy¬ twarza sie sposobem wedlug wynalazku przez ho¬ dowanie mikroorganizmu M. inyoensis NRRL 3292 w wodnym srodowisku odzywczym, w warunkach aerobowych, korzystnie w zanurzeniu. W celu wy¬ tworzenia niewielkich ilosci antybiotyku, mozna stosowac hodowle powierzchniowa w butlach lub kolbach wstrzasanych. Mikroorganizm hoduje sie w pozywce zawierajacej zródlo wegla, na przyklad ulegajacy przyswojeniu weglowodan, przy czym niezbedny jest tez przyswajalny zwiazek azotu lub substancja bialkowa. Jako zródlo wegla korzystnie stosuje sie glikoze, maltoze, mannoze, sacharoze, skrobie, krochmal zbozowy itp., zas jako zródlo azotu namok kukurydziany, wyciag drozdzowy, maczke sojowa, peptony miesne, produkty, hydro¬ lizy kazeiny, wyciagi z miesa wolowego itp. Ko¬ rzystnie jest stosowac kombinacje zródel wegla i azotu. Na ogól nie trzeba dodawac pierwiastków sladowych, poniewaz do wytwarzania srodowiska, stosuje sie wode wodociagowa, ale korzystnie jest stosowac dodatek soli kobaltu.Wytwarzanie antybiotyku 66-40 odbywa sie w do- m/e 40 41 42 43 44 45 46 51 52 53 54 55 56 57 38 59 60 65 66 67 68 69 70 71 72 73 I 74 | Rei. Int. 3.0 30.0 63.0 50.0 100$ 8.0 5.0 2.5 3.5 10.0 10.0 20.0 50.0 23.5 64.0 40.0 13.5 4.0 3.5 12.0 65.0 21.0 19.0 30.0 66.0 66.0 28.0 I m/e 75 80 81 82 83 84 85 86 87 88 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 107 108 109 110 111 112 | Rei. Int. 3.0 24.0 19.5 35.5 16.5 51.0 21.0 58.0 28.0 11.0 7.0 6.0 15.0 7.0 10.0 15.0 23.0 11.0 44.0 14.0 17.0 3.0 7.5 17.0 50.9 13.0 19.0 | m/e 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 1 128 129 130 131 133 135 138 140 142 143 144 145 I Tabl Rei. Int. 11.0 14.0 2.5 2.5 1.0 100. 8.0 2.0 2.0 2.0 2.0 3.0 6.0 20.0 35.0 12.0 5.0 15.0 2.5 2.0 2.0 2.0 3.0 16.0 ,3.5 6.0 65.0 1 ica F m/e 146 147 151 152 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 168 169 170 173 147 176 178 185 186 187 188 191 192 1 Rei. Int. 11.0 3.5 2.0 2.5 3.0 2.0 2.5 4.5 3.5 98.0 9.5 2.0 20.0 2.0 2.0 3.5 2.5 19.0 3.0 3.0 7.0 2.0 2.5 17.0 2.5 32.0 3.5 | m/e 199 200 201 202 203 205 206 215 216 219 220 236 237 238 239 245 246 253 254 255 256 270 271 272 282 289 299 1 Rei. Int. 2.0 2.0 3.0 2.5 22.0 6.0 6.0 6.0 2.0 2.0 2.0 7.0 2.0 6.0 2.0 4.0 6.0 2.5 4.5 2.5 10.0 2.0 11.0 6.0 5.0 4.5 9.0 | m/e 300 304 305 317 322 330 331 332 333 350 362 363 411 412 414 429 430 431 447 448 Rei. Int. 4.0 41.0 7.0 8.5 3.0 5.0 2.0 23.0 4.0 5.0 15.0 3.0 0.5 0.6 0.5 0.9 4.5 1.0 5.0 1.380113 8 wolnej temperaturze odpowiedniej dla dobrego wzro¬ stu mikroorganizmu, na przyklad w temperaturze 20—40°C, a korzystnie 25—35°C. Zwykle optimum produkcji osiaga sie po uplywie 3—7 dni. Wartosc pH srodowiska w ciagu fermentacji utrzymuje sie w 5 poblizu 7, a koncowa wartosc zalezy w pewnej mierze od ewentualnie dodanych substancji bufo¬ rowych i przed sterylizacja nastawia sie ja ko¬ rzystnie na okolo 8,0. W przypadku hodowli w du¬ zych zbiornikach, korzystnie jest wytwarzac we- 10 getatywny material do szczepienia przez zaszczep pienie brzeczki hodowlanej skosna lub liofilizowa¬ na kultura mikroorganizmu. Otrzymany w ten spo¬ sób material do zaszczepienia przenosi sie aseptycz- nie do wiekszych naczyn lub zbiorników. Jako sro- 15 dowisko do wytwarzania materialu do szczepienia mozna stosowac takie samo