PL43809B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano dnia 12 listopada 1960 r. #*"*** tM% aa \ POLSKIEJ RZECZYPOSPOLITEJ LUDOWEJ OPIS PATENTOWY Nr 43809 KI. 6 b, 16/03 Instytut Antybiotyków Warszawa, Polska Sposób otrzymywania nowego antybiotyku, onkoslafyny K Patent trwa od dnia 21 listopada 1959 r.Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania i wyodrebniania nowego antybiotyku, onkosta- tyny K, droga biosyntezy za pomoca nowego i nie opisanego dotychczas szczepu Strepto- myces species INA 1-79/58.Szczep Streptomyces species INA 1-79/58, otrzymywany na drodze selekcji naturalnej szczepu Streptomyces melanochromogenes 1779, rózni sie od dotychczas opisanego szczepu, wy¬ twarzajacego aktynomycyne K.Szczep Streptomyces species INA 1-79/58 hodowany na podlozu Pridhama zawierajacym: skrobi — 1%, K2HPOL — 0,1%, MgSOA.7H20 — 0,1% NaCl — 0,1%, (NH4)2SOA — 0,2%, CaC09 — 0,2%, agaru — 2,0%, wykazuje spo- rofory spiralne, a zarodniki lekko owalne. Wy¬ twarza on grzybnie podstawowa kremowa, grzybnie powietrzna szara i wydziela zólty pig¬ ment, rozpuszczalny w podlozu.Szczep Streptomyces species INA 1-79/58 na podlozu peptonowym, zawierajacym: Bactotryp- tonu — 0,1%, Bacto-Yeast-Extract — 0,1%, NaCl — 0,85°/o, agaru — 1,7%, wytwarza pig¬ ment typu melaniny.Na podlozu Czapek-Doxa, zawierajacym: NaNOs — 0,2°/o, K2HPOA — 0,1%,MgSOf 7HtO — 0,05%, KCl — 0,05%, FeSOt. 7H2G — 0,001%, sacharozy — 3,0%, agaru — 2,0%, szczep Strep¬ tomyces species INA 1-79/58 wytwarza grzybnie podstawowa jasno-zolta, grzybnie powietrzna barwy kremowej i wydziela jasno-brazowy pig¬ ment, rozpuszczalny w podlozu.Na podlozu tryptonowym, zawierajacym 1,0% Bactotryptonu, l,0°/i glukozy, 2,0% agaru, szczep Streptomyces species INA 1-79/58 wytwarza kremowa grzybnie podstawowa, grzybnie po¬ wietrzna jasno-zólta i wydziela ciemno-brazo- wy pigment, rozpuszczalny w podlozu.Na podlozu Krainskiego, zawierajacym: glu¬ kozy __ i,o%, NHiNOs — 0,05%, KtHPOt — 0,05%, agaru — 2,0% i wode wodociagowa, szczep Streptomyces species INA 1-79/53 wy¬ twarza grzybnie podstawowa kremowa, grzyb-nie powietrzna szara oraz wydziela zólty pig¬ ment, rozpuszczalny w podlozu.Na podlozu owsianym, zawierajacym: plat¬ ków owsianych — 2,0%, agaru — 2,0%), szczep Streptomyces species INA 1-79/53 wytwarza jasno-kremowa grzybnie podstawowa, grzybnie powietrzna szara i wydziela zólty pigment, rozpuszczalny w podlozu.Na podlozu dekstrynowym, zawierajacym: dekstryny — 1,0%, peptonu '— 0,5%, NaNOs — 0,3%, KH2POi — 0,l°/o, KCl — 0,05%, MgSOA.7H20 — 0,001%, wyciagu drozdzowe¬ go — 0,04%, FeSOi. 