PL55121B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo:.Opublikowano: 17. IV 1968 55121 KI. 30 h, 2/04 MKP •„ A 61 k «ll(X, UKD Wspóltwórcy wynalazku: dr Fritz Wadehn, Barbara Trafala, Ryszarda Stelagowska, dr Edward Debicki, Bronislawa Dziegiel, Urszula Tyblewska Wlasciciel patentu: Jeleniogórskie Zaklady Farmaceutyczne „Polfa" Przedsiebiorstwo Panstwowe, Jelenia Góra (Polska) Sposób otrzymywania czystych roztworów oksytocyny z ekstraktów tylnego plata przysadek mózgowych zwierzat Wiadomo (Dale: Biochem. Journal 4,427, 1909), ze ekstrakty z tylnego plata przysadek mózgowych zawieraja bardzo aktywne, fizjologicznie czynne ciala (hormony): oksytocyne (Orasthin, Pitocin), oraz wazopresyne (Tonephin, Pitressin). Oksyto¬ cyna wywiera wplyw na macice, zwlaszcza w okre¬ sie ciazy. Wywoluje ona bóle porodowe, a po za¬ konczeniu porodu zatrzymuje krwawienia, powo¬ dujac kurczenie sie macicy. W zwiazku z tym zna¬ czenie oksytocyny w praktyce ginekologicznej jest bardzo duze. Natomiast wazopresyna dziala w in¬ nym kierunku. Zwieksza ona cisnienie krwi przez wywolanie zwezenia malych naczyn krwionosnych, takze naczyn krwionosnych serca. To zwezenie naczyn wloskowatych serca moze prowadzic do uposledzenia krwiobiegu wiencowego i spowodowac nawet stany zagrazajace zyciu. Obecnosc wazopre- syny* w preparatach oksytocyny, przeznaczonych do stosowania w ginekologii, jest wiec jak najbar¬ dziej szkodliwa.Fodejmowane próby- usuniecia domieszek wazo- presyny z ekstraktów tylnego plata przysadek móz¬ gowych w celu uzyskania roztworów oksytocyny, nadajacych sie do bezpiecznego zastosowania w lecznictwie nie daly dotychczas pozadanych wy¬ ników. Tak zwana „klasyczna" metoda otrzymy¬ wania hormonalnych ekstraktów z tylnego plata przysadki mózgowej i oddzielenia od siebie obu hormonów znajdujacych sie. w tych ekstraktach, opublikowana w roku 1929 przez Kamm'a, Al- drich'a i wspólpracowników (Journal of. Am. Che¬ mical Society 50, 573) polega na ekstrakcji wysu¬ szonych acetonem i sproszkowanych tylnych pla¬ tów przysadek mózgowych wieprzowych lub byd- 5 lecych za pomoca 100-krotnej ilosci rozcienczonego kwasu octowego na goraco.Towarzyszace hormonom ciala bialkowe zostaja usuniete przez traktowanie wyciagów zelem wo¬ dorotlenku zelazowego i przez frakcyjne wytraca¬ lo nie acetonem.Otrzymany tym sposobem odbialczony roztwór, zawierajacy oksytocyne i wazopresyne mniej wie¬ cej w równej ilosci jednostek, zageszcza sie do Vio objetosci i poddaje sie procesowi wysalania za 15 pomoca siarczanu amonowego. Powstaly osad po wysuszeniu, ekstrahuje sie kwasem octowym, po czym roztwór w kwasie octowym oczyszcza sie w sposób frakcyjny przez wytracanie osadów za pomoca eteru i eteru naftowego.Osad wytracony eterem zawiera przewazna czesc wazopresyny, natomiast osad wytracony ete¬ rem naftowym — przewazna czesc oksytocyny.Oddzielenia od siebie obu hormonów nie uzyskuje sie nawet przy powtórzeniu calego procesu.W metodzie opisanej w roku 1958 przez