PL45165B1 - - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania trój¬ wartosciowej zywej szczepionki poliomyelitis, od¬ powiedniej do podawania doustnego w postaci jednostki dawkowania.Stosowanie szczepionki oslabionego zywego wirusa polio przedstawia wiele korzysci w sto¬ sunku do szczepiojiki wirusa zabitego stosowa¬ nego przez dr Salk'a. Bezpieczenstwo stosowa¬ nia szczepionki oslabionego zywego wirusa, jesli podaje sie ja doustnie, zostalo sprawdzone bada- nami na wiecej niz szesciuset tysiacach pacjen¬ tów bez wywolania wypadku parailitic polio wskutek szczepionki. Osiagano doskonala reakcje przeciwciala i wysoki stopien odpornosci. Wiel¬ ka ilosc szczepien, byla przeprowadzona przez podawanie doustnie szczepionki z oddzielnych szczepów oslabionego wirusa w krótkich odste¬ pach. Poniewaz wymaga to tylko trzech poda- wan doustnych przedstawia przez to rzeczywista korzysc wobec koniecznosci stosowania trzech, lub czterech zastrzyków szczepionki a zabitego wirusa. Nie jest to jeszcze doskonalym osiagnie¬ ciem, poniewaz potraja czas wymagany do szcze¬ pienia i powieksza mozliwosc zapominania pa¬ cjentów do powtórzenia jednego lub dwóch ostatnich szczepien.Dalsze badania prowadzono w kierunku wyho¬ dowania trójwartosciowej szczepionki, to znaczy szczepionki, która bylaby .mieszanina oslabio¬ nych szczepów wszystkich trzech typów wirusa polio. Niestety usilowania wyhodowania prak¬ tycznie zdatnej do stosowania trójwartosciowej szczepionki napotykaly na powazne trudnosci, polegajace na zjawiskach wzajamnego oddzialy¬ wania szczepów i wynikaJi^ej z tego braku sku¬ tecznosci. ; - Zjawiska wzajemnego oddzialywania poszcze¬ gólnych szczepów zaobserwowal dr Sabin stosujac w szczepionce trzy oslabione szczepy ty- pu I, II i III wirusa polio uprzednio wyhodo-wajjifc at5Yier^y,t on bar^p ^w^e, otjWfcialy- wanie wzajemne, poniewaz |egofoslabiony szczep.Typu II okazal^ie lub zmniejszajacym liar&zb 'powaznie rozwój za¬ kazen pr^ea\%rp l i Typ III polio,, a'przez to i wytwarzacie przeciwcial tych trzech typów.Bylo to szczególnie niekorzystne, poniewaz Typ II ma* mniejsze znaczenie w porównaniu z Typa- mli I i III. Typ I stanowi- wielkie zagrozenie wskutek swego wielkiego rozpowszechnienia i przewazajacego powiazania z polio paralitic.Typ III jest drugim co do znaczenia, a tym II ma znacznie mniejsze znaczenie, poniewaz wy¬ woluje bairdzo maly procent schorzen parali- tycznych. Wskutek tego trójwartosciowa szcze¬ pionka Sabina byJa praktycznie bezuzyteczna i w opisie jego doswiadczen w Journal of the American Medical Assotiation, tom 172, str 1589 — 1956 stwierdza on, ze uodpornienie przeciwko trzem typom wirusa polio przez proste poda¬ wanie mieszaniny tych trzech szczepów jest nie do rozwiazania. Dlatego poleca on, zeby te trzy szczepy podawac oddzielnie w przerwach trzy¬ tygodniowych w kolejnosci: Typ I, Typ III i w koncu Typ II.Wedlug wynalazku problem wzajemnego od¬ dzialywania zostaje calkowicie rozwiazany przez dostarczenie trójwartosciowej, zywej szczepion¬ ki poliomyelitis, odpowiedniej do doustnego po¬ dawania w postaci jednostki dawkowania, za¬ wierajacej mieszanine: a) oslabionego wirusa Typu I poliomyelitis nie zjadliwego dla ludzi, b) oslabionego wirusa Typy III poliomyelitis nie zjadliwego dla ludzi, c) oslabionego wirusa Typu II adaptowane¬ go w embrionie kurczecia i nie zjadliwe¬ go dla ludzi i który nie hamuje zakazenia ' nie