7H20 — 0,001%, agaru — 3,0%, szczep Streptomyces species INA 1-79/58 wytwarza grzybnie podstawowa jasno-kremowa, grzybnie powietrzna biala i wydziela zólty pig¬ ment, rozpuszczalny w podlozu.Na podlozu Sabouraud, zawierajacym: gluko¬ zy — 2,0%, peptonu — 1,0%, agaru — 2,0%, Charakterystyka szczepu Streptomyces speci¬ es INA 1-79/58 na agarze zwyklym, zawiera¬ jacym: NaCl — 0,5%, pepton — 1,0%, agar — Zarodnikowanie grzybnia powietrzna grzybnia podstawowa pigment rozpuszczalny Szczep Streptomyces melanochromogenes 1779 uplynnia czesciowo zelatyne i wytwarza bra¬ zowy pigment. Szczep Streptomyces species INA 1-79/58 nie uplynnia zelatyny i nie wytwarza pigmentu. szczep Streptomyces species INA 1-79/58 wy¬ twarza grzybnie podstawowa jasno-kremowa, grzybnie powietrzna jasno-zólta oraz zólty pig- p ment, rozpuszczalny w podlozu, a Na podlozu syntetycznym z peptonem, zawie- a rajacym: glukozy — 0,5%, peptonu — 0,5%, t, KN03 — 0,1%, K2HPOi — 0,5%, MgSO^. 7H20 — 0,02%, FeSO±.7H20 — 0,001%, agaru — : 2,5%, szczep Streptomyces species INA 1-79/58 3 wytwarza grzybnie podstawowa jasno-kremowa, ?, grzybnie powietrzna biala oraz ciemno-brazo- wy pigment, rozpuszczalny w podlozu.W ponizszych tabelach zestawiono biologiczne ° wlasciwosci wyjsciowego szczepu Streptomyces l» melanochromogenes 1779 i szczepu Strepto¬ myces species INA 1-79/58, uzyskanego ze szczepu Streptomyces 1779 na drodze selekcji naturalnej.», Charakterystyka szczepu na ziemniaku: 2,0% i wyciag wolowy rozcienczony woda w stosunku 3:1.Zdolnosc wykorzystywania róznych zródel wegla w agarze syntetycznym Pridhama i Gott- lieba, zawierajacym: (NH^SOl — 0,264%, KH2POL — 0,238%, K2HPOi — 0,565%, Mfif504. -7H2Q ~ 0,1%, CuSOl 5H20 — 0,00064%, Streptomyces Streptomyces species melanochromogenes INA 1-79/58 Zarodnikowanie grzybnia powietrzna pigment rozpuszczalny Charakterystyka szczepu ginowym: asparaginy — Szczep slabe zólta zólty na podlozu aspara- 0,1%, KH2POl — 0,025%, 1,0%, obfite brazowa brazowy wyciagu wolowego - agaru — 2,0%. - 0,2%, glukozy - Streptomyces Streptomyces species melanochromogenes INA 1-79/58 Zarodnikowanie dobre dobre grzybnia powietrzna zloto-zólta szara grzybnia podstawowa zloto-zólta zólta pigment rozpuszczalny zloto-czerwony zólty s „ Streptomyces Streptomyces species melanochromogenes 1779 INA 1-79/58 Streptomyces Streptomyo melanochromogenes 1779 INA 1 brak brak brak brak jasno-brazowa bezbarwna jasno-brazowy ciemnonbrazowyFeSOi'7H20 — 0,0001 l*/o, MnCl2'4H20 — 0,00079%, ZnSOL. 7H20 — 0,000l5°/o, zródlo wegla — 1,0, agar — l,5°/o, przedstawia sie nastepujaco: szczep Streptomyces species INA 1-79/58 metabolizuje d(—)fruktoze, d{+)galak- toze, d(+)glukoze, d(+)mannoze, laktoze, mal¬ toze, sacharoze, trehaloze, d(—jrafinoze, skrobie oraz inozytol i mannit. Szczep ten nie przys¬ waja octanu sodowego, dulcytu i fiie rozklada celulozy. Szczep Streptomyces species INA 1-79/58 metabolizuje bursztynian sodowy i 1- ramnoze, co rózni go od szczepu Streptomyces melanochromogenes 1779, który niezuzywa bur- sztynianu sodowego i 1-ramnozy jako zródla wegla.Szczep Streptomyces species INA 1-79/58 nie redukuje azotanów do azotynów, na podlozu tryptonowym plynnym wytwarza H2S, pepto- nizuje mleko i nie rozklada celulozy.Podlozem sporulacyjnym dla szczepu Strep¬ tomyces species INA 1-79/58 jest agar aspara¬ ginowy o wymienionym wyzej skladzie. Ho¬ dowle inkubuje sie w termostacie w tempera¬ turze 25 — 30°C przez 7 — 10 dni. Wyrosle hodowle