PL56644B1 - - Google Patents

Description

29.X. 1962 Stany Zjednoczone Ameryki Opublikowano: 30.1.1969 56644 KI. 30 h, 6 MKP C 1249tó CZYTELNIA Wspóltwórcy wynalazku: Jerry Robert Daniel Mc Cormick, Noweli Os¬ car Sjolander, Sylvia Jennie Johnsen, Jules Reichental Wlasciciel patentu: American Cyanamid Company Township of Wayne, New Jersey (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób biologicznego przeksztalcania pochodnych naftacenu w zwiazki o dzialaniu antybiotyków typu tetracykliny Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania anty¬ biotyków typu tetracykliny.Sposób wedlug wynalazku polega na biologicz¬ nym przeksztalcaniu pochodnych naftacenu o wzo¬ rze ogólnym 2, w którym R4 oznacza wodór lub grupe dwumetyloaminowa, R5 oznacza wodór, grupe hydroksylowa, nizsza alkilowa lub nizsza alkoksylowa, R6 oznacza wodór lub nizszy alkil, R7 oznacza wodór, hqlogen lub grupe hydroksylowa, Rs i Rq ozndczaja wodór w zwiazki o dzialaniu an¬ tybiotyków typu tetracykliny o wzorze ogólnym 1, w którym R'5 jest identyczne jak R5 i R5, R6 R? Rg, R9 maja takie same znaczenie jak we wzorze 2, przez poddanie fermentacji tlenowej w wodnym srodowisku odzywczym pochodnej naftacenu za pomoca fermentujacego szczepu Streptomyces, zdol¬ nego do biologicznego zuzytkowania takich po¬ chodnych naftacenu. Fermentacje kontynuuje sie do momentu przeksztalcenia pochodnej naftacenu w odpowiednia tetracykline.W czasie fermentacji do pozycji 6 i 12a pierscie¬ nia wyjsciowej pochodnej saftacenu zostaja wpro¬ wadzone grupy hydroksylowe, przy czym w przy¬ padku jezeli pozycja 4 pierscienia naftacenu jest niepodstawiona, zostaje wprowadzona równoczes¬ nie do tej pozycji grupa dwumetyloaminowa. W przypadku jezeli pozycje 7 i/lub 5 pierscienia wyj¬ sciowej pochodnej naftacenu sa niepodstawione, stosuje sie ewentualnie taki szczep Streptomyces, który wprowadza do pierscienia wyjsciowej pochod- 2 nej naftacenu oprócz wyzej wymienionych grup, grupe 7 halogenowa i/lub 5 hydroksylowa. Reakcje biologicznego przeksztalcania, zachodzace w czasie fermentacji przedstowia schemat I. 5 Dla wygody 1, 3, 10, 11, 12-pieciohydroksynafta- ceno-2-karbonamid nazwano „pretetramidem". Tak wiec podstawione 1, 3, 10, 11, 12-pieciohydroksynaf- taceno-2-karbonamidy, bedace substancjami wyjs¬ ciowymi w procesie wedlug wynalazku, nazwac 10 mozna dogodnie pochodnymi pretetramidu. Np. 6- -metylo-1, 3, 10, 11, 12-pieciohydroksynaftaceno- 2-karbonamid jest odpowiednio 6-metylopretetrami- dem, dalej 7-chloro-l, 3, 10, 11, 12-jieciohydroksy- naftacenokarbonamid-2 jest 7-chloropretetramidem 15 i 4-dwumetyloamino-l, 3, 10, 11, 12-pieciohydro- ksynaftaceno-2-karbonamid nazywa sie dogodnie 4-dwumetyloaminopretetramidem.Wytwarzanie pretetramidów, stosowanych jako substancje wyjsciowe w procesie wedlug wynalaz- 20 ku, opisano w opisie patentowym nr 55957. Spo¬ sób ten polega na kondensacji odpowiednio pod¬ stawionego bezwodnika ftalowego z odpowiednio podstawionym 1,3-dwuhydroksynaftalenem i zre¬ dukowaniu powstalego jako produkt posredni 6- 25 hydroksynaftaceno-5, 12-chinonu lub naftaceno-6, 11-chinonu, albo na kondensacji odpowiednio pod¬ stawionego naftalenu z odpowiednio podstawionym bezwodnikiem 3,5-dwuhydroksyftalowym oraz re¬ dukcji powstalego jako produkt posredni 6-hydrok- 30 synaftaceno-5,12-chinonu. 566443 Stwierdzono, ze mozna dokonac biologicznego przeksztalcenia pretetramidów w antybiotyki typu tetracykliny. W sposobie wedlug wynalazku na¬ stepuje biologiczne uwodnienie pretetramidów w pozycjach 5a, 6 i 4a, 12a, czyli polaczenie dwóch moli wódy, jednego w pozycji 5a, 6, a drugiego w pozycji 4a, 12a. Przeksztalcenia tego dokonuje sie przez dodanie podstawionego pretetramidu lub sa¬ mego pretetramidu do srodowiska fermentacyjnego, zaszczepionego szczepem gatunku w rodzaju Strep¬ tomyces, zdolnym do wytworzenia jednego z anty¬ biotyków typu tetracykliny. Równoczesnie moga zachodzic pewne inne biologiczne przeksztalcenia