PL71105B1 - - Google Patents

Description

Uprawniony z patentu: Eli Lilly and Company, Indianapolis (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób wytwarzania nowego antybiotyku A16886 Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego antybiotyku, oznaczonego symbolem A16886 lub jego dopuszczalnych w farmacji soli.Podczas fermentacji szczep Streptomyccs clavuligarus produkuje nowa substancje antybiotyczna, oznaczo¬ na w niniejszym opisie jako antybiotyk A16886. Jego sole otrzymuje sie bez trudu w reakcji z odpowiednim kwasem lub zasada. Antybiotyk A16886 i jego solc wykazuja aktywnosc przeciwbakteryjna i dzialanie przeciw- robacze. Dzialanie przeciwbakteryjne dotyczy przede wszystkim bakterii Gram-ujemnych oraz w pewnym stopniu takze Gram-dodatnich. Antybiotyk A16886 jest takze skuteczny w zwalczaniu chorób roslin pochodze¬ nia bakteryjnego.W szczególnosci wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania antybiotyku A16886 lub jego dopuszczalnych w farmacji soli, który to proces polega na hodowaniu szczepu Streptomyces clavuligerus NRRL 35 85 na pozywce, zawierajacej przyswajalne zródla wegla, azotu i soli nieorganicznych w hodowli glebinowej z napowie¬ trzaniem do otrzymywania znacznych ilosci antybiotyku A16886, po czym wyodrebnia sie go w postaci kwasu lub soli i ewentualnie sól rozdziela na czynniki A168861 i Al 6288611 ^v postaci soli lub kwasów.Antybiotyk Al6886 jest produkowany podczas hodowli nowego szczepu, wyizolowanego z próbek gleby pochodzacej z Poludniowej Ameryki.Drobnoustrój izolowano, zawieszajac porcje próbek gleby w jalowej wodzie destylowanej i nastepnie nanoszac otrzymana zawiesine na pozywke agarowa. Zakazone plytki z agarem inkubowano przez kilka dni w temperaturze 25-35°C. Po zakonczeniu inkubacji kolonie szczepu, produkujacego antybiotyk Al6886, przenoszono przy uzyciu jalowego kólka platynowego na skosy agarowe, które inkubowano celem otrzymania odpowiedniej ilosci inokulum do produkcji antybiotyku Al 6886.V Promieniowiec uzyty zgodnie ze sposobem wedlug wynalazku trudno jest zaklasyfikowac do rodzaju Streptomyces z powodu jego nietypowej morfologii sporoforów. Jednak dane otrzymane z analizy sciany komórkowej wskazuja, ze szczep ten powinien byc uwazany za gatunek z rodzaju Streptomyces. W zwiazku z tym drobnoustrój zostal potraktowanyjako nowy gatunek i otrzymal nazwe Streptomyces clavuligerus.Szczep charakteryzuje sie wytwarzaniem grzybni powietrznej w postaci krótkich, sympodialnie rozgalezio¬ nych strzepek, które ewentualnie dziela sie na zespoly spor. Tworza sie krótkie maczugowate galezie boczne,2 71 105 który zwykle wytwarzaja od 1 do 4 spor. Konidia nie sa wytwarzane w grzybni podstawowej. Fotografia w mikroskopie elektronowym wykazuje gladkoscienne spory. Hydrolizaty sciany komórkowej zawieraja kwas L,L-dwuaminopimelinowy i glicyne obok glównych skladników kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego i alaniny. Spory sa azare en masse, a grzybnia podstawowa ma barwe od bladozóltej do zólto-brazowej. Pigmenty rozpuszczalne nie sa wytwarzane. Optymalna temperatura hodowli wynosi od 26 do 30°C, powyzej 37°C brak wzrostu. Morfologicznie hodowla ta przypomina pewne szczepy Thermonospora i Micromonospora.Nowy szczep zdolny do wytwarzania antybiotyku Al6886 zostal przekazany do depozytu w Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, US. Department of Agriculture (dawniej Northern Regional Research Laboratories), Peoria, Illinois, 61604 i jest powszechnie dostepny pod numerem NRRL 35 85.Charakterystyke szczepu Streptomyces clavuligerus NRRL 35 85 podano w tablicy 1, poslugujac sie przy tym metodami charakteryzowania promieniowców zalecanymi przez International Streptomyces Projekt (Shirling i inni, „Methods for Characterization of Streptomyces Species", Intern. Buli. Systemie Bacteriol. 16, 313, 1966) oraz pewnymi dodatkowymi testami. Do okreslania barw zastosowano metode ISCC-NBS, opisana przez Kelly*ego i in. w The ISCC-NBS Method of Designating Colours and a Dictionary of Colour Names (U.S.Department of Commerce Circ. 553, Washington, D.C. 1955). Oznaczenia w nawiasach zwyklych odnosza sie do serii barw wedlug Tresnera i Backusa (Tresner i in., „System of Colour Wheela for Streptomyces Taxonomy", Appl. Microbiol. 11, 335, 1968) a symbole barw sa podkreslone. Symbole w nawiasach kwadratowych dotycza oznaczenia barw wedlug Maerz'a i Paula (Maerz i in., Dictionary of Colour, Mc Graw—Hill Book Co. Inc., New York, 1960). Szczep hodowano w ciagu 14 dni w temperaturze 30°C, o ile nie podano inaczej.W tablicy 2 przedstawiono wyniki badan zdolnosci wykorzystywania zródel wegla przez szczep NRRL 35- 85.Zastosowano nastepujace oznaczenia: + wzrost i przyswajanie — brak wzrostu, brak przyswajania (+) prawdopodobne przyswajanie (—) watpliwe przyswajanie ;¦ Antybiotyk Al6886 jest produkowany podczas hodowli szczepu NRRL 35 85 przy uzyciu róznego typu pozywek. Z wyników testu, przedstawionego w tablicy 2, widac jednak, ze drobnoustrój jest zdolny do przyswajania tylko kilku zródel wegla w warunkach sztucznej hodowli. Dla znajacych zagadnienie jest oczywistym, ze drobnoustrój hodowany w kompletnej pozywce moze przyswajac wegiel takze ze zródel, które w sztucznych warunkach hodowli sa nieprzyswajalne. Jednak ze wzgledów ekonomicznych, dla uzyskania maksymalnej wydajnosci antybiotyku oraz dla uproszczenia izolacji korzystnym jest uzywanie kilku wzglednie prostych substancji, do których np. naleza latwo przyswajalne zwiazki takie, jak glukoza, skrobia, gliceryna, melasa, dekstryna i podobne.Korzystnymi zródlami wegla sa glukoza i gliceryna. Jako przyswajalne zródla azotu mozna stosowac make sojowa, wyciag namokowy kukurydzy, make z nasion bawelny, wyciag wolowy, pepton miesny lub sojowy, kazeine, mieszanine aminokwasów i podobne. Korzystne jest stosowanie peptonów, maki sojowej, mieszaniny aminokwasów i podobnych. Do soli nieorganicznych, wchodzacych w sklad pozywki, naleza pospolite sole, zawierajace jony sodowe, potasowe, amonowe, wapniowe, fosforanowe, siarczanowe, chlorkowe, weglanowe ipodobne. .Do pozywki mozna równiez dodawac mikroelementy, niezbedne dla optymalnego wzrostu i rozwoju szczepu, produkujacego antybiotyk Al6886. Zazwyczaj jednak sladowe ilosci tych pierwiastków towarzysza w postaci zanieczyszczen innym skladnikom pozywki w ilosciach, wystarczajacych na pokrycie zapotrzebowania podczas hodowli promieniowca, stosowanego zgodnie ze sposobem wedlug wynalazku.Wyjsciowa wartosc pH pozywki moze byc rózna, stwierdzono jednak, ze powinna wynosic od 6,5 do 7,2.Podobnie, jak w przypadku innych promieniowców, wartosc pH pozywki wzrasta stopniowo podczas hodowli drobnoustroju i produkcji antybiotyku, osiagajac wartosc od 6,7 do 7,5 lub nawet wyzsza. Koncowa wartosc pH zalezy, przynajmniej czesciowo, od jego