na sporulacyjnym, skosnym agarze przechowuje sie w chlodni w temperaturze 4°C.Szczep mozna przechowywac takze w ziemi i w postaci zliofilizowanej.Sposób wytwarzania onkostatyny K droga biosyntezy polega na fermentacji szczepu Strep¬ tomyces species INA 1-79/58 w temperaturze ponizej 30°C az do czasu wytworzenia maksy¬ malnej ilosci tego antybiotyku w brzeczce.Grzybnie, oddzielona z brzeczki fermentacyjnej przez wirowanie lub saczenie, ekstrahuje sie trzykrotnie acetonem, stosujac kazdorazowo 1 czesc objetosciowa acetonu na jedna czesc ob¬ jetosciowa grzybni lub dwukrotnie ekstrahujac acetonem w wyzej podanej ilosci, a po raz trzeci 1/2 czesci objetosciowej acetonu ria 1 czesc objetosciowa grzybni. Nastepnie polaczone wyciagi acetonowe odparowuje sie w prózni w temperaturze nie przekraczajacej 30 — 35°C do calkowitego usuniecia acetonu, a pozosta¬ losc wodna ekstrahuje dwukrotnie benzenem, biorac 1/10 do 1/5 czesci objetosciowych ben¬ zenu na 1 czesc objetosciowa pozostalosci wod¬ nej. Przesacz brzeczki zadaje sie dwukrotnie benzenem, zobojetnia i prowadzi ekstrakcje, przy czym na 1 czesc objetosciowa brzeczki stosuje sie 1/5 — 1/15 czesci objetosciowych benzenu. Polaczone wyciagi benzenowe z grzyb¬ ni i z przesaczu brzeczki zlewa sie razem, zageszcza w prózni i wprowadza na kolumne z tlenkiem glinowym. Na kolumnie tworzy sie pierscien barwy ciemno-czerwonej, który, w zaleznosci od ilosci onkostatyny K w wy¬ ciagu benzenowym, jest szerszy lub wazszy.Po przepuszczeniu calej objetosci wyciagu ben¬ zenowego, antybiotyk eluuje sie z kolumny, acetonem az do jego calkowitego usuniecia.Eluaty acetonowe zageszcza sie w prózni do suchej pozostalosci i rekrystalizuje z wrzacego roztworu octanu etylowego lub innych rozpu¬ szczalników organicznych, w których onkosta- tyna K jest dobrze rozpuszczalna. W przy¬ padkach, gdy brzeczka wykazuje szczególnie wysoka aktywnosc, mozna pominac etap chro¬ matografii na kolumnie z A12Oq i po zageszcze¬ niu do sucha wyciagów benzenowych mozna rekrystalizowac pozostalosc w sposób opisany wyzej.Przyklad I. Jednostadiowa fermentacja w kolbach na trzesawce. Kolbe o pojemnosci 750 ml, zawierajaca 100 ml pozywki o skla¬ dzie: maka sojowa — 2°/o, glukoza — 2Vo, {NH^SOi — 0,2*/o, NaCl — 0,2 0,05Vo, CaC03 — 0,4«/o, ph — 7,0, wyjalowiona w sposób powszechnie znany, zaszczepia sie zawiesina zarodników szczepu Streptomyces^spe- cies INA 1-79/58 w 0,85%owym roztworze NACL Kolbe z zaszczepiona pozywka umieszcza sie na trzesawce i inkubuje w temperaturze 25 — 30°C przez 120 — 168 godzin.Przyklad II. Trzystadiowa fermentacja. w fermentorach. Stadium I przeprowadza «ie w kolbach, jak w przykladzie I, lecz fermen¬ tacje prowadzi sie przez 48 — 72 godziny*.Stadium II prowadzi sie w fermentorze o ob-; jetosci np. 100 litrów. Podloze produkcyjne: 0 skladzie jak wyzej, zawierajace ponad ta olej sojowy w ilosci okolo l°/o, wyjalawia sie, w temperaturze 115°C przy 0,8 atm. w ciagu 1 godziny. Wyjalowiona pozywke szczepi sie 48 — 72 godzinna hodowla ze stadium I i pod¬ daje 36 — 48 — godzinnej fermentacji wtem-; peraturze 25 — 30°C przy napowietrzaniu 0,4 — 1,0 objetosci powietrza na objetosc po^ zywki na minute. Stadium III prowadzi sie w fermentorze o pojemnosci np. 1500 litrów na podlozu podanym wyzej, wyjalowionym jak w stadium II i przy utrzymywaniu takich sa¬ mych parametrów, lecz przy napowietrzaniu 0,2 — 0,6 objetosci powietrza na objetosc po¬ zywki na minute przez okres srednio 80 godzin.Oznaczenie onkostatyny. K w przesaczu brze¬ czki przeprowadza sie metoda biologiczna plyt- kowo-cylinderkowa, uzywajac jako szczepu wzorcowego Bacillus subtilis 6633.Po fermentacji oddziela sie z brzeczki grzyb¬ nie np. przez odwirowanie na wirówce koszo¬ wej lub odsaczenie na nuczach prózniowych o duzej powierzchni saczacej, po czym grzyb¬ nie w ilosci 60 litrów umieszcza sie w reaktorze o pojemnosci okolo 150 litrów, zadaje 1 czescia objetosciowa acetonu na 1 czesc objetosciowa grzybni i ekstrahuje mieszajac do calkowitego wyciagniecia onkóstatyny K z grzybni. W przy¬ padku niecalkowitej ekstrakcji antybiotyku, ekstrakcje powtarza sie dwu- lub trzykrotnie.Polaczone wyciagi acetonowe odparowuje sie w prózni w temperaturze nie przekraczajacej 30 — 35°C, do calkowitego odpedzenia acetonu.Pozostalosc wodna ekstrahuje sie trzykrotnie benzenem, biorac kazdorazowo 1/6 czesc objetosciowa benzenu na 1 czesc obje¬ tosciowa pozostalosci wodnej. Oddzielony od grzybni przesacz brzeczki umieszcza sie w re¬ aktorach o pojemnosci okolo 100 litrów na 700 litrów przesaczu, dodaje do nie¬ go 1/20 — 1/6 czesci objetosciowych ben¬ zenu na 1 czesc objetosciowa przesaczu brzecz¬ ki, mieszanine wodno-benzenowa zobojetnia sie i miesza 1 — 1,5 godziny, po czym zostawia do odstania na 12 — 20 godzin. Nastepnie faze dolna ekstrahuje sie jeszcze raz 1/20 — 1/6 czesci objetosciowych benzenu na 1 czesc obje¬ tosciowa fazy wodnej. Emulsje powstajaca na granicy faz wiruje sie na wirówce Sharplesa lub innej, odpowiedniej wirówce szybkoobro¬ towej, po uprzednim dodaniu do niej Na^SO^ NaCl lub innej soli i wymieszaniu. Polaczone wyciagi benzenowe z grzybni i z przesaczu brze¬ czki, po uprzednim zageszczeniu w prózni, chro¬ matografuje sie na kolumnie z tlenkiem glino¬ wym. Zaadsorbowana na tlenku glinowym on- kostatyne K eluuje sie acetonem w ilosci po¬ trzebnej do calkowitego wymycia antybiotyku z kolumny. Eluaty acetonowe zageszcza sie w prózni w temperaturze nie przekraczajacej 30 — 35°C do uzyskania suchej pozostalosci i rekrystalizuje z wrzacego roztworu octanu etylowego lub innych rozpuszczalników orga¬ nicznych, w których onkostatyna K jest dobrze rozpuszczalna na goraco i malo rozpuszczalna na zimno. Krystaliczny osad zostawia sie na 5 — 7 dni w temperaturze 4 — 10°C, saczy, przemywa woda lodowata i suszy w tempera¬ turze pokojowej w prózni. Wydajnosc antybio¬ tyku w przeliczeniu na zawartosc antybiotyku w grzybni i w przesaczu brzeczki wynosi 60Vo.Onkostatyna K jest substancja o barwie ciemno-czerwonej. Tworzy krysztaly w formie dwupiramid i plytek. Chromatografia