PL51197B1 - - Google Patents

Description

Stwierdzono, ze do otrzymywania fumagiliny nadaja sie niektóre szczepy Aspergillus fumigatus var. helvola wzglednie ich mutanty otrzymane metodami sztucznymi i/lub naturalnymi, poddane fermentacji metoda podpowierzchniowa w warun¬ kach napowietrzania.Odmiane plesni helvola gat. Aspergillus fumi¬ gatus opisano w roku 1938, jak równiez okreslono jej wlasciwosci morfologiczne i stwierdzono, ze ten typ grzybka wytwarza kwas helwolowy.Istota sposobu wedlug wynalazku jest wiec stwierdzenie, ze pewne szczepy nalezace do od¬ miany helvola gatunku Aspergillus fumigatus, w okreslonych warunkach moga wytwarzac nie tylko kwas helwolowy lecz takze i fumagiline.Szczepy nalezace do odmiany helvola róznia sie od innych typów grzybków nalezacych do gatun¬ ku Aspergillus fumigatus zwlaszcza zas od szcze¬ pów Aspergillus fumigatus H-3 i NRRL-2346 zdolnoscia wytwarzania kwasu helwolowego oraz innymi wlasciwosciami biochemicznymi i morfo¬ logicznymi. 10 15 20 30 Stwierdzono ponadto, ze niektóre sposród szcze¬ pów Aspergillus fumigatus var. helvola — w prze¬ ciwienstwie do opisanych dotychczas szczepów Aspergillus fumigatus var. helvola — odznaczaja sie tym, iz obok minimalnych ilosci kwasu hel¬ wolowego wytwarzaja fumagiline w duzym ste¬ zeniu, albo nawet sama tylko fumagiline. Dzieki temu sa one przydatne do wytwarzania fumagili¬ ny na skale przemyslowa. Do tego celu szcze¬ gólnie odpowiedni okazal sie na przyklad szczep nr A-33 Aspergillus fumigatus var. helvola znaj¬ dujacy sie w depozycie Wegierskiego Panstwowego Instytutu Higieny pod nr 630.704/23. Szczep ten wyodrebniono z próbki gleby pobranej z zespolu roslinnego nalezacego do Quarceto-Lithosperme- tum w górach w przelomie Dunaju na Wegrzech.Cechy morfologiczne nowego szczepu sa naste¬ pujace.Kolonia: barwa grzybni powietrznej: biala-jasna ochra; barwa podloza: jasno-zólta, jasno-pomaranczowo- -brazowa; typu porostu: podobny do zamszu; szybkosc rozprzestrzeniania sie: srednio umiarko¬ wana; tworzenie zarodników: obfite.Bulawa: ksztalt: pólkulisty, slupkowaty; dlugosc 50—70 mikronów; srednica: 30—70 mikronów. 5119751197 3 pecherzyk (vesiculum): ksztalt: butelkowaty srednica: 9—16 mikronów (kolonia wykazuje równiez obecnosc nielicznych szczególnie malych tzw. „wtórnych bulaw").Strzepek koncowy (sterigma): ugrupowanie: w 1 rzedzie, scisle, w górnej czesci pecherzyka; dlugosc: 5,7—7,2 mikrona; szerokosc: 2,5—3,2 mikrona.Zarodnik (conidium): barwa: bezbarwny, w masie Jasno-zólto-brunatnawy; ksztalt: okragly, Jajowaty; srednica: 2,5—3,3 (3,7) mikrona.Nitka zarodnikujaca: dlugosc: 150—400 mikronów; srednica: 3,5—7,2 mikrona, zwieksza sie ku górze; * barwa: bezbarwna; powierzchnia sciankiz gladka, nieco falista.Natomiast znane szczepy Aspergillus fumigatus charakteryzuja sie ponizszymi cechami morfolo- gicznymi.Kolonie: barwa grzybni powietrznej: barwa podloza: typ porostu: szybkosc roz¬ przestrzeniania sie: tworzenie zarod¬ ników Bulawy: ksztalt: dlugosc: srednica: Pecherzyki: ksztalt: srednica: Strzepki konco¬ we: ugrupowanie: dlugosc: srednica: