PL46572B1 - - Google Patents

Description

Tetracykline proponowano wytwarzac na drodze chemicznej afllbo fermentacyjnej. Spo¬ sród licznych sposobów fermentacyjnego wy^ twarzania tego antybiotyku znane jest podda¬ wanie fermentacji szczepu Streptomyces Aure¬ ofaciens albo winnych szczepów, (które pierwot¬ nie wytwarzaja cMorotetracyfcline. W celu nie¬ dopuszczenia do powstawania podczas fermen¬ tacji chlorotetiracykliny stosowano dotychczas dwie metody, albo fermentacje prowadzono na pozywce wolnej od chlorków albo do srodo¬ wiska fermentacyjnego wprowadzano homologi halogenków, które zapobiegaly chlorowaniu tetracykliny.W sposobie wedlug wynalazku stosuje sie nowy szczep stanowiacy mutanta Streptomy¬ ces Aureofaciens, który posiada wlasciwosc wytwarzania ponad 9l0^/o tetracykliny.W celu uzyskania tego mutanta, szczep Streptomyces Aureofaciens poddaje sie w po¬ danej kolejnosci naswietlaniu promieniami ul¬ trafioletowymi o 25'010IO erg/mim2 w ciagu mniej wiecej 18 minut,* naswietlaniu promieniami Rentgena o 4i0iQOO r w ciagu 5 godzin, ponow¬ nie naswietlaniu promieniami ultrafioletowymi o 510010 erg/mm2 w ciagu 2 godzin w obecnosci roztworu zawierajacego 8 — li5 g/ml rodanku benzylu i w ciagu 23 minut promieniami Rent¬ gena o 18DCl3i r, nastepnie silnie oziebia do temperatury od —8 do—1.5 °C, traktuje strep¬ tomycyne w roztworze 0,5*/o wym. inkubuje na syntetycznej pozywce, traktuje koenzymem A, w ilosci 1 mg/ml w rotworze 0,05 molaNaHCOs, znowu naswietla poronieniami Rentgena o 6(000 r w ciagu 8 minrut w obecnosci lOydOS imola cy¬ janku potasu i z otrzymanym mutantem GDSD — 314 ewentualnie z jego szczepami dziedzicz-4 ttyml lub •mutantaani praecjrawaclza w znany Ponizsza tablica podaje wlasciwosci szczeku . sposób fermentacje w ppzyiwce zawierajacej wyjsciowego (oznaczonego LSZ 536) i nowego jony chloru. szczepu (oznaczonego CDSD 314): Pozywka sacharoza aspa- ragdina agar saohairoza cza¬ pek Dox agar ekstrakt kartoflany gliceryna z eks¬ traktem cfcroz- dizowym papka kukury¬ dziana gliceryna papka kukury¬ dziana skrobiai NH4NO3 CaCOa Rozwój dobry slaby srednio dobry dobry dobry Tworzenie sporów dobre slabe srednie srednie dobre - Tworzenie pigmentu azerwony zadne czerwono brunatny zadne zadne Calkowita Micella powietrza szara szaro- biala szaro- szara zólto- brunatna zólta Rozwój dobry dobry dobry slaby slaby Tworzenie sporów dobre dobre dobre slabe slabe Tworzenie pigmentu zadne zadne zadne zadne zadne produkcja antybiotyku E/ml 980 MiceUa powietrza biala biala biala zólta zólta biala 1850 Produkcja tetracykliny w ° <3 /o°/o 91 Nowy szczep uznano na podstawie systemu Pridlhama i wspólpracowników (Appl. Micro- biol. 6, 52, 195i8) jako plerwsiza serie przyna¬ lezna do grupy ,yPetiinaoulum apertum" (White series"), podczas gdy szczep wyjsciowy nalezy do cazóstej serii („gray series").Fermentacje szczepu przeprowadza sie naj- konzyistniiej w napowietrzanej kulturze glebi¬ nowej. Mozna stosowac znane pozywki, tak .0 pozywki zawierajace chlorki.Produkt otrzymany na drodze fermentacji z nowym szczepem mozna stosowac bez dal¬ szego oczyszczania do celów paszowych. W tym przypadku sfermentowany material korzystnie najpierw zageszcza sie. Produkt fermentacji mozna równiez przerabiac i oczyszczac dowol¬ nymi znanymi metodami przy otczymywatki-u tetracykliny. Szczególnie korzystny jeat naste¬ pujacy sposób. Oiecz fenmentacyjna odsacza sie w srodowisku kwasnym od noaoel, #0 czym Obydwa szczepy wykiaauja takze rózna adol- nosc rozkladania cukrów, co widoczne jest z ponizszej tablicy.Rodzaj cukru glukozanws fruktoza l sacharoza maltoza maggnosa mannit laktoza galaktoaa fcsyloza LSZ 536 ¦ + . - --¦¦¦ + + —¦ + —.