Asher'a, Lighfa i du Vigneaud (Journal Biological Chemi- stry 233, 116—120)) rozdzielenie obu hormonów wprawdzie jest calkowite, przebiega jednak po¬ przez 9 kolejnych procesów, takich na przyklad 30 jak dializa, wytracanie za pomoca NaCl i za pc- 20 25 551213 moca kwasu trój chlorooctowego oraz zastosowa¬ nie 2 rodzajów amberlitów do rozdzialu cial czyn¬ nych. Mniej skomplikowane sa metody adsorpcyj- ne, na przyklad metoda opracowana przez Maier- -Hiisera, Clausera i Fromageota, i opisana w Che- mische Zentralblatt 1956, str. 11218.W metodzie tej ekstrakt z przysadki zadaje sie zelem krzemowym i zaadsorbowana przy pH = = 3,8 — 4,0 oksytocyna eluuje za pomoca goracego 0,5% kwasu octowego. Eluat poddaje sie nastepnie zmudnemu oczyszczaniu; zag^szozj&niu^ .w, niskiej temperaturze, ekstrakcji ejt&c&i'Y alkoholem k)kty- lowym w celu usuniecia i zanieczyszczen, zaikali- zowaniu amoniakiem i ekstrakcji^^inj^em -w ce¬ lu otrzymania samej oksytpcy^yy^^,vij;-,.-.-- Sposób otrzymywania oksytocyny wedlug nie¬ mieckiego opisu patentowego nr 550935 polega na usuwaniu wazopresyny z ekstraktu przysadkowe¬ go za pomoca nieaktywowanego bentonitu lub nieaktywowanego zelu krzemowego przy czym ad- sorbcje prowadzi sie w srodowisku kwasnym. Uzy¬ skany roztwór oksytocyny nie jest calkowicie czy¬ sty i zawiera wazopresyne w ilosci co najmniej 5% najczesciej jednak powyzej 8%. Ilosci te zna¬ cznie przekraczaja dopuszczalna norme.Stwierdzono, ze z ekstraktu tylnego plata przy¬ sadek mózgowych adsoprcja za pomoca krzemia¬ nów (metoda Maier-Hiisera i innych, wyzej cy¬ towana) moze byc tak przeprowadzona, ze adsor¬ benty usuwaja z ekstraktów wazopresyne prawie ilosciowo, natomiast adsorbuja maly procent oksy¬ tocyny.Wedlug wynalazku adsorbenty przeznaczone do oddzielania wazopresyny poddaje sie wstepnej ob¬ róbce przy której zwieksza sie ich powierzchnia i specyficznosc, a proces adsorpcji prowadzi sie przy wartosci pH w granicach 4,1—4,9 zaleznie od rodzaju uzytego adsorbenta. Adsorpcja przy takiej wartosci pH jest bardziej selektywna. Wstepna obróbka adsorbenta sposobem wedlug wynalazku polega na aktywacji na drodze wytracania uzy¬ tego krzemianu za pomoca rozcienczonego kwasu solnego lub octowego.Aktywacja bentonitu 0,5% kwasem octowym w ciagu kilku godzin daje preparat odznaczajacy sie szczególnie silna zdolnoscia adsorpcyjna w sto¬ sunku do wazopresyny. Podobnie tez zel krzemo¬ wy poddany ogrzewaniu z 0,02% kwasem solnym i przemyty nastepnie az do odczynu obojetnego wykazuje zwiekszona zdolnosc adsorpcji wazopre¬ syny. ; Ilosc uzytego krzemianu na 1 jednostke uzyska¬ nej oksytocyny wynosi praktycznie 0,5—2 mg.Adsorpcje wazopresyny przeprowadza sie dwu¬ krotnie; aktywowanym bentonitem przy wartosci pH = 4,1—4,2 otrzymujac roztwór zawierajacy w 1 ml 12 jednostek oksytocyny, w którym zawar¬ tosc wazopresyny nie przekracza 5%, a nastepnie aktywowanym zelem krzemowym przy wartosci pH = 4,7 uregulowanej za pomoca rozcienczonego roztworu NaOH. Po oddzieleniu wazopresyny i za¬ kwaszeniu przesaczu 10% kwasem octowym do wartosci pH = 4,0 uzyskuje sie roztwór zawierajacy 4 w 1 ml jednostek oksytocyny oraz sladowe ilosci wazopresyny.Otrzymany roztwór oksytocyny odpowiada wy¬ sokim wymaganiom jakosciowym Farmakopei Bry- 5 tyjskiej 1963.Przyklad. 