przy uwodnieniu pretetramidów w pozycjach 5a, 6 i 4a, 12a. Na przyklad, jezeli R4 w powyzszym schemacie reakcji oznacza wodór, to jakikolwiek szczep z rodzaju Streptomyces wprowadzi grupe dwumetyloaminowa w polozeniu 4 pretetramidu.Jezeli R4 oznacza grupe dwumetyloaminowa, to podstawnik ten pozostaje w polozeniu 4 bez wzgle¬ du na przeksztalcenia biologicznie dokonujace sie w pozostalej czesci czasteczki pretetramidu. Jezeli R5 w powyzszym schemacie oznacza wodór, to przy zastosowaniu hydroksylujacego w polozeniu 5 ga¬ tunku z rodzaju Streptomyces, wprowadza sie grupe hydroksylowa w pozycji 5. Jezeli R5 oznacza niz¬ szy alkil lub wodór, to przy zastosowaniu niehy- droksylujacego w polozeniu 5 gatunku z rodzaju Streptomyces — R'5 oznaczac bedzie odpowiednio nizszy alkil lub wodór. Jezeli R7 w powyzszym schemacie oznacza podstawnik inny niz wodór, to podstawnik ten pozostaje w pozycji 7 bez wzgledu na przeksztalcenia biologiczne, jakie dokonuja sie w pozostalej -czesci' czasteczki pretetramidu. Jezeli R7 oznacza wodór, to przy zastosowaniu niehalo- genujacego szczepu Streptomyces — R7 w produk¬ cie oznacza równiez wodór. Jezeli R7 w czasteczce pretetramidu oznacza wodór, to przy zastosowaniu halogenujacego w polozeniu 7 szczepu z rodzaju Streptomyces — R7 w produkcie oznacza chlor lub brom w zaleznosci od warunków fermentacji.Ponizej podano szczepy Streptomyces aureofa¬ ciens, które wprowadzaja chlor lub brom w pozycji 7 czasteczki pretetramidu jak równiez powoduja podwójne uwodnienie w pozycjach 5a, 6 i 4a, 12a oraz wprowadzanie grupy dwumetyloaminowej, o ile R4 oznacza wodór: Streptomyces aureofaciens ATCC 10762a ATCC 10762b ATCC 10762g ATCC 10762i ATCC 11989 „ „ ATCC 12416b ATCC 12416C ATCC 12416d ATCC 12551 ATCC 12552 ATCC 12553 ATCC 12554 ATCC 13189 ATCC 13899 ATCC 13900 NRRL B-1286 NRRL B-1287 NRRL B-1288 ¦¦• - ¦' 4 streptomyces aureofaciens NRRL 2209 NRRL B-2406 NRRL B-2407 NRRL 3013 5 Przedstawicielem niehalogenujacego szczepu ro¬ dzaju Streptomyces, czyli szczepu, który nie wpro¬ wadza chlorowca w pozycji 7 pretetramidu, lecz powoduje podwójne uwodnienie w pozycjach 5a, 6 i 4a, 12a oraz wprowadzenie grupy dwumetyloa- 10 minowej, o ile R4 oznacza wodór, jest Streptomyces aureofaciens NRRL 3014.Przedstawicielem niehalogenujacych szczepów z rodzaju Streptomyces, które wprowadzaja grupe hydroksylowa w pozycji 5 czasteczki pretetramidu 15 poza powodowaniem podwójnego uwodnienia w po¬ zycjach 5a, 6 i 4a, 12a oraz wprowadzeniem grupy 4-dwumetyloaminowej przy R4 oznaczajacym wo¬ dór sa Streptomyces rimosus NRRL 2234; Strepto¬ myces platensis NRRL 2364 i Streptomyces hygro- 20 scepicus NRRL 3015.Organizmami, które nadaja sie do stosowania w sposobie wedlug wynalazku, sa wszystkie orga- ; nizmy z gatunku rodzaju Streptomyces wytwarza¬ jace antybiotyki typu tetracykliny. Korzystne jest 25 jednak stosowanie tych gatunków z rodzaju Stre¬ ptomyces, które nie wytwarzaja antybiotyków typu tetracykliny, o ile w srodowisku fermentacyjnym nie jest obecna pretetramidowa pochodna nafta- cenu, w której grupa hydroksylowa podstawiona 30 jest w pozycjach 1, 3, 10, 11 i 12 pierscienia, d gru¬ pa karbonamidowa w pozycji 2 pierscienia.Jezeli zastosuje sie gatunki z rodzaju Strepto¬ myces, które wytwarzaja antybiotyki typu te¬ tracykliny bez obecnosci pretetramidów, antybioty- 36 ki te powstana z fermentujacych czynników od¬ zywczych jak równiez z pretetramidów, co w pew¬ nych przypadkach spowoduje koniecznosc oddziele¬ nia róznych typów takich antybiotyków. W niektó¬ rych przypadkach moze byc pozadane dodanie pew- 40 nego szczególnego pretetramidu do fermentujacych szczepów gatunku Streptomyces wytwarzajacych antybiotyki typu tetracykliny, w celu zwiekszenia produkcji pewnego szczególnego antybiotyku tego typu. 45 Przedstawicielami pretetramidów, które mozna biologicznie przeksztalcic sposobem wedlug niniej¬ szego wynalazku za pomoca niehalogenujacego szczepu z rodzaju Streptomyces sa