srodowisko, jakie sto¬ suje sie do hodowli w zbiornikach lub inne, umo¬ zliwiajace dobry wzrost mikroorganizmu.Po zakonczeniu fermentacji material przerabia 20 sie nastepnie, na przyklad w ten sposób, ze do brzeczki dodaje sie kwasu mineralnego, korzystnie wodnego roztworu kwasu siarkowego, az do uzy¬ skania wartosci pH okolo 2, przy czym rozpuszczal¬ ny w wodzie antybiotyk uwalnia sie z grzybni i 25 rozpuszcza w wodnym srodowisku fermentacyjnym.Nastepnie mieszanine odsacza sie, zobojetnia prze¬ sacz i dodaje don kwasu szczawiowego w celu wy¬ tracenia jonów zelaza. Po ponownym przesaczeniu i zobojetnieniu, korzystnie za pomoca wodorotlen- 30 ku amonowego, klarowny, zobojetniony przesacz przepuszcza sie przez zywiczny wymieniacz jonowy, korzystnie IRC-50 Amberlit w postaci ^amoniowej.Przyklady zywicznych wymieniaczy jonowych ty¬ pu Amberlitu, stosowanych w procesie wedlug wy- 35 nalazku, zarówno amoniowych jak i kationowych, sa podane w Handbook of Chemistry and Physics, wydanie 42, 1960. Ciecz odplywajaca z kolumny wymieniacza jonowego odrzuca sie, a nastepnie antybiotyk eluuje sie z zywicy za pomoca wodoro- 40 tlenku amonowego. Eluat steza sie i odparowuje otrzymujac jako pozostalosc surowy antybiotyk 66- -40, a aktywnosc okolo 500 mikrogramów/mg. Spo¬ sób oznaczania aktywnosci jest omówiony nizej.Surowy antybiotyk oczyszcza sie za pomoca anio- 45 nowego wymieniacza zywicznego, korzystnie typu Dowex 1X2 lub Amberlite IRA. Surowy produkt absorbuje sie z wodnego roztworu i eluuje z ko¬ lumny destylowana woda, otrzymujac produkt o aktywnosci okolo 900 mikrogramów/mg. Mozna tez 50 oczyszczac surowy antybiotyk na kolumnie celu¬ lozowej, stosujac jako rozpuszczalnik mieszanine chloroformu z metanolem i 17% wodorotlenkiem amonowym (2:1:1). Górna faza tego ukladu roz¬ puszczalników sluzy do pierwszego zwilzania ko- 55 lumny, a dolna stanowi eluent. Antybiotyk kieruje sie na kolumne przez adsorpcje ze stezonego roz¬ tworu w górnej fazie podanego wyzej ukladu roz¬ puszczalników.W celu oznaczenia aktywnosci róznych prepa- 60 ratów w mikrogramach antybiotyku na 1 miligram preparatu, stosuje sie typowa metode próby w kubku cylindrycznym, przy uzyciu Staphylococcus aureus ATCC 6 538P (American Type Culture Col- lection) jako próbnego mikroorganizmu. Metoda ta 65 jest w pelni analogiczna do metody opisanej przez Oden'a i in. W Antimicrobial Agents and Che- motherapy (1963). Wedlug tej metody aktywnosc 1 mikrograma antybiotyku oznacza taka ilosc pre¬ paratu, która w warunkach prowadzenia próby da¬ je reakcje strefowa 16,3 ±0,9 mm i wyraza sie ja w mikrogramach na 1 miligram.Jak wyzej wspomniano, antybiotyk wytwarzany sposobem wedlug wynalazku mozna przeprowadzac w farmakologicznie dopuszczalne pochodne, na przyklad solwaty, takie jak wodziany, sole lub produkty kondensacji z aldehydami i/lub ketonami.Wlasciwosci niektórych tych pochodnych podano ponizej.Dzieki zasadowemu charakterowi antybiotyk 66- -40 latwo tworzy nietoksyczne sole z kwasami or¬ ganicznymi i nieorganicznymi, takimi jak kwas solny, siarkowy, fosforowy, octowy, stearynowy, propionowy, winowy, maleinowy, benzoesowy itp.Mozna tez stosowac wielozasadowe kwasy czescio¬ wo zobojetnione, na przyklad zasade nieorganiczna taka jak wodorotlenek sodowy lub zasade orga¬ niczna. Sole z kwasami nieorganicznymi takimi jak kwas solny, siarkowy, fosforowy itp. sa rozpusz¬ czalne w wodzie i otrzymuje sie je przez stezanie lub liofilizacje ich wodnych roztworów lub przez stracanie za pomoca mieszajacych sie z woda orga¬ nicznych rozpuszczalników, korzystnie nizszych al¬ koholi alifatycznych lub ketonów. Nalezy nadmie¬ nic, ze chlorowodorki antybiotyku 66-40 sa pod tym wzgledem nietypowe, gdyz rozpuszczaja sie w znacznym stopniu w metanolu. Z roztworów wod¬ nych straca sie je za pomoca nizszych alkiloketo- nów, takich jak aceton. Miareczkujac wodny roz¬ twór antybiotyku 66-40 kwasem w ilosci mniejszej od stechiometrycznej, mozna wytwarzac niepelne sole addycyjne. Takie sole sa w niniejszym opisie objete równiez okresleniem „sole addycyjne z kwa¬ sami". Sole addycyjne z kwasami maja zakres dzialania antybiotycznego taki sam, jak wolna za¬ sada, ale rózniaca sie od niej rozpuszczalnoscia.Antybiotyk otrzymywany sposobem wedlug wy¬ nalazku i jego sole addycyjne z kwasami tworza z woda wodziany, a z rozpuszczalnikami organicz¬ nymi daja solwaty. Z tego powodu, w wyniku opi¬ sanych nizej operacji zwykle otrzymuje sie anty¬ biotyk w postaci wodzianu, zas jego sole addy¬ cyjne z kwasami jako solwaty nizszych alifatycz¬ nych alkoholi lub ketonów. Te wodziany i solwaty sa stosunkowo trwale, totez wyosobnione produkty zawieraja wode lub rozpuszczalnik, zwykle w ilos¬ ci 1 mola na 1 mol antybiotyku. Wlasciwosci fi¬ zyczne niektórych zwiazków tego typu podano w tablicy G.Tablica G Chlorowodorek antybiotyku 66-40 w postaci sol- watu metanolowego. [a]D25 (c = 1% w H20)+112,2a Analiza elementarna Znaleziono Obliczono C 37,70 36,29 H 7,15 7,00 N 10,61 10,58 Cl 25,60 26,78 Wyniki analizy odpowiadaja wzrostowi C19H37N5CV •5HCl*CH3OH absorpcja w swietle nadfioleto-9 wym: przepuszczalnosc promieni przy dlugosci fali 220—400 milimikrpnów.Siarczan antybiotyku 66-40 w postaci solwatu me¬ talowego. [a]D25 (c = 1% w H20) +105,1° Analiza elementarna Znaleziono Obliczono C 32,52 33,14 H 6,33 6,39 N 9,32 9,66 S04 33,90 33,13 Wyniki analizy odpowiadaja wzorowi,(C^H^NgO^* •5H2S04-2CH3OH. Absorpcja w swietle nadfiole¬ towym: przepuszczalnosc promieni przy dlugosci fali 220—400 milimikronów.Jak juz wspomniano, antybiotyk 66-40 tworzy równiez nietoksyczne produkty kondensacji z al¬ dehydami i/lub ketonami, w sposób znany dla wy¬ twarzania zwiazków tego typu. Korzystnie stosuje sie je jako zasady Schiffa, wytwarzane przez kon¬ densacje antybiotyku z aldehydem i/lub ketonami, zawierajacymi do 12 atomów wegla, takimi jak alifatyczne, alicykliczne, aromatyczne i heterocy¬ kliczne. Aldehydy i ketony o budowie pierscienio¬ wej moga zawierac podstawniki, takie jak grupy wodorotlenowe, atomy chlorowców, grupy nitrowe, nizsze rodniki alkoksylowe lub alkanoiloksylowe itp. Przykladami takich aldehydów i ketonów sa: aldehyd octowy, aceton, keton metyloetylowy, al¬ dehyd krotonowy, furfural, aldehyd cyklopentylo- octowy, wanilina, aldehyd weratrowy, benzofen, aldehyd benzoesowy, acetofenon, aldehyd salicylo¬ wy, pirydoksal itp. Nalezy nadmienic, ze te pro¬ dukty kondensacji nie sa trwale w obecnosci wody.Antybiotyk 66-40 i jego dopuszczalne w lecznic¬ twie pochodne funkcjonalne maja szeroki zakres dzialania przeciwbakteryjnego. Hamuje