PL49963B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: 49963 03.XII.1962 15.XII.1961 Holandia Opublikowano: 10.IX.1965 KI. 30 h, 2/04 MKP ,A61k UKB Twórca wynalazku: Jacobus Polderman Wlasciciel patentu: N. V. Organon, Oss (Holandia) BIBLIOTEKA Sposób wytwarzania odczynnika do oznaczania gonadotropin Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania odczyn¬ nika do oznaczania gonadotropin.R. Weinbach opisal (Z. Path. BakL 22, 1/1959), ze erytrocyty traktowane formalina i tanina sa od¬ powiednimi nosnikami dla antygenów. Erytrocyty z osadzonymi na nich antygenami reaguja z od¬ powiednim obecnym antysenum (przeciw — suro¬ wica) tworzac jasnozólty, rozproszony osad (aglu¬ tynacja).Wychodzac z tej zasady L. Wide i C. A. Genzell otrzymali odczyn na ciaze, (Acta Endoarinal 35, 261/1960). Jezeli stosuje sie ludzka kosmówkowa gonadotropine jako antygen, wyzej wymienionej reakcji mozna zapobiec przez dodanie dodatko|wej ilosci antygenu do mieszaniny reakcyjnej. Stosujac wiec mocz ciezarnej kobiety jako antygen latwo jest stwierdzic ciaze, gdyz przy znacznej ilosci kos- mówkowej gonadotropiny w tym moczu, wolne erytrocyty osiadaja na dnie naczynia reakcyjnego nie jako rozproszony osad, lecz w postaci ciemno¬ brunatnego pierscienia, co wskazuje na ciaze.Metode te mozna równiez stosowac przy stawia¬ niu diagnozy zjawisk patologicznych, w którym to* przypadku gonadotropiny równiez wystepuja w moczu, i do oznaczania innych gonadotropin, jak gonadotropin, serum w serum ciezarnych klaczy i gonadotropin przysadkowych w wyciagach przy¬ sadki. Te dwa ostatnie oznaczenia sa bardzo wazne jezeli chodzi o selekcje surowego materialu do wytwarzania tych hormonów. 10 15 20 25 30 Znany sposób wytwarzania odczynnika do ozna¬ czania gonadotropiny polega na zmieszaniu korzy¬ stnie w probówce, wodnego roztworu antysenum przeciwko oznaczanej gonadotropinie i wodnej za¬ wiesiny erytrocytów uczulonych ta gonadotropma.Jako plynna zawiesine dla erytrocytów mozna sto¬ sowac fizjologiczny roztwów 6oli kuchennej (chlor¬ ku sodowego) lub buforu fosforanowego. Te same rozpuszczalniki mozna stosowac do antys-erum.Stwierdzono jednakze, ze w niektórych przypad¬ kach stosowanie odczynnika wytworzonego w zna¬ ny sposób prowadzi do falszywych wniosków, w innych przypadkach wyniki sa watpliwe, zwlasz¬ cza, gdy badania prowadzi sie nie nad swiezym moczem.Stwierdzono, ze dotychczasowe oznaczenia pro¬ wadzily do falszywych wniosków, gdy zawartosc jonów wapnia w cieczy poddawanej badaniu, byla wyzsza od normalnej. Zawartosc tych jonów w swiezym moczu jest raczej niska rzedu okolo 0,1 mg/ml, przy calkowitej ilosci wapnia okolo 0,24 mg/ml.Prawdopodobnie wapn w swiezym moczu jest w znacznym stopniu zwiazany z proteinami, tak ze mala ilosc pozostalych wolnych jonów wapnia nie moze przeszkadzac próbie. Jednakze, gdy mocz pozostawi sie na pare dni, zawartosc jonów wap¬ nia moze wzrosnac do wartosci okolo 0,2 mg/ml, który to wzrost jest prawdopodobnie spowodowany rozkladem kompleksów wapnia i proteiny. Nadmiar 4996349963 jonów wapnia powoduje samorzutna aglutynacje erytrocytów niezaleznie od obecnosci gonadotropi- ny kosmówkowej i mocz dodatni (zawierajacy go- nadotropine kosmówkowa) zachowuje sie w wyni¬ ku jak mocz ujemny (nie zawierajacy gonadotropi- ny