PL63498B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano: 20.XI.1971 63498 KI. 12 q, 24 MKP C 07 d, 7/02 UKD Wlasciciel patentu: Rhóne — Poulenc S.A., Paryz (Francja) Sposób otrzymywania \iowej pochodnej trójacetylowej spiramycyny I Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymy¬ wania nowej pochodnej trójacetylowej spiramy¬ cyny I.Spiramycyna jest antybiotykiem przeciwbakte- ryjnym zlozonym z trzech skladników spiramycy¬ ny I, spiramycyny II i spiramycyny III, których wzory strukturalne ustalili R. Paul i S. Tchelit- cheff, Buli. Soc. Chim. (3/650/1965) Sposród tych spiramycyn szczególne zaintere¬ sowanie przedstawia spiramycyna I ze wzgledu na mozliwosc bezposredniego otrzymywania me¬ toda fermentacyjna w skali przemyslowej.Sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie no¬ wa pochodna trójacetylowa spiramycyny I, której wzór strukturalnie nie zostal jeszcze ustalony.Pochodna czteroacetylowa spiramycyny I otrzy¬ muje sie przez dzialanie bezwodnika kwasu octo¬ wego na spiramycyne I w temperaturze 50—150°C, korzystnie w temperaturze 100°C, ewentualnie w obecnosci trzeciorzedowej zasady organicznej, takiej jak pirydyna. W zaleznosci od tempera¬ tury reakcja trwa 5—70 godzin. Reakcja ta wy¬ woluje jednoczesnie estryfikacje spiramycyny I i modyfikacje jej budowy, której nie mozna bylo ustalic dokladnie.Sposobem wedlug wynalazku nowa pochodna trójacetylowa spiramycyny I otrzymuje sie przez metanolize pochodnej czteroacetylowej. Reakcje prowadzi, sie dzialajac mieszanina wody i meta¬ nolu, korzystnie w temperaturze wrzenia, pod 10 15 chlodnica zwrotna, mozna równiez stosowac ogrze¬ wanie ponizej temperatury wrzenia mieszaniny reakcyjnej, ale wówczas nalezy przedluzyc czas trwania reakcji. Podczas metanolizy nastepuje od¬ laczenie sie jednej z czterech grup acetylowych zwiazanych ze spiramycyna I.Nowa pochodna trójacetylowa spiramycyny I mozna stosowac bezposrednio albo po oczyszcze¬ niu. Oczyszczanie prowadzi sie metodami klasycz¬ nymi, zwlaszcza przez bezposrednia krystalizacje w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, ta¬ kim jak eter izopropylowy, ekstrakcje przeciwpra- dowa, chromatografie, ekstrakcje mieszanina wo¬ dy z organicznym rozpuszczalnikiem przy odpo¬ wiedniej wartosci pH.Nowa pochodna trójacetylowa spiramycyny I jest bardziej trwala w srodowisku kwasnym niz spiramycyna I albo mieszanina spiramycyn. Po¬ chodna ta zachowuje calkowita aktywnosc prze- ciwbakteryjna po dzialaniu w ciagu 5 godzin 10 n kwasem solnym, natomiast spiramycyna I albo mieszanina spiramycyn w tych samych warun¬ kach traci 90% aktywnosci.Nowa pochodna spiramycyny I otrzymana spo¬ sobem wedlug ¦wynalazku wykazuje, tak jak spi¬ ramycyna I, aktywnosc przeciwbakteryjna. Bada¬ nia prowadzone na myszach wykazaly, ze nowa pochodna jest szczególnie korzystna, poniewaz sto¬ sowana doustnie wykazuje aktywnosc przeciwbak- io teryjna na zakazenie paciorkowcami i pneumoko- 25 63 49863 498 kami 2—3-krotnie wyzsza niz spiramycyna I lub mieszanina spiramycyn. Ze wzgledu na lepsza trwa¬ losc w srodowisku kwasnym i na wieksza aktyw¬ nosc przeciwbakteryjna in vivo, nowy produkt przedstawia pewien postep w stosunku do spira¬ mycyn.Trójacetylospiramycyna otrzymana sposobem we¬ dlug wy nalazku ma wzór sumaryczny C51H82013No i nastepujace cechy fizykochemiczne: wyglad: proszek o barwie kremowej; temperatura topnienia : 156— 157°C; [a] ?