on wzrost bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, totez moze byc stosowany sam lub w polaczeniu z inny¬ mi srodkami antybiotycznymi do hamowania ro¬ zwoju lub zmniejszenia ilosci bakterii w róznych srodowiskach, na przyklad do dezynfekowania szklanych sprzetów laboratoryjnych, narzedzi i wyposazenia dentystycznego i medycznego, zarazo¬ nych bakteriami Staphylococcus aureus lub inny¬ mi, ulegajacymi dzialaniu antybiotyku 66-40. Ze wzgledu na szczególna skutecznosc przeciwko bak¬ teriom Gram-ujemnych, antybiotyk ten jest uzy¬ teczny przy zwalczaniu zakazen tymi bakteriami.Aktywnosc antybiotyku 66-40 przeciw róznym bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym jest podana w tablicy H. Minimalne stezenie, przy któ¬ rym antybiotyk dziala hamujaco na rozwój bak¬ terii, oznaczone w skrócie MIC, okresla sie stosu¬ jac jako srodowisko próbne brzeczke drozdzowo- -wolowa i przy uzyciu metody dwukrotnego roz¬ cienczania seryjnego. Minimalne stezenie MIC od¬ powiada stezeniu w srodkowym punkcie pomiedzy ostatnia probówka z zawartoscia wzrokowo kla¬ rowna i pierwsza probówka z zawartoscia metna.Oznaczenia prowadzi sie stosujac rozcienczenie 10_3 hodowli badanych bakterii majacej 24 godziny.Wszystkie probówki zaszczepia sie po uplywie 18 godzin w temperaturze 37°C. Do badan stosuje sie antybiotyk 66-40 o aktywnosci 1000 mikrogra- mów/mg. Symbol DA w tablicy oznacza próbe ze zbioru Schering Corporation. 10 Tablica H Badane mikroorganizmy Bakterie Gram-dodatnie Diplococcus pneumoniae DA 150 Enterococcus sp. DA 800 Enterococcus sp. DA 801 Enterococcus sp. DA 802 Staphylococcus aureue ATCC 6538P Staphylococcus aureue ATCC 11631 Staphylococcus aureus Gray Staphylococcus aureus DA 2033 Streptococcus faecalis ATCC 10541 Streptococcus pyogenes DA 1 Streptococcus pyogenes DA 21 Streptococcus pyogenes DA 15 Bakterie Gram-ujemne Escherichia coli ATCC 10536 Escherichia coli DA 3 Escherichia coli DA 4 Escherichia coli DA 1 Klebsiella pneumaniae DA 20 Klebsiella pneumaniae ATCC 10031 Proteus vulgaris DA 121 Proteus vulgaris ATCC 9921 Proteus vulgaris DA 13 Proteus vulgaris DA 12 Pseudomonas aeruginosa ATCC 8709 Pseudomonas aeruginosa ATCC 8689 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Salmonella schottmuelleri DA 10 Salmonella sp. DA 101 Salmonella sp. DA 102 Aerobacter sp. DA 3a i | MIC w mikro- gramach/ml 3,0 2,25 2,25 2,25 0,23 0,21 0,05 0,08 3,0 3,0 3,7 3,7 0,6 0,3 0,6 0,6 0,23 ] a,o 0,6 0,6 0,3 ; 3,0 0,45 0,6 ' 0,6 0,53 0,5 0,3 0,3 Ostra toksycznosc antybiotyku 66-40 w postaci jego siarczanu okresla sie typowa metoda, przy podawaniu antybiotyku róznymi drogami myszom o ciezarze ciala 18—20 g. Dane dotyczace toksycz¬ nosci sa podane w tablicy J i wyrazone w przeli¬ czeniu na wolna zasade.Tablica J Sposób podawania antybiotyku podskórnie dootrzewnie 1 dozylnie LD50 w mg/kg 288 221 3480113 11 12 Antybiotyk 66-40 przejawia dzialanie przeciw- lakteryjne w przypadku licznych zakazen bakte¬ ryjnych wywolanych u zwierzat w laboratorium, a zwlaszcza u myszy. W icelu okreslenia in vivo wlasciwosci ochronnych antybiotyku 66-40 w przy¬ padku zakazen chorobotwórczych bakteriami u my¬ szy, podaje sie myszom antybiotyk dwukrotnie, raz bezposrednio przed dootrzewnym zaszczepie¬ niem bakteriami