np. (1) prete- tramid, (2) 4-dwumetyloaminopretetramid i (3) 6- 50 metylo- 4-dwumetyloaminopretetramid, z których otrzymuje sie odpowiednio (1) 6-demetylotetracy- kline, (2) 6-demetylotetracykline i (3) tetracykline.Przedstawicielami pretetramidów, które mozna biologicznie przeksztalcic sposobem wedlug wyna- 55 lazku za pomoca halogenujacego w polozeniu 7 szczepu z rodzaju Streptomyces sa np. (1) pretetra- mid, (2) 6-metylopretetramid, (3) 4-dwumetyloami¬ nopretetramid i (4) 6-metylo-4-dwumetyloamino- pretramid, z których otrzymuje sie odpowiednio (1) 60 7-chloro-6-demetylotetracykline, (2) 7-chlorotetra- cykline (3) 7-chloro-6-demetylotetracykline i (4) 7- chlorotetracykline.Przedstawicielami pretetramidów, które mozna biologicznie przeksztalcic sposobem wedlug wyna- 65 lazku za pomoca hydroksylujacego w polozeniu 55 56644 6 szczepu z rodzaju Streptomyces jest 6-metylopre- tetramid, z którego otrzymuje sie 5-hydroksytetra- cykline.Pochodna naftacenu o wzorze ogólnym 4, w którym R4 oznacza wodór lub grupe dwumetyloami- nowa a R6 oznacza wodór lub nizszy alkil pod¬ daje sie tlenowej fermentacji w srodowisku wod¬ nym za pomoca szczepu Streptomyces z gatunku wytwarzajacego tetracykliny, lecz niehalogenuja- cego w polozeniu 7 tej pochodnej i otrzymuje sie tetracykline o wzorze 3, w którym R6 ma wyzej po¬ dane znaczenie.Pochodna naftacenu o wzorze ogólnym 4, w któ¬ rym R4 i R6 maja wyzej podane znaczenia poddaje sie tlenowej fermentacji w srodowisku wodnym za pomoca hydroksylujacego w polozeniu 5 szcze¬ pu Streptomyces z gatunku wytwarzajacego tetra¬ cykliny przy czym otrzymuje sie tetracykline o wzorze 5, w którym R6 ma wyzej podane znaczenie.Jezeli natomiast ten sam zwiazek wyjsciowy podda sie fermentacji za pomoca szczepu Streptomyces z gatunku wytwarzajacego tetrocykliny i haloge¬ nujacego w polozeniu 7 te pochodna, otrzymuje sie tetracykline o wzorze 6, w którym Re ma wyzej podane znaczenie a R7 oznacza halogen.Pochodna naftacenu 1, 3, 10, 11, 12-pieciohydrok- synaftaceno-2-karbonamid poddana tlenowej fer¬ mentacji w srodowisku wodnym za pomoca szczepu Streptomyces z gatunku wytwarzajacego tetracyk¬ liny, lecz niehalogenujacego w polozeniu 7 tej pochodnej, ulega przemianie w 6-demetylotetra- cykline.Ten sam produkt wyjsciowy poddany tlenowej fermentacji w srodowisku wodnym za pomoca szczepu Streptomyces z gatunku wytwarzajacego tetracykliny i halogenujacego w polozeniu 7 te po¬ chodna daje jako produkt koncowy 7-chloro-6-de- metylotetracykline.Pretetramidy sluza w tym sposobie jako substra- ty w reakcji biologicznego przeksztalcania za po¬ moca mikroorganizmów w antybiotyki typu tetra¬ cykliny.Warunki fermentacji w celu biologicznego prze¬ ksztalcenia pretetramidów w antybiotyki typu te¬ tracykliny sa w zasadzie te same, jakie podano w opisach patentowych St. Zjedn. Am. nr 2482055, nr. 2734018 i nr. 2878289, które zreszta sa identycz¬ ne z warunkami stosowanymi dotychczas w zna¬ nych sposobach wytwarzania róznych antybioty¬ ków typu tetracykliny droga fermentacji. Oznacza to, ze srodowisko fermentacyjne zawiera zwykle stosowane odzywki i substancje mineralne. Sto¬ sowac mozna rózne odzywki, zawierajace przyswa¬ jalny wegiel, takie jak polisacharydy lub skrobie oraz polialkohole, takie jak gliceryna. Przyswajal¬ nym zródlem azotu sa proteiny, hydrolizaty prote¬ inowe, mocznik, namok kukurydziany, ekstrakty miesne, pepton, oleje roslinne, maczka rybna i inne znane substancje odzywcze. Aniony i kationy wpro¬ wadza sie w postoci ich znanych nietoksycznych soli. Pierwiastki sladowe takie jak mangan, kobalt, cynk, miedz itd. wprowadza sie z wyzej wymie¬ nionymi solami lub z woda wodociagowa jako za¬ nieczyszczenia sladowe, albo tez stosujac roztwo¬ ry celowo wzbogacone w te pierwiastki.Inne warunki fermentacji, takie, jak stezenie jo¬ nów wodorowych, temperatura, szybkosc napowie¬ trzania, przygotowanie szczepu, sterylizacja, zasz¬ czepianie itd. sa znane i podobne do tych, jakie 5 stosuje