^ =97° (c = l, etanol); analiza ele¬ mentarna : C 60—60,5%, H 8,2—8,4%, O, 28,3%, N 2,6—2,65%, CH CO 12,5—12,9% widmo w nad¬ fiolecie (oznaczenie z roztworu w etanolu) maksi¬ mum absorpcji przy 230 m // (E^cm = 280), wid¬ mo w podczerwieni (oznaczenie w tabletce mie¬ szaniny z KBr). Widmo w podczerwieni przed¬ stawiono na rysunku, na którym odcieta oznacza dlugosc fal w mikronach (skala dolna) oraz licz¬ by falowe w cm-1 (skala górna), a rzedna gestosc optyczna.W tablicy podano glówne pasma absorpcyjne nowego zwiazku.Tablica Rozmiesz¬ czenie pasm 3420 tF 2960 ep 2920 F 2850 F 2820 ep 2770 m 1730 tF 1625 F 1590 ep 1450 F Czestotliwosc w liczbach falowych cm-1 1 1370 F 1335 ep 1292 m 1270 f 1230 tF 1170 ep 1150 F 1115 F 1080 m 1060 ep 1040 tF 1020 sp 985 m 965 m 945 ep 930 ep ^ 900 m 850 m 835 m 800 f tF = Pasmo bardzo ostre F = Pasmo ostre m = Pasmo rozciagniete f = Pasmo bardzo rozciagniete ep = intensywnosc zmienna Spiramycyne I, czteroacetylospiramycyne i kry¬ staliczna trójacetylospiramycyne I rozdzielono za pomoca chromatografii cienkowarstwowej na tlen¬ ku glinu.Zastosowano warstwe tlenku glinowego o gru¬ bosci 0,3 mm osadzona na szklanej plytce. Po wysuszeniu plytki z nosnikiem w ciagu 12 go¬ dzin w temperaturze otoczenia nosnik aktywowano przez ogrzewanie w temperaturze 100QC w ciagu 1 godziny, a nastepnie naniesiono na linii starto¬ wej nosnika po 10^1 roztworu benzenowego ba¬ danego produktu o stezeniu 0,1 mg/ml, czyli w ilosci 0,l/*g badanego zwiazku. Chromatogram roz¬ winieto za pomoca mieszaniny benzenu i octanu etylu (60 :40 obj.), przy czym czolo fazy rucho¬ mej osiagnelo linie 15—17 cm od linii startowej.Nastepnie chromatogramy suszono w ciagu 15 mi¬ nut w cieplym pradzie powietrza, po czym wy¬ wolano droga biologiczna na plytce agaru z kul¬ tura Bacillus subtilis. Otrzymano nastepujace war¬ tosci Rf : 0 dla spiramycyny I, 0,6 dla czteroacety- 10 20 25 30 35 40 45 50 55 65 lospiramycyny I i 0,5 dla krystalicznej trójacety- lospiramycyny I.Sposób wedlug wynalazku wyjasnia nastepujacy przyklad nie ograniczajacy jego zakresu, przy czym aktywnosc okreslono przez oznaczenie bio¬ logiczne metoda dyfuzyjna stosujac Bacillus sub¬ tilis jako wrazliwy drobnoustrój iw stosunku do próbki spiramycyny czystej jako wzorca. Aktyw¬ nosc ta jest wyrazona w jednostkach na mg, przy czym jednostka jest najmniejsza iloscia produk¬ tu rozpuszczona w 1 ml odpowiedniego podloza hamujaca wzrost Staphylococcus aureus ATCC 6538 P w warunkach okreslonych.Przyklad. Roztwór 1000, g spiramycyny I w 5400 g mieszaniny acetylujacej, otrzymanej przez zmieszanie 4752 g pirydyny i 648 g bezwodnika octowego, ogrzewano w temperaturze 100°C w ciagu 24 godzin, po czym wlano do 10 kg wody z lodem i doprowadzono mieszanine do wartosci pH = 7,5 przez dodanie 800 ml roztworu 10 n so¬ dy i poddano dwukrotnej ekstrakcji chlorofor¬ mem uzytym w ilosci 2 1 i 1 1. Polaczone ekstrak¬ ty przemyto 4 razy po 4 1 wody, odsaczono i od¬ parowano. Otrzymana pozostalosc, po wysuszeniu pod cisnieniem 1 mm Hg rozpuszczono w 30 1 cykloheksanu. Otrzymany roztwór odsaczono w temperaturze 28°C, a nastepnie przesacz odparo¬ wano. Stala pozostalosc wysuszono pod cisnie¬ niem 1 mm Hg, otrzymujac 1150 g czteroacety- lospiramycyny I, o mianie 1185 jednostek na mg; temperatura topnienia 148—152° [a] ^ = 106° (c = 2, etanol); CH8CO = 17,0%.Roztwór 1000 g czteroacetylospiramycyny I w 9 1 mieszaniny skladajacej sie z 7,2 1 metanolu i 1,8 1 wody ogrzewano w ciagu 24 godzin pod chlodnica zwrotna, a nastepnie ochlodzono, do¬ dano 10 1 wody i poddano ekstrakcji 4 1 chlorku