PL 441547 A1 2/11 Biosensor do oznaczania neuropiliny-1 technika matrycowego powierzchniowego rezonansu plazmonów w wersji lmaging Przedmiotem wynalazku jest biosensor do oznaczania neuropiliny-1 technika matrycowego powierzchniowego rezonansu plazmonów w wersji lmaging. Neuropilina - I jest markerem raka piersi (Rachner, T.D. · Kasi mir-Bauer_ S .. Goebel, A,· Erdmann, K., · Hoffmann, O, Rauner, M, · Hofbauer, LC. , · Kimmig, R., Bittner, A.-K., 5.'o!uh!e Neurop;/;n-1 is an independent marker of poor prognosis in ear!y breast cancer, J. Cancer Res.Clin. Oncol. (2021) 147:2233-2238. https://doi.org/10.1007/s00432-021-03635-1). Jest takze waznym koreceptorem ataku wirusa SARS-CoV-2 na zaatakowana komórke (Gudowska Sawczuk, M., Mroczko, B. 1he Role ul Neuropilin-1 (NRP-1) in SARS-CoV-2 lnfectzon: Review. J. Cli n. Med. 2021, IO, 2772. https:/ /doi.orgii 0.3390/jcm l O 132772). Biomarker odgrywa istotna role zarówno w regulacji angiogenezy podczas rozwoju embrionalnego, jak i podczas patologicznej angiogenezy w guzach nowotworowych. Angiogeneza jest procesem tworzenia naczyn krwionosnych. Neuropilina 1 promuje wzrost, migracje, inwazje i przezycie komórek nowotworowych. [Liu SD, Zhong LP, He J, Zhao YX. Ta,xetinx neuropilin-1 znteractzons is a promisznx antz-t11111or smtte:,.o: Chin Med J (Engl). 2020, 134( 5 ): 508-5 17]. Neuripilina -l jest bialkiem o masie czasteczkowej 246 kDa a jej poziom stezenia w surowicy krwi wynosi l ,88 ± 0,52 nM to jest 130,8 ± 36,2 ng/mL (Rachner, T.D. · Kasimir-Bauer, S., Goebel, A.,Erdmann, K., Hoffmann, O., Rauner, M., Hofbauer, L.C., Kimmig, R., Bittner, A.-K., Soluble Neuropilin-1 is an independent marker of poor prognosis in early breast cancer, J. Cancer Res.Clin. Oncol. (2021) 147:2233-2238. https://doi.org/10.1007/s00432-021- 03635-1). Neuropilina-1 jest oznaczana za pomoca testów immunoenzymatycznych ELISA z granica oznaczalnosci 6,3 ng/mL. PL 441547 A1 3/11 Alternatywna do oznaczania neuropiliny-1 za pomoca testów ELISA moze byc zastosowanie techniki matrycowego powierzchniowego rezonansu plazmonów w wersji Imaging. Technika ta odnosi sukcesy w oznaczaniu róznych biomarkerów w plynach ustrojowych, glównie osoczu lub surowicy krwi. Systematycznie jest rozwijana liczba biomarkerów mozliwych do oznaczania ta technika. Swiadcza o tym m.in. liczne wynalazki na biosensory. Wedlug obecnego stanu techniki istnieja liczne biosensory SPRi umozliwiajace oznaczama stezenia substancji bioaktywnych. Takie biosensory ujawniaja przykladowe opisy: JP2009133844 (A), US6239255, PL223400, PL210052, PL222548, PL222549, PL234488, PL 235043 ,PL235044, PL 235045, PL234329, PL236387, PL236773, PL239340 czy takze PL239339. Technike matrycowego powierzchniowego rezonansu plazmonów w wersJl Imaging cechuje prostota budowy biosensorów w polaczeniu ze skutecznoscia w wykonywaniu praktycznych pomiarow. W odróznieniu od bardziej rozpowszechnionej przeplywowej techniki SPR, oznaczame technika matrycowego powierzchniowego rezonansu plazmonów