PL53913B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: Opublikowano: 25. IX. 1967 53913 KI. 6 a, 22/01 MKP C 12 d 4* CZYTELNIA Urzedu Palento*«go Wspóltwórcy wynalazku: dr Heinrich Kirchhof, prof. dr G. Pfleiderer, dr Kurt Holle Wlasciciel patentu: Zellstofffabrik Waldhof, Mannheim-Waldhof (Nie¬ miecka Republika Federalna) Sposób oczyszczania wodnego ekstraktu z materialu roslinnego, zawierajacego aktywna 5'-fosforodiesteraze, stosowanego do otrzy¬ mywania 5'-mononukleotydów z kwasów nukleinowych Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszcza¬ nia wodnego ekstraktu z materialu roslinnego, za¬ wierajacego aktywna 5'-fosforodiesteraze, stosowa¬ nego do otrzymywania 5'-mononukleotydów z kwa¬ sów nukleinowych.Wiadomo, ze kwasy nukleinowe mozna rozszcze- . pic na 5'-mononukleótydy za pomoca enzymów.Jako substancje, zawierajace enzymy odpowiednie -do tego celu, nalezy wymienic obok pawnych mi¬ kroorganizmów przede wszystkim jad wezy. Jed¬ nakze wada stosowania jadów wezy jest to, ze w wyniku zawartosci w nich róznego rodzaju en¬ zymów rozpad jest trudny do kontrolowania i cze¬ sto przebiega az do wytwarzania nukleozydów. Tak daleko posuniety rozpad w wiekszosci przypad¬ ków jest niepozadany. Dlatego tez usilowano osla¬ bic enzymatyczne dzialanie jadów wezy przez -utrzymanie wysokiej aktywnosci 5'-fosforodieste- razy i równoczesne obnizenie aktywnosci 5'-nukle- otydazy. Mozna to osiagnac róznymi drogami. Jad weza np. oczyszczano stosujac róznego rodzaju operacje wytracajace lub poddawano go dzialaniu wysokiej temperatury. Jest takze rzecza wiadoma, ie jony pewnych metali wykazuja zdolnosc dez- ¦aktywizacji. Znane sa równiez kombinacje opisa¬ nych metod dezaktywizacji.Metody te wykazuja jednak wady, gdyz sa zmud¬ ne, czasochlonne i daja sie zastosowac tylko przy rachowaniu okreslonych warunków. Nadto uzys- 10 15 20 30 kanie jadu wezowego, potrzebnego jako material wyjsciowy, jest kosztowne i niebezpieczne.Wiadomo, ze mozna uzyskac 5'-mononukleotydy w sposób prosty i tani, jesli enzymatyczny rozpad kwasów nukleinowch prowadzi sie za pomoca wod¬ nych ekstraktów fosforodiesterazy, uzyskanych z materialu roslinnego w obecnosci rozpuszczal¬ ników organicznych w ilosci od 5 do 20%, ko¬ rzystnie 10% calkowitej objetosci plynu, po czym z mieszaniny reakcyjnej oddziela sie powstale 5'-mononukleotydy. Stwierdzono bowiem, ze ma¬ terial roslinny róznego pochodzenia zawiera 5'-fos- forodiesteraze, która mozna uzyskac w postaci czynnego ekstraktu enzymatycznego przez wylugo¬ wanie tego materialu woda, równiez w obecnosci rozpuszczalników organicznych.Jako material roslinny nalezy rozumiec przede wszystkim rosliny nadziemne i/lub podziemne czes¬ ci roslin, jak owoce, nasiona, bulwy, korzenie ro¬ slin zwyklych i/lub okopowych, dalej zarodki ro¬ slinne, jak równiez mieszaniny rozmaitych roslin