PL59584B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: Opublikowano: 30JV.1970 59584 KI. 6 b, 16/03 MKP C 12 d Q\0O Wspóltwórcy wynalazku: mgr inz. Wieslaw Lewenstein, mgr inz. Zdzi¬ slaw Zakrzewski, mgr Sabina Raczkowska, mgr Anna Groszkiewicz, mgr Irena Wierzbicka, inz.Maria Iwaszkiewicz, Barabara Sokolowska Wlasciciel patentu: Instytut Farmaceutyczny, Warszawa (Polska) Sposób wyodrebniania 17a, 21-dwuhydroksypregnen-4-dionu-3,20 z brzeczki pofermentacyjnej Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodrebnia¬ nia 17 brzeczki pofermentacyjnej. 17a, 21-dwuhydroksy- pregnen-4-dion-3,20, wazny produkt posredni w syntezie kortykoidów, powstaje w wyniku podda¬ wania 3,21-dwuoctanu pregnen-5-triol-3/3, 17a, 21- onu-20 dzialaniu odpowiednich drobnoustrojów hy- drolizujacych, odwodorniajacych i izomeryzujacych, przy czym w sklad brzeczki pofermentacyjnej obok zanieczyszczen wchodzi zarówno produkt jak i nie- przereagowany substrat sterydowy.Znany sposób wyodrebniania z brzeczki pofer¬ mentacyjnej mieszaniny obu sterydów polega na bezposredniej ekstrakcji brzeczki chlorowcoalka- nem lub chlorowcalkenem, po czym pozostalosc po odparowaniu rozpuszczalnika rozdziela sie chro¬ matograficznie lub przez wielokrotna krystaliza¬ cje. Przy tym sposobie do ekstraktu dostaje sie wiele substancji stanowiacych rozpuszczalne i nie¬ rozpuszczalne w brzeczce zwiazki, takie jak sub¬ stancje bialkowe, lipidy, cukry i produkty degrada¬ cji tych zwiazków oraz barwniki, pochodzace za¬ równo z podloza wzrostowego, jak i powstale w wyniku procesów metabolizmu, które utrudniaja wyodrebnienie produktu i nieprzereagowanego sub- stratu w postaci czystej.Sposób ten zwiazany jest ze znacznym nakladem pracy i czasu. Tak wiec na przyklad operowanie duzymi objetosciami toksycznych rozpuszczalni¬ ków zmusza do stosowania specjalnych warunków 10 15 20 25 30 bezpieczenstwa i higieny pracy, przy czym wlasci¬ wosci zawartych w brzeczce skladników, a glów¬ nie zawiesiny mikroorganizmów, prowadza do po¬ wstawania trudnej do rozdzielenia wieloskladniko¬ wej warstwy emulsyjnej czyli tzw. interfazy, oraz woduje duze zuzycie tych rozpuszczalników, a rozdzielanie chromatograficzne lub przez wielokro¬ tna krystalizacje jest klopotliwe i trudne do stoso¬ wania w skali przemyslowej.W pewnych przypadkach rozdzielanie to jest ma¬ lo skuteczne i produkt daje sie wyodrebnic dopiero na drodze chemicznej poprzez na przyklad pochod¬ na Girarda, co wydatnie obniza wydajnosc.Stwierdzono, ze trudnosci te mozna ominac przez oddzielenie czesci stalych brzeczki, w których znaj¬ duje sie przewazajaca wiekszosc sterydów, wysu¬ szenie osadu i poddanie go kilkakrotnej ekstrakcji za pomoca kilku odpowiednio dobranych rozpusz¬ czalników organicznych, selektywnie rozpuszcza¬ jacych poszczególne skladniki, przy czym sposób ten w pelni nadaje sie do zastosowania w skali przemyslowej.Wedlug wynalazku brzeczke pofermentacyjna za¬ wierajaca 17a, 21-dwuhydroksypregnen-4-dion-3,20 oraz nieprzereagowany 3,21-dwuoctan pregnen-5- triol-3|3, 17a, 21-onu-20 poddaje sie sedymentacji iAub odwirowaniu badz odsaczeniu, osad suszy sie, rozdrabnia i ekstrahuje benzenem, eterem nafto¬ wym oraz mieszanina chlorowcoalkanu, takiego jak chlorek metylenu i niskiego alkanolu, takiego jak 59584;*¦:;.