PL59682B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: Opublikowano: 9. V. 1970 59682 KI. 6 b, 16/03 MKP C 12 d A\oo Wspóltwórcy wynalazku: mgr Jadwiga Dmochowska, dr Antoni Sie- winski, doc. dr Ancjrzej Nespiak Wlasciciel patentu: Wyzsza Szkola Rolnicza (Katedra Chemii Ogólnej), Wroclaw (Polska) Sposób równoczesnego otrzymywania androsteronu i epiandrosteronu Przedmiotem wynalazku jest sposób równocze¬ snego otrzymywania androsteroniu i epiandrostero¬ nu na drodze mikrobiologicznej. Oba powyzsze hormony stosuje sie w lecznictwie ze wzgledu na ich dzialanie regulujace rozwój meskich cech plciowych.Znane sa zarówno chemiczne i mikrobiologiczne sposoby otrzymywania tych zwiazków.Androsteron otrzymuje sie na drodze chemicz¬ nej dwoma sposobami. W sposobie pierwszym, materialem wyjsciowym jest androstenolon, w któ¬ rym redukuje sie podwójne wiazanie, a nastepnie przeprowadza sie epimeryzacje grupy alkoholowej na C-3.Druga znana metoda chemiczna jest redukcja ketonu na C-3 w 5a-androstan-3,l7-dionie pro¬ wadzaca do mieszaniny androsteroniu i epiandro¬ steronu, która rozdziela sie przy pomocy digito- niny.W metodach opierajacych sie na transformacjach mikrobiologicznych steroidów, które prowadza do otrzymania androsteronu stosuje sie jako czynnik przeksztalcajacy, wydzielony ferment z Pseudo- monas testosteroni lub Nocardia restriotus. Surow¬ cem w tych fermentacjach jest 5a-androstan-3,17- -dion, 5a-androstan-3a, 17/?-diol lub octan 5a-an- drostan-3 -ol-17-onu. Epiandrosteron otrzymuje sie mikrobiologicznie z 5a-androstan-3,17-dionu przy pomocy Streptomyces griseus.Sposób otrzymywania androsteronu i epiandro¬ steronu na drodze chemicznej jest skomplikowany, a rozdzielenie mieszaniny produktów wymaga sto¬ sowania digitoniny. Przy opisanym natomiast spo¬ sobie mikrobiologicznym napotyka sie na tru¬ dnosci w izolowaniu czystego preparatu enzyma¬ tycznego zdolnego do selektywnej transformacji substratów.Celem wynalazku jest znalezienie prostej meto¬ dy otrzymywania androsteronu i epiandrosteronu oraz ich rozdzielania. Cel ten zostal osiagniety na drodze mikrobiologicznej transformacji androsten- dionu lub testosteronu za pomloca szczepu z ga¬ tunku Rhodotoruilia mucilaginosa. Szczep ten izo¬ lowano z torfu sfangoweigo z torfowiska Zieleniec w okolicach Klodzka, Identyfikacje szczepu prze¬ prowadzono na podstawie wlascijwosci morfolo¬ gicznych i fizjologicznych wedlug metod podanych w monografii: J. DODDER, N. J. W. KREGER van RIJ „The Yeasts" Nofth-Holland Publishing Company Amsterdam, 1967.Cechy makroskopowe szczepu: kolonia na agarze maltozowym sluzowata o powierzchni gladkiej, lsniacej, koloru rózowo-czerwonego. 25 Cechy mikroskopowe: komórki po trzech dniach na agarze maltozowym okragle lub owalne, ulo¬ zone pojedynczo lub parami wielkosci 5-^6/3— 4,5 ii.Asymilacja culkrów wedlug podanej metody so LODDERA i KREGERA: glukoza ++, galakto- 10 15 20 5968259682 3 rTOS^^lTTffff^^ mg/litr kultury. Czyn- 'IfosWmujacyTn^amdrostendion, jak i tes- zia +, sacharoza + + , maltoza +, laktoza —, asy¬ milacja azotanów (KNÓ3): brak.Glównymi produktami przeksztalcenia andro¬ stendionu lub testosteronu sa mieszaniny zawie¬ rajace do 75O/0 androsteronu i epiandrosteronu w prawie równych ilosciach wagowych obu sklad¬ ników bez wzgledu na to, z którego substratu (an¬ drostendionu czy testosteronu) zostaly otrzymane.Izolowania mieszaniny produktów dokonuje sie chloroformem, a .rozdzielenie ich przebiega na drodze chromatografii kolumnowej.Sposób wedlug wynalazku polega na wprowa¬ dzeniu do 3—5-dniowej wodnej kultury wyzej wy¬ mienionego szczepu nalezacego do gatunku Rho¬ dotorula mucilagiinosa androstendionu, jak i testo¬ steronu*? nikiem tosforonf jest uklad enzymatyczny zawarty w zy¬ wych komórkach gatunkuj Rhodotorula mucilagi¬ nosa. I ' ¦ i Wodna TEulture tego gatunku