lub ich czesci, ewentualnie z zarodkami. Jakc spe¬ cjalnie odpowiednie okazaly sie surowe wyciagi z nasion, zarodków i/lub czesci skladowych zarod¬ ków roslin dwu- lub jednolisciennych, jak np. ros¬ lin motylkowych, pszenicy, ryzu, jeczmienia i/lub traw, jak równiez z odpadków otrzymywanych przy slodowaniu.Na ogól celowe jest wzbogacenie otrzymanego ekstraktu w enzym na drodze niewielu zabiegów 5391353913 3 oczyszczajacych. W tym celu mozna np. obsorbo- wac enzym na zelu fosforanu wapniowego, któ¬ ry dodaje sie do klarownego roztworu, po czym odwirowuje sie i wymywa roztworem siarczanu amonowego i roztworem buforowym fosforanu, a nastepnie wytraca z roztworu metanolem, etano¬ lem, acetonem lub podobnymi rozpuszczalnikami organicznymi. Przez nastepujace po tym chroma¬ tografowanie usuwa sie takze obecna jeszcze 5'-nu- kleotydaze. Poza znacznym nakladem materialo¬ wym i wymaganym dlugim czasem prowadzenia procesu istnieje niebezpieczenstwo utraty czesci cennej 5'-fosforodiesterazy w poszczególnych fa¬ zach procesu.Przedmiotem -wynalazku jest sposób oczyszcza¬ nia J wodnego ekstraktu materialu roslinnego, za¬ wierajacego aktywna i'-fosforodiesteraze, stosowa¬ nego do otrzymywania 5'-mononukleotydów z kwasów nukleinowych przez krótkotrwale pod¬ dawanie dzialaniu" 'ciepla wodnych ekstraktów z materialu roslinnego. Ogrzewanie prowadzi sie korzystnie w obecnosci soli metali ciezkich.Ekstrakty z materialu roslinnego, do których do¬ daje sie organiczne rozpuszczalniki trudno rozpusz¬ czalne lub nierozpuszczalne w wodzie, jak np. to- ulen lub chloroform w ilosci od 0,5 do 3%, ko¬ rzystnie 1 do 1,5% objetosci plynu, podgrzewa sic przed ich zastosowaniem do rozszczepiania kwasów nukleinowych do temperatury 45—70°C, korzystnie 55—65°C, w ciagu 5—40 minut, najkorzystniej 15— 25 minut.Ogrzewanie mozna prowadzic równiez w obec¬ nosci soli metali ciezkich. Szczególnie korzystne jest zastosowanie soli nieorganicznych, takich jak chlorki, siarczany i azotany cynku, niklu i miedzi.Stezenie molowe soli metali ciezkich w wyciagach powinno wynosic od 10-2 do 10-5.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze wartosc pH en¬ zymów moze wahac sie w szerokich granicach, przy czym ze zrozumialych wzgledów nalezy uni¬ kac obszarów krancowo kwasnych lub alkalicznych.W celu daleko idacego zdezaktywowania 5'-mono- nukleotydazy okazalo sie szczególnie korzystne sprowadzenie pH ekstraktu do wartosci 4—7. Proces mozna prowadzic równiez w obecnosci roztworu buforowego, jak na przyklad fosforanowego, ftala- nowego, octanowego lub trójoksymefyloaminorne- tanowego.Zachowujac powyzsze warunki utrzymuje sie mozliwie maksymalna aktywnosc 5'-fosforodieste- razy przy równoczesnej jak najdalej posunietej d-- zaktywizacji 5'-nukleotydazy. Jednoczesnie metoda jest szybka i nie wymaga duzego nakladu materia¬ lowego.Jezeli