sie w produkcji innych antybiotyków typu tetracykliny wedlug wyzej wymienionych amery¬ kanskich opisów patentowych.Jedynie przy zastosowaniu halogenujacego w po¬ lozeniu 7 szczepu rodzaju Streptomyces oraz pre- 10 tetramidu, w którym R7 oznacza wodór, nalezy sto¬ sowac srodowisko fermentacyjne, zawierajace co najmniej 10 czesci na milion, a korzystnie 1000— 1500 czesci na milion jonów chlorkowych, w przy¬ padku wprowadzenia podstawnika 7-chlorowego, 15 albo podobna ilosc jonów bromkowych, w przy¬ padku wprowadzenia podstawnika 7-bromowego.Po przeprowadzeniu fermentacji w odpowiednim okresie czasu, np. 12—96 godzin i zakonczeniu prze¬ ksztalcania zwiazku pretetramidowego w pozadana 20 tetracykline, wydziela sie zwiazek typu tetracykli¬ ny z zacieru fermentacyjnego w jakikolweik ze znanych sposobów.Wyjsciowe pretetramidy dodaje sie do srodowisk oc odzywczych w dowolnym stezeniu, korzystnie w ste- 25 .... . j_ zeniu do 10 g/litr. Stosuje sie równiez wyzsze ste¬ zenia, co prowadzi jednak do pewnego obnizenia wydajnosci. Sposób dodawania jest dowolny, pod warunkiem, aby umozliwial wspóldzialanie pete- 30 tramidu ze srodowiskiem biologicznym. Korzystne jest dodawanie pretetramidu w roztworze takich rozpuszczalników, jak dwumetyloformamid, dwu- metyloacetamid, dwumetylosulfotlenek, czterome- tylenosulfotlenek i N-metylopirolidon, przy czym najkorzystniejszym rozpuszczalnikiem jest dwume¬ tylosulfotlenek, a zwlaszcza roztwór octanu magne¬ zowego w dwumetylosulfotlenku. Roztwory prete¬ tramidów latwo ulegaja utlenieniu, wskutek czego nalezy je chronic przed dostepem powietrza. 4o Wynalazek wyjasniaja blizej nie ograniczajac jego zakresu, ponizsze przyklady: Przyklad I. Biologiczne przeksztalcenie pre¬ tetramidu (1,3,10,11,12-peciohydroksynaftaceno- 2 - -karbonamidu) w 6-demetylotetracykline przy za- 45 stosowaniu Streptomyces aureofaciens NRRL 3014.Zarodniki niehalogenujacych S. aureofaciens NRRL 3016 wymywa sie z agaru sterylna woda destylowana i uzyskuje zawiesine 60—80 X 106 za¬ rodników/ml. Zawiesine te w ilosci 0,33 ml uzywa 50 sie do zaszczepienia znajdujacych sie 20 cm dlugiej probówce 8 ml substancji przygotowanej wedlug nastepujacej receptury: sacharoza 30 g siarczan amonowy 2 g weglan wapniowy 7 g namok kukurydziany 20 g woda wodociagowa do 1000 ml Przed zaszczepieniem roztwór ten sterylizuje sie 60 w ciagu 20 minut w autoklawie pod cisnieniem 1,05 atm. Nastepnie zaszczepiona probówke pod¬ daje sie inkubacji w ciagu 24 godzin, w tempera¬ turze 28°C we wstrzasarce posuwisto-zwrotnej, o cyklu 116 ruchów na minute i otrzymuje za- 66 szczep S. aureofaciens.7 Nastepnie przygotowuje sie srodowisko o naste¬ pujacym skladzie: (NH4)2S04 6,7 g CaC03 9,0 g CoCl2 • 6H20 5,0 g NH4C1 2,0 g MnS04 (techn. 70%) * 0,10 g namok kukurydziany 25,0 g skrobia 52,5 g maczka kukurydziana v 14,5 g woda wodociagowa do 1000 ml Po sterylizowaniu przez 20 minut w autoklawie, pod cisnieniem 1,05 atm., 25 ml tego srodowiska zaszczepia sie w kolbie stozkowej 1 ml porcjami S. aureofaciens.Fermentacje prowadzi sie w ciagu 24 godzin w temperaturze 25°C na wstrzasarce obrotowej o 180 obrotach/min. Nastepnie kazda porcje zacieru prze¬ nosi sie do oddzielnej kolby zawierajacej roztwór 10 mg pretetramidu w 1 ml dwumetylosulfotlenku, po czym kontynuuje sie fermentacje na wstrza- sarce obrotowej przez dalsze 96 godzin, w tempe¬ raturze 25°C. Analiza zacieru wykazuje wtedy obecnosc 15 mg 6-demetylotetracykliny w 1 ml.Badanie zawartosci kolby kontrolnej, która przy¬ gotowuje sie w identyczny sposób, lecz bez dodatku pretetramidu, nie wykazuje obecnosci pretetrami¬ du.Przyklad II. Biologiczne przeksztalcenie pre¬ tetramidu (i, 3, 10, 11,12-pieciohydroksynaftaceno- -2-karbonamidu) w 7-chloro-6-demetylotetracykli- ne z zastosowaniem Streptomyces aureofaciens NRRL 3013.Postepuje sie jak w przykladzie I, stosujac jed¬ nak nastepujaca odmiane! czesciowo sfermento¬ wany zacier halogenujacyeh S. aureofaciens NRRL 3013 przenosi