i drugi raz po uplywie 4 godzin od tego zaszczepienia. Liczbe zywych myszy okre¬ sla sie po uplywie 48 godzin od zarazenia i zebra¬ ne dane analizuje w zwykly sposób w celu usta¬ lenia wartosci PD50 z dokladnoscia 95%. W tablicy K podano wyniki oznaczania aktywnosci antybio¬ tyku 66-40 w stosunku do róznych bakterii choro¬ botwórczych.Tablica K Mikroorganizm Staphylococcus aureus Gray DC 445 1 Streptococcus pyogenes f CDC 28 1 Klebsiella pneumoniae DC 801 Pseudomonos aerugi- nosa ATCC 8709 Salmonella paratyphi BDC 837 Podawanie podskórnie doustnie podskórnie podskórnie doustnie podskórnie podksórnie PD50 w mg/kg 0,12 25,0 0,87 0,70 50,0 1,12 1,91 | Z tablicy K wynika, ze wskaznik temperatury LD50/PD50 przy podawaniu podskórnym wynosi 330—2400 w odniesieniu do bakterii Gram-dodat- nich i 150—410 w odniesieniu do bakterii Gram- -ujemnych.Badania wykazaly równiez, ze myszy zakazone dootrzewnie 8 dawkami LD50 Rickettsia akaria uzy¬ skuja 100% ochrony przy podawaniu im podskórnie 2 mg antybiotyku 66-40 raz dziennie w ciagu 4 dni.Biorac pod uwage podane wyzej dane in vivo, a zwlaszcza korzystny wskaznik terapeutyczny antybiotyku 66-40, jest rzecza oczywista, ze anty¬ biotyk ten moze byc stosowany do hamowania i zwalczania róznych zakazen u ssaków, na przy¬ klad powodowanych przez Streptococcus, Staphy¬ lococcus, Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Pro- teus, Pseudomonas itp. Bakterie te powoduja lub uwaza sie ze powoduja zapalenie gruczolu sutko¬ wego u bydla, zakazenie przewodu moczowego i biegunke. Niektóre szczepy tych bakterii powoduja prawdopodobnie chorobe skóry i górnego ukladu oddechowego lub przyczyniaja sie do nasilania tych schorzen wystepujacych w lzejszej postaci u ssa¬ ków. Antybiotyk 66-40 i jego pochodne stanowia przeto wazny srodek do zwalczania wymienionych wyzej mikroorganizmów i zapobiega wywolywa¬ nym przez nie chorobom.Antybiotyk 66-40 i jego pochodne mozna sto¬ lo 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 sowac miejscowo w postaci masci, zarówno hydro- filowych, jak i hydrofobowych, w postaci plynów do przemywania, zarówno wodnych jak i niewocl- nych lub typu emulsji, czy tez w postaci kremów.Jako nosniki w takich preparatach stosuje sie na przyklad wode, oleje, tluszcze, poliestry, alkohole wielowodorotlenowe itp. Srodki do stosowania miejscowego przewaznie zawieraja okolo 0,1—3,0 g antybiotyku na 100 g masci, plynu lub kremu i stosuje sie je na miejsca schorzen 2—5 razy dzie- nie.Preparaty zawierajace antybiotyk wytwarzany sposobem wedlug wynalazku moga byc tez stoso¬ wane w postaci cieczy jako roztwory, zawiesiny itp. przy schorzeniach uszu i oczii, a takze moga byc podawane pozajelitowo jako zastrzyki domies¬ niowe. Roztwór lub zawiesine do zastrzyków sto¬ suje sie zwykle w ilosci okolo 1—5 mg antybio¬ tyku na 1 kg ciezaru ciala w postaci 2—4 dawek w ciagu 1 dnia. Wielkosc dawek zalezy od nasile¬ nia choroby, podatnosci chorobotwórczych bakterii na dzialanie antybiotyku i wlasciwosci leczonego ssaka.W ponizszych przepisach podano sposoby wy¬ twarzania preparatów zawierajacych antybiotyk wytwarzany sposobem wedlug wynalazku.Przepis I. Roztwór do wstrzykiwania Skladnik Na 1 ampulke 2 ml Na 50 litrów Siarczan antybióty- ku 66-40 Ester metylowy kwa su