proces prowadzi sie bez dodatku soli me¬ tali ciezkich, to dla osiagniecia daleko idacej d- zaktywizacji 5'-nukleotydazy szczególnie celowe jest sprowadzenie pH ekstraktu do wartosci 4—7.Stwierdzono jednakze, ze rosliny podczas procesu ekstrakcji nie musza byc traktowane roztworem wodnym, nastawionym do okreslonej wartosci pH.Ekstrakty oczyszczone sposobem wedlug wyna¬ lazku uzywane sa bezposrednio do rozszczepiania .kwasów nukleinowych. 10 20 30 35 40 45 50 55 Przytoczenie ponizej lifzyklady wyjasniaja spo¬ sób wedlug wynalazku.Przyklad I. W celu otrzymania ekstraktu z materialu roslinnego, np. z kielków oczyszczo¬ nego slodu jeczmiennego, wprowadza sie 10 czesci, wagowych materialu roslinnego do 100 czesci wa¬ gowych wody, a nastepnie miesza w temperaturze pokojowej przez dwie godziny i odwirowuje. Eks¬ trakt wykazuje wartosc pH = 5-^6 i zostaje- za po¬ moca lugu sodowego lub kwasu octowego sprowa¬ dzony do pozadanej wartosci pH, podanej w ta¬ blicy I. Nastepnie wyciag podgrzewa sie w kapieli wodnej w temperaturach i odstepach czasu po¬ danych w tej tablicy. Po ogrzewaniu ochladza sie; i wartosc pH sprowadza do 8. 15 czesci objetosciowych wyciagu z kielków z oczyszczonego slodu jeczmiennego, otrzymanego- w wyzej opisany sposób, albo wyciagu z innego materialu roslinnego, np. z kielków pszenicznych,, dodaje sie do 10 czesci objetosciowych roztworu nu- kleinianu sodowego (2%-go roztworu kwasu nu¬ kleinowego) i 12 czesci objetosciowych wodnego roztworu, zawierajacego 0,1 mola trój-(oksymety- lo)-aminometanu jako buforu o wartosci pH = 8,0 z dodatkiem 0,5—3% toluenu. W slepych próbach zastepuje sie roztwór kwasu nukleinowego 10 czes¬ ciami objetosciowymi wody. Czas trwania roz¬ szczepiania enzymatycznego wynosi okolo 20 go¬ dzin przy temperaturze 37°C.Wyniki podane sa w kolumnach 5 i 6 ponizszej^ tablicy I.Tablica I Kolumna Doswiadczenie 1 2 3 4 5 1 Material ekstrakcyjny kielki z oczyszczo¬ nego slodu jeczmiennego » ,, kielki pszenicy " 2' 3 ' 4 Wstepna obróbka ekstraktu ogrzewanie temperatura G°C 55 65 65 65 65 czas ogrzewania w minutach 20 20 15 20 15 wartosc PH 4 5 6 5 6 5 6 Kwas nukleinowy rozszczepienie kwasu nukleinowego % 81 87 92 78 84 o V 'n „ o Hi 2,0 1,6 [ 2,3 [ r 5,3 | 6,1 W dalszej tablicy II przytoczono przyklady., w których uzyto wyciagów z materialów roslin¬ nych ogrzewanych w obecnosci soli metali ciezkich.Przyklad II. Wytwarzanie ekstraktu z zarod¬ ków: 10 czesci wagowych kielków z oczyszCzonega slodu jeczmiennego i 100 czesci objetosciowych wo¬ dy, o wartosci pH doprowadzonej na poczatku ekstrakcji lugiem sodowym do 8,0, miesza sie dwie godziny w temperaturze pokojowej i nastepnie od¬ wirowuje. Ekstrakt sprowadza sie za pomoca lu¬ gu sodowego lub kwasu octowego do pozadanej53913 wartosci pH, podanej w tablicy II. Nastepnie do¬ daje sie tyle roztworu soli metalu