PL52322B1 - - Google Patents

Description

Dwie próbki tego grzyba o nazwie Claviceps paspali 20 Stevens et Hall zostaly zdeponowane w United States Departament of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division) Peoria, Illinois pod numerem NRRL 3081. W prze¬ ciwienstwie do opisanych dotad szczepów Clavi- 28 ceps paspali Stevens et Hall (Arcaraooe et. aL Proc. Roy. Soc. Serials B, 155, 26, 1901; Nature 187, 236, 1960) te nowe szczepy sa zdolne do tworzenia konidiów in vitro.Nizej podano charakterystyke morfologiczna 8t grzyba Claviceps microcephala, stosowanego w 5232252322 3 znanych sposobach otrzymywania ergobazyny, jak równiez charakterystyke morfologiczna szczepu Claviceps paspali Stevens et Hall NRRL 3081 stosowanego wedlug wynalazku.Stosowany w znanych metodach otrzymywania ergobazyny grzyb Claviceps microcephala ma mniej rozwiniete spermogona niz Claviceps pur- purea. Ma on cylindryczne lub proste sklerocja, które sa bardzo male (dlugosc 3—4 mm, w nie¬ których przypadkach 7—9 mm). Ma on nitkowate nózki o dlugosci 1—2 cm, na których znajduja sie sferidia o srednicy do 0,7 mm. Wystepuje on na Phragmites communis Trin oraz na Molinia cae- rulea Moen w okolicach Paryza oraz w Niemczech Zachodnich.Innymi zywicielami jego sa: Agrostis palustris Huds.Aira caespitosa L.Aira fluxuosa L.Alopecurus agrestis L.Alopecurus geniculatus L.Alopecurus pratensis L.Ammophila arenaria L.Arrhenatherum erianthum Boiss. et Reut.Calamagrostis aleutica Bong.Calamagrostis arenaria Roth.Calamagrostis arenaria x epigeios Calamagrostis arundinacea Roth.Calamagrostis epigeios Roth.Calamagrostis Langsdorffil Trin.Cinna latifolia Griseb.Nardus Stricta L.Stosowane wedlug wynalazku szczepy Clavi- ceps paspali Stevens et Hall maja konidia (Spha- celia paspali Born.) bezbarwne, wydluzone, owalne, eliptyczne o wymiarach 3,5—1,5 X 2,5— —7,5 \x globularne sklerocja, które w stanie doj¬ rzalym sa pomarszczone, na powierzchni zóltawe, a biale w srodku, o wymiarach 2,5—0 X 2—4 mm; zóltawe, twarde cylindryczne lub z boku splasz¬ czone nózki o wymiarach 4—6,5 X 0,3—0,8 mm; globularne lub subglobularne sferidia o wymiarach 1023—1618 X774^1023 ^, owalne wydluzone peri- tecja o wymiarach 173—300 X 25—162 p, aschi cylindryczne o wymiarach 90—205 X 2,8—3,6 ^, nitkowate, nierozgalezione askospory o wymiarach 65—110 X 0,6—0,6 [*.Pasozytuje na Paspalum dilatatum Poir. oraz Paspalum laeve Michx. (Pólnocna Karolina).Innymi zywicielami sa: Paspalum almum Chase Paspalum caespitosum Fliig Paspalum ciliatifolium Michx.Paspalum cruciforme Paspalum distichum L.Paspalum distichum var. paspalodes Thell.Paspalum floridianum Michx.Paspalum floridianum var. glabratum Engelm.Paspalum giganteum Baldw.Paspalum intermedium Munro 4 Paspalum langei (Fourn.) Nash Paspalum longipilum Nash.Paspalum monostachyum Vasey Paspalum notatum Fliig. 5 Paspalum orbiculare Paspalum plicatulum Michx. (Brazylia) Paspalum ploriferum (Brazylia) Paspalum pubescens Muhl.Paspalum pubiflorum Rupr. io Paspalum auadrifarium Lam.Paspalum supinum Bose.Paspalum Urvillei Steud.Dla wprowadzenia sposobu wytwarzania ergo- 15 bazyny metoda mikrobiologiczna na skale tech¬ niczna ogromne znaczenie ma fakt, czy stosowany w niej grzyb tworzy konidia in vitro czy tez nie.Za pomoca konidiów mozna bowiem uzyskac material genetycznie jednorodny, a przez dziala- 20 nie promieniami Roentgena i promieniami nad¬ fioletowymi, jak równiez zwiazkami chemicznymi mozna z konidiów o wiele latwiej wytworzyc i wyodrebnic mutanty niz z jalowej grzybni. Po¬ nadto za pomoca konidiów mozna infekowac 25 kwitnace rosliny Paspalum uzyskujac w ten spo¬ sób na naturalnym podlozu sklerocja nadajace sie bardzo dobrze do zakonserwowania szczepów.Mozna na przyklad z tego trwalego materialu uzyskac w kazdej