zjadliwymi wirusami Typu I i Ty¬ pu III, przy czym mieszanina ta posiada wstepnie oznaczone miano kazdego typu wirusów.Ten oslabiony wirus Typu < II wyhodowano w Lederle Laboratories of American Cyanamid Company, przy czym oslabienie osiagnieto jW sposób nizej opisany, przez kolejne pasaze wiru¬ sa przez tkanke nerwowa mlodych gryzoniów az do przystosowania do wzrostu w embrionach kurczat, a nastepnie przez kolejne pasaze po¬ przez embriony kurczat az staje sie nie zjadli¬ wy dla ludzi. .Szczepy wirusa Typu U, które rozwijaja sie w tkance centralnego ukladu nerwowego gryzo- niów latwo otrzymuje^ sie z róznych zródel. Ten material, zazwyczaj w postaci wodnej zawiesi¬ ny ze zmielonej tkanki nerwowej stanowiacy po¬ siew wirusowy, zaszczepia sie do mózgów mlo¬ dym, ssacym gryzoniom, korzystnie chomikom w wieku okolo 1 do 12 dni. Stosowanie innych mlodych ssacych gryzoniów, lub w innym wieku do hodowli szczepu az do uzyskania miana !&& dla myszy i przystosowanie go do wzrostu w tkance embrionowej jajka nie jest wykluczone.Wirusowi temu pozwala sie wzrastac w mlodych ssacych gryzoniach az do zaobserwowania cho¬ roby u co najmniej kilku zwierzat, które byly zaszczepione. Czas, który powinien byc rzedu 48 godzin na poczatku seryjnych pasazy redukuje sie pózniej do okolo 18 — 24 godzin, gdy wirus przeksztalca sie w szeregu pasazy w mlodym ssacym gryzoniu. Jesli objawy choroby wystepu¬ ja u kilku zaszczepionych mlodych ssacych, za¬ bija sie cala partie, usuwa sie ich tkanke cen¬ tralnego ukladu nerwowego i wytwarza zawiesi¬ ne zazwypzaj w izotonicznym roztworze soli i dalej kontynuuje sie szczepienie nie uodpornio¬ nych, mlodych ssacych gryzoni. Zakazona tkan¬ ka powinna byc zebrana dokladnie w czasie Wczesniejszym od tego, w którym zaszczepione iisace mlode zaczynaja wykazywac objawy para¬ lizu. Wieksze stezenie czasteczek zywego wirusa wystepuje w tkance nerwowej w czasie wczes¬ niejszym od widocznych juz objawów paralizu.Dlatego przez zabijanie mlodych ssacych gryzoni wlasnie przed rozwinieciem sie. objawów mozna otrzymac z ich tkanki nerwowej wieksze steze¬ nie czasteczek wirusa. Odpowiednia droga usta¬ lenia czasu zbierania tkanki centralnego ukladu nerwowego polega na zaszczepieniu znacznej ilosci mlodych ssacych gryzoniów w tym samym czasie i zbieranie zakazonej tkanki nerwowej calej grupy, gdy pierwszy z nich wykaze klinicz¬ ne objawy choroby. W ten sposób wiekszosc po¬ zostalych gryzoniów bedzie usmiercona i ich tkanka nerwowa zostanie usunieta w czasie, gdy. miano wirusa jest w poblizu maksimum. Pro¬ ces szczepienia mlodych ssacych gryzoniów, \vy^ tworzenie zawiesiny z ich tkanki nerwowej i za¬ szczepienie nieuodpcrnicnych mlodych ssacych, prowadzi sie seryjnie w sposób opisany przy sta¬ lym obserwowaniu miana LD50 dla myszy, wy¬ tworzonej zawiesiny. Stwierdzono1, ze jako wy¬ nik tej metody hodowli wirusa, miano prepara¬ tu LD50 dla myszy wykazuje stala daznosc do zwiekszania 'poziomu az dp 10-5, a nawet do -2 -1Q-.7,5 przy ciaglych- pasazach seryjnych. Gdy miano LD50 myszy zawiesiny wytworzonej z tkanki centralnego ukladu nerwowego osiagnie wartosc co najmniej 10-5, mozna wirus przeniesc do inkuibowanych jaj, po czym prowadzic seryj¬ ne pasaze w embrionie kurczecia, az wirus zc- s-tantie zmodyfikowany tak, ze mozna go bez¬ piecznie stosowac jako zywa szczepionke u ludizi i innych z rzedu naczelnych. Opisane to jest w artykulach Roca — Garda