ciezkiego, azeby osiagnac pozadana ilosc w molach, podana rów¬ niez w tablicy II, i ogrzewa w kapieli wodnej w temperaturach i okresach czasu podanych w ta¬ blicy II. Po zakonczeniu ogrzewania ekstrakt ochladza sie i sprowadza wartosc pH z powrotem do 8,0 (kolumny 1—6 w podanej dalej tablicy II).W celu otrzymania 5'-mononukleotydów, 3 czesci objetosciowe ekstraktu z kielków z oczyszczonego slodu jeczmiennego otrzymanego jak wyzej lub wyciagu z innych roslin, np. z kielków pszenicz¬ nych, dodaje sie do 2 czesci objetosciowych roz¬ tworu nukleinianu sodowego (1,687% roztworu kwasu nukleinowego) i 3 czesci objetosciowych roztworu, zawierajacego 0,1 mola trój-(oksymety- lo)-aminometanu jako buforu o wartosci pH = 8,0 z dodatkiem 0,5—3% toluenu. W jednoczesnie pro¬ wadzonych slepych próbach zastepuje sie roztwór kwasu nukleinowego dwoma czesciami objetoscio¬ wymi wody. Czas trwania rozszczepiania enzyma¬ tycznego wynosi okolo 20 godzin w temperaturze 37°C.Wyniki przedstawiono w kolumnach 7 i 8 nizej podanej tablicy II. 6 10 20 25 1 Ko- l'jm na nie cze 'U CO * s G 7 8 9 10 i 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 1 24 25 Pr rodk i ccyjny strak OJ 31 *E oj 1 Mat kielki z oczyszczo¬ nego slodu jeczmiennego » ,, ,, ,, ,, " " " 1 z y k l a d I] ów: 150 g Tablica II 2 3 1 | 4 | 5 Obróbka wstepna ekstraktu sól metalu i O oj m fl U N WZÓ mic: CUC12 ,, NiCl2 ,, ,, ,, ,, ,, ZnCl2 " " " " " " " " " 1 i—i o S V *s CU stez 0,002 0,002 0,001 0,00025 0,001 0,00025 0,001 0,00025 0,01 0,001 0,01 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 1 ogrze¬ wanie cd tur co OJ ft -l- -5 65 65 65 65 65 65 65 i 65 65 65 65 65 55 55 55 55 55 65 65 „ | 0,001 | 65 | 1 ^ Sd ^ Ojo czas wan 20 20 20 ' 20 20 20 20 20 i 20 20 20 20 5 10 20 40 10 10 20 49 6 sn O +J CO ! £ 5 5 5 5 6 C 7 7 4 4 6 6 4 4 4 4 4 4 4 1 1 7 8.! Kwas nu¬ kleinowy o e*cu piei ukl OJ G N _ ° 3 ~ N » O rozs kwa weg 87 91 100 100 100 100 S6 87 9G 92 1 85 79 92 97 87 69 97 L 80 75 4 1 59 1 |s$ nie £ O) odd: 11 4 15 | 18 15 1 16 1 15 8 10 3,6 2,6' 2,7 | 32 23 16 2 23 0,5 0,3 0,1 [I. Wytwarzanie ekstraktu z za- kielkó^sv pszerlicziiycli mriesza sie 30 35 40 50 z 1000 cm3 wody w ciagu dwóch godzin w tem¬ peraturze pokojowej i przy wartosci pH = 7,5 (uzyskanej przez dodatek roztworu wodorotlenku 65 potasowego). Nastepnie mieszanine odwirowuje sie.Po doprowadzeniu ekstraktu do wartosci pH = 5 przez dodatek kwasu solnego, dodaje sie roztworu chlorku cynkowego tak, aby stezenie molowe wy¬ nosilo 0,005 mola ZnCI2. Na koniec ekstrakt utrzy¬ muje sie w temperaturze 65°C przez 20 minut, ochladza i ponownie sprowadza otrzymany eks¬ trakt z zarodków do wartosci pH = 5. 