chwili swiezy material do 30 szczepienia wtedy, kiedy hodowle prowadzone in vitro ulegna juz po wielu przeszczepach degene¬ racji. Konidia mozna takze nieograniczenie dlugo przechowywac w postaci zliofilizowanej, co rów¬ niez umozliwia zakonserwowanie szczepu. Do za- 35 szczepienia plynnej pozywki nadaje sie najlepiej zawiesina konidiów, poniewaz w takiej postaci mozna najdogodniej dawkowac ilosc materialu do szczepienia i mozna z nia najlatwiej pracowac w warunkach jalowych (podczas gdy jalowa grzyb¬ no nie trzeba z poczatku zhomogenizowac w mik¬ serze).Wyodrebnienia i rozmnazania nawego szczepu grzyba Claviceps paspali Stevens et Hall NRRL 3081 mozna dokonac w nastepujacy sposób: 45 z wnetrza sklerocji pobiera sie w sposób jalowy maly kawalek tkanki i przenosi na pozywke o skladzie: 250 ml jasnej brzeczki piwnej bez chmielu, sucha masa 17%- 18 g agar-agar, woda destylowana do 1 litra i pH = 5,2. Wyrasta kolista 50 kolonia, która po 14 dniach w temperaturze 24° C osiaga srednice 15 mm. Tworzy ona na agarze powloke o strukturze pseudoskleroejalnej o gru¬ bosci okolo 1 mm, na której znajduje sie warstwa bialej grzybni powietrznej. Brunatny barwnik dy- 55 funduje do agaru. Nie tworza sie zadne konidia.Te kolonie dzieli sie za pomoca szpatulki na czesci i przenosi do probówki, w której znajduje sie 12 ml pozywki agarowej o nastepujacym skladzie: co brzeczka piwna — 500 ml suszony wyciag z kukurydzy — 60 g kwas mlekowy — 1 ml roztwór salmiaku w ilosci po- 65 trzebnej do uzyskania pH = 4,85 52322 6 agar-agar — 20 g woda destylowana — do 1 litra Wokól kazdej szczepionki tworzy sie mala kolo¬ nia o strzepkach grzybni najpierw bialych, póz¬ niej czerwono-brazowych. Po 10 dniach na kon¬ cach nitkowatych rozgalezien grzybni zaczynaja sie tworzyc zarodniki. Po 20 dniach jest wystar¬ czajaca ilosc zarodników (konidiów), aby z nich sporzadzic zawiesine wodna, która mozna za¬ szczepic 20 probówek z agarem skosnym (ta sama pozywka agarowa jak wyzej). Kultury te poddaje sie inkubacji w temperaturze 24° C. Konidia wy¬ puszczaja kielki po 24—36 godzinach. Po 6 dniach powierzchnia agaru powleka sie równomier¬ nie delikatnymi bialymi strzepkami grzybni, po 10 dniach wytwarza sie brunatno-szara delikatnie pobryzdzona powloka strzepków grzybni, która przylega szczelnie do agaru i posiada tylko krót¬ kie nitkowate rozgalezienia powietrzne. Na nich wyksztalcaja sie. konidia. Po 12 dniach powstaja w licznych miejscach na strzepkach grzybni cen¬ tra, z których wydzielaja sia male kropelki czer- wono-brunatnej cieczy. Kropelki osiagaja srednice 1—3 mm i wkrótce staja sie wskutek bardzo licz¬ nych konidiów mleczno-metne. Po 16—18 dniach tworzenie sie konidiów jest praktycznie zakon¬ czone. Kultura na agarze w probówce o srednicy 2 cm, zawierajacej 12 ml pozywki agarowej po¬ siada okolo 109 konidiów.W celu prowadzenia hodowli glebinowej przy¬ gotowuje sie najpierw hodowle wstepna w nastepu¬ jacy sposób: jako podloze hodowlane stosuje sie 4,5- -procentowy wodny roztwór ekstraktu slodowego o pH = 5.4. Jeden litr tego roztworu poddaje sie sterylizacji w kolbie stozkowej o pojemnosci 2 litrów w ciagu 20 minut w temperaturze 110° C, po czym zaszczepia sie konidiami w ilosci 4 X 108 otrzymanymi z 17 dniowej hodowli na agarze opisanej poprzednio, a nastepnie poddaje inkubacji na wytrzasarce rotacyjnej w ciagu 3 dni w temperaturze 24° C. Powstaje zwarta hodowla, skladajaca sie z delikatnych strzepków grzybni.Strzepki tworza luzne peczki nitkowatych roz¬ galezien grzybni i maja srednice 2—4 mm. Nie stwierdzono obecnosci alkaloidów.W celu sporzadzenia wiekszych ilosci hodowli wstepnej zaszczepia sie wyzej opisane podloze w szklanych naczyniach do fermentacji, zawiera¬ jacych po 10 litrów podloza, konidiami w ilosci 4 X 109 sztuk