sie do oddzielnych kolb zawieraja¬ cych roztwór 11,4 g pretetramidu w mieszaninie 10 mg octanu magnezowego i 1 ml dwumetylosul¬ fotlenku. Fermentacje kontynuuje sie na wstcza- sarce obrotowej w ciagu dalszych 96 godzin, w temperaturze 28°C. Analiza zacieru wykazuje wter dy obecnosc 85 mg 7-chloro-6-demetylotetracykliny w 1 ml. Badanie zawartosci kolby kontrolnej, przy¬ gotowanej w identyczny sposób, lecz bez dodania pretetramidu, nie wykazuje obenosci 7-chloro-6- demetylotetracykliny.Przyklad III. Biologiczne przeksztalcenie 6- metylopretetramidu w 7-chlorotetracykline z zosto- sowaniem Streptomyces aureufaciens NRRL 3013.Zarodniki S. aureofaciens NRR1 3013 wymywa sie z agaru woda destylowana i uzyskuje zawiesine zawierajaca €0—80X106 zarodników/ml. 0,33 ml tej zawiesiny uzywa sie do zaszczepienia, zawar¬ tych w probówce o dlugosci 20 cm, 8 ml zaszczepu S. aureofaciens wytworzonego jak w przykladzie I.Srodowisko fermentacyjne wytwarza sie takie jak w przykladzie I. Po jego wysterylizowaniu, 25 ml porcje tego srodowiska zaszczepia sie 1 ml daw¬ kami S. aureofaciens, stosujac do tego celu stozko¬ we kolby o pojemnosci 250 ml. Fermentacje pro¬ wadzi sie w ciagu 24 godzin w temperaturze 25°C, na wytrzasarce obrotowej o 180 obrotach/min.Nastepnie kazda porcje zacieru przenosi sie do oddzielnej kolby zawierajacej roztwór 10 mg 6-me- 56644 8 tylopretetramidu w 1 ml dwumetylosulfotlenku, zalkalizowanego wodorotlenkiem amonowym. Fer¬ mentacje kontynuuje sie na wytrzasarce obrotowej w ciagu dalszych 96 godzin, w temperaturze 25°C. 5 Biologiczna analiza zacieru wykazuje wtedy aktyw¬ nosc antybakteryjna odpowiadajaca 180 mg 7-chlo- rotetracykliny w 1 ml. Obecnosc tego produktu potwierdza buforowana chromatografia bibulowa na roztworze butanolu i fosforanu o wartosci pH = 10 3. Badanie zawartosci kolby kontrolnej bez dodatku pretetramidu, przy zastosowaniu tego samego spo¬ sobu postepowania i z dodadaniem sulfotlenku, nie wykazuje obecnosci 7-chlorotetrocykliny.Przyklad IV. Biologiczne przeksztalcenie 6- 1B metylopretetramidu w 7-chlorotetracykline z zasto¬ sowaniem Streptomyces aureofaciens ATCC 10762a.Postepuje sie jak w przykladzie III, z nastepuja¬ ca odmiana: Zamiast zarodników S. aureofaciens NRRL 3013 stosuje sie szczep ATCC 10762a. Czescio- 20 wo sfermentowany zacier przenosi sie do oddziel¬ nych kolb zawierajacych roztwór 11 mg 6-metylo- pretetramidu w mieszaninie 10 mg octanu magne¬ zowego i 1 ml dwumetylosulfotlenku, po czym fer¬ mentacje kontynuuje sie na wstrzasarce obrotowej 25 w ciagu dalszych 96 godzin, w temperaturze 28°C.Analiza zacieru wykazuje wtedy obecnosc 265 mg 7-chlorotetracykliny w 1 ml. Badanie zawartosci kolby kontrolnej, przy zastosowaniu tego samego sposobu postepowania, lecz bez dodania 6-metylo- 30 pretetramidu, nie wykazuje obecnosci 7-chlorotetra¬ cykliny.Przyklad V. Biologiczne przeksztalcenie 6- metylopretetramidu w tetracykline z zastosowaniem Streptomyces aureofaciens NRRL 3014. •5 Postepuje sie jak w przykladzie lv z nastepujaca odmiana: Stosuje sie zarodnik niehalogenujacych S. aureofaciens NRRL 3014 zamiast ATCC 10762a.Czesciowo sfermentowany zacier przenosi sie do oddzielnych kolb zawierajacych roztwór 11 mg 6- 40 metylopretetramidu w mieszaninie 10 mg octanu magnezowego i 1 ml dwumetylosulfotlenku, po czym fermentacje kontynuuje sie za wstrzasarce obrotowej w ciagu dalszych 96 godzin, w tempera¬ turze 28°C. 45 Analiza zacieru wykazuje, ze obecna jest w nim tetracyklina w ilosci 108 mg/ml. Badanie zawartos¬ ci kolby kontrolnej, przy zastosowaniu tego samego postepowania lecz bez dodania 6-metylopretetra- midu, nie wykazuje obecnosci tetracykliny. 