okresla sie kultura rosnaca na pozywce sporzadzonej przez rozpusz¬ czenie w 1 1 wody wodociagowej 20 g wyciagu slodowego, który zawiera 72% wagowych malto¬ zy, 2PU wagowych dekstryn, 4% wagowych sub¬ stancji bialkowych, 1% wagowych soli mineral¬ nych i 18°/o wagowych wody. Fermentacje prowa¬ dzi sie w ciagu 10—20 dni, korzystnie W ciagu 14 dni od momentu dodania substratu, w tempe¬ raturze 22—28°C, korzystnie 27°C przy wartosci pH = 4,5—6,0 korzystnie 5.Zarówno przygotowanie kultury miikroorganizmu jak i nastepujaca po nim fermentacja dodanego substratu przebiega przy wstrzasaniu reagujacych mieszanin, które po ekstrakcji chloroformem roz¬ dziela sie chromatograficznie.Czterodniowa hodowla wstepna szczepu jest najkorzystniejsza, bowiem wtedy osiaga sie naj- intensyfwmiejsizy rozwój mikroorganizmu. Prze¬ dluzenie okresu wstepnego ponad cztery dni po¬ woduje starzenie sie kultury, co wplywa na zmniejszenie wydajnosci obu prodoktów. Kolejna fermentacja dwutygodniowa 'androstendionu lub testosteronu prowadzi do osiagniecia najwyzszej wydajnosci (do 75% mieszaniny obu produktów).Skracanie okresu fermentacji powoduje obnize¬ nie wydajnosci produktów, dluzsza natomiast hodowla prowadzi do powstania dalszych pro¬ duktów przemiany obok androsteronu i epian¬ drosteronu.Optymalne ilosci dodawanego substratu (andro¬ stendionu lub testosteronu) do 1,2 1 pozywki z ro¬ snaca w niej kultura opisanego wyzej szczepu Rhodotorula mucilaginosa wynosza 100—120 mg.Dodatek wiekszej ilosci substratu do tej samej objetosci kultury wodnej Rhodotorula mucilagi¬ nosa powoduje pozostanie materialu wyjsciowego po reakcji mikrobiologicznej.Temperatura 27°C i wartosc pH = 5 przy wstrza¬ saniu stanowia najkorzystniejsze warunki dla opisywanego procesu. Podwyzszenie temperatury powyzej 28°C lub obnizenie ponizej 22°C hamuje rozwój mikroorganizmu. Tak samo hamujaco na jego rozwój wplywa zmiana wartosci pH ponizej 4.5 i powyzej 6,0. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Wstrzasanie reagujacego roztworu przyspiesza reakcje przemiany zarówno testosteronu, jak i an¬ drostendionu. Oba te substraty sa nierozpuszczalne w wodzie, a wstrzasanie liodowli utrzymuje je caly czas w zawiesinie, co ulatwia kontakt obu reagujacych zwiazków z ukladem enzymatycznym komórek Rhodiotorula mucilaginosa. Opisane wa¬ runki transformacji obu substratów stanowia naj¬ korzystniejsze parametry znalezione w omawia¬ nej metodzie otrzymywania androsteronu i epian¬ drosteronu.W porównaniu z przedstawionymi na wstepie metodami chemicznymi i mikrobiologicznymi spo¬ sób wedlug wynalazku daje szereg korzysci — hodowle opisanego szczepu Rhodotorula mucilagi¬ nosa przeprowadza sie prostym sposobem na po¬ zywce maltozowej, przy czym fermentacja doda¬ nych substratów przebiega przy pomocy calej kul¬ tury bez izolowania preparatu enzymatycznego.W czasie tego procesu przeksztalcenia androsten¬ dionu do androsteronu i epiandrosteronu zachodza równoczesnie redukcja podwójnego wiazania 4,5 do ukladu pierscieni A/B trans oraz redukcja gru¬ py ketonowej na C-3 do obu alkoholi a i fi. W te¬ stosteronie ma miejsce ta sarna wielostopniowa transformacja oraz utlenienie alkoholu na C-17 do ketonu. 0 W znanych pracach mikrobiologicznych po¬ slugiwano sie preparatami enzymatycznymi, któ¬ rych izolowanie jest pracochlonne i trudne. Jako substraty stosowane sa natomiast 5a-androsban- -3, 17-dion, 5a-androstan-3a, 17/?