—* — — CDiSD 314 + + + + -h + + + + Spory i aporofory wyjsciowego szczepu sa szare, przy czym sporofory rozwijaja sie w ksztalcie otwartych, prostych spiral. Nowy szcatep GDSD 3114 daje haozykowiatto zakrzywio¬ ne jsjporofary, oraz biale spory i sporoiory. -2 -po odpowiednim zadkaKzow&o&i (pH=<8—9) traktuje czwartorzedowa zasada arooniowa afflbo jej sola. Wydzielona przy tym czwiar.tarzedowa sol tetoacykiliiiny odsacza sie i po wypiwk-aniu rozklada kwasem w srodowisku woctaym. Po usunieciu xaniieczysaczajacyoh jonów zelaza i wapnia ekscanuje sie z farzesaccu tetracykli- ne za pomoca roepuszczalindka organieanego, korzystnie alkoholu mp„ butanolu. Otrzymuje sie ekstrakt alkoholowy^ który nastepnie eks- teabiaje sie kwasna woda zawierajaca chlorek zelazowy. Tetracyklirua tworzy z zelazem kom¬ pleks, który jest roagyu&zczailny w wodzie, wo¬ bec czego wydajnosc tej ekstrakcji wyoaosii po¬ wyzej 95%. Kompleks tetracykliaay z zelazem rozklada sie nasltepioie za pomoca siairozynu alkalicznego .albo sposobem wedlug wynalazku za pomoca borowiodorkiu, najkorzystniej boro¬ wodorku sodowego. Nastepnie wodny ?eksitrakt zageszcza sie, po czym otirzymuje sie tetracy- kline w postaci -soli albo po zakwaszeniu jako krysztalki w postaci dwowodziami.Otrzymany dwuiwodzian tetracykliny nadaje sie do celów farmaceutycznych i odpowiada wymaganiom farmakopealnym.Z roztworu tetracykliny albo z dwuwodzianu teftracyMirty mozna wytwarzac w pozadanym przypadku dowolna sól tetracykliny, przy czym z lugów macderizytftych mozna otrzymac jeszcze dals&e ilosci "tego aotytodotyfku.Przyklad I. 100 ml podloza Inoculum zaszczepia sie w 500 ml kolbie Erlenimayera 1 ind zawiesiny spor szczepu ODSD-314 prze¬ chowywanego w temperafairze 10°C i kultywu- je przez 46 godzin na wstrzasarce iprzy W°C.Dobrano nastepujacy sklad pozywki: 2*/§ skro¬ bi, 12f% namoku kukurydzianego (w przelicze¬ niu na sucha substancje), 0$% weglanu wap- aikawe^o, O^P/t oleju pataowego. Wartosc pH po flteryliaacgd = 6r6 — 0,8, temperatura 25 °C. 100 ml pozytki w kolbie Erlenmeyera o po¬ jemnosci 500 ml zaszczepia sie 2 ml otrzyma¬ nego inocukim i .poddaje fermentacji przez 06 godzin w temeperaturze (25°C. Sklad pozywki: 2y5V» skrobi, 0,6 namoku kukurydzianego przeliczeniu na sucha substancje), O.Wo NHi NOs, 0,4% CaCO*, 0,2% KNOs i 0,3«/o oleju palmowego. Po sterylizacji wartosc pH wynosi Gjlr-6,3.Zawartosc antybiotyku ustalono poczawszy od 40 godzin fermentacji. 40 godzina €4 godzina 88 godzina zawartosc antybiotyku E/ml 1<260 16512 1820 tetracykMna % — , 9l;i5 90,9 który ap. w «4 godzinie fie*rme&tacji wynotó aiv5:e, ustaiorko za posooca cfonomatografiii mt bfitnfle.Dalej postepuje sie jak w przykladzie IV.Przyklad li. 100 ml pozywki zaszczepia sie w 500 ml kolibie Erlenmeyera 2 ml 46-godzinnej kultury otrzymanej iz pozywki taoculum i fer¬ mentuje przez 88 godzin na wistrzaoarce w tem- peraiturze 25°C. Sklad pozywki: 2°/o skrobi lo/0 maki z orzeszków Aszanti, 0^°/o namoku kuku¬ rydzianego (w przeliczeniu na aucna substan¬ cje), 0£Vo NHdtO*, 0,4J°/o CACO*, 0£% KNO* i 0^/o oleju palmowego. ¥Po scberyfliizacijli war¬ tosc pH wynosi 0,1—6,3* Zawartosc antybioty¬ ku poczawszy od 40 godziny fermentacji jest nastepujaca: 40 godzfea «4 godzina «8 godzina zawartosc antybiotyku E/ml 1450 2225 21100 tetarecykli- na % — 02 M Przyklad III. 6 litrów pozywki inoculium (patrz wyzej) zasizczepia sie 30 ml kultury QDSD-3il4 zmrozonej w temperaturze —10°C.Kulture poddaje sie fermentacji przy miesza¬ niu i napowietrzaniu przez 48 godzin. (600 obrotów/minute), 6 litrów pozywki zaszczepia sie jak w przykladzie I, 600 ml rozwinietej Hultey, po czym poddaje fermentacji w tem- peraitturze 25°C napowietrzajac 6 Mitrami po¬ wietrza/minute.Otrzymaje sie nastepujacy wynik: &8 godz. 