50 Przyklad VI. Biologiczne przeksztalcenie 6- metylopretetramidu w oksytetracykline z zastoso¬ waniem Streptomyces hygroscopicus NRRL 3015.Postepuje sie jak w przykladzie III z nastepujaca odmiana: Stosuje sie zarodnik S. hygroscopicus 55 NRRL 3015 zamiasa S. aureofaciens NRRL 3013.Czesciowo sfermentowany ' zacier przenosi sie do kolb zawierajacych roztwór 10 mg 6-metylopre- tetramidu w mieszaninie 10 mg octanu magnezowe¬ go i 1 ml dwumetylosulfotlenku, po czym fermen- 60 tacje kontynuuje sie na wstrzasarce obrotowej w ciagu dalszych 96 godzin, w temperaturze 34°C.Analiza zacieru wykazuje wtedy wieksza ilosc oksytetracykliny niz w kolbie kontrolnej, której za¬ wartosc uzyskano w ten sam sposób lecz bez za- g6 stosowania'6-metylopretetramidu..56644 10 Przyklad VII. Biologiczne przeksztalcenie 6- metylopretetramidu w oksytetracykline z zastoso¬ waniem Streptomyces rimosus NRRL 2234.Postepuje sie jak w przykladzie VI z ta róznica, ze stosuje sie zarodniki S. rimosus NRRL 2234 za¬ miast S. hygroscopicus NRRL 3015. Koncowa ana¬ liza zacieru wykazuje wieksza ilosc oksytetracykli¬ ny niz w kolbie kontrolnej, której zawartosc uzys¬ kuje sie w ten sam sposób, lecz bez zastosowania 6-metylopretetramidu.Przyklad VIII. Biologiczne przeksztalcenie 4-dwumetyloamino- 6-metylopretetramidu w tetra- cykline z zastosowaniem Streptomyces aureofaciens NRRL 3014.Zarodniki halogenujacyeh S. aureofaciens NRRL 3014 wymywa sie z agaru woda destylowana i uzys¬ kuje zawiesine zawierajaca 60—80Xl O6 zarodników/ ml. 0,33 ml porcje tej zawiesiny uzywa sie do zasz- czczepienia w 25 cm probówce 8 ml srodowiska zaszczepowego, przygotowanego i inkubowanego w sposób opisany w przykladzie I, otrzymujac w ten sposób zaszczep kultury S. aureofaciens. Po stery¬ lizacji srodowiska fermentacyjnego 25 ml porcje te¬ go srodka zaszczepia sie 1 ml dawkami S. aureofa¬ ciens w 250 ml kolbach stozkowych. Fermentacje prowadzi sie w ciagu 24 godzin w temperaturze 25°C, na wstrzasarce obrotowej o 180 obrotach/min.Nastepnie kazda porcje zacieru przenosi sie do od¬ dzielnej kolby zawierajacej roztwór 10 mg 4-dwu- metyloamino-6-metylopretetramidu w 1 ml dwu- metylosulfotlenku, po czym fermentacje konty¬ nuuje sie na wstrzasarce obrotowej w ciagu dal¬ szych 96 godzin, w temperaturze 25°C.Biologiczna analiza zacieru wykazuje wtedy obecnosc 25 mg tetracykliny/ml. Badanie zawartosci kolby kontrolnej, przy zastosowaniu tego samego postepowania, lecz bez uzycia 4-dwumetyloamino-6 -metylopretetramidu, nie wykazuje obecnosci te¬ tracykliny.Przyklad IX. Biologiczne przeksztalcenie 4- dwumetyloamino-6-metylopretetramidu w 7-chlo- rotetracykline z zastosowaniem Streptomyces au¬ reofaciens NRRL 3013.Postepuje sie jak w przykladzie III z nastepuja¬ ca odmiana: czesciowo sfermentowany zacier prze¬ nosi sie do oddzielnych kolb zawierajacych roztwór 10,6 mg 4-dwumetyloamino-6-metylopretetramidu w mieszaninie 10 mg octanu magnezowego i 1 ml dwumetylosulfotlenku, po czym fermentacje kon-, tynuuje sie na wstrzasarce obrotowej w ciagu dal¬ szych 96 godzin, w temperaturze 28°C.Analiza zacieru wykazuje wtedy obecnosc 58 mg 7-chlorotetracykliny/ml. Badanie zawartosci kolby kontrolnej, przy stosowaniu tego samego postepo¬ wania, lecz bez dodania 4-dwumetyloamino-6-me- tylopretetramidu, nie wykazuje obecnosci 7-chloro- tetracykliny.Pr z y k l a d X. Biologiczne przeksztalcenie 7- chloro-4-dwumetyloaminopretetramidu w 7-chloro^ 6-demetylotetracykline z zastosowaniem Strepto¬ myces aureofaciens NRRL 3013.Zarodniki S. aureofaciens NRRL 3013 wymywa sie z agaru woda destylowana i uzyskuje zawiesine zawierajaca 60—80X10« zarodników na 1 ml. 0,33 mi zawiesiny uzywa sie do zaszczepienia w 20 cm probówce 8 ml srodowiska zaszczepowego, przygo¬ towanego jak w przykladzie I, otrzymujac po in¬ kubacji zaszczep kultury S. aureofaciens. Medium fermentacyjne przygotowuje sie podobnie jak w 5 przykladzie I. Po sterylizacji tego srodowiska, jego 25 ml porcje zaszczepnia sie w 250 ml kolbach stozkowych 1 ml dawkami zaszczepu S. aureofa¬ ciens. Fermentacje prowadzi sie w temperaturze 25°C na wstrzasarce obrotowej o 180 obrotach/min. io Nastepnie kazda porcje zacieru przenosi sie do od¬ dzielnej kolby zawierajacej 10 mg 7-chloro-4-dwu- metyloaminopretetramidu w 1 ml