wartosci poczatkowej, buforów znajdujacych sie w pozywce i czasu hodowli szczepu.Warunkami z wyboru dla wytwarzania antybiotyku A16886 jest hodowla glebinowa z napowietrzaniem.W celu otrzymania wzglednie niewielkich ilosci antybiotyku mozna poslugiwac sie hodowla powierzchniowa na trzesawkach, natomiast do produkcji w wiekszej skali korzystna jest fermentacja glebinowa z napowietrzaniem prowadzona w jalowych fermentorach. Pozywka w fermentorze moze byc zaszczepiana zarodnikujaca postacia szczepu lecz z doswiadczenia wiadomo, ze nastepuje wtedy opóznienie wzrostu, bardziej korzystnym jest wiec71 105 3 stosowanie postaci wegetatywnej szczepu. Pozwala to na lepsze wykorzystywanie urzadzen fermentacyjnych.W zwiazku z tym najpierw przygotowac nalezy inokulum wegetatywne przez zaszczepienie stosunkowo malej ilosci pozywki zarodnikujaca postacia szczepu. Otrzymane mlode, aktywne inokulum wegetatywne przenosi sie w sposób jalowy do duzego fermentora. Pozywka dla hodowli wegetatywnej moze byc taka sama lub inna, niz pozywka produkcyjna.Drobnoustrój, produkujacy antybiotyk A16886, mozna hodowac w szerokim zakresie temperatur od 25 do 37°C, ale optymalna wydajnosc antybiotyku otrzymuje sie w granicach temperatur od 26 do 30°C. Maksimum antybiotyku produkowane jest miedzy 36 i 72 godzina od momentu zaszczepienia.¦' Jak zwykle, podczas hodowli glebinowej z napowietrzaniem przez pozywke w fermentorze przepuszcza sie powietrze w ilosci 0,2-0,4 objetosci na objetosc pozywki w ciagu.jednej minuty, korzystnie 0,40 objetosci.Stezenie wytwarzanego w czasie fermentacji antybiotyku moze byc z latwoscia kontrolowane w brzeczce przez oznaczanie dzialania hamujacego wzrost drobnoustrojów wrazliwych 'na A16886. Do szczepów takich naleza E.coli, Salmonella gallinarum i Pseudomonas solanacearum. Oznaczenia wykonuje sie metoda turbidyme- tryczna lub cylinderkowo-plytkowa.Z reguly maksimum wytwarzania antybiotyku obserwowano po 1 do 3 dni po zaszczepieniu, dotyczy to zarówno procesu prowadzonego na trzesawce,jak i w fermentorze.Antybiotyk Al6886, wyprodukowany w procesie fermentacji, znajduje sie w brzeczce fermentacyjnej.Zastosowana w sposobie wedlug wynalazku technika izolacji pozwala na maksymalny odzysk antybiotyku z brzeczki. Grzybnie i nierozpuszczalne substancje stale usuwa sie z brzeczki, stosujac zwykle metody w rodzaju saczenia lub wirowania. Z przesaczonej lub odwirowanej brzeczki odzyskuje sie antybiotyk, stosujac technike ekstrakcyjna lubabsorpcyjna. * W technice adsorbcyjnej stosuje sie rozmaite adsorbenty, np. zel krzemionkowy, wegiel, tlenek glinu, mikrokrystaliczna celuloze oraz zywice jonowymienne. Antybiotyk A16886 otrzymuje sie w zaleznosci od warunków prowadzenia fermentacji albo w postaci amfoterycznej albo w postaci soli, niezaleznie jednak od postaci moze byc on adsorbowany z odpowiedniego roztworu na jednym z wymienionych lub podobnych adsorbentów, a pózniej eluowany przez przemywanie odpowiednim rozpuszczalnikiem. Jesli do elucji uzywa sie roztworów np. roztworu mrówczanu amonowego lub octanu sodowego, otrzymuje sie w efekcie sól amonowa lub sodowa antybiotyku. Sole te mozna z latwoscia rewertowac do wolnego antybiotyku.Inne sole, poza amonowa i solami metali alkalicznych, otrzymuje sie w zwykly sposób w reakcji wolnego antybiotyku z odpowiednimi kwasami lub zasadami. Dla otrzymania wiec kwasowych soli addycyjnych antybiotyk poddawany jest reakcji z kwasami organicznymi lub nieorganicznymi takimi, jak kwas solny, bromowodorowy, jodowodorowy, siarkowy, fosforowy, octowy, benzoesowy, sulfamowy, cytrynowy, maleino¬ wy, bursztynowy, askorbinowy i glikolowy.Antybiotyk A16886 tworzy równiez solc z kationami w reakcji z zasadami organicznymi oraz solami. Moga to byc np. sole amonowe, podstawione sole amonowe, sole metali alkalicznych takich, jak sód, potas, lit, cez i rubid; sole metali ziem alkalicznych takich, jak wapn, stront, bar oraz sole miedzi, cynku, magnezu i srebra. Jesli idzie o zasady organiczne, to chociaz ich rodzaj nie jest istotny, korzystnymi sa zasady, wykazujace w roztworze wodnym wartosc pH = 3 lub wyzsza. Do takich zasad naleza miedzy innymi benzyloamina, metyloamina, dwuetyloamina, trójetyloamina, prokaina, dwuizopropyloamina, etanoloamina, cykloheksyloamina, dwucyklo- heksyloamina, dwufenyloamina, dwu-n-butyloamina, chinolina i pirydyloamina.Na ogól w stosowaniu farmaceutycznym bardziej korzystne sa dopuszczalne w farmacji sole, niz wolny antybiotyk A16886. Sa one równiez korzystne jako produkty przejsciowe podczas produkcji, izolacji i oczyszcza¬ nia antybiotyku. W terapii dopuszczalne w farmacji sole sa na ogól równowazne, jesli idzie o dzialanie, wolnemu antybiotykowi A16886, niektóre jednak z nich sa szczególnie korzystne dzieki swoim specyficznym wlasciwos¬ ciom, np. lepszej rozpuszczalnosci, zwiazanej z wprowadzeniem reszty, tworzacej sól.Antybiotyk A16886 nalezy do grupy- antybiotyków peptydowych, posiada charakter amfoteryczny i w czasteczce zawiera siarke. Podobnie, jak w przypadku innych drobnoustrojów, produkujacych antybiotyki podczas fermentacji szczepu Streptomyces clavuligerus NRRL 3583 otrzymuje sie mieszanine kilku substancji antybiotycznych zwanych „czynnikami". Antybiotyk Al6886 sklada sie z dwóch glównych substancji antybio- typznych, nazwanych przez nas antybiotykiem Al68861 i antybiotykiem A16886II lub czynnikiem I i czynni¬ kiem II. Podczas niektórych fermentacji obserwowano takze powstawanie minimalnych ilosci innych antybioty¬ ków, których jednak nie izolowano i nie badano. W dalszej czesci opisu okreslenie antybiotyk Al 6886 bedzie uzywane w stosunku do antybiotyku otrzymywanego w procesie fermentacji i zawierajacego od 1 do 99% czynnika 1,99% do 1% czynnika II oraz minimalne ilosci innych antybiotyków. W zwiazku z tym w rozwazaniach dotyczacych metod wytwarzania i sposobów stosowania termin antybiotyk A16886 oznacza zarówno poszczegól¬ ne czynniki, jak tez ich mieszaniny, gdyz wlasciwosci poszczególnych czynników i ich mieszanin sa podobne.4 71 105 Antybiotyk Al6886 mozna stosowac równiez w postaci soli np. addycyjnych soli z kwasami lub soli z kationami, w drugim przypadku moga to byc sole pojedyncze lub podwójne. Czesto jest korzystnym otrzymywanie soli bezposrednio podczas procesu oczyszczania i izolowanie antybiotyków w postaci soli.Antybiotyk A16886 izoluje sie w postaci soli jednoamonowej i dlatego podano charakterystyke tej postaci.Mieszanine czynników I i II poddano rozmaitym badaniom. Miedzy innymi przeprowadzono szereg jakosciowych testów chemicznych mieszaniny soli jednoamonowych czynników I i II uzyskujac dodatnie wyniki prób z odczynnikami: ninhydrynowym, Pan Dutscher'a, Benedicfa, Molisch'a, Fehlinga, chlorkiem dansylu, jodem i chlorkiem zelazowym oraz negatywne wyniki testu biuretowego iSakaguchi. Mieszanina soli jednoamo¬ nowych czynników I i II suszona pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze pokojowej nad bezwodnym chlorkiem wapniowym w ciagu okolo 15 godzin wykazywala skrecalnosc wlasciwa (a)2rj, wynoszaca +110,1°. (c = 1, woda). Mieszanina taka byla trwala w zakresie wartosci pH = 3—8 w temperaturze 6°C w ciagu 8 dni oraz wzglednie trwala w temperaturze 25°C wciagu 2 dni. Aktywnosc biologiczna w temperaturze 25°C i przy wartosci pH od 3 do 8 spadla w ciagu czterech dni do polowy.Antybiotyk Al6886 w postaci soli jednoamonowej mozna rozdzielic na czynniki I i II, nanoszac roztwór antybiotyku A16886 w mieszaninie acetonitrylu z woda na kolumne chromatograficzna wypelniona celuloza.Kolumne eluuje sie mieszanina acetonitrylu z woda i kontroluje sie zawartosc kazdego z czynników w odbiera¬ nych frakcjach. Frakcje, zawierajace czynnik I, i frakcje, zawierajace czynnik II, laczy sie oddzielnie i liofilizuje.Otrzymuje sie liofilizaty A16886I i A16886II w postaci soli jednoamonowych.Sól jednoamonowa antybiotyku A168861 posiada nastepujaca charakterystyke: biala, puszysta, bezposta¬ ciowa substancja, topniejaca w zakresie temperatur 190—300°C ze zmiana barwy na ciemnobrazowa; dobrze rozpuszczalna w wodzie, slabo rozpuszczalna w nizszych alkoholach, nierozpuszczalna w acetonitrylu; charakter amfoteryczny, posiada cztery dajace sie miareczkowac grupy, których pKa wynosza odpowiednio: pKai = 4,1; pKa2 = 5,2; pKa3 = 9,3 ipKa4 = 10,5; ciezar czasteczkowy, obliczony na podstawie miareczkowania wynosi okolo 530; czasteczka sklada sie z 40,26% wegla, 5,94% wodoru, 13,98% azotu, 33,37% tlenu i 7,21% siarki; skrecalnosc wlasciwa (a)b5 wynosi +153,6°C (C = 1, woda); w widmie w podczerwieni w postaci zawiesiny w nujolu wystepuja wyrazne pasma absorpcji przy dlugosci fali 3,10; 5,68; 6,30; 6,60; 7,20; 7,60; 8,80; 9,35; 9,60; 9,85; 11,60 i 12,90 mikronów.Sól jednoamonowa antybiotyku A16886 posiada nastepujaca charakterystyke: biala, puszysta, bezposta¬ ciowa substancja, topniejaca w zakresie temperatur od 190 do 300°C ze zmiana barwy na ciemnobrazowa; dobrze rozpuszczalna w wodzie, slabo rozpuszczalna w nizszych alkoholach, nierozpuszczalna w acetonitrylu: charakter czasteczki amfoteryczny z czterema dajacymi sie miareczkowac grupami, których pKa wynosza odpowiednio: pKa! = 4,1; pKa2 = 5,2; pKaj = 9,3 oraz pKa4 = 10,5; ciezar czasteczkowy, wyliczony na podstawie miarecz¬ kowania, wynosi okolo 528; czasteczka sklada sie z 41,01% wegla, 5,60% wodoru, 15,75% azotu, 29,28% tlenu i 7,04% siarki, skrecalnosc wlasciwa (a)2rj wynosi +86,2°C (C = 1, woda); w widmie w podczerwieni w zawiesi¬ nie w nujolu wystepuja wyrazne pasma absorpcji przy dlugosci fali 3,15; 5,70; 6,30; 7,22; 7,64; 9,05; 9,40; 9,65 i 11,60 mikronów.Jednoczesnie sole jednoamonowe czynników I i II byly badane indywidualnie w sposób opisany powyzej.Podane uprzednio wartosci skrecalnosci wlasciwej soli jednoamonowych antybiotyków A16886I i A16886II dotycza soli, suszonych pod obnizonym cisnieniem, w temperaturze pokojowej nad bezwodnym chlorkiem wapniowym wciagu okolo 15 godzin. Miareczkowanie potencjometryczne wykonywano w 66% roztworze wodnym dwumetyloformamidu przy poczatkowej wartosci pH, wynoszacej 6,50.Do analizy elementarnej brano sole jednoamonowe antybiotyków A168861 iA16886II suszone pod obnizonym cisnieniem, w temperaturze okolo 80°C nad pieciotlenkiem fosforu. Antybiotyk A168861 zawiera 5,02% grup metoksylowych, których obecnosc zostala potwierdzona obecnoscia w widmie magnetycznego rezonansu jadrowego singletu przy 3,53 ppm. Zawartosc azotu aminowego w A168861, oznaczona metoda Van Slyke'a, wynosi 5,3%.Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego antybiotyku Al 68861 wD20 wykazuje nastepujace ugrupo¬ wania sygnalów: jednoprocentowy singlet przy 5,19 ppm., dwuprotenowy kwartet J^b = 13 Hz przy 4,94 ppm i 4,74 ppm, jednoprotonowy multiplet przy 4,0-4,2 ppm, dwuprotonowy kwartet Jab = 18 Hz przy 3,68 ppm i 3,32 ppm, trzyprotonowy singlet przy 3,53 ppm, dwuprotonowy multiplet przy 2,6—2,4 ppm i czteroprotono- wy multiplet przy 2,1 -1,6 ppm.Widmo absorpcyjne w podczerwieni soli jednoamonowej A168861 w zawiesinie w nujolu przedstawione jest na rysunjcufig. 1.Widmo w nadfiolecie roztworu wodnego Al68861 wykazuje maksimum absorpcji przy dlugosci fali 242 an/i (Ei cm **'132) i 264 m/i (Ej c„ = 165). Pomiary dichroizmu kolowego, wykonywane w roztworze wodnym, wykazuja dodatni efekt Cottona przy dlugosci fali 263 m/i oraz ujemny przy 236 m/i.71 105 5 Wartosc Rp soli jednoamonowej A168861 podczas chromatografii na bibule Whatman 1, w ukladzie propanol, acetonitryl, woda (1:1:1) wynosi 0,41. Bioautograf wykonywano umieszczajac chromatogram bibulowy na plytach z agarem zakazonym szczepem testowym Salconella gallinarum.Chromatografie cienkowarstwowa wykonywano na dwóch typach nosników. Dla zelu krzemionkowego i 70% roztworu wodnego acetonitrylu jako ukladu rozwijajacego wartosc Rp wynosi okolo 0,51, dla celulozy i ukladu acetonitryl, izopropanol, woda (1 :1 :1) Rp = 0,36. W obu przypadkach plytki wywolywano odczyn¬ nikiem ninhydrynowym. « Analiza skladu aminokwasowego kwasnego hydrolizatu antybiotyku Al68861, wykonana metoda Spack- mana, Moore*a i Steina, wykazala obecnosc dwóch reagujacych z ninhydryna skladników, z których jeden po eluacji zidentyfikowano jako glicyne (0,61 jM./mg), drugi zasjako kwas a-aminoadypinowy (1,97 juM/mg).Miareczkowanie potencjometryczne solijednoamonowej antybiotyku A16886II w 66% roztworze wodnym dwumetyloformamidu przy poczatkowej wartosci pH, wynoszacej 7,7 wykazala obecnosc czterech dajacych sie miareczkowac grup o pKai = 4,4; pKa2 = 5,7; pKa3 = 9,6 oraz pKa^ = 10,4. Podczas miareczkowania przy pH poczatkowym równym 6,8 odpowiednie wartosci wynosily: pKai = 4,0; pKa2 = 5,3; pKa3 = 9,2 i pKa4 = 10,5.Analiza soli jednoamonowej A16886II nie wykazala obecnosci grupy metoksylowej, w przeciwienstwie do czynnika I nie stwierdzono takze sygnalu, odpowiadajacego tej grupie w widmie magnetycznego rezonansu jadrowego. Zawartosc azotu aminowego, oznaczona metoda Van Slyke'a, wynosi 5,1%.Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego antybiotyku A16886II w D2 O wykazuje nastepujace ugrupo¬ wania sygnalów: jednoprotonowy dublet J = 5 Hz przy 5,67 ppm, jednoprotonowy dublet J = 5 Hz przy 5,15 ppm, dwuprotonowy kwartet J^b = 13 Hz przy 4,90 ppm i 4,68 ppm, jednoprotonowy multiplet przy 3,9—3,7 ppm, dwuprotonowy kwartet Jab = 18 Hz przy 3,69 ppm i 3,99 ppm, dwuprotenowy multiplet przy 2,6—2,3 ppm oraz czteroprotonowy multiplet przy 2,1-1,5 ppm.Widmo absorpcyjne w podczerwieni zawiesiny soli jednoamonowej A16886II w nujolu przedstawiono na rysunku fig. 2.Widmo w nadfiolecie roztworu wodnego A16886II wykazuje maksimum absorpcji przy dlugosci fali 260 ix (Ei - 148). Pomiary dichroizmu kolowego, wykonane w roztworze wodnym, wykazaly dodatni efekt Cottona przy dlugosci fali 258 m/i oraz ujemny przy 228 m/i.Wartosc Rp soli jednoamonowej antybiotyku A16886II podczas chromatografii na bibule Whatman 1 w ukladzie propanol, acetonitryl, woda (1:1:1) wynosi 0,33. Bioautograf wykonywano umieszczajac chroma¬ togram bibulowy na plytkach z agarem zakazonym szczepem testowym Salmonella gallinarum.Wartosc Rp podczas chromatografii cienkowarstwowej na plytkach, pokrytych zelem krzemionkowym i rozwijanych 70% roztworem wodnym acetonitrylu, wynosi 0,42, zas w przypadku zastosowania jako nosnika celulozy oraz ukladu rozwijajacego zawierajacego acetonitryl, izopropanol i wode (1 :1 : 1) Rp = 0,29. W obu przypadkach plytki wywolywano odczynnikiem ninhydrynowym lub wykonywano bioautograf.Analiza skladu aminokwasowego kwasnego hydrolizatu antybiotyku A16886II, wykonywana metoda Spackmana, Moore'a i Steina, wykazala poczatkowo obecnosc jednego tylko skladnika reagujacego z ninhydryna i zidentyfikowanego po elucji jako kwas a-aminoadypinowy (2,1 jitM/mh). Zaobserwowano jednak takze bardzo male maksimum absorpcji nalezace do skladnika, który eluowal sie identycznie, jak glicyna. W nastepnej próbce analizowanej w identyczny sposób stwierdzono zawartosc pierwszego skladnika 2,1 juM/mh i drugiego 0,13juM/mg.Dodatkowo oba czynniki I i II w postaci soli jednoamonowych poddawano chromatografii bibulowej i cienkowarstwowej wykorzystujac szereg* dalszych ukladów rozwijajacych i uzyskujac wyniki podane w tabli¬ cy XIV.Antybiotyk Al6886 i jego sole wykazuja dzialanie hamujace wzrost zarówno bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych. Stezenia, przy których antybiotyk A16886 w postaci czesciowo oczyszczonej mieszaniny soli jednoamonowych czynnika I i II wykazuje dzialanie hamujace wzrost róznych drobnoustrojów, podane sa w tablicy 3. Stezenia hamujace, oznaczone metoda plytkowa lub metoda rozcienczeniowa, oznaczono odpowied¬ nio symbolami „m.p." lub „nur.".W metodzie plytkowej badany drobnoustrój nanoszono na serie plytek z agarem, zawierajacym rózne stezenia antybiotyku A168861 1AI6886II w postaci soli jednoamonowych i oznaczano minimalne stezenie hamujace wzrost drobnoustrojów w mikrogramach na milimetr w podlozu agarowym, w okresie 48 godzin lub w przypadku mikroorganizmów, wywolujacych choroby roslin w czasie 72 godzin.W metodzie rozcienczeniowej serie probówek, zawierajacych rózne stezenia solijednoamonowych czynni¬ ków I i II zakazono badanym drobnoustrojem i oznaczono najmniejsze stezenie hamujace (wmog/ml) wzrost drobnoustroju w podlozu plynnym w ciagu okolo 20 godzin.6 71 105 W zadnym z powyzszych testów nie zaobserwowano wiazania sie antybiotyku z surowica konska. Jak wynika z tablicy 3, antybiotyk Al6886 w postaci mieszaniny soli jednoamonowych czynnika I i II wykazuje dzialanie hamujace w stosunku do bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych.Dzialanie przeciwbakteryjne antybiotyku Al 6886 oznaczano takze metoda krazkowa dyfuzji w agarze wedlug Beuera-Kirbye'go. Badaniu poddano oddzielnie sole jednoamonowe czynnika I i II. Tablica 4 przedstawia wyniki testu, wyrazone w podanej w milimetrach wielkosci strefy zahamowania dla danego stezenia.Antybiotyk Al 6886 i jegp sole wykazuje równiez dzialanie hamujace wzrost wielu powyzszych drobno¬ ustrojów in vivo i jest dlatego uzyteczny wleczeniu zakazen, wywolanych przez nie u zwierzat nosicieli pasozytów. Toksycznosc antybiotyku dla ssaków jest. niska LD5 0 wynosi wiecej niz 5 g/kg. Codzienne podawanie podskórne 350mg/kg grupie 10 szczurów nie spowodowalo wciagu 14dni zadnego wypadku smiertelnego ani zauwazalnych objawów zatrucia. Antybiotyk Al 6886 w postaci mieszaniny jednoamonowych soli czynników I i II wykazuje nastepujace wartosci EDS0 u myszek, zakazonych róznymi drobnoustrojami: Antybiotyk A16886 ijego sole wykazuje dzialanie przeciw bakteriom wywolujacym choroby roslin i moze byc stosowany do leczenia takich chorób, jak powodowane przez bakterie wiedniecie i opadanie lisci, sniec oraz bakteryjna chorobe plamista lisci.Sposób stosowania antybiotyku w ochronie roslin moze byc rozmaity. Zazwyczaj pierwsze zetkniecie drobnoustrojów z roslina odbywa sie za posrednictwem lisci, stad korzystne jest czeste podawanie antybiotyku ta droga. Antybiotyk A16886 ijego sole sa jednak wchlaniane przez rosliny i dlatego mozna go podawac do galezi, kwiatów, nasion, korzeni i innych czesci, uzyskujac efekt bakteriobójczy w calej roslinie.Zwalczanie bakterii, wywolujacych choroby roslin, polega na podawaniu skutecznych ilosci antybiotyku.Bez znaczenia jest przy tym, czy stosuje sie osobno poszczególne czynniki, bowiem zarówno mieszanina, jak i kazdy z czynników I i II, uzyte osobne daja dobre wyniki. Antybiotyk Al 6886 lub jego sole mozna stosowac bezposrednio w postaci substancji, na ogól jednak korzystne jest dla zwalczania bakteryjnych chorób roslin stosowanie kompozycji antybiotyku z jednym lub wiecej adjuwantami. Takwiec antybiotyk lub jego sole mozna podawac w roztworach z woda lub innymi nosnikami cieklymi, rozpuszczalnymi organicznymi, cieklymi lub stalymi srodkami powierzchniowo czynnymi, obojetnymi dobrze sproszkowanymi lub granulowanymi stalymi nosnikami. Stezenie antybiotyku nie jest wielkoscia krytyczna i moze sie zmieniac w zaleznosci od przeznacze¬ nia. Na ogól do zwalczania typowych zakazen bakteryjnych u roslin przez podawanie antybiotyku do lisci, dobre wyniki otrzymuje sie przy stezeniu od 10 do 1000 i wiecej promili. W przypadku uzycia postaci pylistej korzystne stezenie wynosi 0,1—1%.W celu przygotowania kompozycji plynnych antybiotyk A16886 lub jego sole mozna mieszac z odpowied¬ nimi nosnikami cieklymi i emulgatorami, otrzymujac w ten sposób dajace sie emulgowac koncentraty, które przed uzyciem rozciencza sie woda lub innymi rozpuszczalnikami, uzyskujac mieszaniny do spryskiwania. Do korzystnych srodków emulgujacych naleza emulgatory niejonowe takie, jak produkty kondensacji tlenków alkilenowych z kwasami nieorganicznymi, pochodne polioksyetylenowe estrów sorbitolu, kompleksy eterów z alkoholami i podobne. Do rozpuszczalników organicznych, stosowanych do przygotowywania kompozycji, naleza miedzy innymi oleje mineralne lub ich poszczególne skladniki, toluen lub syntetyczne oleje organiczne.Substancje powierzchniowo czynne sa uzywane zazwyczaj w ilosci 0,1—20% wagowych w stosunku do ciezaru calej mieszaniny. Do mieszanin pylistych mozna wykorzystywac kazda dobrze sproszkowana lub granulowana substancje, stosowana do innych srodków chemicznych, uzywanych w rolnictwie.Antybiotyk A16886 i jego sole lub odpowiednie kompozyqe moga byc rozpylane w dowolny sposób, np. przy pomocy rozpylaczy recznych lub wysokocisnieniowych. Kompozycje stosowane do spryskiwania lisci nie moga zawierac nawet nieznacznych ilosci rozpuszczalników