*. 59584 %* i metanol, przy czym rozpuszczalniki te mozna sto¬ sowac w róznej kolejnosci.Brzeczke pofermentacyjna, uprzednio ogrzana w ciagu okolo 1 godziny do temperatury okolo 100°C w celu ulatwienia sedymentacji i zniszczenia form wegetatywnych drobnoustrjów, pozostawia sie na kilka godzin i dekantuje tzw.n supernatant od za¬ wiesiny osadu, po czym osad odwirowuje sie lub odsacza. W przypadku zmniejszenia szybkosci se¬ dymentacji, na przyklad przy wzmozonej lizie ko¬ mórek drobnoustrojów, zwlaszcza pod wplywem zwiekszonego pH srodowiska, trzeba przystapic od razu do odwirowania lub odsaczenia czesci stalych T*. j C^djlz$eleriie 'dsldu prowadzi do pozostawienia w cieklej fazie brzeczki rozpuszczalnych substancji t i barwników, które utrudniaja oczyszczanie produ- ; fctu i substratu sterydowego. Faza ta po oddziele- I niu ^osadu zawiera jeszcze okolo 2% rozpuszczo¬ nych sterydów, jednakze jak stwierdzono oplaci sie zrezygnowac z tej czesci sterydów poddajac przerobowi sam tylko osad. Te czesc sterydów mo¬ zna zreszta wyekstrahowac w latwy sposób z cie¬ klej fazy brzeczki, poniewaz nie zawiera ona juz osadu wywolujacego powstawanie trudnej do roz¬ dzielenia interfazy.Wysuszenie osadu przez ogrzewanie w tempera¬ turze 50—60°C pod zmniejszonym cisnieniem oraz dokladne rozdrobnienie, korzystnie do wielkosci ziarna nie wiekszej niz 4 mikrony, powoduje ter¬ miczna i mechaniczna denaturacje bialka oraz pozbawia go wlasciwosci koloidogennych, co nasu¬ wa glówna przyczyne powstawania interfazy.Otrzymany w ten sposób osad zawiera obok stery¬ dów komórki drobnoustrojów, lipidy, czesc bar¬ wników i inne zanieczyszczenia, w odmiennym je¬ dnak skladzie jakosciowym i w mniejszej ilosci niz surowy produkt otrzymany przez ekstrakcje calej brzeczki.Dla oddzielenia zanieczyszczonej lipidami mie¬ szaniny produktu i substratu sterydowego stosuje sie wedlug wynalazku ekstrakcje osadu mieszani¬ na chlorowcoalkanu, takiego jak chlorek metylenu i niskiego alkanolu, takiego jak metanol. Dla od¬ dzielenia zwiazków barwnych stosuje sie przy tym srodki odbarwiajace, na przyklad wegiel aktywny.Dla oddzielenia produktu od substratu sterydo¬ wego oraz substancji lipidowych stosuje sie wedlug wynalazku ekstrakcje benzenem. Natomiast reszte substancji lipidowych oddziela sie przez ekstrakcje eterem naftowym.Kolejnosc stosowania rozpuszczalników wplywa na jakosc i wydajnosc wyodrebnianego i oczyszcza¬ nego produktu i w zaleznosci od potrzeb moze byc celowo zmieniana.Najwyzsza wydajnosc produktu uzyskuje sie przez ekstrakcje osadu mieszanina chlorku metyle¬ nu i metanolu, korzystnie w stosunku objetoscio¬ wym 1 :1, przy czym do ekstraktu przechodzi pro¬ dukt i substrat oraz lipidy, odparowanie ekstraktu, wyekstrahowanie z pozostalosci substartu i czesci lipidów za pomoca benzenu i nastepnie wyekstra¬ howanie reszty lipidów za pomoca eteru naftowe¬ go. Otrzymuje sie produkt o zabarwieniu lekko