Zarodniki: barwa: ksztalt: srednica: Nitki zarodniku¬ jace: dlugosc: srednica: barwa: powierzchnia scianki: AspergiUus fu¬ migatus NRRL 2436 biala do ciemno¬ zielonej cielista do kre- mowo-zóltego podobny do zam¬ szu umiarkowana obfite zwarty, slupko- vAy 70—05 mikronów 30—40 mikronów butelkowaty, w górnej polowie plenny 12—20 mikronów w 1 rzedzie, rów¬ nolegle do osi nitki, skupione 5—7,5 mikrona 1,5—2,5 mikrona zielona kulisty, chropo¬ waty 2,5—3,0 mikro¬ nów 70—650 mikro¬ nów 2,5—5,5 mikrona zielona gladka AspergiUus fu¬ migatus H-3 biala do ciemno¬ szarej Jasno-cytryno- wo-zólta klaczkowaty rozprzestrzenia pie umiarkowane zwarty, slupko¬ wy 75—125 mikronów 35—60 mikronów butelkowaty, w górnej polowie plenny 14—20 mikronów w 1 rzedzie, rów¬ nolegle do osi nitki, skupione 4,5—7,5 mikrona 1,5—2,5 mikrona zielona kulisty, chropo¬ waty 2,5—3,5 mikro- ncfw 35—400 mikronów 2.5—7,0 mikro¬ nów zielona gladka 10 15 35 40 45 50 55 60 65 Hodowle nowego szczepu A-33 Aspergillus fu¬ migatus var. helvola wytwarzajacego fumagiline prowadzi sie na pozywce zawierajacej azot, wegiel oraz sole nieorganiczne w temperaturze 26—28°C i przy wartosci pH srodowiska 4—7. W sposobie wedlug wynalazku nalezy dobrac taka pozywke, aby nie ulegla ona zbyt wczesnemu zalkalizowaniu, gdyz spowodowaloby to zahamowanie biosyntezy fumagiliny. Stwierdzono, ze wymienionym warun¬ kom odpowiada taka pozywka, w której stosunek wegla do azotu wynosi 20—60:1. Jako organiczne zródla azotu mozna stosowac make sojowa, wy¬ ciag namokowy kukurydzy, maczke z orzechów laskowych itd. Korzystnie jest, gdy stosuje sie wyciag namokowy kukurydzy o zawartosci 5C°/o substancji stalej, w ilosci 2—10°/o wagowo w sto¬ sunku do pozywki.Stwierdzono ponadto, ze w przeciwienstwie do danych w literaturze dla znanych dotychczas szczepów, cukry zlozone nie sa odpowiednie w ho¬ dowli szczepów Aspergillus fumigatus helvola wytwarzajacych fumagiline. Jako weglowodany najodopowiedniejsze sa cukry proste wzglednie dwucukry. Na przyklad z bardzo dobrym rezulta¬ tem mozna stosowac sacharoze, jak tez glukoze, przy czym — w przeciwienstwie do znanych do¬ tychczas sposobów (na przyklad patent USA 2 803 586) — wielokrotne uzupelnianie pozywki glukoza nie jest konieczne. Jako zródlo cukru mozna takze stosowac na przyklad melase.Do pozywki hodowlanej wprowadza sie rów¬ niez sole nieorganiczne zawierajace azot jak: azotan sodowy, potasowy, amonowy, nieorganiczne sole fosforanowe, na przyklad: fosforan jednopo- tasowy, fosforan dwusodowy, fosforan jednoamo- nowy itd. oraz inne sole nieorganiczne, na przy¬ klad chlorek potasowy, siarczan magnezowy itd.Te ostatnie sole stosuje sie w ilosci po 0,05—0,l°/o wagowo w przeliczeniu na calkowita objetosc pozywki.Korzystnie jest prowadzic fermentacje w obec¬ nosci pierwiastków sladowych na przyklad zelaza.Stwierdzono, ze w tym charakterze z dobrym rezultatem mozna stosowac cynk albo bor w ilosci 0,001—0,01% wagowo na objetosc pozywki. Zasto¬ sowanie tych pierwiastków w tym celu dotychczas nie bylo znane.U opisanych w literaturze szczepów Aspergil¬ lus fumigatus wydajnosc