Pierwszenstwo: 77164 S Zgloszenie ogloszono: 30.05.1973 Opis patentowy opublikowano: 10.09.1975 KI. 30h,2/04 MKP C07g 7/00 Twórcy wynalazku: Maria Górna, Barbara Grabarek, Jerzy Strzelecki Uprawniony z patentu tymczasowego: Instytut Przemyslu Miesnego, Warszawa (Polska) Sposób otrzymywania albuminy z krwi zwierzecej Przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania frakcji albuminowej z osocza lub surowicy krwi zwierzecej, a zwlaszcza wolowej, umozliwiajacy uzyskanie albuminy o 100°/o czystosci elektrofore- tycznej.Przyjete ogólnie metody izolacji frakcji bialko¬ wych obieraja sie badz na (kolejnych ekstrakcjach alkoholem w temperaturach ujemnych i przez ste¬ rowanie takimi wielkosciami, jak ipH srodowiska, sila jonowa, stezenie bialka, zdolnosc tworzenia kompleksów z niektórymi metalami dwuwartoscio¬ wymi i itemperaitura pozwalaj]a na uzyskanie po¬ zadanych grup bialek, badz tez na wysalaniu tyich bialek solami nieorganicznymi takimi, jak sierczan amonu ii siarczan sodu w pH srodowiska, okresla¬ jacym punkt izoelektryczny izolowanej frakcji bialkowej.Ek&fcrakcja alkoholem jest -procesem wieloetapo¬ wym, czasochlonnym przebiegajacym w tempera¬ turach —5 do —1,2° co wymaga kosztownych inwe¬ stycji. Stosuje sie równiez do izolacji frakcji bialkowych w szczególnosci do gflobullin z knwi ludzkiej metody laczace w soblie elemenlty ekstrak¬ cji alkoholem ze straceniem niektórych bialek .poprzez tworzenie nierozpuszczalnych kompleksów z cynkiem lub glinem, co przy równoczesnych zmianach pH pozwala na izolowanie poszczególnych frakcji bialkowych.Metody te dotychczas nie zostaly przystosowane do izolacji frakcja bialkowych krwi zwierzat rzez¬ nych, a w postaci oryiginalnej nie pozwalaja na uzyskiwanie czystych preparatów. Natomiast kla¬ syczne metody izolacji albuminy jako jednej z frakcji bialkowych, polegajace na wysalaniu jej 5 z roztworu surowicy krwi lub osocza ludzi i zwie¬ rzat przy okreslonej kwasowosci srodowiska, nie pozwalaja na uzyskanie wysokiego stopnia czys¬ tosci bialka. Dzieje sde rtak dlatego, ze podczas do¬ dawania do roztworu surowicy krwi lub osocza io sold nieorganicznych mimo intensywnego mieszania istnieja wewnetrz roztworu dosc znaczne lokaflne zróznicowania nasycenia, a oo za tym idzie wy- solone globuliny sa zanieczyszczone albuminami, a stracone w pH = 4,5 albuminy sa znacznie za- 15 nieczyszczone alfa, beta i gama globulinamii.Celem wynalazku bylo opracowanie prostego, nie wymagajacegp zlozonej aparatury i ujemnych temperatur sposobu izolowania albuminy z krwi zwierzacej, a zwlaszcza wolowej. Okazalo sie to mozliwe dzieki opracowaniu metody, polegajajcej na izolowaniu albuminy o 1100% czystosci elefetro- foretycznej na drodze oddzielenia 80Vo globulin pojprzez utworzenie ich (nderozpuszczainycih kom¬ pleksów z cynkiem, a nastepnie usuniecie pozo¬ stalych jeszcze w roztworze glównie alfa i beta globulin przez wysolenie ich siarczanem amonu i wreszcie spowodowanie wypadniejcia czystych* albumin z roztworu po ustaleniu pH srodowiska 30 na 4,5. 