w wersji Imaging nie wymaga skomplikowanego wzmacniania sygnalu np. za pomoca wprowadzania do biosensora nanoczasteczek zlota. Technika jest z powodzeniem stosowana w licznych badaniach klinicznych o czym swiadcza m.in. opublikowane ostatnio prace eksperymentalne opublikowane w prestizowych czasopismach:. Bogdan, S.; Puscion-Jakubik, A.; Klimiuk, K.; Socha, K.; Kochanowicz, J.; Gorodkiewicz, E. UCHLJ and Proteasome in Blood Serum in Relation to Die tary Hahzts, Concentratzon of Se/ected Antioxzdant Mznera/s and Fota/ Antioxzdant Status among Patients wzth Alzheimer 's Disease. J. Clin. Med. 2022, 11, 412. https://doi-1org-10000387b5567.han3 .library. put.poznan.pl/10.3390/j cml 1020412 Sankiewicz, A; Guszcz, T.; Gorodkiewicz, E. Application of SPRi Biosensors for Determznatzon of 20S Proteasome and UCH-LI Levels in the Serum and Urine of Transitional Bladder Cancer Patients. Appl. Sci. 2021, 11, 7835. https://doi-lorg-10000387b5567.han3 .library. put.poznan. pl/10.3390/ PL 441547 A1 4/11 app 1117783 5 Matuszczak, E.; Cwalina, I.; Tylicka, M.; Wawrzyn, K.; Nowosielska, M.; Sankiewicz, A.; Oldak, L.; Gorodkiewicz, E.; Hermanowicz, A. Levels uf Selec.:ted A1atrix A1etallopruteinases-lvlA,JP-1, JvJA,JP-2 and Fibrunectin in the Saliva of Patients Planned for L'ndudontic J'reatment or Surgical Lxtraction. J Cli n. Med. 2020, 9, 3971. https://doi-1 org- 10000387b5567.han3.library.putpoznan.pl/l 0.339Wicm9123971 Komarowska, M, Szymanska, B., Oldak, L., Sankiewicz, A., Matuszczak, E., Gorodkiewicz, E., Debek, W., Milewski, R, Hermanowicz, A., Plasma levcl of laminin 5 and c:ollagen IV in c1yptorchidism, Advances in Medical Sciences , 65, ( 2020) 176-181, https://doi.org/10.1016/j.advms.2019.10.004 Technika matrycowego powierzchniowego rezonansu plazmonów w wersji lmaging zostala omówiona na tle innych podobnych osiagniec w pracach przegladowych: [Gorodkiewicz E, Lukaszewski Z, Recent Progress in Surface Plasmon Resonance Biosensors (2016 to Mid-2018), Biosensors, 2018, 4, 132,] [ Falkowski P., Lukaszewski Z, Gorodkiewicz E., ,,Potentia! of Swface Plasmon Resonance Biosensors in cancer detection ", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2021, 194, 113802]. Dotychczas nie opracowano biosensora SPRi do oznaczania neuropiliny-1. Istota wynalazku jest biosensor do specyficznego oznaczania neuropiliny-1 w ludzkim materiale biologicznym (osocze, surowica krwi, slina), dostosowany do wspólpracy z technika matrycowego Powierzchniowego Rezonansu Plazmonów w wersji obrazowej (Imaging). Opracowany biosensor wykorzystuje mysie monoklonalne przeciwcialo specyficzne na neuropiline-1 jako receptor i spelnia warunki analityczne pod wzgledem zakresu pomiarowego, specyficznosci, precyzji i dokladnosci pomiaru. Biosensor wedlug wynalazku zawiera plytke szklana pokryta warstwa tytanu oraz zlota oraz polimerem w postaci siatki, który wyodrebnia miejsca aktywne z warstwa receptorowa. Receptor czyli wyzej wymienione przeciwcialo jest zimmobilizowane na powierzchni