bibulowa w róznych ukladach rozpuszczalników wykazuje obecnosc 4 komponentów, zidentyfikowanych jako I0a, lo, Ii, Ig. Nie zawiera komponentu I8, wystepujacego w aktynomycynach z grupy D.Temperatura topnienia onkóstatyny K wynosi 250 — 253°C, temperatura ciemnienia 241°C.Skrecalnosc wlasciwa w absolutnym etanolu 20 (a) D = ^260°. Ekstynkcja wlasciwa (33ft/o-ego etanolowegp roztworu z buforem fosforanowym, PH 7,01) przy 445 milimikronach wynosi 20 8.Spektrum antybiotyczne onkóstatyny K przed¬ stawia tabela 1.Tabela 1.Szczepy wzorcowe Najmniejsze ste¬ zenie onkóstatyny K powodujace za¬ hamowanie wzro¬ stu szczepu wzor¬ cowego (mcg/ml) Micrococcus pyogenes var. aureus 209-P 0,2 Micrococcus pyogenes var. albus 0,2 Sarcina lutea 0,05 Bacillus circulans 8144 0,2 Bacillus brevis 10068 0,45 Bacillus subtilis 6633 0,01 Escherichia coli 308 125,0 Proteus vulgaris OX19 125,0 Pseudomonas aeruginosa 62,0 Candida albicans 102 125,0 Mycobacterium607 7.5 Mycobacterium smegmatis 15,0 Mycobacterium phlei 3,7 Penicillium chrysogenum Q 176 62,0 Aspergillus niger 31,0 Badania przeprowadzone na myszach z 5 róznymi nowotworami wykazaly, ze dobowa dawka onkóstatyny K wynoszaca 100 mcg/kg dziala hamujaco na rozwój raka Ehrlicha oraz czerniaka (melanoma). Podobne dzialanie wyka¬ zuja dawki 50 i 25 mcg/kg wobec miesaka Crockera 180. Onkostatyczne dzialanie onkó¬ statyny K zanotowano równiez w doswiadcze¬ niu z miesakiem SA 37.LD50 onkóstatyny K w stosunku do myszy przy podaniu dootrzewnowym wynosi 745 mcg/kg, po dodaniu dozylnym 1 mg/kg. — 4 — PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania nowego antybiotyku, onkostatyny K, znamienny tym, ze prowadzi sie biosynteze metoda fermentacji glebino¬ wej szczepu Streptomyces species INA 1-79/58, otrzymanego na drodze selekcji na¬ turalnej szczepu Streptomyces melanochro- mogenes 1779, w temperaturze ponizej 30°C na pozywce zawierajacej przyswajalny we¬ giel, azot i sole mineralne, do czasu wytwo¬ rzenia przez ten szczep w brzeczce anty¬ biotyku, który izoluje sie metoda ekstrakcji i adsorpcji oraz eluacji.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze z brzeczki oddziela sie grzybnie, na przy¬ klad przez odsaczenie lub odwirowanie, eks¬ trahuje antybiotyk z przesaczu dwukrotnie benzenem lub innym rozpuszczalnikiem' nie mieszajacym sie z woda, a antybiotyk wy¬ tworzony w grzybni ekstrahuje z niej kil¬ kakrotnie acetonem lub innym odpowiednim rozpuszczalnikiem, po czym odparowuje ten rozpuszczalnik, a pozostalosc ekstrahuje ben¬ zenem, a nastepnie polaczone zageszczone wyciagi benzenowe z brzeczki i z grzybni przepuszcza sie przez kolumne z tlenkiem glinowym i eluuje acetonem, odparowuje eluaty w prózni w temperaturze 25 — 35°C, a uzyskana sucha pozostalosc rekrystalizuje z goracego octanu etylu lub innego, odpo¬ wiedniego rozpuszczalnika organicznego, a krystaliczny osad po odsaczeniu przemywa woda lodowata i suszy w prózni w tempe¬ raturze pokojowej. Instytut Antybiotyków Zastepca: mgr inz. Jerzy Hanke rzecznik patentowy PL