PL52116B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: 30.VIII.1962 Szwajcaria Opublikowano: 28.X.1966 52116 KI. 6 b, 16/03 MKP C12d l '0& BIBLIOTEKA UKD ' U rufowy Patentowego I "'" :i;i ;l?.';c7V|:nsf!'ilitBi LudoBej | Wspóltwórcy wynalazku: dr Jiirg Rutschmann, dr Hans Kobei Wlasciciel patentu: Sandoz A. G., Bazylea (Szwajcaria) Sposób wytwarzania amidów kwasu -lizergowego i izolizergowego Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania amidów kwasu lizergowego i izolizergowego za pomoca no¬ wego Szczepu Claviceps paspali Stevens et Hall.Rozmaite szczepy tego grzyba byly juz znane od dluzszego czasu, jednakze dopiero niedawno udalo sie po raz pierwszy z okreslonego szczepu tego ro¬ dzaju grzyba, po uprzednim „zaktywowaniu" go otrzymac pochodne kwasu lizergowego i izolizergo¬ wego. Aktywacje tego szczepu prowadzono przez przeszczepienie go na kielki traw. Pózniej inna grupa badaczy stwierdzila, ze ten sposób postepo¬ wania da sie w okreslonych warunkach ominac, jednakze tak otrzymane wydajnosci kwasu lizergo¬ wego sa dosc male, co bardzo utrudnia techniczne wykorzystanie tej metody.Znany jest na przyklad z brytyjskiego opisu pa¬ tentowego nr. 883 329 sposób otrzymywania miesza¬ niny amidu kwasu lizergowego i amidu kwasu izo¬ lizergowego na drodze fermentacji roztworu wod¬ nego pozywki, zawierajacej zródlo wegla, azotu i sole mineralne w warunkach aerobowych za po¬ moca szczepu Claviceps paspali Stevens et Hall wyodrebnionego ze sklerocji wytworzonych na ro¬ slinach Paspalum disticum, zebranych w Tivoli kolo Rzymu. Szczep ten jednak, jak równiez inne do¬ tychczas znane szczepy Claviceps paspali Stevens et Hall nie tworzy konidiów in vitro.W sposobie wedlug wyzej wymienionego brytyj¬ skiego opisu patentowego nr 883 329 prowadzi sie fermentacje glebinowa w temperature 22—30°C przy 15 20 25 30 pH = 4,6—6, w ciagu 10—15 dni. Przesacz z kultury alkalizuje i ekstrahuje rozpuszczalnikami organicz¬ nymi lub absorbuje na stalym sorbencie i wyod¬ rebnia alkaloidy.Dla wprowadzenia metod biologicznych na skale techniczna jest rzecza wielkiej wagi, czy okreslony grzyb wytwarza konidia czy tez nie. Za pomoca ko¬ nidiów mozna bowiem otrzymac kultury z jednego zarodnika i dzieki temu dochodzi sie do genetycznie jednolitego materialu. Z konidii mozna tez, dziala¬ niem promieni rentgenowskich i ultrafioletowych, jak równiez dzialaniem odczynników chemicznych, duzo latwiej otrzymac mutanty i wydzielic je ze sterylnej grzybni. Ponadto zakazajac konidiami kwi¬ tnace rosliny Paspalum mozna na naturalnym zy¬ wicielu otrzymac przetrwalniki, które doskonale na¬ daja sie do konserwowania szczepu. Z tego trwale¬ go materialu mozna na przyklad otrzymac swiezy material do szczepien, o ile kultury in vitro dege¬ neruja sie. Konidia moga byc równiez poddawane liofilizacji i w postaci zliofilizowanej moga byc prze¬ chowywane bez ograniczen. Do szczepienia pozywki najlepiej nadaje sie zawiesina konidiów, poniewaz w takiej postaci mozna ja najdogodniej dawkowac do szczepienia i mozna z nia najlatwiej pracowac w warunkach jalowych. Natomiast jalowa grzybnia musi byc na poczatku zhomogenizowana.W sposobie wedlug wynalazku zastosowano nowy szczep Claviceps paspali Stevens et Hall, zdolny do wytwarzania konidiów in vitro, Szczep ten znale- 521165*110 S 4 nono w Nowej Gwinei na trawie Paspalum dilata- tum Poir. Zdolnosc wytwarzania konidiów stanowi ceche