zlota wiazaniem kowalencyjnym za posrednictwem linkera- cysteaminy. PL 441547 A1 /11 Zastosowanie cysteaminy zapewnia korzystne zorientowanie przeciwciala na powierzchni biosensora z czescia Fe zawierajaca grupy karboksylowe zwiazana z linkerem a czescia Fab zawierajaca aktywne elementy - skierowana w kierunku roztworu. Biosensor czescia Fab mysiego monoklonalnego przeciwciala wychwytuje wylacznie oznaczana substancje z roztworu w postaci niezwiazanej. Aparatura SPRi mierzy sygnal analityczny bedacy odpowiedzia na przyrost masy na powierzchni biosensora. Rozwiazanie takie cechuje prostota ,vykonania biosensora oraz przeprowadzenia calego procesu pomiarowego. Biosensor do specyficznego oznaczania neuropiliny-1 w przykladzie realizacji uwidoczniony jest na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat biosensora i przekrój pionowy przez miejsce aktywne, a fig. 2 przedstawia zakres prostoliniowy zaleznosci sygnalu SPRi od stezenia neuropiliny-1. Biosensor w przykladzie - jak przedstawiono na fig. I - sklada sie z podzielonej na partycje za pomoca siatki polimerowej I plytki szklanej 2 pokrytej warstwa tytanu 3 oraz zlota 4. Warstwa receptorowa sklada sie z !inkera - cysteaminy 5 oraz mysiego monoklonalnego przeciwciala 6 specyficznego na neuropiline-1 polaczonego kowalencyjnie z linkerem-cysteamina. Warstwa receptorowa specyficznie wylapuje neuropiline-1 7 z badanego roztworu. Biosensor zostal wykorzystany do oznaczania neuropiliny-1 w serii próbek osocza pacjentów chorych na stwardnienie rozsiane. Po 3 µL osocza z 9 róznych próbek w rozcienczeniu 1 :200 nanoszono na poszczególne miejsca aktywne. Po uplywie 1 O min miejsca aktywne 6-krotnie przemywano buforem HBS-ES oraz woda. Mierzono sygnal SPRi. Stezenie nauropiliny- 1 odczytano z krzywej kalibracyjnej i po uwzglednieniu rozcienczenia uzyskano nastepujace \vyniki: Próbka 1 sygnal SPRi 3427 \vynik 141 ng/mL Próbka2 sygnal SPRi 4108 '\/Ynik 202 ng/mL Próbka 3 sygnal SPRi 5245 \vynik 305 ng/mL Próbka4 sygnal SPRi 4542 \vynik 241 ng/mL PL 441547 A1 6/11 Próbka 5 sygnal SPRi 4584 wynik 245 ng/mL Próbka 6 sygnal SPRi 3974 ,vynik 190 ng/mL Próbka 7 sygnal SPRi 6034 wynik 376 ng/mL Próbka 8 sygnal SPRi 5150 wynik 296 ng/mL Próbka 9 sygnal SPRi 5468 wynik 325 ng/mL PL 441547 A1 7/11 Zastrzezenie patentowe Biosensor do specyficznego oznaczania neuropiliny-1 w plynach ustrojowych homogenatach tkankowych technika matrycowego powierzchniowego rezonansu plazmonów w wersji Imaging, który zawiera plytke szklana pokryta warstwa zlota na podlozu tytanu oraz siatke polimeru tworzaca pek miejsc aktywnych zawierajacych warstwe receptorowa znamienny tym, ze warstwe receptorowa stanowi monoklonalne mysie przeciwcialo specyficzne na nauropiline -1 (6) polaczone kowalencyjnie z !inkerem, w postaci cysteaminy (5), laczacym receptor z warstwa tytanu (3) oraz zlota (4) pokrywajaca plytke szklana (2). PL 441547 A1 8/11 fig.I 7 6 4 3 2 1 PL 441547 A1 9/11 9000 8000 7000 =i 6 ooo :i o: 5 ooo ~ ni 4 ooo l 3000 2000 1 