p-hydroksybenzo- esowego Ester propylowy kwasu p-hydroksy- benzoesowego Wodorosiarczan so¬ dowy Dwuwodzian soli dwu- sodoetylenódwuami- nowej kwasu czte¬ rooctowego Woda do zastrzyków do 84,0 mg 3,6 mg 0,4 mg 6,4 mg 0,2 mg 2,0 ml 2100,0 g 90,0 g 10,0 g 160 g 5,0 g do 50,0 li¬ trów W zestawieniu skladników podano 5% nadmiar w stosunku do ilosci teoretycznie potrzebnych. W celu wytworzenia 50 litrów roztworu preparatu, 35 litrów wody do wstrzykiwania ogrzewa sie w naczyniu ze stali nierdzewnej, zaopatrzonym w plaszcz grzejny, do temperatury 70°C i mieszajac rozpuszcza oba estry kwasu p-hydroksybenzoeso- wego. Nastepnie roztwór chlodzi sie do tempera¬ tury 25—30°C przepuszczajac przez plaszcz zimna wode, przedmuchuje roztwór azotem w ciagu co najmniej 10 minut i w dalszej fazie procesu utrzy¬ muje w atmosferze azotu. Nastepnie w roztworze rozpuszcza sie sól kwasu czterooctowego i kwasny siarczyn sodowy, a na koniec siarczan antybiotyku 66-40. Dodaje sie wody do objetosci 50 litrów i miesza w celu wytworzenia homogenicznego roz¬ tworu. Roztwór ten przesacza sie w warunkach sterylnych przez filtr zatrzymujacy bakterie i prze-80113 13 14 saczem napelnia ampulki sterylizowane i wolne od pyrogenów.Przepis II. Masc antybiotyczna 5 Stapia sie 990 g wazeliny i okolo 100 g wazeliny miesza sie 10 g antybiotyku 66-40 w postaci za¬ sady. Mieszanine przepuszcza sie przez mlyn ko¬ loidalny, dodaje pozostala czesc wazeliny i chlodzi mieszanine do konsystencji pólstalej. Produkt pa- 10 kuje sie w odpowiednie pojemniki.Nizej podane przyklady wyjasniaja blizej sposób prowadzenia fermentacji i wyosabniania antybio¬ tyku 66-40 sposobem wedlug wynalazku.Przyklad I. Fermentacje Micromonospora 15 inyoensis NRRL 3292 przeprowadza sie w zbiorni¬ kach. W pierwszej fazie rozwoju liofilizowana kul¬ ture lub komórki otrzymane ze skosnej kultury M. inyoensis umieszcza sie w warunkach aseptycz- nych w 300 ml kolbie do wytrzasania, zawieraja- 20 cej 100 ml srodowiska o nastepujacym skladzie. 25 30 Hodowle te wytrzasa sie w ciagu 5 dni w tempe¬ raturze 35°C za pomoca wstrzasarki obrotowej o 280 obrotów/min. i suwie 50,8 mm. W drugiej fa¬ zie rozwoju 25 ml hodowli otrzymanej w 1 gazie, wlewa sie w aseptycznych warunkach do kolby 35 wstrzasowej o pojemnosci 2 litry, zawierajacej 500 ml srodowiska sterylnego o wyzej podanym skladzie i wstrzasa w temperaturze 28°C w ciagu 3 dni, stosujacj wstrzasarke o wyzej podanej cha¬ rakterystyce. 43 W stadium fermentacji 500 ml hodowli otrzyma¬ nej w 2 fazie rozwoju, wlewa sie w warunkach aseptycznych do zbiornika fermentacyjnego o po¬ jemnosci 14 litrów, zawierajacego 9,5 litra steryli¬ zowanego srodowiska o nastepujacym skladzie: Ekstrakt wolowy trypton ekstrakt drozdzowy dekstroza skrobia weglan wapniowy woda wodociagowa 3g 5 g 5 g 1 g 24 g 2 g 1000 ml dekstryna dekstroza maczka sojowa weglan wapniowy chlorek kobaltu 45 50 g 5 g 35 g 7g 50 10~6 molowy roz¬ twór w sro¬ dowisku woda wodociagowa 1000 ml emulsja silikonowa GE60 10 ml jako srodek 55 zapobiegajacy pienieniu Przed sterylizowaniem tego srodowiska nastawia sie jego wartosc pH = 8. Fermentacje aerobowa prowadzi sie w ciagu 66—90 godzin, mieszajac za 60 pomoca mieszadla o 250 obr./min. i wprowadzajac na 1 litr cieczy w ciagu 1 minuty 4,5 litra powie¬ trza