kosmówkowej).Stwierdzono, ze dokladnosc oznaczania gonado- tropin mozna znacznie zwiekszyc przez wytworze¬ nie odczynnika do ich oznaczania w nowy sposób wprowadzajac w jego sklad jeden lub kilka zwiaz¬ ków zdolnych do wiazania jonów wapnia w roz¬ puszczalny zwiazek kompleksowy. Czynnik wiaza¬ cy jony wapnia stosuje sie w sposobie wedlug wy¬ nalazku w takiej ilosci, zeby zostal zwiazany nad¬ miar jonów wapnia. Nadmiar czynnika wiazacego nie wplywa na oznaczenie gonadotropiny.Wytworzony sposobem wedlug wynalazku od¬ czynnik moze byc stosowany do jakosciowego i. ilo¬ sciowego oznaczania gonadotropin w moczu kobiet ciezarnych, w serum ciezarnych klaczy i w wy¬ ciagach przysadki.Sposób wytwarzania odczynnika' do oznaczenia gonadotropiny wedlug wynalazku, polega na tym, ze w probówce miesza sie wodny roztwór anty¬ serum przeciwko gcnadotropinie i wodna zawiesi¬ ne erytrocytów uczulonych ta gonadotropina i do jednego z tych skladników, dodaje sie czynnika chelatujacego odpowiedniego do zwiazania jonów wapnia, wystepujacych w badanej cieczy.Obydwa skladniki odczynnika stosuje sie ko¬ rzystnie w postaci zliofilizowanej, a czynnik che- latujacy w wodnym roztworze lub zliofilizowany razem z jednym ze skladników.Wnioski dotyczace obecnosci lub nieobecnosci gonadotropiny wyciagniete z oznaczen za pomoca odczynnika wytworzonege sposobem wedlug wy¬ nalazku, sa zawsze pewne we wszystkich tych przypadkach, gdy wyniki otrzymane znanymi me¬ todami byly falszywe lub niepewne. W zaleznosci od ilosci stosowanego antyserum mozna latwo stwierdzic ilosc okolo 100 jednostek kosmówkowej gonadotropiny na litr moczu i wiecej. Ponadto mozna obecnie przeprowadzic dokladne oznaczenia w moczu przechowywanym przez pewien czas, co dotychczas nie bylo mozliwe. Dalsza korzysc sto¬ sowania sposobu wedlug wynalazku stanowi to, ze dodanie czynnika chelatujacego do mieszaniny reakcyjnej powoduje zwiazanie wystepujacego w badanej cieczy cynku, który równiez moze przesz¬ kadzac w oznaczeniu.Przykladami czynnika wiazacego jony wapnia sa: kwas etylenodwuaminoczterooctowy, kwas cy¬ trynowy, kwas winowy, kwas glukoronowy, kwas cukrowy i odpowiednie sole tych kwasów, np. sole metali alkalicznych, sole amonowe i podstawione sole amonowe, glikole, polietylenowe i poliamino- karboksylany, oraz pochodne kwasu etylenodwua- minoczterooctowego jak kwas metyloaminodwu- octowy, kwas (2-karboksyfenylo) — iminodwuocto¬ wy, kwas uramilo — N, N — dwuoctowy, kwas nitrylotrójoctowy i ich odpowiednie sole. Korzyst¬ nie jednak stosuje sie kwas etylodwuaminoeztero- octewy, kwas cytrynowy i ich sole metalu alkalicz¬ nego i amonowe.Przykladowo w sposobie wedlug wynalazku sto¬ suje sie czynnik wiazacy jony wapnia w ilosci 0,2% wagowo.w stosunku do 0,4 ml roztworu antyserum w buforze fosforanowym. W praktyce we wszyst- 5 kich przypadkach ta ilosc jest w zupelnosci wy¬ starczajaca do zwiazania wapnia, znajdujacego sie w moczu. Bufor fosforanowy mozna wytworzyc np. przez rozpuszczenie 2,9 g fosforanu jedno-potaso- Wego, 9,6 g fosforanu sodu i 4,5 g chlorku sodo- io wego w destylowanej wodzie i uzupelnienie woda do 1 litra objetosci.Mozna równiez stosowac bufor cytrynianowy za¬ miast fosforanowego, który moze równoczesnie slu¬ zyc jako czynnik wiazacy jony wapnia. Przepro- 15 wadzono rózne liczne badania porównawcze z prób¬ kami moczu, o którym wiedziano napewno, ze jest dodatni. W zaleznosci od czasu przechowywania moczu i temperatury, w której byl przechowywany, stosujac odczynnik wytworzony znana metoda 20 otrzymano w 5—10% przypadków watpliwe lub ujemne wyniki. Wszystkie te same próbki badano znowu stosujac odczynnik wytworzony sposobem wedlug wynalazku, przy czym próbki watpliwe i rzekomo ujemne, daly wyniki pewne i dodatnie. 