fitotoksycznyeh. Dla spryskiwania duzych obszarów moga byc stosowane samoloty.W opisanych ponizej badaniach stosowano antybiotyk Al6886 w postaci soli jednoamonowych czynni¬ ków I i II.Badano dzialanie hamujace in vitro wzrost szczepów Erwinia amylovera iPseudomonas solanacearum w nastepujacy sposób. Kazdymi z drobnoustrojów zakazano osobno standartowa pozywke agarowa, która rozlewano na szereg plytek i pozostawiano do zastygniecia. Badania prowadzono róznymi metodami. W pierw¬ szej do dwóch cylinderków stalowych umieszczonych na powierzchni.agaru dodawano po 0,1 ml badanego roztworu, w drugiej zas dwa krazki bibulowe nasycone 0,1 ml badanego roztworu nakladano na powierzchnie agaru. Badany roztwór antybiotyku przygotowywano, rozpuszczajac odpowiednia jego ilosc w wodzie destylowa¬ nej w aparaturze szklanej. Wielkosci afer zahamowania podaje tablica 6.Badano dzialanie antybiotyku A16886 in vivo na Pseudomonas solacacearum na plantacji pomidorów. Do badania przygotowano roztwory wodne, zawierajace 1% etanolu, 0,1% srodka powierzchniowo czynnego71 105 7 (pochodna polioksyetylenowa czesciowo zestryflkowanego kwasem tluszczowym sorbitolu) oraz rózne stezenie antybiotyku po dwie sztuki w donicach. Sadzonki w kazdej donicy opryskiwano jednym z powyzszych roztwo¬ rów, pozostawiono do wyschniecia na powietrzu i zakazano aktywna hodowla Pseudomenas solanacearum.Wszystkie rosliny przetrzymywano w ciagu 24 godzin w komorze wilgotnej, a nastepnie 7 dni w normalnych warunkach. Po zakonczeniu tego okresu wszystkie rosliny przegladano dla oceny stopnia zakazenia. Wyniki przedstawiono w tablicy 7, poslugujac sie skala ocen od 0 do 4, gdzie 0 oznacza calkowity brak dzialania, a 4 calkowite wyleczenie.Jak widac z tablicy 7 w grupie roslin kontrolnych obserwuje sie silne zakazenie Pseudomonas solanacearum. < Badano dzialanie antybiotyku A16886 na Pseudomonas glycinia podczas zanurzania korzeni roslin do roztworu, zawierajacego antybiotyk. Przygotowano w tym celu dwa roztwory o stezeniu antybiotyku A16886 wynoszacym odpowiednio 200 i 400 czesci na milion. Zakazano dziesieciodniowe sadzonki soi szczepem Pseudomonas glycinia, a nastepnie w czasie przeprowadzania doswiadczenia korzenie wszystkich roslin namacza- no w wodnych roztworach antybiotyku. Poczatkowo zakazone rosliny namaczano w 50 ml roztworu, w tym jedna grupe w roztworze o stezeniu 200 czesci na milion, druga w roztworze o stezeniu 400 czesci na milion oraz trzecia grupe kontrolna w wodzie. Korzenie moczono w ciagu 24 godzin, napowietrzajac w tym czasie, roztwór.Nastepnie wszystkie rosliny z korzeniami zanurzonymi w roztworze inkubowano w ciagu 24 godzin. Po wyjeciu z komory inkubacyjnej rosliny przetrzymywano jeszcze przez tydzien. Poczawszy od rozpoczecia inkubacji do konca doswiadczenia podawano roslinom roztwór, zawierajacy skladniki odzywcze niezbedne dla utrzymywania ich przy zyciu. Po zakonczeniu doswiadczenia rosliny obserwowano w celu okreslenia stopnia rozwoju Pseudomonas glycinia. Wyniki przedstawiono w tablicy 8,'poslugujac sie opisana poprzednio skala ocen.Podczas pierwszego doswiadczenia, majacego na celu ocene dzialania Xauthomonas phascoli var. sojensis przy spryskiwaniu lisci, dziesieciodniowe sadzonkj soi zakazano, namaczajac dolne powierzchnie lisci w zawiesi¬ nie, zawierajacej Xanthomonas phaseoli var. sojensis. Dwie godziny pózniej liscie jednej grupy roslin spryskiwano roztworem, zawierajacym antybiotyk Al6886 w stezeniu 100 czesci na milion oraz liscie drugiej grupy roslin roztworem, zawierajacym 500 czesci na milion. Roztwór antybiotyku Al6886 przygotowywano w wodzie z 353 czesciami na milion mieszaniny niejonowych cieklych emulgatorów sulfonowych.W drugim doswiadczeniu liscie dziesieciodniowych sadzonek soi spryskiwano najpierw roztworem, zawierajacym 100 lub 500 czesci na milion antybiotyku Al6886, przygotowanego, jak w doswiadczeniu pierwszym, a dwie fodziny pózniej zakazono równiez w identyczny sposób.Roslinom zapewniono dobre warunki rozwoju w ciagu okolo 11 dni i badano na obecnosc lub brak Xanthomonas phaesolfrar. sojensis. Wyniki podano w tablicy 9, poslugujac sie skala ocen taka, jak podano poprzednio.W celu oceny dzialania na Pseudomonas phaseolica przy spryskiwaniu lisci wszystkie powierzchnie dwudziestodniowych sadzonek fasoli czerwonej spryskiwano wodnym roztworem, zawierajacym 400 czesci na milion antybiotyku Al6886 oraz 0,1% srodka powierzchniowo czynnego (pochodna polieksyetylenowa czescio¬ wo zestryflkowanego kwasem tluszczowym sorbitolu). Po wyschnieciu rosliny zakazano Pseudomonas phaseoli¬ ca, namaczajac dolna powierzchnie jednego listka z kazdego pierwszego i drugiego okólka lisciowego wodna zawiesina bakterii, wykazujaca 30% transmisji mierzonej na spektrofotometrze Spectronic 20 produkcji firmy Bausch i Lomb. Nastepnie rosliny przetrzymywano w ciagu 24 godzin w komorze wilgotnej, a nastepnie wciagu 14 dni zapewniano im dobre warunki rozwoju. Pod koniec tego okresu badano wszystkie rosliny, stwierdzajac' w opryskiwanej grupie umiarkowane zakazenie Pseudomonas phaseolica, podczas gdy w grupie kontrolnej zakazenie to bylo intensywne.W celu oceny dzialania na Pseudomonas selanacearum, przez spryskiwanie lisci lub lodyg przygotowywano wodny roztwór, zawierajacy 353 czesci na milion mieszaniny dwóch niejonowych cieklych emulgatorów sulfonowych oraz 100 lub 400 czesci na milion antybiotyku A16886. Badania prowadzone na dwóch grupach osiemnastodniowych sadzonek pomidorów. Jednej grupie podawano roztwór tylko do lisci, drugiej tylko do lodyg. W dwie godziny pózniej obie grupy zakazono, wprowadzajac wykalaczke namoczona w hodowli Pseudomonas solanacearum do lodygi przy liscieniu. Roslinom zapewniono dobre warunki rozwojowe w ciagu 10 dni i obserwowano wyniki leczenia, które przedstawiono w tablicy 10, poslugujac sie skala ocen taka sama, jak w poprzednich doswiadczeniach.8 71105 Jak juz wspomniano, antybiotyk Al 6886 i jego sole wykazuja obok aktywnosci przeciwbakteryjnej dzialanie przeciwrobacze. Antybiotyk A16886 ijego sole mozna podawac zwierzetom stalocieplnym w celu zwalczania róznych pasozytów wewnetrznych, szczególnie pasozytów zoladka ijelit takich, jak Ascaris lumbricoides var. sum, Nematospiroides dubius, Aspiculurius tetraptera, Syphacia obvelata {podobnych.Podobnie, jak w przypadku aktywnoid przeciwbakteryjnej, dzialanie przeciwrobacze wykazuja oba czynniki zarówno podawane pojedynczo, jak i w mieszance.Antybiotyk A16886 korzystnie jest podawac doustnie np. z pokarmem dla zwierzat w postaci tabletek, plynów itp. Skuteczna dawka podczas kuracji wynosi na ogól od 1 do 500 mg na kilogram wagi ciala zwierzecia.Jefli antybiotyk jest podawany przez dluzszy okres czasu w pokarmie stezenie od 0,01 do 0,05% daje wystarczajaco dobre wyniki. Korzystne stezenie wynosi od 0,01 do 0,05%.W