fumagiliny wynosi 100— 400 y/ml, podczas gdy szczepy Aspergillus fumi¬ gatus var. helvola stosowane w sposobie wedlug wynalazku zwiekszaja te wydajnosc do 800— —1000 y/mL Sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie fu¬ magiline na drodze fermentacji w obecnosci szcze¬ pu Aspergillus fumigatus var. helvola albo jego mutantów, najkorzystniej w obecnosci szczepu Aspergillus fumigatus var. helvola A-33, metoda podpowierzchniowa w warunkach napowietrzania, w temperaturze najkorzystniej 26—28°C i przy pH pozywki najkorzystniej 4—7.W procesie biosyntezy, sposobem wedlug wyna¬ lazku szczepionke zarodnikowa sporzadza sie na pozywce Czapek-Doxa, przy czym inkubacja trwa 7—10 dni w temperaturze 28°C, po czym51197 zawiesin* zarodników na przyklad szczepu Asper- riflus fumigatus var. helwola A«43 przenori sie aa pozywka posiewowa stosujac na przyklad 10 ml zawiesiny zarodników na JO* ml pozywki posie- wowaj, przy czym pozywka ta zawiera wymienio¬ na uprzednio zródla azotu, wegla oraz sladowe ilosci soli zelaza i cynku i/lub boru.Kulture posiewowa hoduje sie na trzesawce w temperaturze najkorzystniej 26—28*C przez okres 20—40 godzin, przy ciaglym mieszaniu (oko¬ lo 150—450 obr/min) i napowietrzaniu, po czym w znany sposób zaszczepia sie nia wlasciwa po¬ zywke produkcyjna, zawierajaca wymienione wy* ze} zródla azotu i wegla oraz pierwiastki sladowe.Szczepionke posiewowa stosuje sie w ilosci okolo 10—20% objetosciowo w stosunku do pozywki pro¬ dukcyjnej. Fermentacje prowadzi sie przy ciaglym mieszaniu, najkorzystniej 350—450 obr/min i na¬ powietrzaniu, przy czym stosunek objetosci po¬ wietrza doprowadzanego na minute do objetosci brzeczki fermentacyjne} wynosi okolo 1:1. Proces biosyntezy w temperaturze 26—*28*C trwa okolo 144—168 godzin. Zawartosc furnagiliny w brzeczce pofermentacyjnej wynosi 400—1000 y na 1 mi Nastepnie* pH brzeczki nastawia sie za pomoca NaOH lub NaHCO* na wartosc okolo 9, wskutek czego ftimagilina zawarta w grzybni zostaje z niej wymyta i przechodzi calkowicie do roztworu, po czym grzybnie odsacza sie.Produkt koncowy mozna wyodrebnic z brzeczki fermentacyjnej róznymi metodami, na przyklad przez tworzenie soli * zasadami organicznymi lub nieorganicznymi Mozna równiez stosowac metody ekstrakcyjne i/lub adsorpcyjne. Równiez pa wy¬ odrebnieniu mozna fumafliline przeprowadzac w sole. Dobre wyniki daje wytracanie produktu wodorotlenkiem sodowym przy pH = 9,0. Dalsze szczególy sposobu wedlug wynalazku zawieraja ponizsze przyklady."Wytwarzajacy fumagiline szczep Aspergillus fu- migatus var. helvol* mozna z bardzo dobrym rezultatem przechowywac na pozywce Czapek-Doxa (przechowywany w temperaturze + 4°C w ciagu roku nie traci aktywnosci). Szczep ten poddany liofilizacji zachowuje swoja zdolnosc; produkcyjna preez lata. Po dodaniu 5—7%' gliceryny, zamro¬ zeniu do temperatury —25-—35^ i przechowywa¬ niu w temperaturze —*10°C» mozna z hodowli wstrzasanej otrzymac dotee szczepionki, które z kolei mozna z powodzeniem stosowac nawet po uplywie wielu miesiecy. Bia duzej hodowli za¬ rodnikowe! bardzo odpowiednia jeat