25 Nastepujace przyklady wyjasniaja sposób wy¬ twarzania odczynnika do oznaczania gonadotro¬ piny.Przyklad I. Wytwarza sie roztwór buforowy, 30 zawierajacy nastepujace zwiazki w 1 litrze: 2,88 g fosforanu jednopot asowego 9,62 g fosforanu dwupotasowego 4,5 g chlorku sodowego.Do tego roztworu dodaje sie 2,0 g dwusodowej 35 soli kwasu etylenodwuaminoczterooctowego.Nastepnie wytwarza sie w tym roztworze bufo¬ rowym roztwór liofilizowanego antyserum w ilosci 0,05°/o wagowo, poczym 0,4 ml roztworu antyserum dodaje sie do liofilizowanej zawiesiny erytrocytów 40 uczulonych ludzka kosrnówkowa gonadotropina, zawierajacej 1% objetosciowo erytrocytów w 0,25 ml destylowanej wody. Otrzymana mieszanine mozna stosowac jako odczynik do okreslania ciazy.W tym celu do odczynnika dodaje sie 0,1 ml bada- 45 nego moczu.Przyklad II. 0,5 g antyserum rozpuszcza sie w 100 ml buforu cytrynianowego, zawierajacego 11,13 g kwasu cytrynowego i 8,53 g wodorotlenku po- 50 tas owego na 1 litr. Po rozdzieleniu w równych ilosciach na 100 fiolek, roztwór liofilizuje sie. Przed rozpoczeciem oznaczenia dodaje sie do kazdej fiol¬ ki po 10 ml destylowanej wody, po czym 0,4 ml tego roztworu dodaje sie do liofilizowanej 1%-wej 55 objetosciowo zawiesiny uczulonych erytrocytów, w 0,25 ml destylowanej wody. Tym odczynnikiem prowadzi sie oznaczenie.Przyklad III. 10 ml zawiesiny o stezeniu 60 10% objetosciowych erytrocytów uczulonych gona¬ dotropina, zawiesza sie w 33 ml destylowanej wody, zawierajacej 0,9% chlorku sodowego i 2% wagowych surowicy królika, podczas dodawania 66,7 mg soli dwusodowej kwasu etylenodw.uamino- 65 czterooctowego. Nastepnie 0,05 ml tej zawiesiny49963 5 dodaje sie do roztworu buforowego, podanego 2. w przykladzie I. Otrzymana mieszanina jest odpo¬ wiednim odczynnikiem do oznaczania gonadotro- piny. 5 PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenia patentowe 3. 1. Sposób wytwarzania odczynnika do oznaczania gonadotropin przez zmieszanie wodnego roztwo¬ ru antyserum przeciwko gonadotropinie i wodnej 10 zawiesiny erytrocytów uczulonych na te gona- 4. dotropine, znamienny tym, ze do jednego z tych skladników dodaje isie czynnika ehelataijacego, odpowiedniego do zwiazania jonów wapnia wy¬ stepujacych w badanej cieczy. 15 6 Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze czynnik chelatujacy dodaje sie do wodnego roz¬ tworu antyserum przeciw gonadotropinie, po czym, jezeli to jest pozadane, roztwór liofi¬ lizuje sie. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze czynnik chelatujacy dodaje sie do wodnej za¬ wiesiny erytrocytów uczulonych gonadotropina, po czym o ile to jest pozadane, roztwór liofili¬ zuje sie. Sposób wedlug zastrz. 1—3, znamienny tym, ze jako czynnik chelatujacy stosuje sie kwas ety- lenodwuaminoczterooctowy, kwas cytrynowy lub sole tych kwasów z metalem alkalicznym albo amonowe. PL PL PL