dwumetylosul¬ fotlenku, po czym fermentacje kontynuuje sie w ciagu dalszych 96 godzin na wstrzasarce obrotowej, 15 w temperaturze 25°C.Biologiczna analiza zacieru wykazuje wtedy o- becnosc 28 mg 7-chloro-6-demetylotetracykliriy w 1 ml. Badanie zawartosci kolby kontrolnej, przy zastosowaniu identycznego sposobu postepowania, 20 lecz bez zastosowania 7-chloro-4-dwumetyloamino- pretetramidu, nie wykazalo obecnosci 7-chloro-6- demetylotetracykliny.Przyklad XI. Biologiczne przeksztalcenie 7- chloro-4-dwumetyloaminopretetramidu w 7-chloro- 25 -6-demetylotetracykliny z zastosowaniem Strepto¬ myces aureofaciens NRRL 3014.Postepuje sie jak w przykladzie X z nastepujaca róznica: stosuje sie zarodniki halogenujacyeh S. aureofaciens 3014 zamiast NRRL 3013. Czesciowo 30 sfermentowany zacier przenosi sie do kojb zawie¬ rajacych roztwór 10 mg 7-chloro-4-dwumetylo- aminopretetramidu w mieszaninie 10 mg octanu magnezowego i 1 ml dwumetylosulfotlenku, po czym fermentacje kontynuuje sie na wstrzasarce 35 obrotowej, w temperaturze 28°C, w ciagu dalszych 96 godzin.Analiza zacieru wykazuje wtedy obecnosc 31 mg 7-chloro-6-demetylotetracykliny w 1 ml. Badanie zawartosci kolby kontrolnej, przy zastosowaniu 40 identycznego postepowania, lecz bez uzycia 7-chlo- ro-4-dwumetyloammopretetramidu, nie wykazuje obecnosci 7-chloro-6-demetylotetracykliny.Przyklad XII. Biologiczne przeksztalcenie 7- chloro-4-dwumetyloaminopretetramidu w 7-chloro- 45 6-demetylotetracykline z zastosowaniem Strepto¬ myces aureofaciens NRRL B-2407.Postepuje sie jak w przykladzie X z nastepujaca róznica: stosuje sie zarodniki S. aureofaciens NRRL B-2407 zamiast NRRL 3013. Czesciowo sfermento- 50 wany zacier przenosi sie do odpowiednich kolb za¬ wierajacych roztwór 10,1 mg 7-chloro-4-dwumetylo- aminopretetramidu w mieszaninie 10 mg octanu magnezowego i 1 ml dwumetylosulfotlenku, po czym fermentacje kontynuuje sie na wstrzasarce 55 obrotowej w ciagu dalszych 96 godzin, w tempera¬ turze 28°C. Analiza zacieru wykazuje wtedy aktyw¬ nosc antybiotyczna odpowiadajaca 99 mg 7-chlo- rotetracykliny w 1 ml. Analiza chromatograficzna na bibule wykazuje obecnosc w zacierze 7-chloro- 60 6-demetylotetracykliny. Badanie zawartosci kolby kontrolnej, przy zastosowaniu identycznego poste¬ powania, lecz bez uzycia 7-ehloro-4-dwunietyloa- minopretetramidu, nie wykazuje obecnosci 7-chlo- ro-6-demetyloJ,etracykliny. 65 Przyklad XIII. Biologiczne przeksztalcenie11 56644 12 7-chloro-4-dwumetyloamino- 6-metylopretetramidu w 7-chlorotetracykline z zastosowaniem Strepto- myces aureofaciens NRRL 3013.Zarodniki S. aureofaciens NRRL 3013 wymywa sie z agaru sterylna woda destylowana i uzyskuje zawiesine zawierajaca 60—80X106 zarodników/ml. 0,33 ml tej zawiesiny uzywa sie do zaszczepienia w 250 cm dlugiej probówce 8 ml roztworu, jaki przy¬ gotowuje sie wedlug nastepujacej receptury: sacharoza 30 g siarczan amonowy 2 g weglan wapniowy 7 g namok kukurydziany 20 k woda wodociagowa do 1000 ml Przed zaszczepienie roztwór ten sterylizuje sie w ciagu 20 minut w autoklawie pod cisnieniem 1,05 atom. Zaszczepiona zawartosc probówki poddaje sie inkubacji w ciagu 24 godzin w temperaturze 28°C na wstrzasarce posuwisto-zwrotnej o 116 obro¬ tach/min. i otrzymuje sie zaszczep S. aureofaciens.Poza tym przygotowuje sie srodowisko fermenta¬ cyjne o skladzie: (NH4)2S04 6,7 g CaC03 9,0 g CoCl2 • 6 H20 5,0 mg NH4C1 2,0 g MnS04 (techn. 