pod cisnieniem 22,5 atm. Aktywnosc antybio¬ tyku wytwarzanego do konca tego okresu osiaga maksimum 150—225 mikrogramów/ml. i pozostaje 65 wzglednie stala. Wartosc pH srodowiska waha sie* podczas fermentacji w granicach 6,8—7,3, W celu wyosobnienia antybiotyku 66-40 laczy sie brzeczki otrzymane w 17 szarzach prowadzonych w wyzej podany sposób i otrzymuje 170 litrów; brzeczki, do której dodaje sie tyle 6 n kwasu siar¬ kowego, aby uzyskac wartosc pH = 2. Zakwaszona brzeczke miesza sie w ciagu 15 minut i odsacza, przemywajac grzybnie woda, przy czym popluczy¬ ny laczy sie z przesaczem. Zobojetnia sie przesacz 6 n wodorotlenkiem amonowym do wartosci pEt = = 7, dodaje kwasu szczawiowego w celu stracenia wapnia i odsacza. Przesacz zobojetnia sie ponow¬ nie wodorotlenkiem amonowym i przepuszcza przez kolumne z wymieniaczem kationowym, zawieraja¬ ca 1500—2000 preparatu Amberlite IRC-50 w po¬ staci amonowej. Odciek odrzuca sie, a kolumne przemywa woda i eluuje 2 n roztworem wodoro¬ tlenku amonowego. Gromadzi sie frakcje po 400 ml i bada metoda tarczowa, stosujac S. aureus ATCC 6538P. Frakcje aktywne laczy sie i odparowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem otrzymujac 28 £ surowego antybiotyku 66-40 o aktywnosci okolo 500 mikrogramów/g.W celu oczyszczenia surowego antybiotyku 66-40 28 g surowego antybiotyku 66-40, otrzymanego w wyzej podany sposób, rozpuszcza sie w 100 ml de¬ stylowanej wody i wprowadza na kolumne z amo¬ nowym wymieniaczem w postaci hydroksylowej (Dowex 1X2). Kolumna zawiera 2000 g zywicy w postaci zawiesiny wodnej i ma srednice 63,5 mm oraz wysokosc 914,4 mm. Kolumne eluuje sie de¬ stylowana woda z predkoscia 23 ml/min., zbiera sie frakcje po 100 ml i mierzy ich przewodnictwo oraz aktywnosc przeciwko Staphylococus aureus.Pomiar aktywnosci metoda tarczowa umozliwia przyblizony podzial eluatu na frakcje zawierajace antybiotyk i nie zawierajace go. W celu upewnie¬ nia sie, ze frakcje miesza sie wlasciwie, czesc kaz¬ dej frakcji bada sie metoda chromatografii bibu¬ lowej, stosujac dolna faze mieszaniny zawierajacej chloroform, metanol i 17% roztwór wodorotlenku amonowego (2:1:1). Kazda bibule zwilza sie nin- hydryna i eluaty zawierajace podobny material laczy sie i liofilizuje, otrzymujac 5,7 g antybiotyku 66-40 o aktywnosci okolo 900 mikrogramów/mg.Przyklad II. 3,9 g antybiotyku 66-40 w po¬ staci zasady, otrzymanej i oczyszczonej w sposób opisany w przykladzie I, rozpuszcza sie w 60 ml wody za pomoca 6 n kwasu siarkowego zakwasza roztwór do wartosci pH = 4,5. Zakwaszony roz¬ twór miesza sie z weglem aktywnym w ciagu okolo 1k godziny i przesacza. Przesacz dodaje sie do oko¬ lo 1 litra metanolu, odsacza osad i suszy, otrzy¬ mujac 4,8 g siarczanu antybiotyku 66-40 o aktyw¬ nosci okolo 640 mikrogramów/mg.W celu oczyszczenia antybiotyku 66-40 poprzez, jego siarczan, 200 g sproszkowanej, celulozy What- man nr 1 miesza sie z 20 ml górnej fazy uklada rozpuszczalników zawierajacych chloroform, meta¬ nol i 17*/o roztwór wodorotlenku amonowego (2:1:1) i umieszcza w malych segmentach w kolumnie o wewnetrznej srednicy 6,35 mm i wysokosci 508 mnu Dolna faze ukladu rozpuszczalników rozpuszcza sie przez kolumne az ukaze sie zólte pasmo zanieczy-80 113 15 szczen. 