i innych: Polio- myelitis II: Propagaticn of MEFj Strain of pcliomyelitis Virus in Developing Chick Emtorio by Yolk Sac Inoculatiicn, Proc. Soc. Exp. Biol. & Med. 81 :519, 1952 Cabasso i innych: Polio^ myelitis II: Prcpagation of MEF, Strain of Pcilicmyelitis Virus in Developing Chick by Allantoic Cavity Incculation, Proc. Soc. Exp.Biol. & Med. 81:525, 1952 i Cabasso i innych: Policmyelitis IV: Some Culture and Other Cha- rakteristics of Chick Embryo Adapted Type II Strain of Pclicimyelitis Virus, Proc. Soc. Kxp.Biel. & Med. 85 :167 - 171, 1954.Potrójne szczepionki przygotowane z oslabio¬ nego szczepu Typu II i oslabionego wirusa Ty¬ pu I szczepu SM i wirusa Typu III szczepu Fcx'a, rozwinietych w Lederle Laboratories, a takze opisane np. na stronicach 134—136 w University of Minnesota Medical Bulletin, tem 29, grudzien 1957 r. nie wykazuja domino¬ wania Typu II, który powodowal niepowodzenie eksperymentów Sabin'ai lecz przedstawiaja inny problem. Jezeli podaje sie w stezeniu mniejszym od miliona TCD50 kazdego typu wirusa, procen- towosc jednostek w surowico ujemnej grupie doroslych, rozwijajacych antyciala byla niezan dowalajaca«. Stezenie szczepionki zwyczajowo odnosi sie do zwyklego logarytmu dawek zaka¬ zajacych i ta terminologia jest stosowana w opi¬ sie i w PL

Claims (1)

1. zastrzezeniach. Doswiadczenia na znacz- nej ilosci doroslych ze szczepionka zawierajaca kazdy z trzech typów wirusa o log. 5,8 wyka¬ zuj ia rozwój antycial surowiczo ujemnych z szybkoscia 71% dla Typu I, 67% — dla TypuII i 75% dla Typu III. Powyzsze wyniki byly u do¬ roslych, u których jest trudniej wywolac reakcje antycial szczepionka zywego wirusa. Podczas, gdy to nie daje niekorzystnego porównania z wynikami otrzymanymi ze szczepionki z za¬ bitego wirusa, nawet jesli poddaje sie trzykrot¬ nemu szczepieniu, to jeszcze pozostawia niebez¬ piecznie wielki stosunek niechronionych surowi¬ czo ujemnie, szczególnie przeciw Typom I i Iii, które sa istotnie niebezpieczne. Nieoczekiwanie stwierdzono, ze jest bardzo estry próg przy log. 6. Przy log. 6,1 procentom wcss u doroslych byla 90% dia Typu I i 100% dla Typu III. Typ II wzrósl do 78% i moze byc zwiekszony przez jeszcze wiejksze dawki. Po¬ wyzsze badanie obejmuje rutynowe szczepienie w szpitalach w Minnesota brzemiennych, kobiet, które sa szczególnie hardziej podatne na polio paralitic. Wskutek tego korzystna jest w poczat¬ kowym okresie potrójna szczepionka dajaca pra¬ wie 100%-owa ochrone surowicoczynna przed niebezpiecznymi szczepami Typu I i III i za¬ sadnicza ochrone przed stosunkowo o wiele mniej niebezpiecznym Typem II. Wynalazek zalezy w swych szerszych aspek¬ tach od stosowania zmodyfikowanego w tkance nerwowej mlodego ssacego gryzonia szczepu Typu II, który nie wykazuje dominowania w szczepionce oraz od dawek nie mniejszych od log. 6. Dlaczego zmodyfikowany w mlodym ssacym gryzoniu wirus Typu II i szczególnie ten, który wykazuje przystosowanie do wzrostu w embrionie kurczecia nie wykazuje wlasciwo¬ sci dominowania, wykazywanej przez modyfiko¬ wany szczep Typu II dr Sabin'a, nie wiadomo. Wirusów nie mozna analizowac chemicznie, mozna je tylko charakteryzowac przez ich wla¬ sciwosci biologiczne i historie ich rozwoju. Dla¬ tego wynalazek nie moze byc ograniczony zad¬ na teoria wyjasniajaca, dlaczego modyfikowany wirus Typu II wedlug wynalazku nie jest domi¬ nujacy. Podobnie istnienie ostrego progu przy