metylenu. Po zdekantowaniu, roztwór chlorku me¬ tylenu odparowano i pozostalosc wysuszono pod cisnieniem 1 mm Hg w temperaturze 60°C do stalej wagi, otrzymujac 705 g trójacety lospira¬ mycyny I o mianie 1670 jednostek na mg; tem¬ peratura topnienia 148—150°C, [a] ^ = 86° (c = 2, etanol); CHsCO = 12,6%. Otrzymana surowa trój¬ acetylospiramycyne I oczyszczono dwoma sposo¬ bami, przez zwykla krystalizacje z roztworu oraz przez krystalizacje frakcyjna w przeciwpradzie.Oczyszczanie trójacetylospiramycyny i przez krystalizacje, 27,5 g surowej trójacetylospiramy¬ cyny I rozpuszczono na goraco, pod chlodnica zwrotna w 50 ml eteru izopropylowego, po czym poddano krystalizacji oziebiajac lodem i mieszajac w ciagu 24 godzin. Wytracony produkt krystalicz¬ ny odsaczono, przemyto 3 razy po 10 ml eteru izo¬ propylowego i suszono w temperaturze 40°C pod cisnieniem 2 mm Hg w ciagu 12 godzin. Otrzyma¬ no 13,5 g trójacetylospiramycyny I w postaci kry¬ stalicznej, o temperaturze topnienia 150—152°C.Oczyszczanie trójacetylospiramycyny I przez krystalizacje frakcyjna w przeciwpradzie, 44,5 g surowej trójacetylospiramycyny I oczyszczano w aparacie Craiga z odbieralnikami o pojemnosci 50 ml, przez rozdzial substancji w przeciwpradzie pomiedzy fazy ciekle mieszaniny o skladzie w pro¬ porcjach objetosciowych: benzenu 45 czesci, cy-63 498 6 kloheksanu 55 czesci, metanolu 80 czesci i wo¬ dy 80 czesci. Dokonano podzialu na 300 frakcji, otrzymujac trójacetylospiramycyne I w odbieral¬ nikach o kolejnej numeracji frakcji 140—210 (1 = 1,38).Zawartosc odbieralników frakcji 164^196 pola¬ czono i zatezono pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 25°C do objetosci 200 ml, otrzy¬ mujac stezony roztwór wodny, który zalkalizowa- no do wartosci pH = 8,5 i poddano ekstrakcji dwu¬ krotnie benzenem w ilosci po 1 objetosci w sto¬ sunku do ekstrahowanej cieczy. Polaczone eks¬ trakty przemyto woda w ilosci 20% objetosci ekstraktu benzenowego, wysuszono bezwodnym siarczanem sodu i odparowano do suchosci w tem¬ peraturze 30°C pod cisnieniem 3 mm Hg. Otrzy¬ mano 15,6 g trójacetylospiramycyny I o mianie 2300 jednostek na mg; [a] 2^ = — 89,2° (c = l, etanol). 6,4 g otrzymanego produktu rozpuszczono na goraco w 140 ml eteru izopropylowego, przesa¬ czono i przesacz zatezono do objetosci 50 ml, pod zmniejszonym cisnieniem. Po oziebieniu lodem, mieszajac w ciagu 2 godzin, otrzymano z roztwo¬ ru bezbarwne krysztaly w postaci igiel, które od- 10 15 saczono, przemyto 5 ml tlenku izopropylu i wysu¬ szono w temperaturze 40°C pod cisnieniem 3 mm Hg w ciagu 12 godzin. Otrzymano 5,25 g trójace¬ tylospiramycyny I w postaci krystalicznej o mia¬ nie 2300 jednostek na mg i temperaturze topnie¬ nia 150^152°C. 3,75 g otrzymanego krystalicznego produktu roz¬ puszczono na goraco w 150 ml eteru izopropylo¬ wego, przesaczono i przesacz zatezono pod zmniej¬ szonym cisnieniem do objetosci 45 ml. Po krysta¬ lizacji w sposób wyzej opisany otrzymano 2,5 g trójacetylospiramycyne I dwukrotnie krystalizowa¬ na o mianie 2300 jednostek na mg, temperaturze topnienia 156—157°C i [a] 2£ = — 97° (c=l, eta¬ nol). PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania nowej pochodnej trójace- tylowej spiramycyny I, znamienny tym, ze po¬ chodna czteroacetylowa spiramycyny I otrzymana w znany sposób na drodze estryfikacji spiramy¬ cyny I za pomoca bezwodnika kwasu octowego w temperaturze 50—150°C traktuje sie mieszani¬ na metanolu i wody. 4000 3000 2000 1500 iOOO 500°*' ¦4 \2 \A 161820 25^ PL PL