odrózniajaca ten nowy szczep pod wzgledem morfologicznym od dotychczasowych szczepów uzy¬ wanych do otrzymywania amidów kwasu lizergo- wego i izolizergowego. Dalsza róznice stanowi to, ze nowy szczep ma srednie wymiary glówek 2,8 X X 3,2 mm (w porównaniu z wymiarami glówek 3,4 X 3,2 mm u szczepu stosowanego wedlug brytyj¬ skiego opisu patentowego nr. 883 329). Próbki nowe¬ go szczepu grzyba zostaly zdeponowane w Departa¬ mencie Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (Northern Utilization Research and Development Division), pod numerem NRRL 3027. W przeciwienstwie do dotychczas opisanych szczepów Claviceps paspali Stevens et Hall przetrwalniki szczepu NRRL 3027 zawieraja alkaloidy. Zawartosc alkaloidów w tych próbkach przetrwalników wynosi 0,04Vt, w tym: amidu kwasu lizergowegó 40V» amidu kwasu izolizergowego 20°/t ergobazyny 15°/t ergobazyniny * l&h chanoklawiny 10^/t nieznanych W% Nalezy zwrócic uwage na fakt, ze stosowane do¬ tad szczepy Claviceps paspali Stevens et Hall two¬ rzyly tylko amidy kwasu lizergowegó i izolizergo¬ wego. Szczep wedlug wynalazku tworzy natomiast dodatkowo ergobazyne, ergobazynine i chanókla- wine. Wyróznia to nowy szczep od znanych pod wzgledem fizjologicznym.Analize mieszaniny alkaloidów przeprowadza sie metoda chromatografii bibulowej a procentowy udzial poszczególnych skladników oznaczono na podstawie intensywnosci barwy plamek.Wydzielanie i rozmnazanie nowego szczepu grzy¬ ba odbywa sie w nastepujacy sposób: Z wewnetrznej czesci sklerocjum pobiera sie ste¬ rylnie maly kawalek tkanki i przenosi na pozywke z agaru i brzeczki piwnej o skladzie: 250 ml bez- chmielowej jasnej brzeczki piwnej (lWt suchej substancji), 18 g agam, wody destylowanej do 1 1 (pH = 5,2)). Rozwija sie okragla kolonia, która po uplywie 14 dni w temperaturze 24°C osiaga sred¬ nice 15 mm. Sklada sie ona z blony grubosci okolo 1 mm o strukturze pseudoprzetrwalnikowej, oraz z bialej grzybni powietrznej. Brunatny barwnik dy- funduje'do wnetrza agaru. Konidia nie wytwarzaja sie. Kolonie te rozdrabnia sie za pomoca lopatki i przenosi do probówki zawierajacej 12 cm9 pozywki agarowej o nastepujacym skladzie: brzeczka piwna 500 ml moczone ziarno 60 g kwas mlekowy 1 ml roztwór salmiaku do pH — 4,8 agar-agar 20 g woda destylowana do 1 1 Wokól kazdej szczepionki powstaje mala kolonia o poczatkowo bialej, pózniej czerwonobrunatnej grzybni. Po 10 dniach na wierzcholkach strzepków grzybni zaczynaja zawiazywac sie konidia. Po 20 dniach konidia sa juz w wystarczajacej ilosci, aby otrzymac z nich wodna zawiesine, która mozna za¬ szczepic 20 probówek skosnego agaru (o skladzie jak wyzej) Kultury te poddaje sie dojrzewaniu w tempe¬ raturze 24°C. Konidia kielkuja po uplywie 24—36 godzin. Po 6 dniach powierzchnia agaru pokrywa sie równomiernie subtelna, biala grzybnia, po 10 dniach 5 tworzy sie brunatnoszara, delikatnie zmarszczona wierzchnia warstwa grzybni, która scisle pokrywa agar i posiada krótkie strzepki powietrzne. Na nich zawiazuja sie. konidia. Po uplywie 12 tygodni w wielu miejscach grzybni tworza sie centra, na których wydzielaja sie male kropelki czerwono¬ brunatnej cieczy. Kropelki osiagaja srednice 1— 3 mm i wkrótce z bardzo licznych konidiów po¬ wstaje mleczne zmetnienie. Po uplywie 16—18 dni tworzenie sie konidiów jest praktycznie zakonczo¬ ne. Kultura na ukosnym agarze w probówce o sred¬ nicy 2 cm i w 12 ml pozywki agarowej zawiera