ponizszych doswiadczeniach badano dzialanie przeciwrobacze w antybiotyku Al 6886 podawanego w postaci mieszaniny solijednoamonowych czynników I i II.Antybiotyk A16886 podawano w pojedynczej dawce kazdej "z dwóch myszy, zarazonych Aspiculuris tetraptera i Syphacia obvelata (owsiki). Dawka antybiotyku w postaci zawjesiny w soli fizjologicznej, zawierajacej 0,125% metylocelulozy (czynnik rozpraszajacy), wynosila 500 mg na kilogram wagi ciala. Grupe kontrolna, skladajaca sie z szesciu myszy, zarazano Aspiculuris tetraptera i Syphacia obvelata. Obie grupy pozostawiano na okres 48 godzin w normalnych warunkach hodowlanych, a nastepnie wszystkie myszy zabijano i sprawdzano obecnosc i ilosc owsików. Wyniki przedstawiono w tablicy 11.Antybiotyk Al6886 mieszano ze standartowym pokarmem dla myszy, otrzymujac pokarm o zawartosci antybiotyku, wynoszacej 0,005, 0,01 i 0,05% wagowych. Do doswiadczenia uzywano grupy, skladajace sie z pieciu myszy. Po okolo 24 godzinach po rozpoczeciu karmienia pokarmem, zawierajacym antybiotyk, myszki zarazono Ascaris lumbricoides var. suum. Grupe kontrolna równiez zarazona karmiono pokarmem*, nie zawierajacym antybiotyku. Wszystkie grupy karmiono w ciagu 10 dni, a nastepnie pokarm odstawiono. Jedenas¬ tego dnia wszystkie myszy zabito i badano ich pluca sprawdzajac obecnosc i ilosc uszkodzen wywolanych przez Ascaris lumbicoides var. suum. Wyniki przedstawiono w tablicy 12.Podobne badania przeprowadzono, stosujac inne stezenia antybiotyku. Wyniki przedstawiono w tablicy 13.Sposób wedlug wynalazku zilustrowany jest nastepujacymi przykladami Przyklad!. Otrzymywanie antybiotyku w kolbach na trzesawce.Zarodnikujaca hodowle szczepu Streptomyces clavuligerus otrzymywano na drodze hodowli drobnoustro¬ jów na skosach z pozywka agarowa o nastepujacym skladzie: Dekstryna 10,0 g Ekstraktdrozdzowy 1,0 g Hydrolizat kazeiny (N-Z Amine-TypeA firmy Sheffield Chemical Company) 2,0 g Wyciagwolowy 1,0 g Woda pojonitach 1 latr Dodatkiem wodorotlenku sodowego pH pozywki korygowano do wartosci 7.Skosy agarowe zaszczepiano zarodnikami szczepu Streptomyces clavuligerus NRRL 35 85, inkubowano w ciagu czterech dni w temperaturze 30°C, po czym pokrywano jalowa woda destylowana i delikatnie skrobano celem otrzymania zawiesiny zarodników i komórek w wodzie. 1 ml otrzymanej zawiesiny zaszczepiano porcje po 100 ml podloza dla hodowli wegetatywnej o nastepujacym skladzie: Glukoza 15,0 g Makasojowa 15,0 g Wyciag namokowy kukurydzy 5,0 g Weglan wapnia 2,0 g Chloreksodu 5,0 g Wóda pojonitach 1 litr Wartosc pH pozywki korygowano do 6,7 dodatkiem wodorotlenku sodowego. Inokulum wegetatywne wstrzasano wciagu 24-48godzin na trzesawce wahadlowej (skok 5 cm, 108 wahniec na minute). Tak przygotowane inokulum uzywano do wytwarzania antybiotyku Al6886, Pozywka produkcyjna posiadala nastepujacy sklad:71 105 9 Makasojowa 15,0 g Kazeina 1,0 g Azotansodu 3,0 g 50% syrop glukozy 20,0 g Woda wodociagowa 1 litr Porcje po 100 ml pozywki produkcyjnej umieszczano w kolbach Erlenmeyera o pojemnosci 50.0 ml i sterylizowano w ciagu 30 minut w temperaturze 120°C. Po schlodzeniu kazda kolbe zaszczepiano dodatkiem 5% inokulum wegetatywnego. Fermentacje prowadzono w ciagu 48—72 godzin w temperaturze 25—30°C na trzesawce obrotowej (250 obr/min). Podczas fermentami pozywke napowietrzano 0,4 objetosciami powietrza na minute. « Izolacje prowadzono w poprzednio opisany sposób.Przyklad II. Antybiotyk otrzymywano w sposób, opisany w przykladzie I, uzywajac trzesawke wahadlowa (108 wahniec na minute) i stosujac nastepujaca pozywke produkcyjna: Sucha pozostalosc po calkowitym, oddestylowaniu zacieru gorzelnianego (Nadrisol) 5,0 g Maka sojowa (Nutrisoy200D) 5,0 g Makaarachidowa 5,0 g Melasa 5,0 g Makaowsiana 5,0 g Gliceryna 10,0 g Wodawodociagowa 1 litr Przyklad III. Antybiotyk A16886 otrzymywano, jak w przykladzie I, stosujac pozywke produkcyjna o nastepujacym skladzie: Maka owsiana 20,0 g Gliceryna 10,0 g Woda wodociagowa 1 litr Przyklad IV. Antybiotyk A16886 otrzymywano, jak w przykladzie I, stosujac pozywke produkcyjna o nastepujacym skladzie: Maka z nasion bawelny 20,0 g Gliceryna 10,0 g Glukoza 5,0 g Woda wodociagowa 1 litr Przyklad V. Antybiotyk A16886 otrzymywano, jak w przykladzie I, stosujac pozywke produkcyjna o nastepujacym skladzie i Glukoza 20,0 g Skrobia rozpuszczalna 10,0 g Pepton (Wilson159) 30,0 g Hydrolizat kazeiny (N-Z-amino-TypdA) 4,0 g Siarczan magnezu siedmiowodny 5,0 g Melasa. 5,0 g Weglanwapnia 2,0 g Wodawodociagowa 1100 ml Przyklad VI. Antybiotyk A16886 otrzymywano, jak w przykladzie I, stosujac nastepujaca pozywke produkcyjna: Gliceryna 20,0 g Peptonsojowy 5,0 g Azotanwapnia 2,0 g Chloreksodu 0,5 g Sucha pozostalosc po calkowitym oddestylowaniu zacieru gorzelnianego (Nadrisol) 3-0 g Wodawodociagowa 1 litr Przyklad VII. Innego rodzaju zarodnikujaca hodowle szczepu Streptomyces davuligerus NRRL 35 85 otrzymano, hodujac drobnoustrój na skosach z pozywka agarowa, która w tym przypadku miala nastepujacy sklad:10 71 105 Dekstryna Wyciag drozdzowy Hydrolizat kazeiny Wyciag wolowy Chlorek wapnia siedmiowodny Agar Mear'a Woda po jonitach 10,0 g 1,0 g 2,0 g 1,0 g 0,01 g 20,0 g 1 litr Wartosc pH pozywki korygowano dodatkiem wodorotlenku sodowego do 6,5.Skosy agarowe zaszczepiano zarodnikami Streptomyces clavuligerus NRRL 35 85, inkubowano w ciagu 7-10 dni w temperaturze 30°C i delikatnie zeskrobywano zarodniki, dodajac do nich 2 ml jalowa surowicy wolowej. 0,1 ml zawiesiny zarodników w surowicy poddawano liofilizacji w wyjalowionych ampulkach, liofili- zat uzywano do zaszczepiania pozywki dla hodowli wegetatywnej o nastepujacym skladzie: Gliceryna 10,0 g Sacharoza 20,0 g Srutsojowy 15,0g AmberBYF300 5,0 g (Hydrolizat drozdzy piwnych firmy Amber Lab.) « Trypten 5,0 g Potasu fosforanII-zas. 0,20 g Wodawodociagowa 1 litr Wartosc pH pozywki, wynoszaca 6,2, korygowano dodatkiem wodorotlenku sodowego do wartosci 6,5.Przyklad VIII. Produkcja doswiadczalna antybiotyku A16886.Fermentor ze stali kwasoodpornej o pojemnosci 40 1 napelniano 24 litrami pozywki o nastepujacym skladzie: Antofoam A (srodek przeciwpienny produkowany przez Dow Corning Company) Skrobia Sucha pozostalosc po calkowitym oddestylowaniu zacieru gorzelnianego (Nadrisol) Srut sojowy Gliceryna Hydrolizat kazeiny (N-Z Amine A) Siarczan zelazawy siedmiowodny Zimna woda wodociagowa 5,0 g U25,0g 125,0 g 500,0 g 187,5 g 125,0 g 2,50 g do 24 litr< Wyjsciowa wartosc pH, wynoszaca 5,9, korygowano do 6,5 dodatkiem okolo 20 ml 5N wodorotlenku sodowego. Pozywke sterylizowano wciagu 30 minut, w temperaturze 120°C i pod cisnieniem 1,1—l,3atn., a nastepnie schladzano i zaszczepiano 5% inokulum wegetatywnego, otrzymanego, jak w przykladzie VII.Fermentacje prowadzono w temperaturze 30°C w ciagu 66 godzin, przepuszczajac jalowe powietrze w ilosci 0,35 objetosci na objetosc