PL43644B1 - - Google Patents

Description

Opublikowac dnlo 27 lyt+gp 1961 r 9 '/aa POLSKIE] RZECZYPOSPOLITEJ LUDOWEJ OPIS PATENTOWY Nr 45644 KI 6 b, 16/03 Instytut Antybiotyków Warszawa, Polska Sposób otrzymywania nowego antybiotyku, onkostatyny C Patent trwa od dnia 23 listopada 1959 r.Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania i wydzielania nowego antybiotyku, onkostatyny C, na drodze biosyntezy za pomoca nowego, nie opisanego dotychczas szczepu Streptomyces species INA 39/58.Onkostatyna C nalezy do grupy aktynomy- cyn C, co stwierdzono na podstawie chromato¬ grafii bibulowej oraz skladu aminokwasów.Nowy szczep Streptomyces species INA 39/58, wytwarzajacy onkostatyne C, rózni sie znacz¬ nie od dotychczas znanego producenta aktyno- mycyny C — Streptomyces chrysomallus.Na podlozu Pridhama zawierajacym: skrobii — 1,0%, K2HP04 — 0,1%, MgS04'7H20 —0,l°/o, NaCl — 0,l°/o, (NH4)2S04 — 0,2%, CaCOs — 0,2°/o, agaru — 2^0%, szczep Streptomyces spe¬ cies INA 39/58 wytwarza sporofory faliste i za¬ rodniki lekko owalne, grzybnie podstawowa bezbarwna, grzybnie powietrzna kremowa i wy¬ dziela jasno-zólty pigment rozpuszczalny w podlozu.Na podlozu peptonowyim, zawierajacym: try- ptonu — 0,1%?: wyciagu drozdzowego — 0,1%, NaCl — 0,85%, agaru — 1,7%, szczep Stiepto- myces species INA 39/58 nie wytwarza piis(men- tu typu melaniny.Na podlozu Krainskiego, zawierajacym, glu¬ kozy — 1,0%, NH4N03 — 0,05%, K2HP04 — 0,05*1%, agaru — 2,0% i wode wodociagowa, szczep Streptomyces species INA 39/58 wytwa¬ rza grzybnie podstawowa bezbarwna, grzybni powietrznej brak.Na podlozu Lindenbeina, zawierajacym: gli¬ cerolu — 2,0%, glikokolu — 0,25%, NaCl — 0,1%, K2HP04 — 0,1%, FeS04'7H20 — 0,01%, MgS04 • 7H20 — 0,01%, CaC03 — 0,0005%, aga¬ ru — 2,0%, szczep Streptomyces species INA 39/58 wytwarza grzybnie podstawowa bezbarw¬ na, grzyibnie powietrzna rózowa i wydziela zól¬ ty pigiment, rozpuszczalny w podlozu,.Na podlozu zawierajacym: platków owsia¬ nych — 2,0%, agaru — 2,0%, szczep Strepto¬ myces species INA 39/58 wytwarza grzybnie .podstawowa bezbarwna, grzybnie powietrana ja&nQ-'kremowa i wydziela w malych Uolclach zólty pigment, rozpuszczalny w'1 podlozu.Na podlozu syntetycznym, zawierajacym: glukozy — 0,5°/o, KN03 — 0,1%, K2HP04 — 0,05%, MgS04*7H20 — 0,02°/o, FeS04-7H20 — 0,0001%, agaru — 2,5%, szczep Streptomyces species INA 39/58 wytwtaTza grzybnie podstawo¬ wa bezbarwna, grzybnie powietrzna jasno-zól- ta i wydziela jasno-zólty pigment rozpuszczalny W podlozu.Na podlozu syntetycznym z dodatkiem pepto¬ nu w ilosci 0,5%, szczep Streptomyces species INA 39/58 wytwarza grzybnie podstawowa bez¬ barwna, grzybnie powietrzna kremowa i wy¬ dziela zólty pigment, rozpuszczalny w podlozu.Na podlozu tryptonowym, zawierajacym: try- t ptonu — 1,0%, glukozy — 1,0%, agaru — 2,0%, szczep Streptomyces species INA 39/58 wytwa¬ rza grzybnie podstawowa kremowa, grzybnie powietrzna jasno-kremowa i wydziela zólty pigment rozpuszczalny w podlozu.Na ziemniaku szczep Streptomyces ,species INA 39/58 wytwarza grzybnie podstawowa zól- to-brazowa, grzybnie powietrzna jaano-zólta.Na podlozu ziemniaczanym z glukoza, zawie¬ rajacym: glukozy — 1,0%, agaru — 2,5% i wy¬ ciag ziemniaczany, szczep Streptomyces species INA 39/58 wytwarza grzybnie podstawowa zól¬ ta, grzybnie powietrzna jasno-zólta i wydziela zólty pigment rozpuszczalny w podlozu.Na agarze zwyklym, zawierajacym: NaCl — 0,5%, peptonu — 1,0%, agaru — 2,0% i wyciag wolowy rozcienczony woda w stosunku 3 : 1, szczep Streptomyces species INA 39/58 wytwa¬ rza grzybnie podlstawowa zólta, nie wytwarza zarodników i wydziela zólty pigment rozpusz¬ czalny w podlozu.Na bulionie zwyklym, zawierajacym: pepto¬ nu — 1,0%, NaCl — 0,5% i wyciag wolowy roz¬ cienczony woda w stosunku 3 :1, szczep Strep¬ tomyces species INA 39/58 wytwarza bezbarwna grzybnie podstawowa, nie wytwarza zarodni¬ ków i nie wydziela pigmentu.Ponizej podano wlasciwosci biologiczne szcze¬ pu Streptomyces species INA 39/58 w porówna¬ niu z odpowiednikii wlasciwosciami macierzy¬ stego saczepu Streptomyces chrysomallus. Szcziep Streptomyces species INA 39/58, wytwarzajacy onkostaityne C, zostal ulzyskany na drodze se¬ lekcji naturalnej ze szczepu Streptomyces chry- somalluis.Charakterystyka szczepów na podlozu aspa¬ raginowym, zawierajacym: aisparaginy — 0,1%, KH2P04 — 0,025%, wyciagu wolowego — 0,2%, glukoizy — 1,0%, agaru — 2,0%.Szczep Streptomyces Streptomyces chrysomallus fp. INA 39/58 Zarodnikowanie grzybnia powietrzna grzybnia podstawowa pigment rozpuszczalny dobre dobre kremowa zólta bezbarwna zólta zólty (skapy) zólty (skapy) Charakterystyka sizdzepów na podlozu azota¬ nowym, zawierajacym: KN03 — 0,1%, wyciag wolowy — 0,3%, pepton — 0,5%, agar — 1,2%.Szczep Streptomyces Streptomyces chrysomallus sp< INA 39/58 Zarodnikowarrie grzybnia powietrzna grzybnia podstawowa pigment rozpuszczalny slabe brak biala brak jasno-zólta kremowa zloto-zólty zloty Charakterystyka szczepów na podlozu Cza- pek-Doxa: NaN03 — 0,2% K2HP04 — 0,1%, MgSO4-7H20 — 0,05%, KCl — 0,05%, FeS04- • 7H20 — 0,001%, sacharozy — 3,0%, agaru — 2,0%.Szczep Streptomyces Streptomyces chrysomallus sp INA Zarodnikowanie grzybnia powietrzna grzybnia podstawowa pigment rozpuszczalny dobre dobre biala bezbarwna bezbarwna brak zólto-zielony biala Charalcterystyika szczepów na podlozu dek¬ stranowym: dekstryny — l,0°/o, peptonu — 0,5%, NaN03 — 0,3%, KH2P04 — 0,1%, KCl — 0,05%, MgS04 • 7H20 — 0,001%, wyciagu drozdzowego — 0,04%, FeS04 • 7HsO — 0,001%, agaru — 3,0%. - 2 -Szczep Streptomyces Streptomyces chrysomallus sp. jna 39/58 Tabela 1, Zarodnikowanie grzybnia powietrzna grzybnia podstawowa pigment rozpuszczalny dobre slabe jasno-zólta biala bezbarwna bezbarwna zólty (skapy) zólty Charakterystyka szczepu na bulionie Emer- sona: wyciagu wolowego — 0,4%, peptonu — 0,4°/o, NaCl — 0,25%, wyciagu drozdzowego — 0,1%, glukozy — 1,0%.Szczep Streptomyces Streptomyces chrysomallus sp INa 39/58 Zarodnikowanie grzybnia powietrzna grzybnia podstawowa pigment rozpuszczalny dobre dobre kremowa biala bezbarwna bezbarwna zloto-zólty jasno-zólty Charakterystyka szczepu na podlozu Sabou- raud, zawierajacym: glukozy — 2,0%, peptonu — 1,0%, agaru — 2,0%.Szczep Streptomyces Streptomyces chrysomallus sp INA 39/58 Zarodnikowanie grzybnia powietrzna grzybnia podstawowa pigment rozpuszczalny brak brak zólta