zóltawym.Produkt nieomal bezbarwny, ale o nieco nizszej' wydajnosci mozna uzyskac przez ekstrakcje osada mieszanina chlorku metylenu i metanolu, czesciowe zageszczenie ekstraktu, oddzielenie wykrystalizowa- 5 nej mieszaniny sterydów zanieczyszczonej lipidami,, wyekstrahowanie mieszaniny eterem naftowym i nastepnie wyekstrahowanie mieszaniny sterydów benzenem. • Najbardziej czysty produkt calkowicie bezbar- 10 wny i o wysokiej wartosci ekstynkcji, uzyskuje sie; przez poddanie osadu ekstrakcji kolejno benzenem i mieszanina chlorku metylenu i metanolu, zagesz¬ czenie ekstraktu chlorek metylenu — metanol, odsa¬ czenie wykrystalizowanego produktu zanieczyszczo- 15 nego lipidami i wyekstrahowanie go eterem nafto¬ wym.Ponizsze przyklady, w których temperatury po¬ dano w stopiach Celsjusza, wyjasniaja blizej wyna¬ lazek. 20 P r z y k l a d I. Brzeczke pofermentacyjna pocho¬ dzaca z procesu biotransformacji sterydu w ilosci 99,16 g w przeliczeniu na 3,17,21-trójhydroksypre- gnen-5-on-20 ogrzewano w ciau 1 godziny w tem¬ peraturze 90—100° i pozostawiono do samorzutnego 25 ochlodzenia do temperatury pokojowej. Nastepnie oddzielono osad od supernatantu odsaczajac go przez filtr Seitza i wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze okolo 55°. Otrzymany osad w ilosci 100,75 g sproszkowano w mozdzierzu, 30 przeniesiono do kolby okraglodennej, dodano 1000 ml mieszaniny chlorku metylenu z metanolem w stosunku objetosciwym 1 :1 i mieszano w tempera¬ turze pokojowej przez jedna godzine z dodatkiem 3°/o wegla aktywnego w stosunku do wagi osadu. 35 Osad odsaczono przezsaczek Schotta G4 i prze¬ myto wielokrotnie malymi porcjami mieszaniny chlorek metylenu-metanol az do calkowitego od¬ mycia sterydów. Polaczone przesacze zageszczono pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze oko- 40 lo 50° do konstystencji gestej papki i pozostawiono przez kilka godzin. Wydzielony osad odsaczono i przemyto kilkoma porcjami wrzacego eteru naf¬ towego, frakcja 35—(55°, usuwajac w ten sposób substancje lipidowe. 45 Z przesaczu chlorek metylenu-metanol uzyskano w analogiczny sposób II i III rzut mieszaniny ste¬ rydów. Polaczone produkty uwolniono od nieprze- reagowanego substratu (w postaci glównie dwuoc- tanu z domieszka octanu i alkoholu) przez ekstra- 50 keje benzenem w ilosci 90 ml na 1 g zawartego w nich 3,21-dwuoctanu 3,17,21-trójhydroksypregnen- 5-onu-20. W tym celu ogrzewano mieszanine do wrzenia utrzymujac zawartosc kolby w tej tempe¬ raturze przy energicznym mieszaniu w ciagu je- 55 dnej godziny.Po ochlodzeniu do temperatury pokojowej za¬ wartosc kolby przesaczono przez saczek Schotta G3, osad przemyto 2—3-krotnie malymi porcjami benzenu i wysuszono. Uzyskano chromatograficznie 60 czysty 17,21-dwuhydroksypregnen-4-dion-3,20 z wydajnoscia 11,0°/0 o ekstyncji E j cm = 45IX max = = 240 m[i. Z roztworu benzenowego zawierajacego mieszanine nieprzereagowanego substratu i produ- 65 ktu w stosunku ilosciwym okolo 4:1 oddestylowa-59984 no rozpuszczalnik i wyodrebnione substancje ste¬ rydowe skierowano do ponownej biotransformacji.Przyklad II. Z otrzymanego