25 cm3 otrzymanego ekstraktu z kielków psze¬ nicznych dodaje sie do 25 cm* 2% roztworu kwasu nukleinewego, wytworzonego z mlecza rybiego i zawierajacego kwas dezoksyrybonukleinowy i sprowadza te mieszanine do wartosci pH = 7,5.Wartosc pH utrzymywana jest przez stale doda¬ wanie rozcienczonego roztworu wodorotlenku po¬ tasowego. Zakonczenie rozszczepienia zaznacza sie przez ustalenie sie wartosci pH. Przecietny czas trwania reakcji prowadzonej w*' temperaturze 37°C wynosi okolo 27 godzin. Rozszczepienie kwasu nu¬ kleinowego wynosi 85%, oddzielenie P.,0,.—6%.Przyklad IV. Zastosowuje sie ekstrakt z za¬ rodków sporzadzony w sposób taki, jak w przy¬ kladzie II. Jako sól metalu stosuje sie ZnCl2 w ta¬ kiej ilosci, aby stezenie wynosilo 0,001 mola/litr i ogrzewanie prowadzi sie przez 20 minut w tem¬ peraturze 65°C, przy wartosci pH = 5. 40 cm3 otrzymanego wyciagu dodaje sie do 10 cm3 2,5% zobojetnionego roztworu kwasu dezoksy¬ rybonukleinowego. Wartosc pH mieszaniny dopro¬ wadza sie do 8 przez dodanie lugu sodowego. Po 24 godzinach, w czasie których utrzymuje sie war¬ tosc pH = 8 przez biezace dodawanie rozcienczo¬ nego lugu sodowego oraz temperature inkubatora 37°C, rozszczepienie kwasu nukleinowego wynosi 75% przy oddzieleniu fosforanu sodu w 9,6%.Przyklad V. 50 g wysuszonych w suszarce prózniowej korzonków zarodkowych bobu (Vicia faba) drobno miele sie i ekstrahuje 50 cm3 wody utrzymujac wartosc pH = 8 (NaOH) w ciagu 5 go¬ dzin. Ekstrakt ten przez dodanie kwasu solnego doprowadza sie do wartosci pH = 5 i dodaje do roztworu CuCl^ tak, ze stezenie soli metalu ciez¬ kiego w mieszaninie wynosi 0,0002 mola/litr. Mie¬ szanine ogrzewa sie w ciagu 20 minut w tempera¬ turze 60°C. Po ochlodzeniu doprowadza sie eks¬ trakt z powrotem do wartosci pH = 8 przez doda¬ nie lugu sodowego. Do 50 cm3 tego wyciagu doda¬ je sie 40 cm3 roztworu, zawierajacego 0,1 mola trój-(oksymetylo)-aminometanu jako buforu o war¬ tosci pH = 8 z dodatkim chloroformu i 10 cm3 2,5% roztworu nukleinianu sodowego i ogrzewa mieszanine do temperatury 37°C. Po 18 godzinach rozszczepienie enzymatyczne kwasu nukleinowego wynosi 92%. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób oczyszczania wodnego ekstraktu z ma¬ terialu roslinnego zawierajacego aktywna 5'-fo- sforodiesteraze, stosowanego do otrzymywania 5'-mononukleotydów z kwasów nukleinowych, znamienny tym, ze surowy ekstrakt poddaje sie ogrzewaniu w obecnosci metali ciezkich w cia¬ gu krótkiego okresu czasu, a nastepnie ochla¬ dza.53913 7 2. Sposób wedlug zastrz. 1 znamienny tym, ze ekstrakt poddaje sie ogrzewaniu w ciagu 5—40 minut, korzystnie 15—25 minut do temperatury 4 45—70°C, korzystnie 55—65°C i nastepnie ochla¬ dza do temperatury otoczenia. s 3. Sposób wedlug zastrz. 1 i 2 znamienny tym, 8 ze jako sole metalu ciezkiego stosuje sie chlorki cynku, niklu lub miedzi. Sposób wedlug zastrz. 1—3 znamienny tym, ze ogrzewaniu poddaje sie ekstrakt, w którym ste¬ zenie molowe soli metalu ciezkiego wynosi 1'0-s __ io-5. KRAK 4, Sarego 7. — Zam. 830/67 — 270 PL