równiez ogól¬ nie znana pozywka ze slodu.Przyklad I. Pozywke Czapek Doxa zaszcze¬ pia sie zawiesina zarodników szczepu Aspergillus fumigatus var. helvola A-33. Po 7—10 dniach inkubaeji w temperaturze 28°*C warstwe zarodni¬ ków splukuje sie wyjalowiona woda destylowana z dodatkiem 1% tweenu 80, po czym mozna uzyc je* jako szczepionke. Tak zwana pozywka posie¬ wowa, która stosuje sie w porcjach po 100 ml w kolbach Erlemayera o pojemnosci 500 ml, po¬ siada nastepujacy sklad: 3% sacharozy, 1% wyciagu namokowego kukurydzy, 41 5S 6ft 0,1% fosforanu jednopotasowego, 0,05% chlorku potasowego, 0,08% MgSO*7H*Or M01% FeSO^fHjG, pH - 6£ (pi-zed wyjalowieniem), Pozywke posiewowa zaszczepia sie 10 lal szcze¬ pionki, po czym kulture wytrzasa w ekscentrycz¬ nej trzesawce stolowej o 250—350 obr/min, przez 20—48 godzin w temperaturze 28*C. Tak otrzymana czynna kulture grzybni zaszczepia sie na pozywce fermentacyjnej w kolbie Erlemayera o pojemnosci 500 ml. Sklad tej pozywki jest nastepujacy: 7% sacharozy, 1% wyciagu namokowego kukurydzy, 0,2% fosforanu jednopotasowego, 0,1% azotanu amonowego, 0,05% chlorku potasowego, 0,05% MgSO+IKtOr 0,05% FeSG4.7H20, pH ** 6,5 &rzed wyjalowieniem).Optymalna ilosc szczepionki wynosi 10—20*/*.Wytrzasanie w trzesawce stolowej kontynuuje sie przez 144—16* godzin.Zawartosc futnagiliny oznaczona spektrofotome- trycznie w zakresie UV wynosi 400—500 -yJ&L Przyklad II. 6 litrów pozywki posiewowej przygotowanej w sposób jak w przykladzie I za¬ szczepia sie otrzymana w wyzej opisany sposób zawiesina zarodników Aspergillus fumigatus var, helvola A-33 lub jego czynna kultura grzybnio¬ wa, po czym inkubuje sie w temperaturze 28"C przez 24—28 godzin przy ciaglym mieszaniu i prze¬ wietrzaniu (stosunek objetosci powietrza na mi¬ nute do objetosci brzeczki wynosi 1:1). Przeciw pienieniu stosuje sie srodki ogólnie uzywane w tym celu w przemysle fermentacyjnym (na przyklad olej slonecznikowy, palmowy, oleje sifK konowe lub 1%-owy alkoholowy roztwór okta- dekanolu). 6 litrów pozywki fermentacyjnej o skla¬ dzie jak w przykladzie 1 zaszczepia sie 600—1000 ml w ten sposób otrzymanej kultury. Sklad po¬ zywki jest taki sam jak wyze}, jedynie zawartosc cukru obniza sie do 4% Fermentacje prowadzi sie przy ciaglym miesza¬ niu (350—450 obr/min) i przewietrzaniu (stosunek objetosci doprowadzanego powietrza na minute do objetosci brzeczki wynosi 1 :1) w ciagu <144—168 godzin. W tych warunkach otrzymuje sie 500— —600 y fumagiliny na 1 ml. Nastepnie pH brzecz¬ ki nastawia sie na wartosc — 9Q, wskutek czego substancja czynna przechodzi calkowicie do roz¬ tworu, zas grzybnie odsacza sie.Wartosc pH przesaczu nastawia sie przy pomo¬ cy 0,J%-owego kwasu fosforowego do wartosci =* = 6,5, po czym dodaje sie 2,3% chlorku barowego i 1,6% krzemionki. Wytracony osad fosforanu barowego, który porywa ze soba z przesaczu nierozpuszczalne zanieczyszczenia* odsacza sie, przy czym filtracje ulatwia ziemia okrzemkowa.Z kolei pH klarownego przesaczu nastawia sie przy pomocy 0,2%-owego kwasu fosforowego do wartosci 3,0, po ezym fumagiline ekstrahuje sie octanem