jak w przykla¬ dzie I przesaczu oddestylowano chlorek metylenu i metanol. Otrzymana sucha pozostalosc uwolniono od nieprzereagowanego substratu i wiekszosci lipi¬ dów przez ekstrakcje wrzacym benzenem w spo¬ sób opisany w przykladzie I i usunieto resztki sub¬ stancji lipidowych przemywajac ja porcjami wrza¬ cego eteru naftowego frakcja 35—65°, a nastepnie wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem w tempe¬ raturze okolo 55°. Otrzymano chromatograficznie czysty lekko zóltawy 17,21-dwuhydroksypregnen-4- -dion-3,20 z wydajnoscia 79,7% o ekstynkcji E /* — = 452 przy X 240 m\i. Przesacz benzenowy odparo¬ wano do sucha, pozostalosc przemyto wrzacym ete¬ rem naftowym i wyodrebniony substrat (w postaci mieszaniny dwuoctanu, octanu i wolnego alkoholu) z domieszka produktu skierowano do ponownej bio¬ transformacji.Przyklad III. Otrzymany jak.w przykladzie I wysuszony i sproszkowany surowy produkt bio¬ transformacji przeniesiono do kolby okraglodennej, dodano benzenu w stosunku 90 ml benzenu na 1 g zawatego w osadzie pierwotnego substratu sterydo¬ wego i ogrzewano pod chlodnica zwrotna w ciagu 1 godziny w temperaturze wrzenia przy energicz¬ nym mieszaniu. Zawartosc kolby pozostawiono do osiagniecia temperatury pokojowej, po czym osad odsaczono i przemyto 2—3 razy malymi porcjami benzenu.Nastepnie z osadu na saczku wymywano 17,21- dwuhydroksypregnen-4-dion-3,20 mieszanina chlor¬ ku metylenu i metanolu (stosunek objetosciowy 1 :1), stosowana malymi porcjami, az do calkowite¬ go wyekstrahowania tego zwiazku. Otrzymany eks¬ trakt zatezono pod zmniejszonym cisnieniem do konsystencji gestej papki i pozostawiono w chlodni w ciagu 8 godzin. Wydzielony osad odsaczono, prze¬ myto kilkoma malymi porcjami wrzacego eteru 5 naftowego frakcja 35—65° i wysuszono pod zmniej¬ szonym cisnieniem w temperaturze okolo 55°. Uzy¬ skano chromatograficznie czysty 17,21-dwuhydro- ksypregnen-4^dion-3,20 z wydajnoscia 63,5°/o o eks¬ tynkcji ^2^ = 462 przy vmax = 240 mji. Przesacz benzenowy przerobiono w sposób opisany w przy¬ kladzie II.Przyklad IV. Z otrzymanego jak w przykla¬ dzie III roztworu 17,21-dwuhydroksypregnen-4- -dionu-3,20 w mieszaninie chlorku metylenu i me¬ tanolu oddestylowano calkowicie rozpuszczalniki, pozostalosc w kolbie poddano kilkakrotnej ekstrak- cij eterem naftowym frakcja 35—65° w celu od¬ dzielenia resztek substancji lipidowych i wysu¬ szono pod zmniejszonym cisnieniem w temperatu¬ rze 55°. Uzyskano chromatograficznie czysty 17,21- dwuhydroksypregnen-4-dion-3,20 m z wydajnoscia 74,3% o ekstynkcji Ej^ = 462 przy Xmax = 240 mpi. 10 15 20 25 30 35 PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wyodrebniania 17 gnen-4-dionu-3,20 z brzeczki pofermentacyjnej za¬ wierajacej nieprzereagowany substrat sterydowy, znamienny tym, ze brzeczke poddaje sie sedmenta- cji i/lub odwirowaniu badz odsaczeniu, osad suszy sie, rozdrabnia i ekstrahuje benzenem, eterem naf¬ towym oraz mieszanina chlorowcoalkanu, takiego jak chlorek metylenu i nizszego alkanolu, takiego jak metanol, przy czym rozpuszczalniki te mozna stosowac w róznej kolejnosci. PL