40 godz. 46 godz. 38 godz. zawartosc antybiotyku E/ml 7124 11289 11567 1905 tetracy- kliina •/• •«* 86 90 91,5 Przyklad IV. 10 litrów cieczy fermentacyj¬ nej (1300 E/ml 90,15 (zawartosc tetracykliny) zakwasza sde |10 n HtSOi do wartosci pH=&,5.Oiecz przesacza sie, nastepnie dodaje sie 1150 ml lOM-wego wodnego roztworu bromku ce- tylopirydyniowiego, po czym wartosc pH nas¬ tawia sie na 9 za pomoca 5-nego wodorotlenku sodowego. Wytracona czwartorzedowa sól od¬ sacza sie, przemywa woda, po czym sporzadza sie zawiiesdine z 300 ml wody, której wartosc pH nastawia sie na 16 za pomoca kwasu j ~szczawiowego. Po odsaczeniu osad przemywa sie 150 trn 0,01 n HCl. Polaczone przesacze zadaje sie 45 g chlorku sodowego 1 ekstrahuje n-buitatiolem. Polaczone ekstraty butamolowe ekstrahuje sie roztworem chlorku zelazowego w Ó^/nwym kwasde solnym (3 razy po 150 mi). Wodne.ekstrakty laczy sie, roztwór alka- lizuije sde 2 n NH+OH do pH = 3,5, po czym dodaje sie borowodorku sodowego,az do uzys¬ kania jasno-zóltawego zabarwienia. Nastepnie wartosc pH nastawia sie na 6 i roztwór za¬ geszcza sie do polowy objetosci w prózni w temperaturze i40°C. Po 24 godzinnym odstaniu w itemiperaturize <5<& odsacza. sie wydzielone krysztaly, pnzewywa mala iloscia wody destylo¬ wanej i zimnego alkoholu i suszy w prózni.Otrzymuje sie 0,5 g wodzianu tetracykliny, wykazujacego aktywnosc 8?0 EAmg. W produk¬ cie stwierdzono na podstawie chromotografii na bibule najwyzej 3°/o chlorotetracykliny.Wodzian tetracykliny rozpuszcza sie przy pH = 2 w kwasie solnym, noztwór liofilizuje, po czym otrzymuje sie bardzo czysty chloro- wdifefrek tetracykliny. Podobnie po zastosowa¬ niu odpowiednich kwasów wzglednie zasad mozna otrzymac najrózniejsze sole tetracy¬ kliny. Sole tetracykliny mozna takze wytwo¬ rzyc w taki sposób, ze wodny roztwór tetra¬ cykliny w odpowiednim kwasie ekstrahuje sie slabo polanym rozpuszczalnikiem (np. n-bu- tanolem), a wyosobniona faze rozpuszczalni¬ ka zageszcza^sie w prózni, przy czym krystali¬ zuje z dobra wydajnoscia sól tetracykliny. PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania tetracykliny na drodze fermentacji glebinowej za pomoca mikro¬ organizmu z gatunku Streptomyces aureo- 11 rzedu ^aciens zdolnego do wytwarzania chloro- tetracykliny, znamienny tym, ze szczep Streptomyces aureofaciens w cedu uzyskania mutanta poddaje sie w podanej kolejnosci naswietlaniu promieniami ultraifioletowymi o 25000 erg/mm2 w ciagu mniej wiecej 16 minut, naswietlaniu promieniami Rentgena o 4O0I0K) r w ciagu 5 godzin, ponownie nas¬ wietlaniu promieniami ultrafioletowymi o 5O00 erg/mftft2 w ciagu 2 godzin w obecnosci roztworu zawierajacego fH-^15 g/ml rodanku benzylu i w ciagu 23 minut promieniami Rentgena o 190O0 r, nastepnie silnie oziebia do temperatury od —& do —!l50C, traktuje streptomycyna fwl roztworze Q,5l°/o-wyimi, inkuibuje na syntetycznej pozywce trak¬ tuje koenzymem A w Ilosci II mg/ml w roz¬ tworze 0;05 mola NaHCOs, znowu naswietla promieniami Rentgena o flOOO r w ciagu 8 minut w obecnosci OJ0O5 mola cyjanku po¬ tasu i z otrzymanym mutantem GDSD-314 ewentualnie z jego szczepami dziedzicznymi lub mutantami przeprowaidzona w znany sposób fermentacje w pozywce zawierajacej jony chloru.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wyizolowana z (roztworu pofermenta¬ cyjnego tetracykline w postaci roztworu al¬ koholowego przeprowaldza sie przez dodanie wodnego roztworu chffloifcu zelazawego w zwiazek kompleksowy zelaza, po czym przez redukcje wodorkiem boru .1 nastepnie za¬ geszczenie roztworu otrzymuje sie krysta¬ liczna tetracykline. Chlnoin Gy ógys-zer-ss Vegyeszeti Termekek Gyira rt. Zastepca: mgr Józef Kaminski rzecznik patentowy IOTEKA PatentowafJ tl*B-S PL