2 g siarczanu antybiotyku 66-40, wytworzo¬ nego w wyzej opisany sposób rozpuszcza sie w okolo 3 ml. górnej fazy ukladu rozpuszczalników, miesza z niewielka iloscia sproszkowanej celulozy, suszy pod zmniejszonym cisnieniem i umieszcza w wierzcholku kolumny. Dalsza faze ukladu rozpusz¬ czalników przepuszcza sie przez kolumne z pred¬ koscia 1 ml/min. i zbiera co 15 minut frakcje po 5 ml.Próbki poszczególnych frakcji nanosi sie na bi¬ bule i bada za pomoca odczynnika ninhydryno- wego w celu oznaczenia obecnosci lub braku anty¬ biotyku. Metoda chromatografii bibulowej stwier¬ dza sie, ze zadany antybiotyk znajduje sie w frak¬ cjach 121—190. Frakcje te laczy sie, odparowuje do sucha, pozostalosc rozpuszcza w wodzie i prze¬ puszcza przez anionowy wymieniacz zywiczny IRA 401S w cyklu wodorotlenowym. Do eluatu dodaje sie kwasu siarkowego, az do uzyskania wartosci pH = 4,5, miesza z weglem aktywnym, odsacza i steza do malej objetosci. Otrzymany koncentrat dodaja sie do metanolu uzytego w nadmiarze i odsacza pozostaly bialy osad. Osad ten rozpuszcza sie w wodzie i przepuszcza przez wymieniony wy¬ zej anionowy wymieniacz IRA 401S. Eluat steza sie i liofilizuje, otrzymujac okolo 300 mg antybio¬ tyku 66-40 w postaci zasady o aktywnosci okolo 1000 mikrogramów/mg.Przyklad III. 104,7 g antybiotyku 66-40, otrzymanego w sposób podany w przykladzie I, rozpuszcza sie w 4 ml wody i dodaje kwasu sol¬ nego, az do otrzymania wartosci pH = 4,5. Roztwór odparowuje sie do sucha i pozostalosc rozpuszcza sie w metanolu. Do roztworu dodaje sie nadmiar acetonu i odsacza powstaly osad. Otrzymuje sie 130 mg chlorowodorku antybiotyku 66-40 o aktyw¬ nosci 753 mikrogramy/mg.Przyklad IV. Wytwarza sie kolumne chro¬ matograficzna (25X2,5 cm) z zelu krzemionkowego, stosujac jako wywolywacz/eluent dolna faze orga¬ niczna mieszaniny rozpuszczalników skladajacych sie z izopropanolu, chloroformu i wodorotlenku amonowego (1:2:1). W 5,0 ml tej mieszaniny roz¬ puszcza sie 1,0 g zasady antybiotyku 66-40 i chro¬ matografuje na zelu krzemionkowym, zbierajac frakcje po 5,0 ml. We frakcjach tych oznacza sie zawartosc antybiotyku metoda chromatografii cien- 16 10 15 20 30 35 45 45 kowarstwowej na plytkach z zelu krzemionkowe¬ go. Laczy sie frakcje 44-78 i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac bladozólty sy¬ rop, który po azeotropowym przedestylowaniu z etanolem krystalizuje w postaci jasnozóltych roze¬ tek. Otrzymuje sie 650 mg jednowodzianu antybio¬ tyku 66-4Q o temperaturze topnienia 185—190°C.Przyklad V. 5,0 g antybiotyku 66-40 w 60 ml bezwodnego etanolu traktuje sie 5,9 g aldehydu benzoesowego (niewielki nadmiar ponad 5 równo¬ wazników) i utrzymuje w stanie wrzenia w ciagu 1 godziny. Roztwór chlodzi sie i przesacza otrzy¬ mujac 7,0 g bialego produktu krystalicznego o tem¬ peraturze 123—126°C, (a)D260 = +43,2° (C = 0,3% w chloroformie). Analiza elementarna produktu wskazuje obecnosc 5 reszt aldehydu benzoesowego.Postepujac w sposób analogiczny, lecz stosujac zamiast aldehydu benzoesowego równowazna ilosc aldehydu octowego, furfuralu, aldehydu cyklopen- tylooctowego, aldehydu krotonowego, waniliny, al¬ dehydu weratrowego lub pirydoksalu, otrzymuje ^sie odpowietinie produkty kondensacji, które z punktu widzenia budowy chemicznej stanowia prawdopodobnie zasady Schiffa. PL PL