butylu i buforowym roztworem boranu. pH polaczonych^ wyciagów nastawia sie 3%-ewym5M07, kwasem fosforowym do wartosci = 3,0 i ponownie ekstrahuje fumagiline octanem butylu.Polaczone wyciagi w octanie butylu odwadnia sie siarczanem sodowym w ilosci 3% objetoscio¬ wych, po czym siarczan sodowy odsacza sie, a przesacz zageszcza pod próznia 0,1 mm Hg — — 1/20 poczatkowej objetosci.Pozostalosc rozpuszcza sie w trzydziestokrotnej objetosci wrzacego metanolu i nastepnie roztwór ten zadaje dwukrotna objetoscia wody destylowa¬ nej. pH roztworu wodnometanolowego nastawia sie kwasem fosforowym na 2,5. Wytracony rozdrob¬ niony (koloidalny) osad fumagiliny adsorbuje sie na ziemi okrzemkowej i nastepnie odsacza.Zaadsorbowana fumagiline miesza sie w ciagu 30 minut z trzydziestokrotna objetoscia goracego metanolu, wskutek czego nastepuje jej wymycie.Wrzacy roztwór fumagiliny w metanolu odbar¬ wia sie weglem zwierzecym (w ilosci 2°/o objetos¬ ciowych), po czym saczy przez plyte filtracyjna Seitza K* Przesacz zageszcza sie pod próznia (1 minute) w atmosferze azotu do 1/20 poczatkowej objetosci i nastepnie poddaje krystalizacji w temperaturze —10°C w ciagu 8—10 godzin, krysztaly odsacza sie na filtrze G-4 i suszy w temperaturze 40°C bez dostepu swiatla. W razie potrzeby fumagiline przekrystalizowuje sie z dwudziestokrotnej obje¬ tosci metanolu zawierajacego 50% wody.Nastepnie krysztaly suszy sie, przesiewa i prze¬ chowuje w 100 gramowych ampulkach w stanie sproszkowanym w temperaturze 0°C, w atmosfe¬ rze azotu i bez dostepu swiatla.Otrzymuje sie 0,8 g fumagiliny, która zawiera 80—85% substancji czynnej. Temperatura topnie¬ nia 190—194°C; (X) *• = — 26° (C = 0,25 w metanolu); sklad % 0 = 24^-26, % C = 56—58.Przyklad III. 6 litrów pozywki posiewo- wej opisanej w przykladzie I zaszczepia sie opi¬ sana w przykladzie I szczepionka zarodnikowa Aspergillu fumigatus var. helvola A-33. Po roz¬ winieciu sie hodowli pobiera sie z niej 10—20% i przenosi na pozywke o nastepujacym skladzie: 6°/o sacharozy, 2°/o wyciagu namokowego kukurydzy, (w prze¬ liczeniu na substancje stala), 0,3°/o fosforanu jednopotasowego, 0,2% azotanu sodowego, 0,l°/o chlorku potasowego, 0,05% MgS04.7H,0, 0,001% FeS04.7H20.Fermentacje prowadzi sie w temperaturze 28°C, w ciagu 144—168 godzin, przy ciaglym mieszaniu (350—450 obr/min) i przewietrzaniu, po czym otrzy¬ muje sie 800—900 Y fumagiliny w 1 ml. pH brzeczki fermentacyjnej nastawia sie 0,3%- -ami wagowo wodorotlenku sodowego (w postaci 20%-owego roztworu do wartosci =9 i nastepnie odsacza grzybnie. Przesacz przy jednoczesnym mieszaniu, zakwasza sie 0,3% kwasem fosforowym do pH = 3, po czym wytracona koloidalnie fu¬ magiline adsorbuje sie na ziemi okrzemkowej (Hilfo-Celite) uzytej w ilosci 0,5% objetosciowo w stosunku do objetosci roztworu. Osad odsacza sie, a przesacz zadaje dziesieciokrotna objetoscia octanu butylu. Mieszanine te ogrzewa sie do 4&-+ —45°C, intensywnie mieszajac, przy czym fumagi- lina przechodzi do octanu butylu. Roztwór w oc- 5 tanie butylu saczy sie i osusza siarczanem sodo¬ wym. Po zageszczeniu pod próznia (0,1 mm Hg) w temperaturze 40°C do 1/5 objetosci poczatkowej, pozostalosc rozpuszcza sie w dwudziestokrotnej objetosci wrzacego metanolu. Nastepnie po dodaniu io dwukrotnej objetosci wody destylowanej, miesza¬ nine zakwasza sie kwasem fosforowym do pH = s« 2,5, wskutek czego wytraca sie fumagilina w po¬ staci rozdrobnionego osadu.Przez dodanie ziemi okrzemkowej w ilosci oko- u lo pieciokrotnej w stosunku do spodziewanej ilosci fumagiliny, antybiotyk zostaje na niej zaadsorbo- wany, po czym ziemie okrzemkowa odsacza sie.Nastepnie fumagiline wymywa sie z ziemi okrzemkowej trzydziestokrotna objetoscia gorace¬ go go acetonu. Roztwór acetonowy odbarwia sie na goraco za pomoca 2% wegla zwierzecego i saczy przez plyte filtracyjna Seitz'a.Przesacz zageszcza sie w atmosferze azotu, przy cisnieniu 1 mm Hg, do 1/30 poczatkowej objetosci jj i prowadzi krystalizacje w temperaturze —10°C, w ciagu 8—10 godzin. Wydzielone krysztaly odsa¬ cza sie i suszy w temperaturze 40°C w ciemnosci.Krystaliczny produkt mozna przekrystalizowac z dwudziestokrotnej objetosci metanolu zawiera- 30 jacego 50% wody. Otrzymane krysztaly przecho¬ wuje sie w ampulkach, w atmosferze azotu, w tem¬ peraturze 0°C i bez dostepu swiatla.Otrzymuje sie 2,9 g fumagiliny o zawartosci 92—95% substancji czynnej. Temperatura topnie- n nia = 191—194°C; «X) J =* —24,2° (C =* 5% w chloroformie); sklad: % 0 = 24^26, % C- 56—58. PL

Claims (8)

1. Zastrzezenia patentowe 40 1. Sposób otrzymywania fumagiliny na drodze fermentacji, znamienny tym, ze proces bio¬ syntezy prowadzi sie w obecnosci szczepu As¬ pergillus fumigatus var. helyola A-33, albo je- 45 go mutantów metoda podpowierzchniowa w warunkach napowietrzania, po czym anty¬ biotyk wyodrebnia sie z brzeczki pofermenta¬ cyjnej w znany sposób na drodze ekstrakcji i ewentualnie przeprowadza w sól z zasada 50 organiczna lub nieorganiczna.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze fermentacje prowadzi sie w temperaturze 26— —28°C.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 i 2, znamienny tym, 65 ze fermentacje prowadzi sie przy wartosci pH srodowiska 4—7.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1—3, znamienny tym, ze fermentacje prowadzi sie na pozywce, w któ¬ rej stosunek wegla do azotu wynosi 20 :1—60 :1. 60
5. 5. Sposób wedlug zastrz. 1 i 4, znamienny tym, ze fermentacje prowadzi sie na pozywce, w której jako zródlo azotu stosuje sie wyciag namokowy kukurydzy w ilosci 2—10% objeto¬ sciowo w stosunku do objetosci brzeczki (przy 55 50-procentowej zawartosci substancji stalych).51197 9
6. 6. Sposób wedlug zastrz. 1—5, znamienny tym, ze fermentacje prowadzi sie w obecnosci dwu- cukrów, zwlaszcza w obecnosci sacharozy.
7. 7. Sposób wedlug zastrz. 1—6, znamienny tym, ze fermentacje prowadzi sie w obecnosci pier¬ wiastków sladowych, najkorzystniej w obecnosci cynku i/lub boru.
8. 8. 10 Sposób wedlug zastrz. 1—7, znamienny tym, ze po zakonczeniu biosyntezy wartosc pH brzeczki doprowadza sie do okolo 9 za pomoca NaOH lub NaHC03 w celu przeprowadzenia fumagiliny zaadsorbowanej w grzybni do roz¬ tworu. PL