okolo 10* konidiów.Kulture wstepna przygotowuje sie w nastepujacy sposób: Jako medium stosuje sie 4,5-procentowy wodny roztwór wyciagu slodowego o pH=5,4. Jeden litr tego roztworu poddaje sie sterylizacji w kolbie stozkowej o pojemnosci 2 litrów w ciagu 20 minut w temperaturze 110 °C, nastepnie przeszczepia sie 5,10* konidiów z dwudziestodniowej kultury agaro¬ wej przeszczepów otrzymanych z jednego zarodnika szczepu z Nowej Gwinei i poddaje sie inkubacji w ciagu 3 dni w obrotowej wytrzasarce w tempe¬ raturze 23 °C. Powstaje gesta kultura zlozona z drobnych platków grzybni. Platki skladaja sie z luznych klebków strzepków i posiadaja srednice od 2—4 mm. Nie daje sie wykryc zadnych alka¬ loidów.W celu otrzymania wiekszych ilosci wstepnej kul¬ tury, przeszczepia sie 5.109 konidiów w szklanym aparacie do fermentacji, zawierajacym 10 1 tego samego medium, i poddaje dojrzewaniu w ciagu 3 dni w temperaturze 23 °C przepuszczajac powie¬ trze z szybkoscia 6 1 powietrza na minute oraz mie¬ szajac z szybkoscia 200 obrotów mieszadla na mi¬ nute. Dla zwalczania piany stosuje sie emulsje sili¬ konowa. Otrzymane w aparacie fermentacyjnym kultury sa takiej samej jakosci jak kultury otrzy¬ mane przez wytrzasanie. Dla glównej kultury oka¬ zuje sie szczególnie korzystna pozywka, zawiera¬ jaca w 1 1 wody destylowanej: sorbit 50 g kwas bursztynowy 36 g KH1PO4 2 g MgSOi 0,3 g FeS04 1 mg • 7 H2O Z11SO4 10 mg • 7 H2O o pH=5,4 ustalonym za pomoca NH4OH.O wplywie jonów cynku i zelaza na wzrost grzy¬ ba i zawartosc alkaidów w roztworze kultury infor¬ muja dwie nastepujace tablice: 1. Wzrost wyrazony w g suchej grzybni na 1 litr roztworu kultury ZnS04»7 H2O w mg/l 0 1 FeS04 0 7.2 4,2 • 7 H2O w mg/l 1 1 6,1 U.7 10 6,1 17,1 | 15 20 25 80 85 45 50 55 605 5«1« • 2. Zawartoftc alkaloidów Wszedzie 1 mg FeS04«7 HO na 1 litr roztworu kultury 1 ZnSO* • 7 H2O w mg/l 1 ° 1 15 60 Zawartosc alkaloidów w mg/l. 8 1060 985 950 Pozywke te zaszczepia sie 10-procentowym roz¬ tworem trzydniowej kultury wstepnej i poddaje inkubacji w porcjach po 100 ml w kolbach stozko¬ wych o pojemnosci 500 ml, umieszczonych w wy¬ trzasarce rewersyjnej w temperaturze 23 °C. Dal¬ sze kultury poddaje sie rozmnazaniu w analogiczny sposób w aparacie de fermentacji, zawierajacym 170 1 pozywki, wykonanym ze stali nierdzewnej.Przepuszcza sie przy tym powietrze z szybkoscia 170 1 na minute oraz miesza sie poczatkowo z szyb¬ koscia 70 obrotów na minute, pózniej 180 obrotów na minute. W celu zwalczania piany stosuje sie emulsje silikonowa.W ten sposób powstaja kultury, zlozone z licznych jednakowych czastek grzybni. Ich srednica wynosi okolo 5 mm oraz posiadaja one kuliste, zwarte jadro o srednicy okolo 1 mm utworzone z tkanki pseudoparenchymatycznej. Jadro to posiada roz¬ mieszczone gwiazdziscie, dlugosci okolo 2 mm wy¬ rostki z równolegle ulozonych strzepków. Pod ko¬ niec dziesieciodniowego okresu istnienia kultury grzybnia jest jasnobrunatna, a przesacz zabarwiony intensywnie na kolor czerwonobrunatny.Tak otrzymany przesacz kultury moze byc pod¬ dawany na przyklad nastepujacej przeróbce: 20 1 przesaczu kultury traktuje sie okolo 1,2 kg sody az do ustalenia pH = 9,75 i trzykrotnie ekstrahuje sie 20 1 chlorku etylenu. Faze organiczna przemywa sie jeden raz 5 1 wody i nastepnie zageszcza sie w prózni do ogólnej objetosci 4 L Koncentrat ekstrahuje sie trzykrotnie 1115 procentowego kwa¬ su winowego. Wyciagi kwasu