20 25 77 16477 164 Sposób otrzymywania albuminy z krwi zwierze¬ cej wedlug wynalazku przedstawia sie nasitejpujaco: Do surowicy lub osocza 'krwi wolowej ó tempera* turze od +1 do +14, korzyjatnie +2°, umieszczo¬ nej w reaktorze, dodaje sde soli fizjologicznej w stosunku 1:1, a nastepnie wolno kroplami z roz¬ dzielacza 0,5 M roztwór dwuwodnego octanu cynku, równoczesnie silnie mieszajac. Octan cynku tworzy z globulinami nierozpuszczalne kompleksy. Tworze¬ niu sie ewentualnych kompleksów cynku z ailibu- miinami zapobiega sie przez .ustalenie pH roztworu na 7,4, a wiec w /poblizu punktu izoelektrycznego globulin i tym samym mniejszej ich rozpuszczal¬ nosci. W roztworze nad osadem (globulin pozostaje frakcja albuminowa z domieszka alfa i beta glo¬ bulin. Alfa i beta globuline usuwa sie nastepnie przez wysolenie ich z (roztworu siarczanem amonu w pH zblizonym do 5,4, a wiec w granicach ich punktu izoelektrycznego. W roztworze zawieraj a- cym tylko albuminy po odwirowaniu alfa i beta globulin ustala sie pH na 4,5i, w którym to pH albuminy charakteryzuja sie najmniejsza rozpusz¬ czalnoscia i wyipadaja z roztworu nasyconego w 56% siarczanem amonu. Caly proces wysalania siarczanem amonu przeprowadza sie w tempera¬ turze pokojowej.Osad albumin po odwirowaniu ii wymieszaniu z sola fizjologiczna w stosunku 1:1 poddaje sde dializie wobec soli fizjologicznej, a nastepnie suszy sie ze stanu zamrozenia lub saczy jalowo.(Proces otrzymywania albumin sposobem wedlug wynalazku przeprowadzac mozna przy zastosowaniu zestawu aparaturowego, skladajacego sie z ultra- termiositatu, zaopatrzonego w dwa pojemdiki na staly dwutlenek wegla — jest to chlodzenie I stopnia oraz pompe tloczaca, ultratermostatu i ukladu chlodzacego II istoipnda. Ultratermolstat polaczony jest rurka szklana z ukladem chlodza¬ cym II stopnia, skladajacym sie z szere&u równo¬ legle ulozonych rur szklanych, oblozonych suchym lodem i izolowanych podwójna warstwa styropianu i folii polistyrenowej. Uklad chlodzacy II stoipnia polaczony jest rurka spiralna ze szkla, stanowiaca element chlodzacy reaktora. Reaktor ponadto jest zaopatrzony w mieszadlo mechaniczne i posiada pokrywy z otworami, w których sa zainstalowane dozatory. Reaktor ma odplyw w dnie naczynia.Element chlodzacy reaktora polaczony jest .prze¬ wodem gumowym z ultraitermostatem, co stanowi zamkniety uklad chlodzenia.Albumina zwierzeca, a zwlaszcza wolowa, otrzy¬ mana sposobem wedlug wynalazku, charakteryzuje sie 100% czystoscia eiekitroforetyczna, ma barwe biala i jest calkowicie rozpuszczalna w wodzie 1 soli fizjologicznej]. Wydajnosc procesu waha sie w granicach 50-^55%.Przyklad I. Do trzydziestu iMtarów surowicy lub osocza krwi wolowej o temperaturze +2°, rozcienczonej w stosunku l:il ochlodzona sola fizjologiczna dodano z rozdzielacza wolno po kropli, stale mieszajac, 4 1 ochlodzonego do +2° M dwuwodnego octanu cynku. INastepnie, nie prze¬ stajac mieszac, przez dodatek okolo 1 1 1 M roz¬ tworu nieorganicznego wodorotlenku ustalono pH roztworu na 7,4. W tym stfcftU pozostawiono plyn, 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 wolno mieszajac do nastepnego dnia. iNastepnie odwirowano osad, a ido roztworu dodano