70%) 0,10 g namok kukurydziany 25,0 g skrobia $3*5 g maczka kukurydziana 14,5 g woda wodociagowa do 1000 ml Po wyjalowieniu w ciagu 20 minut w autokla¬ wie, pod cisnieniem 1,05 atm, 25 ml porcje tego sro¬ dowiska fermentacyjnego zaszczepia sie 1 ml daw¬ kami S. aureofaciens, stosujac do tego celu kolby stozkowe. Fermentacje prowadzi sie w ciagu 24 godzin w temperaturze 25°C na wstrzasarce obro¬ towej o 180 obrotach/min. Nastepnie kazda porcje zacieru przenosi sie do oddzielnej kolby zawieraja¬ cej roztwór 9,5 mg 7-chloro-4-dwumetyloamino-6- -metylopretetramidu w mieszaninie 10 mg octanu magnezu i 1 ml dwumetylosulfotlenku, po czym fermentacje kontynuuje sie na wstrzasarce obro¬ towej w temperaturze 28°C, w ciagu dalszych 96 godzin. Analiza zacieru wykazuje wtedy obecnosc 20 mg 7-chlorotetracykliny w 1 ml. Badanie za¬ wartosci kolby kontrolnej, przy zachowaniu tego samego sposobu postepowania, lecz bez uzycia 7- chloro- 4-dwumetyloamino- 6-metylopretetramidu, nie wykazuje obecnosci 7-chlorotetracykliny.Przyklad XIV. Biologiczne przeksztalcenie 7-hydroksypretetramidu w 7-hydroksy-6-demetylo- tetracykline z zastosowaniem Streptomyces aureo¬ faciens NRRL 3013.Postepuje sie jak w przykladzie XIII z nastepu¬ jaca odmiana: "czesciowo sfermentowany zacier przenosi sie do oddzielnych kolb zawierajacych roztwór 3,95 mg 7-hydroksypretetramidu w mie¬ szaninie 10 mg octanu magnezowego i 1 ml dwu¬ metylosulfotlenku, po czym fermentacje konty¬ nuuje sie w ciagu dalszych 96 godzin na wstrza¬ sarce obrotowej, w temperaturze 28°C. Analiza za¬ cieru wykazuje wtedy aktywnosc antybiotyczna od¬ powiadajaca 2,8 mg 7-chlorotetracykliny.Badanie zawartosci kolby kontrolnej, przy za¬ chowaniu tego samego sposobu postepowania, lecz bez uzycia 7-hydroksypretetramidu, nie wykazuje dzialania antybiotykowego.Przyklad XV. Przeksztalcanie 4-dwumety- 5 loaminopretetramidu w 6-demetylotetracykline z zastosowaniem Streptomyces aureofaciens ATCC (F-198-1).Prowadzi sie nastepujaca fermentacje: zarodniki halogenujacych szczepu S. aureofaciens ATCC 10 (F-198-1) wymywa sie z agaru wyjalowiona woda destylowana na zawiesine zawierajaca 60—80Xl O6 zarodników/ml. 0,33 ml tej zawiesiny uzywa sie do zaszczepienia w 250 mm probówce 8 ml roztworu, jaki przygotowano wedlug nastepujacej receptury: 15 sacharoza 30 g siarczan amonowy 2 g weglan wapniowy 7 g namok kukurydziany 20 g woda wodociagowa do 1000 ml 20 Przed zaszczepieniem roztwór ten sterylizuje sie w ciagu 20 minut w autoklawie pod cisnieniem 1,05 atm. Zaszczepiona zawartosc probówki poddaje sie inkubacji w ciagu 24 godzin, w temperaturze 28°C i otrzymuje zaszczep S. aureofaciens. 25 Równoczesnie sporzadza sie srodowisko fermen¬ tacyjne o skladzie: (NA4)2S04 6,7 g CaC03 9,0 g CoCl2 • 6 H20 5,0 mg 30 NH4C1 2,0 g MnS04 (techn. 70%) 0,10 g namok kukurydziany 25,0 g skrobia 52,5 g maczka kukurydziana 14,5 g 35 woda wodociagowa do 1000 ml Po sterylizacji w ciagu 20 minut w autoklawie, pod cisnieniem 1,05 atm., 25 ml dawki tego srodo¬ wiska zaszczepia sie 1 ml porcjami S. aureofaciens, stosujac do tego celu kolby stozkowe. Fermentacje 40 prowadzi sie w ciagu 24 godzin w temperaturze 28°C na wstrzasarce obrotowej. Nastepnie kazda porcje zacieru przenosi sie do oddzielnej kolby za¬ wierajacej roztwór 10 mg 4-dwumetyloaminopre¬ tetramidu w mieszaninie 10 mg octanu magnezowe- 45 go i 1 ml dwumetylosulfotlenku, po czym fermen¬ tacje kontyuttje sie w ciagu dalszych 96 godzin na wstrzasarce obrotowej, w temperaturze 28°C.Analiza wykazuje wtedy obecnosc 6-demetylotetra- * cykliny w zacierze. Badanie zawartosci kolby kon- 50 trolnej, przy czym zachowano ten sam sposób po¬ stepowania, lecz bez uzycia 4-dwumetyloaminopre- tetramidu, nie wykazuje obecnosci 6-demetylote- tracykliny.Przyklad XVI. Przeksztalcanie 6-metylo-4- 55 dwumetyloaminopretetramidu w tetracykline z za¬ stosowaniem Streptomyces aureofaciens ATCC (F-198-1).Fermentacje prowadzi sie jak w przykladzie XV z nastepujacymi róznicami: czesciowo sfermento- 60 wany zaciek przenosi sie do kolb zawierajacych roztwór 10 mg 6-metylo-4-dwumetyloaminopre- tetramidu w mieszaninie 10 mg octanu magnezo¬ wego i 1 ml dwumetylosulfotlenku, po czym fer¬ mentacje kontynuuje sie jak w przykladzie XV. 65 Analiza zacieru wykazuje obecnosc tetracykliny.59644 13 Badanie zawartosci kolby kontrolnej, przy zacho¬ waniu tego samego sposobu postepowania, lecz bez uzycia 6-metylo- 4-dwumetyloaminopretetramidu, nie wykazuje obecnosci tetracykliny. 5 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1.