na kazde naczynie i poddaje inku¬ bacji w ciagu 3 dni w temperaturze 23° C z równoczesnym napowietrzaniem (6 litrów po¬ wietrza/minute i mieszaniem) 300 obrotów na minute. W celu przeciwdzialania pienieniu sie uzywa sie emulsji silikonowej. Tak otrzymane hodowle z naczyn fermentacyjnych maja te sama konsystencje co hodowle z wytrzasarek.Do otrzymywania hodowli glównej szczególnie korzystne okazalo sie podloze, zawierajace w 1 litrze wody destylowanej: sorbitu — 50 g kwasu bursztynowego — 36 g KH2PQ4 — 2 g MgS04 — 0,3 g FeS04-7H20 — 1 mg ZnS04-7H20 — 10 mg 5 Podloze to nastawia sie na pH = 5,4 za pomoca NH4OH.To podloze zaszczepia sie 10-procentami 3 dnio¬ wej hodowli wstepnej i poddaje inkubacji w por¬ cjach po 100 ml w kolbach stozkowych o pojem- 10 nosci 500 ml na wytrzasarce wahadlowej w tem¬ peraturze 23° C. Inne hodowle prowadzi sie w analogiczny sposób w naczyniu fermentacyjnym z nierdzewnej stali, zawierajacym 170 1 podloza.Stosuje sie przy tym napowietrzanie z szybkoscia 15 1701 powietrza na minute oraz mieszanie poczatko¬ wo z szybkoscia 70, pózniej 180 obrotów na minute.W celu przeciwdzialania pienieniu sie dodaje sie emulsji silikonowej. W ten sposób powstaja ho¬ dowle, zlozone z licznych jednakowych strzepków 20 grzybni. Srednica ich wynosi okolo 5 mm i po¬ siadaja one kuliste zwarte jadro o srednicy okolo 1 mm, zbudowane z tkanki pseudoparenchyma- tycznej. Jadro to posiada gwiazdziscie ulozone 0 dlugosci okolo 2 mm wypustki z równolegle 25 polozonych nitkowatych rozgalezien grzybni. Przy koncu 12 dniowej hodowli strzepki grzybni sa za¬ barwione na ciemno-brunatno, a przesacz ma barwe intensywnie czerwono-brunatna. Wartosc pH zmienia sie nieznacznie. Z przesaczu tak otrzy- 30 manej hodowli mozna na przyklad w nastepujacy sposób wydzielic wytworzone alkaloidy: 20 litrowa porcje przesaczu doprowadza sie za pomoca okolo 1,2 kg sody do pH = 9,75 i ekstrahuje 3-krotnie chlorkiem etylu w ilosci po 20 litrów. Warstwe 35 organiczna przemywa sie kazdorazowo 5 1 wody, a nastepnie podgeszcza w prózni do lacznej ob¬ jetosci 4 1. Podgeszczony roztwór ekstrahuje sie 5-procentowym kwasem winowym 3-krotnie po 1 litrze, kwasne wyciagi doprowadza sie weglanem 40 sodowym do pH = 9,0 po czym ekstrahuje chlor¬ kiem etylenu 3-krotnie po 2 litry. Polaczone wy¬ ciagi organiczne, wymyte mala iloscia wody i osuszone nad siarczanem sodowym zawieraja 8 g alkaloidów. Analize tak uzyskanej mieszaniny 4- alkaloidów dokonano na drodze chromatografii bibulowej i procentowy udzial poszczególnych skladników okreslono na podstawie identycznosci plamy barwnej z plama wzorca. 50 ergobazyna — 65% ergobazynina — 13% amid kwasu lizergowego — 9% amid kwasu izolizergowego — 5% chanoklawina — 4% 55 elymoklawina — 1% peniklawina — 2% nieznane skladniki — 1% Ergobazyne mozna wyodrebnic w czystej po- 60 staci z osuszonych wyciagów organicznych, spo¬ rzadzonych z przesaczu z hodowli na drodze chro¬ matografii, przez przekrystalizowanie lub wyko¬ rzystujac zdolnosc ergobazyny do tworzenia soli na przyklad z kwasami organicznymi. Tym spo- 65 sobem mozna z 8 g otrzymanej sumy alkaloidów52322 uzyskac 5,39 g wodoromaleinianu w czystej, krystalicznej postaci. ergobazyny PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania ergobazyny na drodze mikrobiologicznej, znamienny tym, ze szczep Claviceps paspali Stevens et Hall nr NRRL 3081 poddaje sie glebinowej J^odowli saprofitycznej na pozywce, skladajacej sie z polialkoholu jako zródla wegla, z soli amonowej organicznego kwasu jako zródla azotu i soli mineralnych, a wytworzona przy tym ergobazyne ekstrahuje sie z przesaczu kultury organicznym rozpuszczalnikiem i nastep¬ nie wyodrebnia w znany sposób. J3IBLIOTEKA] (Urzedu Pa te nfowego „Prasa" Wr. Zam. 7258/66. Naklad 260 egz. PL