100 g handlowego bentonitu miele sie drobno i przez 1 godzine wytrzasa energicznie z 10-krotna iloscia 0,5% kwasu octowego, usuwa roztwór po opadnieciu osadu i ponawia wytrzasa¬ lo nie z taka sama jak poprzednio iloscia kwasu octowego, a nastepnie odsacza bentonit, przemy¬ wa go na filtrze jednym litrem 0,5% kwasu octo¬ wego, wyklada na tace i suszy na' powietrzu. Tak przygotowany bentonit wprowadza sie w ilosci 15 48,4 g do 2000 ml ekstraktu z przysadek, zawiera¬ jacego 44 000 jednostek oksytocyny (i odpowiednia ilosc jednostek wazopresyny) i przy wartosci pH —- 4,2 wytrzasa energicznie przez 3 godziny, odsacza lub odwirowuje bentonit. Otrzymuje sie 20 klarowny, przezroczysty roztwór zawierajacy 12— 14 jednostek oksytocyny w 1 ml, w którym za¬ wartosc wazopresyny nie przekracza 5 jednostek na 100 jednostek oksytocyny. Z roztworu tego usuwa sie wazopresyne przez poddanie go powtór- 25 nej adsorpcji na odpowiednio przygotowanym zelu krzemowym. W tym celu 50 g zelu krzemowego ogrzewa sie pod chlodnica zwrotna w kolbie umieszczonej na wrzacej lazni wodnej przez 2 go¬ dziny z 2 litrami 0,02% HC1 i saczy na goraco. 30 Zel krzemowy przemywa sie woda destylowana, az przesacz stanie sie obojetny wobec lakmusu i suszy na powietrzu. 43,2 g zaktywowanego zelu krzemowego miesza sie nastepnie z okolo 2 litra¬ mi ekstraktu zawierajacego 12 jednostek w 1 ml 35 oksytocyny oraz wazopresyne, uprzednio dopro¬ wadzonego za pomoca 5% wodorotlenku sodowego do wartosci pH = 4,7. Calosc wytrzasa sie w cia¬ gu 8 godzin, odwirowuje zel, przesacz zakwasza za pomoca 10% roztworu kwasu octowego do war- 40 tosci pH = 4,0 i saczy przez bibule, otrzymujac roztwór zawierajacy w 1 ml 7 jednostek oksytc- cyny oraz jedynie slady wazopresyny. 45 PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania czystych roztworów oksy¬ tocyny z ekstraktów z tylnego plata przysadek mózgowych zwierzat rzeznych zawierajacych oksy- 53 tocyne i wazopresyne przez oddzielanie wazopre¬ syny na drodze selektywnej adsorpcji na krze¬ mianach w srodowisku kwasnym, znamienny tym, ze ekstrakt wytrzasa sie z bentonitem uprzednio zaktywowanym rozcienczonym kwasem octowym, 55 utrzymujac pH srodowiska w granicach 4,1—4,2 po czym oddzielony od adsorbenta roztwór oksy¬ tocyny, uwolniony od glównej czesci wazopresy¬ ny, doprowadza sie za pomoca rozcienczonego roz¬ tworu NaOH do wartosci pH = 4,7 i wytrzasa go z zelem krzemowym uprzednio zaktywowanym rozcienczonym kwasem solnym, utrzymujac pH srodowiska w granicach 4,7—4,9, a przesacz uzy¬ skany po oddzieleniu adsorbenta zakwasza do wartosci pH = 4 0 i odsacza, otrzymujac przy tym 65 roztwór czystej oksytocyny. . * KZG-3, zam. 104/68 — 250 PL