pozywki w ciagu jednej minuty. Mieszano mieszadlem mechanicznym przy 420 obr/min.Koncowa wartosc pH wynosila 6,3.Antybiotyk A16886 izolowano z brzeczki w sposób, opisany w przykladzie IX.Przyklad IX. Izolacja surowego antybiotyku Al 6886 w postaci solijednoamonowej.Okolo 75 litrów brzeczki, otrzymanej w sposób opisany w przykladzie VIII, przesaczono z dodatkiem 5 gramów na 100 ml ziemi okrzemkowej (Hyflo Super-Cel produkowanej przez Johns-Manville Products).Przesacz przepuszczano przez kolumne, zaladowana 8 litrami wegla aktywnego (Pittsburgh 12 x 40) z szybkoscia 60 ml/min. Kolumne przemywano 10 litrami odmineralizowanej wody o wartosci pH = 5,2, a nastepnie antybio¬ tyk zaadsorbowany na weglu eluowano, przepuszczajac przez kolumne 50% roztwór acetonu w wodzie.Polaczone frakcje, zawierajace antybiotyk, zatezano pod zntniejszonym cisnieniem w celu usuniecia acetonu i podawano na kolumne o wymiarach 9,5 x 140 cm zaladowana silnie zasadowym wymieniaczem jonowym Dowex 1-X1 w formie mrówczanowej. Kolumne przemywano 10 litrami demineralizowanej wody, a antybiotyk eluowano 0,1 molarnym roztworem mrówczanu amonu. Polaczone frakcje zawierajace antybiotyk przepuszczano przez kolumne o wymiarach 9,5 x 100 cm zaladowana weglem aktywnym (Pittsburgh 12x40) z szybkoscia 60 ml/min. Kolumne przemywano woda, a nastepnie antybiotyk eluowano mieszanina wody i acetonu (4 :1)71105 11 z szybkoscia 60 ml/min., zbierajac dwie frakcje po 15 litrów oraz nastepnie mieszanina wody i acetonu (1 :1), odbierajac jedna 18-litrowa frakcje. Polaczone frakcje antybiotyk zatezano pod zmniejszonym cisnieniem w celu usuniecia acetonu i liofilizowano. 40 gramów liofilizatu ekstrahowano 4 litrami metanolu mieszajac mieszadlem elektromagnetycznym w ciagu 16 godzin. Po odsaczeniu czesci nierozpuszczalnych do roztworu dodano 5 objetosci acetonu, wytracony osad odsaczono i suszono. Wydajnosc 20,6 g. Osad rozpuszczano w minimalnej ilosci wody i naniesiono na kolumne o wymiarach 5,8 x 120 cm, zaladowana Spehadexem G-25 z szybkoscia 1 ml/min. Eluowano deminera- lizowana woda, frakcje, zawierajace antybiotyk polaczono i liofilizowano. < Liofflizat w ilosci 10 gramów rozpuszczano w 256 ml mieszaniny acetonitiylu z woda (55 :45) i naniesiono z szybkoscia 3 ml/min. na kolumne o wymiarach 5,5 tf 85 cm, zaladowana zelem krzemionkowym zawieszonym w mieszaninie acetonitiylu z woda (7 :3). Eluowano mieszanina acetonitiylu z woda (7:3) z szybkoscia 5 ml/min. Frakcje, zawierajace najwiecej antybiotyku, zatezono do sucha pod zmniejszonym cisnieniem i liofilizowano. < Otrzymany w taki sposób material byl mieszanina soli jednoamonowych czynnika I i II. Uzywano go zarówno do badania aktywnosci przeciwbakteryjnej i przeciwrobaczej opisanego powyzej, jak tez do prób rozdzialu i oczyszczania opisanych ponizej.Przyklad X. Rozdzial solijednoamonowych czynników I i II antybiotyku A16886. 10 gramów preparatu przygotowanego wedlug przepisu z przykladu IX rozpuszczono w 197 ml mieszaniny acetonitiylu z woda (55 :45) i naniesiono z szybkoscia 1 ml/min., na kolumne o wymiarach 4 x 130 cnuzalado- wana 1,6 litra mikrokiystalicznej celulozy (Avicel) zawieszonej w acetonitiylu z woda (7 :3). Eluowano mieszani¬ na acetonitiylu z woda (7 : 3) z szybkoscia 2 ml/min. Odbierane frakcje kontrolowano chromatograficznie na bibule. Frakcje zawierajace poszczególne czynniki zbierano osobno i liofilizowano.Przyklad XL Otrzymywanie chlorowodorku antybiotyku Al6886. 200 mg soli jednoamonowej antybiotyku Al6886 przygotowanej w sposób opisany w poprzednich przykladach rozpuszczono w 2 ml wody. Poczatkowa wartosc pH roztworu wynoszaca 5,30 skorygowano IN kwasem solnym do 2,0, a nastepnie roztwór zatezono pod zmniejszonym cisnieniem prawie do sucha.Dodano 0,5 ml wody i 1,5 ml metanolu, a nastepnie stracono chlorowodorek antybiotyku dodatkiem 10 objetos¬ ci acetonu. Wytracony osad odsaczono, przemyto acetonem i wysuszono. Analiza wykazala zawartosc 4,50% chlorku. Miareczkowanie potencjometryczne w 66% roztworze wodnym dwumetyloformamidu przy poczatkowej wartosci pH = 5,0 wykazalo obecnosc trzech dajacych sie miareczkowac grup o pKat = 3,6; pKa^ = 5,2 i pKa3 = 10,8.Przyklad XII. Otrzymywanie soli dwusodowej antybiotyku Al6886. 200 mg soli jednoamonowej antybiotyku A16886 otrzymanej jv sposób opisany w poprzednich przykla¬ dach rozpuszczono w 2 ml wody, a wartosc pH roztworu wynoszaca 5,30 skorygowano dodatkiem 2,5N wodoro¬ tlenku sodowego do 10,5. Roztwór wtedy natezono pod zmniejszonym cisnieniem prawie do sucha, a nastepnie dodano 1,5 ml metanolu i wytracono sól dodajac 10 objetosci acetonu. Osad odsaczono, przemyto acetonem i wysuszono. Analiza wykazala zawartosc 6,79% sodu. • Przyklad XIII. Otrzymywanie antybiotyku Al6886 w formie kwasowej. 200 mg mieszaniny soli jednoamonowych antybiotyku A16886 i A16886II rozpuszczono w 40 ml wody i dodano 6 ml wymieniacza jonowego Dowex 50W-X12 (forma H4). Mieszano w ciagu 30 minut i saczono przez lejek z wkladka spiekana sredniej gestosci. Przesacz o wartosci pH = 2,65 liofilizowano. # Miareczkowanie potencjometryczne w 66% roztworze wodnym dwumetyloformamidu wykazalo obecnosc trzech dajacych sie miareczkowac grup o pKax = 4,2; pKa^ = 5,6 i pKa3 = 10,4. PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego antybiotyku Al6886 lub jego dopuszczalnych w farmacji soli, zna¬ mienny tym, ze szczep Streptomyces clamligerus NRRL 35 85 hoduje sie na pozywce, zawierajacej przyswajalne zródla wegla, azotu i soli nieorganicznych, w hodowli glebinowej z napowietrzaniem, az do otrzymania znacznych ilosci antybiotyku Al6886, po czym wyodrebnia sie go w postaci kwasu lub w postaci soli, i ewentualnie sól antybiotyku A16886 rozdziela na czynniki A168861 i Al688611 w postaci soli lub w postaci kwasów.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze fermentacje prowadzi sie w temperaturze 25—37°C w czasie 36-72 godzin. « .12 71105 Obserwowane wlasciwosci Morfologia Cechy hodowlane ISP nr 2 (agar z wyciagiem drozdzowym i slodowym) ISP nr 3 (agar z maka owsia¬ na) ISP nr 4 (agar ze skrobia i so¬ lami nieorganicznymi) ISP nr 5 (agar z gliceryna i asparagina) Agar z maka owsiana i pasta pomidorowa Agar Emersona Agar Bennetta Agar Czapek'a Agar glukozowo-asparagino- wy Agar tyrozynowy Agar odzywczy (nutrient agar) Jablczan wapnia Dzialanie na mleko Redukcja azotanów Uplynnianie zelatyny Wplyw wartosci pH. na wzrost Tablica I Charakterystyka szczepu wytwarzajacego antybiotyk A16886 Sporofory sa wytwarzane na obficie rozgalezionej grzybni powietrznej i skla¬ daja sie z siatki krótkich, sympodialnie rozgalezionych strzepek. Zwykle wytwarzanych jest od 1 do 4 spor na krótkich maczugowatych galazkach. Ewentualnie sporofory dziela sie tworzac lancuszki zarodników. Wymiary spor wynosza 0,34-0,85/1X0,85-3,3/1, przecietnie 0,64X1,5/1. Fotografia w