jasno--zólty dobre kremowa pomaranczowi zólty Szczep Streptomyceis species INA 39/58 nie uplynnia zelatyny, alkailizuje i peptonizuje mle¬ ko, z jedinoczesinyim wydzielaniem zóltego pi¬ gmentu, rozpuszczalnego w podlozu, wydziela siarkowoidór na podlozu ciieklym z tryptonem, a na agarze z krwia wykazuje dzialanie hemo- lizujace. Szczep Streptomyces sp. INA 39/59 silnie redukuje azotany do azotynów w odróz¬ nieniu od szczepu Streptomyces chrysomallus, którego zdolnosci redukujace sa znacznie slab¬ sze.Tabela I przedstawia izdolnosc wykorzystywa¬ nia róznych zródel wegla w agarze 'syntetycz¬ nym Pridhama i Gottlieba, zawierajacym: (NH4)2S04 — 0,264%, KH2P04 — 0,238%, K2HP04 — 0,565%, MgS04'7H20 — 0,1%, CuS04'5H20 — 0,00064%, FeS04'7H20 — 0,00011%, MnCl2-4H20 — 0,00079%, ZnS04- 7H20 — 0,00015%, zródlo wegla — 1,0%, agar —-1,5%, przez szczep Streptomyces chrysomal- luis i przeiz szczep Streptomyces sp. INA 39/58.Zródlo wegla Streptomyces Streptomyces sp. chrysomallus INA 3»/58 dulcyt — 1 (—) rammoza + + d (—) fruktoza + + + d (+) gailaktpza + + + glukoza + + + d (+) mannoza + + + laktoza + maltoza — sacharoza + trechaloza , + + d (—) rafinoiza — skrobia + + + gicerol + + + inozytol — d (—) mannit + + + bursiztynian isodu + + + octan sodu + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Podlozem sporulacyjnym dla szczepu Strep¬ tomyces species INA 39/58 jest podloze Linden- beina o isikladztie uprzednio podanym. Hodow¬ le na skosnych agarach inkubuje sie 8—10 dni w temperaturze 25—35°C, a nastepnie przecho¬ wuje w chlodni w temperaturze 4°C. Ponad to szczep Streptomyces species INA 39/58 mozna przechowywac w positaci zarodników w piasku oraz w postaci zarodników zliofiilizowanych.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze prowadzi sie fermentacje glebinowa za pomoca sizczepu Streptomyces species INA 39/58 na od¬ powiedniej pozywce, w temperaturze ponizej 30°C i w warunkach optymalnych dla wytwo¬ rzenia w brzeczce maksymalnej ilosci onkosta- tyny C. Z brzeczki zawierajacej antybiotyk, od¬ dziela sile grzybnie na przyklad przez odwiro¬ wanie lub saczenie i ekstrahuje ja dwukrotnie acetonem w ilosci 1 czesc objetosciowa acetonu na 1 czesc objetosciowa grzybni. Polaczone wy¬ ciagi acetonowe odparowuje sie w prózni w temperaturze nie przekraczajacej 30—35°C az do calkowitego usuniecia acetonu. Pozostalosc wodna ekstrahuje, sie dwukrotnie benzenem, biorac kazdorazowo Vio—Vs czesci objetoscio¬ wej benzenu na 1 czesc objetosciowa fazy wod¬ nej. Antybiotyk zawarty w przesaczu brzeczki ekstrahuje sie 1—2 krotnie benzenem w stosun¬ ku V2o—Ve czesci objetosciowej benzenu na 1 — 3 -ccdesc objetosciowa przesaczu, po uprzednim izo- bogeliiielniiiu tej miiesziadiiny.Polaczone wyciagi benzenowe grzybni i prze¬ saczu brzeczki zlewa sie razem, zageszcza w prózni i wprowadza na kolumne z tlenkiem glinowym. Na kolumnie tworzy sie pierscien barwy pomaranczowo-czerwonej, który w za¬ leznosci od ilosci onkostatyny C w wyciagu ben¬ zenowym jest szerszy lub wezszy. Po przepusz¬ czeniu calej objetosci wyciagu benzenowego, an¬ tybiotyk eluuje sie z kolumny acetonem do calkowitego usuniecia go z kolumny. Acetonoi- we eluaity zageszcza sie w próznii do suchej po¬ zostalosci i rekrystalizuje z wrzacego roztworu octanu etylowego luib innych estrów, w których onkoistatyna C jest dobrze rozpuszczalna.Przyklad I. Jedinostadiowa fermentacja w kolbach na trzesawce. Kotlbe o pojemnosci 750 ml, zawierajaca 100 ml pozywki o skladzie: maka sojowa — 2,0%, glukoza — . 