stezeniu równym log. 6 jest calkowicie nieocze¬ kiwane i dotychczas nie wyjasniono, dlaczego taki próg istnieje dla trójwartosciowej szcze¬ pionki otrzymanej sposobem wedlug wynalazku, ze szczególnym rodzajem modyfikowanego szczepu Typu II, który nie jest dominujacym. Obydwa czynniki sa konieczne, poniewaz potrój¬ na szczepionka dr Sabin'a podawana przy ste¬ zeniu log. .6 nie dawala wyników. Wynalazek wyjasniaja bardziej szczególowo nastepujace przyklady. Przyklad I. Wytwarzanie oslabionego wi¬ rusa. Typ I, szczep Sickles — Mahony, pochodzacy z mieszaniny szczepu Sickles, otrzymanego przez dr Alberto Sabin'a i szczepu Mahony, od dr Browna z Uniwersytetu w Michigan przepu¬ szczono kolejno 26 razy przez tkanke rdzenia pacierzowego myszy. Po tym nastapilo 10 kc^ lejnych pasazy kultury przez tkanke nerkowa malpki, w tym czasie wirus zostal przystosowa¬ ny do rozwoju w embrionie kurczecia. Wirus przeprowadzono kolejno 14 razy przez tkanki embrionu kurczecia, po czym nastapily na zmia¬ ne przejscia kilkakrotne przez tkanke nerkowa - 3.,-malpki i tkanke embriona kurczecia. To do¬ prowadzilo do wytworzenia niezjadliwego posie¬ wu Typu I, który nastepnie rozwijal sie w tkan¬ ce nerkowej malpki, wytwarzajac duze ilosci materialu odpowiedniego do zastosowania w koncowej szczepionce. Wirus Typu II otrzymano biorac szczep MEFj (pierwotnie wyosobniony w Middle East w 1942 roku). Przeprowadzono go dziewiec razy sród- mózgowTo przez myszy, po czym 157 razy przez tkanke nerwowa mlodych ssacych chomików. Po tych pasazach wirus zostal przystosowany do rozwoju w embrionie kurczecia, przeprowa¬ dzono go wiec seryjnie 17 razy przez embrion kurczecia i 11 razy przez tkanke nerkowa malpki. Nastepnie wirus byl hodowany na ko¬ mórkach nerki malpki, pasazowany dwukrotnie, po czym operacje te jeszcze raz powtórzono. Wytworzony nie zjadliwy wirus byl wirusem pcsiewowym do produkowania szczepionki Ty¬ pu II przez hodowanie na tkance nerkowej malpki. Wirus Typu III otrzymano biorac szczep Fox'a niie zjadliwego wirusa. Byl on jedynie hodowany przez ckolicznc^sciowe posrednie hol¬ dowanie na komórkach nerki malpki i wytwo¬ rzono material posiewowy dla szczepionki Typu III, który nastepnie rozwijal sie na tkance ner¬ kowej malpki. Ciekla tkankowa kulture ze zbioru kazdego wirusa rozcienczono taka sama objetoscia 70%-owego roztworu wodnego sorbitolu. Nastep¬ nie ciecz rozcienczono 35%-owym roztworem wodnym sorbitolu; rozcienczalnik: na podstawie z syropu mial nastepujacy sklad i byl przygoto¬ wany jak nizej: Podstawa syropcwa 35% sorbitolu skladników na litr p-hydrcksybenzoesan etylu (Metylo^ parabens U.S.P.) 0,44 g p-hydiroksybenzoesan propylu (propy- loparabens U.S.P.) 0,11 g fosforan sodowy, jednozasadcwy 2.76 g fosforan sodowy, dwuzasadowy 11.36 g Givandan Cherry Flavor (substancja o smaku wisniowym) 0,26 g woda destylowana 500,00 g roztwór sorbitolu 70%-wego q.s. 500,00 g Sposób wytwarzania roztworu sorbitolu jest nastepujacy: ogrzewa sie destylowana wode do temperatury 90—95°C, dodaje p-hydroksj^ben- zoesanu etylu i propylu i mieszajac, rozpuszcza je, z kolei dodaje sie fosforanów i rozpuszcza je, po czym dodaje sie Givamdan Cherry Flayor, oziebia do temperatury 25°C, doprowadza do po¬ zadanej objetosci roztworem 70%-owego sor¬ bitolu, przesacza i wartosc pH doprowadza do 7,0±0.2, nalewa do sterylnego naczynia i zazna¬ cza liczbe log. i date. Otrzymany koncowy pro¬ dukt stanowi trójwartosciowa szczepionke o mia¬ nie log. 5.8 na 1 cm3 kazdego rodzaju wirusa. 