-diol lub octan 5a-androstan-3a-ol-17-onu, które ulegaja jedno- stopniowemu przeksztalceniu (redukcja ketonu na C-3, utlenienie alkoholu na C-17 lub hydroliza octanu na C-3). We wszystkich przypadkach sub¬ straty posiadaja juz konfiguracje A/B trans.Dotychczas znane metody mikrobiologiczne ze wzgledu nia skomplikowane materialy wyjsciowe i poslugiwanie sie trudno dostepnymi preparatami enzymatycznymi sa nieprzydatne do zastosowa¬ nia w produkcji na skale przemyslowa.W metodach chemicznych natomiast stosowano równiez substraty, które badz to posiadaly juz uklad pierscieni A/B trans, badz to wymagaly kilkustopniowych procesów prowadzacych do opi¬ sywanych produktów. Rozdzial produktów wyma¬ gal zastosowania digitoniny i rozkladu digitonidu.Metoda mikrobiologiczna wedlug wynalazku transformacji androstendionu lub testosteronu prowadzaca do mieszaniny androsteronu i epian¬ drosteronu jest wiec od przedstawionych spo¬ sobów korzystniejsza ze wzgledu na przeprowa¬ dzenie kilkustopniowego przeksztalcenia w jednej reakcji, a w rozdziale chromatograficznym unika sie stosowania digitoniny. Osiagnieto wydajnosci do 75 nego do kultury wodnej substratu) o prawie rów¬ nej ilosci androsteronu i epiandrosteronu.Wynalazek wyjasniaja blizej nastepujace przy¬ klady: Przyklad I. W czterech kolbach o pojem¬ nosci 2 1, zawierajacych po 1,2 1 sterylnej pozywki maltozowfcj otrzymanej przez rozpuszczenie 20 g '*'5 59682 6 ekstraktu slodowego o skladzie podanym wyzej w jednym 1 wody wodociagowej, zaszczepia sie wyzej opisany szczep Rhodotorula mucilaginosa.Po czterech dniach wzrostu szczepu przy wstrza¬ saniu w temperaturze 27°C i przy wartosci pH — 5 5 dodaje sie do kazdej kolby po 110 mg andro- stendionu rozpuszczonego w 1,5 ml acetonu. Fer¬ mentacje prowadzi sie przy wstrzasaniu w ciagu 14 dni.Roztwór metabolityczny zawierajacy zawiesine 10 zarodników po dodaniu 200 ml metanolu do kaz¬ dej kolby wstrzasa sie dodatkowo w ciagu 1 go¬ dziny. Nastepnie polaczona zawartosc czterech kolb elkstrahuj-e sie trzykrotnie chloroformem w porcjach po 1,2 1. Ekstrakty chloroformowe la- 15 czy sie, suszy nad bezwodnym Na2S04. Po odde¬ stylowaniu rozpuszczalnika organicznego otrzy¬ muje sie 450 mg pólkrystaiicznych produktów przemiany androstendionu — izoluje sie wieksza ilosc produktów niz dodaje, ze wzgledu na za- 20 nieczyszczenia metabolitami wlasnymi Rhodoto¬ rula mucilaginosa. 450 mg produktów przemiany chromatografuje sie pod 150 mm Hg nadcisnienia na 60 g zelu krzemionkowego o sredniej srednicy ponizej 25 0,08 mm mieszanina benzenu i metanolu o sto¬ sunku objetosciowym 100 :2,5. W wyniku otrzy¬ muje sie 45 mg 5a-androstan-3,17-dionu, 7 mg androstendionu, 25 mg testosteronu oraz 325 mg mieszaniny androsteronu i epiandrosteronu. Z ko- 30 lei w trzykrotnej chromatografii 325 mg miesza¬ niny na 40 g krzemianu magnezu I aktywnosci eluentem benzen-metanol o stosunku objetoscio¬ wym 100:5 uzyskuje sie 170 mg androsteronu i 155 mg epiandrosteronu.Przyklad II. Sposób postepowania taki sam, jak w przykladzie I, z tym, ze do kazdej kolby dodaje sie po 110 mg testosteronu. Pozostale czyn¬ nosci przeprowadza sie w analogiczny sposób.Izoluje sie po fermentacji 450 mg mieszaniny produktów zawierajacych zanieczyszczenia, pocho¬ dzace z metabolitów wlasnych Rhodotorula muci¬ laginosa. W wyniku chromatografii z 450 mg produktów przemiany otrzymuje sie 38 mg 5a- -androstan-3,17-dionu, 10 mg androstendionu, 65 mg testosteronu i 295 mg mieszaniny androste¬ ronu i epiandrosteronu. Trzykrotna chromato¬ grafia 295 mg mieszaniny na 35 g krzemianu ma¬ gnezu daje 150 mg androsteronu i 135 mg epian¬ drosteronu. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób równoczesnego otrzymywania androste¬ ronu i epiandrosteronu na drodze mikrobiologiicz- nej znamienny tym, ze do 3—5-dniowej kultury wodnej szczepu nalezacego do gatunku Rhodoto¬ rula mucilaginosa dodaje sie androstendion lub testosteron w ilosciach 100—120 mg/litr kultury wodnej, po czym prowadzi sie fermentacje wstrza¬ sana w ciagu 10—20 dni w temperaturze 22—28°C przy wartosci pH = 4,5—6,0, a nastepnie ekstrahu¬ je sie chloroformem mieszanine, zawierajaca jako glówne produkty androsteron i epiandrosteron, które z kolei rozdziela sie na drodze chromato¬ graficznej. PL