winowego traktuje soda do pH — 9,0 i ekstrahuje trzykrotnie 2 1 chlorku etylenu. Wyciagi przemyte mala iloscia wo¬ dy i wysuszone siarczanem daja 16,7 g zasad, które wedlug van Urka zawieraja 12,2 g substancji indo- lowych, wzglednie po badaniu chromatografia bibu¬ lowa zawieraja 11,3 g zmydlajacyeh sie indoli.Tak otrzymana mieszanina zasad, po zanalizowa¬ niu metoda chromatografii bibulowej wykazuje na¬ stepujacy sklad: amid kwasu amid kwasu ergobazyna ergobazynina chanoklawina elimoklawina penniklawina lizergowego izolizergowego 45«/e 42°/e 3Vt 3Vo 3Vo 2% 2*/o Wychodzac z kultury fermentacyjnej otrzymuje sie z niej po 12 dniach hodowli 145 1 przesaczu. Ten przesacz po zalkalizowaniu 2n lugiem sodowym ekstrahuje sie 5 razy 200 1 estru octowego przy pH = 7,4 i 3 razy 200 1 estru octowego przy pH — = 10. Oba wyciagi z octanem etylu zageszcza sie do objetosci 101 i z koncentratu ekstrahuje sie alkaloi- s dy wodnym roztworem kwasu winowego. Wyciagi uzyskane z ekstrakcji wodnym roztworem kwasu winowego ekstrahuje sie po zalkalizowaniu ponow¬ nie przy pH = 7,4 i pH = 10 octanem etylu i po przemyciu mala iloscia wody odparowuje do sucho- 10 sci. Pozostalosc ekstrakcyjna po zanalizowaniu metoda chromatografii bibulowej wykazuje naste¬ pujacy sklad: amid kwasu lizergowepo amid kwasu izolizergowego ergobazyna ergobazynina chanoklawina elomoklawina agroklawina penniklawina 60*/. 21»/t *•/• */• 2Vt Xh 2Vt !•/• Otrzymana mieszanina jest szczególnie bogata w amid kwasu lizergowego wzglednie amid kwasu izolizergowego. Oba te zwiazki w przeciwienstwie 25 do naturalnych alkaloidów sporyszu, takich jak na przyklad ergobazyna daja sie znacznie latwiej hy- / drolizowac do wolnego kwasu lizergowego, który jest waznym produktem posrednim dla syntezy w^ysokoaktywnych preparatów farmaceutycznych. 80 W razie potrzeby mozna równiez te hydrolize prze¬ prowadzac bezposrednio w cyklu roboczym, wy¬ dzielajac mieszanine alkaloidów z przesaczu kultu¬ ry, na przyklad w nastepujacy sposób: 16,7 g otrzymanej wedlug powyzszej metody mie- 80 szaniny surowych alkaloidów rozpuszcza sie w 50 procentowym alkoholu i alkaliczny roztwór po do¬ daniu 75 g wodorotlenku barowego i 2 g dwutionia- nu sodowego ogrzewa sie w ciagu H godziny pod chlodnica zwrotna. 40 Do oziebionej mieszaniny reakcyjnej dodaje sie 16 ml stezonego amoniaku i 218 ml 2n kwasu siar¬ kowego. Nastepnie osad odfiltrowuje sie. Pozo¬ stalosc odszlamowuje sie jeszcze 5 razy za pomoca 200 ml goracej mieszaniny metanolu i amoniaku 45 (9:1). Przesacz oczyszcza sie przez przemywanie roztworem mieszaniny metanolu i amoniaku i za¬ geszcza w prózni. Tak otrzymany surowy kwas li- zergowy wytraca sie z mieszaniny o zawartosci 75 ml metanolu i 75 ml 2n lugu sodowego przez 50 dodatek 33 ml lodowatego kwasu octowego. Wydaj¬ nosc czystego kwasu lizergowego wynosi 6,5 g. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe x 55 Sposób wytwarzania amidów kwasu lizergowego i izolfzergowego na drodze mikrobiologicznej, ina- mienny tym, ze tworzacy konidia szczep Claviceps paspali Stevens et Hall nr NRRL poddaje sie gle¬ binowej hodowli saprofitycznej na pozywce, skla- 60 dajacej sie z polialkoholu jako zródla wegla, soli amonowej kwasu organicznego jako zródla azotu i soli mineralnych, uzyskana mase saczy, a z prze¬ saczu wyodrebnia amidy kwasu lizergowego i/lub izolizergowego przez ekstrakcje organicznym roz- 65 puszczalnikiem. PL