ooo o 1,5 Stezenie neuropmny-1 (ng/ml] fig. 2 + 1866,9 R 2 = 0,9862 I PL 441547 A1 /11 al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 OS 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NR P.441547 Klasyfikacja zgloszenia: G0lN 33/543. G0lN 33/68. G0lN 21/55 Podklasy w których prowadzono poszukiwania: G0lN Bazy komputerowe w których prmvadzono poszukiwania: Epoqucnct (EPODOC. WPI. Embasc. Mcdlinc ). bazy UPRP. Internet (Google) Kategoria Dokumenty - z podana. identyfikacja. Odniesienie dokumentu do zastrz. A PL430495 Al (Politechnika Poznaiiska) 11-01-2021 zastrz. cah dokument A PL433106 Al (Politechnika Pozna11ska et al) 06-09-2021 zastrz. cah dokument A PL43202 I Al (Politechnika Poznanska et al) 31-05-2021 zastrz. calY dokument A M. Teran et al.: ··characterization of receptor binding kinetics zastrz. for vascular endothelial gro,,ih factor-A using SPR": Ana! Biochcm.; 2019; 564-565: 21-31, caly dokument 181 Dalszy cia.g wykazu dokumentów na nast9pncj stronic --\-dokument okreslajacy ogólny stan techniki. który nic jest m:,,-J7.::rny za posiJdajacy szczególne 7.naczcnlC, E doh.umcul stanowiacy \\CzesmcjsLc Lgfoszcnic lub palcnl. ak opubhl"-owany \\ lub po dacie zg.losLcma, L- dokument. który moze poclclan-ac w Yvatpli\Yosc zastr?.egane pierwszetlstwo(-wa). lub pr1,ytoczony w celu ustalenia daty publikacji inne_go cytow3nego dokumentu lub 7. itmc~o S7.C7cg0lncgo pmYodu, O - dokument oduosLacy- si~ do uja\\ uieuia uslnego prLez Laslm,ov\-anic, V\ y stawi011ic lub uja\\ nieuie w imt) sposób, P - dokumem opubllko\\'anv pr,ecl dala Lgloszema. ale po!:meJ mz Lastrze~ana dala p1erwsLenslwa. T- dokument pó7.nlejs7y. op11hhkow3ny po (l[lcie 7.gfoszenir1 h1b w cfacie pienvs7enstwr1 i niebedacy ''" konflikcie 7e zglos7.e11iem. [Ile cytowm1y ''" celu 7T07umieni;i i'.as;id lub teorii lc/.acych u podsl:J\\ \\")'Hal:vl-.tL X - doh.umeut o SLczegóh1: m LHaczeuiu: z.aslrLegany wy 11alaLeh. nie moze byc U\\ azcill) La HO\\ y lub 11.ie moLe byc uwazany La posiada1ac: poLiom \\ y 11.alaLcz:, jeL.eh ten dokument brany jest pod uw[lge s3modzielme. Y - dokument o szczcg(llnym 7.naczcnin: 7nstf7cgany ,vynalazck nic mo7.c byc mYn7.any zn posinclajacy poziom 1vy1rnlazczy jc7.ch ten clokumcnt 7.0st;inic polac7.0lly 7 jednym lub l....iU, ... oma tego l; pu dol....umcntami. a tal.Je polacLe1tie b9dLie ocz: v\-islc dla znawcy, & - dokumern nalezacv do te1 sameJ rodZlm paternowa Sprawozdanie wykonali-a: Malgorzata Kozlowska Ekspert Koordynator Data: .01.2023 Uwagi do zgloszenia Podpis: /podpisano kwalifikmrnnyrn podpisem clcktronic7.nym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 26.06.2022 r. PL 441547 A1 11/11 ZGLOSZENIE NR P.441547 Kontynuacja wykazu dokumentÓ\\ Kategoria Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie: dokumentu do zastrz. A K. Pimkova et al.: "Smface plasmon resonance biosensor zastrz. for the detection ofVEGFR-1- a protein marker of myclodysplastic syndromcs ,. : Anal Bioanal Chem.: 2012: 402(1): 381-387 cah- dokument PL PL