mikroskopie elektronowym wykazuje gladkoscienne spory. Spory w grzybni podstawowej nie sa wytwarzane. Wzrost obfity, spód szarawo-zólty [12K3]; grzybnia powietrzna obfita, ciemnoszara (G) 3ih [21B1]; brak rozpuszczalnych pigmentów. Wzrost umiarkowany, spód bladozólty [11C1]; grzybnia powietrzna dosc obfita, biala (W) b [27A1 ]; brak rozpuszczalnych pigmentów. Wzrost obfity, spód szarawo-zólty 12B2; grzybnia powietrzna umiarkowana, srednio-szara (GY) 2fe [45A1 ]; brak rozpuszczalnych pigmentów. Wzrost dosc obfity, spód bladozólto-zielony [1OBI]; grzybnia powietrzna dosc obfita biala (W) a; brak rozpuszczalnych pigmentów. Wzrost obfity, spód szarawo zólty [11E4]; grzybnia powietrzna umiarkowa¬ na, jasnoszarawo-oliwkowa (GN) 1—l/2ig [21B1]; brak rozpuszczalnych pi¬ gmentów. Wzrost obfity, spód bladozólty [11C1]; grzybnia powietrzna uboga; brak rozpuszczalnych pigmentów. Wzrost obfity, spód jasnozólty [11J2]; grzybnia powietrzna obfita, ciemno- szarawo-zielona (GN) 24-l/2ih [23A3]; brak rozpuszczalnych pigmentów. Wzrost ubogi Wzrost umiarkowany, spód bladozólto-zielony [10B1]; grzybnia powietrzna dosc obfita, biala (W) b [27A1 ]; brak rozpuszczalnych pigmentów. Wzrost umiarkowany, spód bladozólty [10B2] grzybnia powietrzna umiarko¬ wana, zóltawoszara (GY) 2dc [10A2]; brak rozpuszczalnych pigmentów. Wzrost dosc obfity, spód bladozólto-zielony [10B1]; grzybnia powietrzna skapa, biala; brak rozpuszczalnych pigmentów. Wzrost obfity, spód bladozólto-zielony [10B1]; grzybnia powietrzna dosc obfita, biala (W) a. Nie powoduje koagulacji, mleko pozostaje klarowne w ciagu 17 dni. Nie redukuje Nie uplynnia Optymalny dla wzrostu zakres pH - 5,0-^,0, przy pH 7,5-8,5 - rosnie lecz nie sporuluje,71105 13 Wytwarzanie melaminy (po¬ zywka zawierajaca trypton i wyciag drozdzowy oraz pep- ton-iron agar) Wymagania temperaturowe Glówne skladniki hydroliza¬ tu calej komórki Nie wytwarza Dobry wzrost i sporulacja w zakresie 26-30°C, brak przy 37°C i powyzej. Kwas L,L-dwuaminopimelinowy, gliceryna, kwas glutaminowy, kwas asparagi¬ nowy, alanina i leucyna. T a b 1 i c a II Wykorzystywanie zródel wegla przez NRRL 3585 Zwiazek I^arabinoza ramnoza fruktoza D-ksyloza melecytoza rafinoza dekstroza cellobioza maltoza sacharoza celuloza inozytol mannitol Glutaminian sodowy — _ _ (-) __ + _ (+) (+) T a b 1 i c a III Badany drobnoustrój Stezenie hamujace mog/ml Escherichia coli 0127 Proteus PR-6 Salmonella typhimurium S-4 Klebsiella sp. K-l Pseudomonoas sp. X239 Salmonella typhosa T-63 Staphylococcus aureus 3 055 Streptococcus pyogenes C2P3 BacillussubtilisX12.1 Staphylococcus aureus 3 150 0,39 m.r. 0,78 m.p. 0,78 m.p., 1,56 m.p. ponad 100 m.p. 0,78 m.r. 25,00 m.p. 6,25 m.p. 1,56 m.p. 50,00 m.p.14 71105 Tablica IV Szczep 1 Czynnik I /ig/krazek 30 10 5 2.5 1.0 2 3 4 5 6 0.5 7 30 8 Czynnik II n\ 10 5 9 10 g/krazek 2.5 11 1.0 12 0.5 13 Escherichia coli 0127 Escherichia coli EC 25 Proteus sp.PR6 Proteus sp. PR7 Salmonella typhosa SA 12 Salmonella typhosa SA 16 Klebasiella aerobacter KA14 Klebsiella areobacter . KA25 Pseudomonas sp. Ps 24 Pseudomonas sp. Ps 30 Staphylococcus aureus 3055 Staphylococcus aureus 3074 25.6 20.7 18.6 15.9 12.7 8.4 19.7 15.9 12.9 19.6 23.2 14.0 27.2 24.2 22.1 23.0 0 0 0 15.1 19.0 10.4 22.8 19.6 12.5 16.7 0 19.9 16.2 9.1 13.6 0 16.9 13.1 0 9.9 0 11.3 9.3 0 0 0 8.0 0 11.9 22.2 7.1 23.8 19.3 7.7 16.7 0 18.7 13.4 15.8 18.2 0 0 0 12.3 15.7 0 0 0 9.0 13.2 0 0 0 0 10.1 0 0 0 0 0 0 0 0 15.6 20.2 0 12.4 10.1 10.1 15.4 0 0 0 0 13.6 0 15.6 11.0 23.0 18.0 15.4 11.4 7.6 0 20.1 13.7 10.8 7.4 12.3*) 0 0 0 9.4 0 10.4 0 12.3 7.5 0 . 0 9.3*) 0 0 0 0 0 0 0 7.5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 *) lacznie z .koloniami satelitarnymi Ts Drobnoustrój Escherichia coli 0127 Salmonella typhosa T-63 Klebsiella K-l Proteus PR-6 tbl ica V EDS0 13.8 15.6 10.2 7,3 Tablica VI ' Srednica stref zahamowania w mm Stezenie Cylinderki staloweA Krazki bibulowe B E. amylovora P. solanaceanim E. amylovora P. solanaceanim A16 886 - 10 czesci na milion A16 886 - 50 czesci na milion A16 886 - 100 czesci na milion Kontrola (woda destylowana) 6-6 12-14 15-16 6-6 16-17 25-25 30-30 6-6 13-13 16-17 20-20 13-13 20-21 30-30 ' 34-35 13-1371105 15 Tablica VII Pseudomonas solanacearum wyniki leczenia Kontrola (1% etanolu + 0,1% srodka powierzchniowo czynnego) 0 0 A16886-400 czesci na milion 2+ 3+ A16886-200 czesci na milion 2+ 2+ Tablica VIII Pseudomonas glycinia wyniki leczenia Kontrola 0 Al6886 — 200 czesci na milion 3+ A16886-400 czesci na milior 2+ T a b 1 i c a IX Wyniki leczenia w posz<#ególnych grupach roslin zakazenie, spryskiwanie pózniej spryskiwanie pózniej zakazanie Kontrola (woda) 0 0 Kontrola (woda z dodatkiem mieszaniny emulgatorów) 0 0 A16886-100 czesci na milion 2 4 A16886-500 czesci na milion 3+ 4 Tablica X Pseudomonas solanacearum wyniki leczenia podawanie tylko podawanie tylko do lisci do. lodyg Kmtrola (woda z dodatkiem emulgatora) A16886-100 czesci na milion A16886 -400 czesci na milion 0 3 4 1 4 4 0 4 4 1 4 416 71105 Tablica XI Przecietna ilosc owsików u jednej myszy Aspiculuris tetraptera Syphacia obvelata Kontrola 35 41 Antybiotyk Al 6886 w dawce 500 mg/kg 4,5 0,5 Tablica XII Grupa Kontrola 0,005% antybiotyku Al 6886 0,01 antybiotyku A16886 0,05% antybiotyku Al6886 Przecietna" ilosc uszkodzen pluc w jednej grupie 2,0 0,166 0,33 0,0 Tablica XIII Grupa kontrola 0,0005% antybiotyku Al6886 0,001% antybiotyku Al6886 0,1% antybiotyku Al 6886 Przecietna ilosc uszkodzen pluc w jednej grupie 2,2 1,2 0,7 0,2 Tablica XIV Uklad rozwijajacy Chromatografia bibulowa Etanol, woda (80 :20) z dodatkiem 1,5% chlorku sodowego, bibula nasycona IN siarczanem sodowym Butanol wysycony woda Butanol wysycony woda z dodatkiem 2% kwasu p-toluenosulfonowego Keton metylowoizobutylowy wysycony woda Keton metylowoizobutylowy wysycony woda z dodatkiem 2% kwasu p-toluenosulfonowego Keton metylowoizobutylowy wysycony woda z dodatkiem 2% pirydyny Acetonitryl Propanol,acetonitryl, metanol, woda (4:3:2:1) Propanol, pirydyna, kwas octowy, woda (15:10:3:12) Wartosc RF Czynniki Czynnik II 0,38 0 0,39 0 0 0,33 0 0,32 0 0 0 0 0 u 0 0,32 OjZi71 105 17 Propanol, pirydyna, kwas octowy, acetonitryl, woda (45 :30 :9 : -,0 : 36) Butanol, kwas octowy, woda (3 :1 : IP) Octan etylu, kwas octowy, woda (3 :1,: 1) Propanol, woda (70 :30) Acetonitryl, woda (70 :30) Woda,etanoi, kwas octowy (70 :42 :6) Chromatografia cienkowarstwowa Acetonitryl, woda (7 :3), na plytkach pokrytych celuloza 0,24 0,20 0,29 0,17 0,72 0,82 0,35 0,15 0,17 0,22 0,17 0,65 0,82 0,2971 105 fpooaoooapo gyp Liczba falowa (cm" ) 150014000001200 1100 K3O09S0! v? 20| ol-s i 1 i r—* * te—rrt—ii 6 * fr- Dhigosc fali (ai ) fig. i 4000 30002800 2000 Liczba falowa Ccm ) I3O014001300 BOO 1100 POO96P 90O 660 flOO TBO ]0£ £» Dtugosc fali (/u) FI6- 2 Prac. Poligraf. UP PRLNaklad 120 + 18 egz. PL PL