1 cm3 powyzszej mieszaniny podano szerego¬ wi przewaznie do-roslych osób, przy czym prc- centcwosc wieku osób poddawanych szczepie¬ niom byla nastepujaca: 8—10 lat — 7 %; 11—20 lat - 17%; 21-30 lat - 22%; 31-40 lat - 33%; 41-50 lat - 14% 51-60 lat - 5% i 61-05 lat - 2%. J)wa procent sposród poddawanych szczepie¬ niom bylo surowicze ujemnych w stosunku do wiszystkich trzech typów, 10% bylo ujemnych wobec dwóch typów, a 21% — wobec jednego typu. Dotyczy to odpowiednio potrójnie ujem¬ nych, podwójnie ujemnych i pojedynczo' ujem¬ nych. Po podaniu szczepionki 71% surowiczo ujemnych Typu I, 67% surowiczo ujemnych Typu II i 75% surowiczo ujemnych Typu III wytworzylo odpowiednie przeciw ciala. Przyklad II. Powtórzono proces z przy¬ kladu I, lecz w tym przypadku dawke koncowej szczepionki stanowilo 2 cm3, przy czym dla kaz¬ dego typu wirusa miano wynosilo log. 6,1. Ilosc osób poddawanych szczepieniom byla w przy¬ blizeniu cztery razy wieksza od ilosci w przy¬ kladzie I, a procentowosc wieku wynosila, jak nastepuje: 4-10 lat - 2%: 11-20 lat - 5%; 21-30 lat 33%; 31-40 lat - 44%; 41-50 lat - 10% i 50-60 lat - 5%. Okolo 5% bylo potrój¬ nie ujemnych, 18% podwójnie ujemnych i 26% pojedynczo ujemnych w stosunku do wszystkich trzech typów. Po zaszczepieniu 96% suro¬ wiczo ujemnych Typu I, 78% surowiczo ujem¬ nych Typu II i 100% surowiczo ujemnych Typu III wytworzylo przeciwciala. Przyklady obejmuja szczepionki wytwarzane w postaci wodnych roztworów sorbitolu. Jest to prosta, niezawodna i nadajaca sie do podawania postac, lecz rozumie sie, ze wynalazek nie jest nia ograniczony i potrójna szczepionke mozna wprowadzic przez absorpcje na bezwodnej ze¬ latynie, lub zmieszac z innymi nadajacymi sie dc' podawania rozcienczalnikami w postaci sta¬ lej lub cieklej. Naturalnie rozcienczalniki musza byc nie tylko nieszkodliwe dla ludzi, lecz takze musza byc nietoksyczne wobec oslabionych wi¬ rusów w szczepionce. - 4 -Zasirzezenia paten toWe Sposób wytwarzania trójwartosciowej zywej szczepionki poliomyelitis odpowiedniej do podawania doustnego w postaci dawki jed¬ nostkowej, znamienny tym, ze miesza sie oslabiony wirus poliomyelitis Typu I, nie- ziadfcwy dla ludzi z oslabionym wirusem po- IionftyeJitis Typu III, niezjadliwym dla ludzi, oraz z oslabionym wirusem poliomyelitis, Ty¬ pu II, adaptowanym w embrionie kurczecia i niezjadliwym dla ludzi, który nie hamuje zakazenia przez niezjadliwe wirusy Typu I i Typu III i z otrzymanej mieszaniny wytwa¬ rza jednostki dawkowania, z których kazda zawiera co najmniej log. 6 kazdego typu wi¬ rusa. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wirusy tych trzech typów dysperguje¦ sie w wodnym roztworze sorbitolu. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 i 2, znamienny tym, ie oslabienie wirusa Typu II przeprowadza sie przez kolejne pasaze w tkance nerwowej mlodych ssacych gryzoniów, az do adaptacji w embrionie kurczecia, a nastepnie przez ko1- lejne pasaze w embrionie kurczecia az do osiagniecia niezjadliwosci wobec ludzi. 4. Sposób wedlug zastrz. 1—3, znamienny tym, ze jako wirus Typu I stosuje sie szczep SM oslabiony przez kolejne pasaze w tkance ner¬ wowej gryzoni, a jako wirus Typu III sto¬ suje sie wirus szczepu Foxla. American Cyanamid Company Zastepca: mgr Józef Kaminski rzecznik patentowy 1. RSW „Prasa4', Kielce. PL