z roz¬ dzielacza, silnie mieszajac* nasycony roztwór siar¬ czanu amonu az do osiagniecia 55°/o nasycenia roz¬ tworu, zawierajacego albuminy oraz okolo 20% alfa i beta globulin. Te ostatnie jako charaktery¬ zujace sie mniejsza od albumin rozpuszczalnoscia wypadaja z roztworu szczególnie w pH = 5,4. Pro¬ ces wysalania alfa i beta globulin prowadzono w temperaturze pokojowefj. \Bo odwirowanliu osadu alfa i beta globulin w roztworze poprzez zmiane pH na 4,5 spowodowano wypadniecie osadu albu¬ min. "W tym celu dodawano wolno z wkrapiacza 0,715 1 1 M roztworu kwasu nieorganicznego, np.HC1. Uzyskany osad odwirowano w ciagu 20 minut przy 3000 obrotów na minute. Odwirowany osad wazono, a nastepnie rozcienczano w stosunku liii sola fizjologiczna i w woreczkach z tomofanu dializowano wobec soli fizjologicznej. Po dializie roztwór, zawierajacy okolo 15% bialka frakcji albuminowej, suszono w prózni ze stanu zamroze¬ nia* iWi celu zapewnienia prawidlowego przebiegu wyzej opisanego procesu technologicznego przepro¬ wadzono go, umieszczajac surowice lub osocze krwi wolowej rozcienczone sola fizjologiczna w reak¬ torze o pojemnosci 1100 1, wyposazonym w miesza¬ dlo mechaniczne oraz spirale z rurki szklanej, przez która przeplywala mieszanina chlodzaca, ipozwalajaca na uzyskiwanie w czasie izolacji frakcji •bialkowych temperatur w granicach +2 do + 3° wewnatrz roztworu. iPrzez te spirale iw czasie izolowania frakcji bialawych przeplywal roztwór 10% glicerolu w wodzie. Roztwór glicerolu" byl czesciowo ochlodzony w ultratermostacie, zaopa-" trzonym w dwa pojemniki zawierajace staly dwu¬ tlenek wegla. Z ultratermostatu 10% roztwór glice¬ rolu byl przepomjpowany do systemu równolegle ulozonych rurek ze szkla Simax, oblozonych sta¬ lym dwutlenkiem wejgla i izolowanyich szczelnie od otaczajacej atmosfery dwoma warstwami sty¬ ropianu oraz folia, co omozldwaalo utrzymanie temperatury roztworu glicerolu w granicach —115° w ciagu godzin, nawet po zuzyciu sie stalego dwu¬ tlenku wegla- w pojemnikach ultratermostatu. Roz¬ twór gUicerolu po przeplynieciu przez zestaw rurek oblozonych suchym lodem w pojemniku styropia¬ nowym i po osiajgnieciu —115° splywal dalej rurka szklana* umieszczona wewnatrz rektora, a stano¬ wiaca element chlodzacy reaktora. Z reaktora roz¬ twór glicerolu przewodem wracal do ultratermo¬ statu, gdzie ponownie ulegal schlodzeniu i byl dalej przejpoimpowany opisana juz droga.Przyklad II. Postepowano, jak w przykla¬ dzie I, do momentu otrzymania osadu, zawieraja¬ cego albumine o 100% czystosci elektroforetycznej w postaci nierozpuszczalinego kompleksu z rodni¬ kiem amonowym. Nastepnie osad wazono, roz¬ cienczano sola fizjologticzna w stosunku 1:& i na¬ noszono na kolumne chromatograficzna napelniona amtoeriitem IRC-60 podstawionyim sodem. Po prze¬ puszczeniu przez kolumne rozpuszczalna albumine poddawano procesowi suszenia ze stanu zamroze¬ nia w prózni77 164 /" Przyklad IH. Postepowano, jak w przykla¬ dzie I, do momentu otrzymania 15% roztworu roz¬ puszczalnych albumin o IDO0/© czystosci ele!ktro- foretycznej, a nastepnie otrzymany roztwór saczono jalowo. PL