2,0°/o, (NH4)2S04 — 0,2°/o, NaCl — 0,2°/o, K2HP04 — 0,05°/o, CaC03 — 0,4°/o, ph — 7,0, wyjalawia sie, poczym zaszczepia .zawiesine zarodników w 0,85°/a-owym roztworze chlorku sodowego i pod¬ daje fermentacji na trzesawce w temperaturze 25—30°C przez 120—150 godzin. Zawartosc onko- 'statyny C w brzeczce wynosi okolo 150 j/ml.P rzy ki a d II. Trzystadiowa fermentacja w fermentorach. Stadium I przeprowadza sie w kolbach, jak w przykladzie I, lecz fermentacja trwa 48—72 godziny, "Stadium II prowadzi sie w fermentorze o pojemnoscii np. 100 litrów. 70 litrów podloza fermentacyjnego o skladzie jak wyzej, zawiera¬ jacego dodatkowo olej sojowy w ilosci 0,7 litra, wyjalawia sie w temperaturze 115°C przy 0,8 astro, w cilagu 1 godziny. Wyjalowiona pozywke szczepi sie 0,7 litra 48—72 godzinnym inoculum (stadium I) i poddaje sie 36—48-o godzinnej fermentacji w temperaturze 25—30°C przy na¬ powietrzaniu od 0,4—1 objetosci powietrza na objetosc pozywki na minute.Stadium III prowadzi sie w fermentorze o pojemnosci np. 1500 litrów, w podlozu podanym wyzej (stadium II) i przy utrzymamiu takich samych parametrów^ lecz pitzy napowietrzaniu 2Q(F-C00 litrów powietrza na minute, prteez o- kres srednio 96 godzin. Koniec fermentacji na¬ stepuje przy Ph 7,0—8,2. Zawartosc onkosta¬ tyny C w brzeczce wynosi wtedy okolo 120 j/ml brzeczki.Oznaczenia onkostatyny C w brzeczce pmze- prowadzja sie metoda biologiczna, plytkowo-cy- linderkowa, wobec szczepu wzorcowego Bacil- lus subtilis 6633.Z brzeczki ofddJzdela sie grzybnie np. przez od¬ wirowanie na wirówce koszowej lub nuczach prózniowych o duzej powierzchni saczacej, po czym grzybnie umieszcza sie w reaktorze o po¬ jemnosci 150 litrów na 60 litrów grzybna, za¬ daje sie 60 litrami acetonu i ekstrahuje mie¬ szajac do calkowitego wyciagniecia onkoistaty- ny C z grzybni. W przypadkach niecalkowitej ekstrakcji antybiotyku proces ekstrakcji powta- rlzia sie po raz drugi. Oddzielony od grzybni przesacz brzeczki umieszcza sie w reaktorach o pojemnosci okolo 1000 litrów na 700 litrów przesaczu, dodaje sie od 35—105 litrów benizelnu, mieszanine wodno-benzenowa zobojetnia sie i miesza od 1—1,5 godzin. Nastepnie mieszanine zostawia sie do odstania na 12—20 godziin7"wod- na faze dolna odrzuca sie, a emulsje powstajaca na granicy faz wiruje sile w wirówce Sharplesa lub innej odpowiedniej wirówce szybkoobroto¬ wej, po uprzednim wymieszaniu z dodatikiem Na2S04, NaCl lub innej soli. Polaczone wyciagi benzenowe z grzybni i przesaczu brzeczki, po uprzednim zageszczeniu w prózni, chroimatoigra- fuje sie na kolumnie z tlenkiem glinowym. Za¬ absorbowana na tlenku glinowym cmkostatyne C eluuje sie acetonem, stosujac takie objetosci acetonu, które pozwalaja na calkowite- wymycie antybiotyku z kolumny. Eluaty acetonowe za¬ geszcza sie w prózni w temperaturze nie prze¬ kraczajacej 30—35°C az do uzyskania suchej pozostalosci i rekrystalizuje sie z wrzacego roz¬ tworu octanu etylowego lub innych rozpusz¬ czalników organicznych, w których onkoistatyna C jest dobrze rozpuszczalna na goraco i malo rozpuszczalna na zimno. Krystaliczny osad zo¬ stawia sie na 5—7 dni w temperaturze 4—10°C, saczy sie, przemywa lodowata woda i suszy w temperaturze pokojowej w prózni. Wydajnosc czystego antybiotyku wynosi 60°/o.Spectrum antybiotyczne onkostatyny C przed¬ stawia tabela II. -4 —Tabela II. PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe Szczepy wzorcowe Najmniejsze stezenie onko- statyny C hamujace wzrost szczepu wzorcowego' w mcg/ml Miicrococicus pyogenes var. aureus 209-P 0,6 MJcrococicus pyogenes var. albus 0,15 Bacilluis suibtiilis 6633 0,01 Bacilluis cereus 8096 0,05 BacMlus circuians 8144 0,07 &acilluis brevis 10068 0,6 Escherchia coli 308 160,0 Proteus vulgaris OX19 40,0 Pseudomonas aeruginosa 80,0 Mycobacterium phlei 0,6 Mycoibacterium smegmatiis 0,6 Mycobaicterium 607 0,6 Caindiida albicans 102 80,0 Saccharamyces cereviaiae 40,0 Panicilliuim chrysogenum Q-176 160,0 Aspergillus niger 80,0 Duza toksycznosc onikostatyny C, wyrazona jako LD50 dlla myszy, wynosi po wstrzyknieciu dozylnym okolo 1 mg na kg wagi. Onkostatyine C mozna stosowac w leczeniu ziarnicy zlosliwej, w przypadkach przerzutów niektórych postaci raka do pluc, rlaka osknzeli, w przypadkach leukopenii, anemii, pancyto- penii oraz przy wprowadzaniu antybiotyku do rakowatych wysieków. Onkoisitatyme C mozna .stosowac równiez w skojarzeniu z leczeniem promieniami Roentge¬ na, iperytem azotowym oraz innymi lekami przeciwnowotworowymii. 1. Sposób otrzymywania nowego antybiotyku, onikostatyny C, znamienny tym, ze proces biosyntezy prowadzi! sie metoda fermentacji glebinowej za pomoca szcziepu Streptomyces species INA 39/58, otrzymanego na drodze selekcji naturalnej ze szczepu Streptamyces chryisomallus, w temperaturze ponizej 30°C, w pozywce zawierajacej przyswajalny we¬ giel, aizot i sole mineralne, do czasu wytwo¬ rzenia przez ten szczep w bitzeczce antybio¬ tyku, który nastepnie izoluje sie metoda eks¬ trakcji, adsorpcji i eluacji.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze iz ibrizeclzkli oddziela sie grzybnie, na przyklad przez odsaczanie lu!b odwirowywanie, eks¬ trahuje antybiotyk z przesaczu w srodowisku obojetnym benzenem lub innymi rozpuszczal¬ nikami nie miesizajacymi sie z woda, a anty¬ biotyk wytworzony w grzybni ekstrahuje kilkakrotnie acetonem lub innymi odpowied¬ nimi rozpUBZczalnikamii, po czym uizyskamy wyciag izagesizcza sie i reekstrahuje do ben¬ zenu, a nastepnie laczy sie obydwa wyciagi i poddaje adisorpcji na kolumnie wypelnio¬ nej tlenkiem gJJtou, z której antybiotyk elu- uje sie acetonem, eluaty odparowuje w prózna w temperaturteie 25—35°C, a uzyska¬ na sucha pozostalosc rekrystalizuje z gorace¬ go octanu etylowego lub innego, odpowied¬ niego rozpuszczalnika organicznego, po czym otrzymany osad po odsaczeniu, przemywa lodowata woda i susizy w temperaturze po¬ kojowej. Instytut Antybiotyków Zastepca: mgr inz. Jerzy Hanke rzecznik patentowy fekk ZÓ17. 21. S. 60. 106+24. §4. PL