PL43565B1 - - Google Patents

Description

^?M-EA £ $ V Opublikowano dnia 5 lipca 1963 r.(JM** 9^ POLSKIEJ RZECZYPOSPOLITEJ LUDOWEJ OPIS PATENTOWY Nr 43565 .Wlodzimierz Kurylomicz Warszawa, Polska Franciszek Ulak Warszawa, Polska KI. 6 b, 16/03 Sposób otrzymywania oksytetracykliny Patent trwa od dnia 24 listopada 1959 r.Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania oksytetracykliny, antybiotyku o szerokim zakre¬ sie dzialania przeciwbakteryjnego, droga pod- powierzchniowej, tlenowej hodowli nieopisanego dotychczas szczepu promieniowca Actinomyces varsoviensis sp. nov. oraz wydzielania oksyte¬ tracykliny z cieczy fermentacyjnej.Stwierdzono, ze ten nowy gatunek promieniow¬ ca wytwarza w cieklym podlozu o odpowiednim skladzie wyzej wspomniany antybiotyk —oksy¬ tetracyklina. Actinomyces varsoviensis sp. nov. zostal sklasyfikowany wedlug metod podanych w odpowiednich kluczach (N. A. Krasilnikow: Opnedielitiel bakterii i aktincmycetow, Izd. AJc.Nauk SSSR, Moskwa, 1949 oraz Bergey's Manual' of Determinative Bacteriology, Williams, Wilkins, Baltimore, 1948), jako drobnoustrój nalezacy do rodzaju Actinomyces (Krasilnikow) wzglednie Sfreptomyces (Henrici, Waksman w Bergey's Ma¬ nual et Determinative Bacterioiogy).Antybiotyk — otayte^racykline wytwarzaja licz¬ ne gatunki promieniowców. Sposób otrzymy¬ wania oksytetracykliny zostal wielekrotnie opi¬ sany zarówno w pismiennictwie naukowym, jak i patentowym. Np. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki (nr 2.516.080), w nie¬ mieckim opisie patentowym (nr 862.647), w bry¬ tyjskim opisie patentowym (nr 648.417) podany jest sposób otrzymywania oksytetracykliny na •drodze biosyntezy przy uzyciu szczepu promie¬ niowca Streptomyces rimosus, zblizonego swymi cechami hodowlanymi i morfologicznymi do zna¬ nego, opisanego w r. 1894 gatunku Streptomyces altous (Rossi-Doria T.: Ann. Ist. Ig. Sper. Roma N. S., 1894, 1, 399) Waksman, Henrici. W brytyj¬ skim opisie patentowym (nr 713.795) oraz w ka¬ nadyjskim opisie patentowym (nr 520.836) poda¬ no sposób otrzymywania oksytetracykliny z cie¬ czy fermentacyjnej promieniowca nazwanego Streptomyces platensis. W szwajcarskim opisie patentowym rzania oksytetracykliny przez nowy gatunek pro¬ mieniowca, Streptomyces yendiargensis sp, nov.Równiez i w .francuskich publikacjach nauko¬ wych, opisano nowy gatunek promieniowca, wy¬ twarzajacego oksytetracykline. Gatunkowi temu nadano nazwe Streptomyces armillatus (Mancy- -Courtillet, Pinert-Sindico: Ann. Inst. Pasteur, 1054,87,580). W pracy S. A. Waksmana i H. A.Lechevaliera: „Actinomycetes and their antibio- tics", Williams, Wilkins, Baltimore 1953, przy opisie gatunku Streptomyces griseoflavus (Krain- sky) Waksman, Henrici (Krainsky A.: Zbl. f.Bakt. II, 1914, 41, 639) autorzy wymieniaja jego silnie antagonistyczne wlasciwosci i stwierdzaja, ze szczep ten jest producentem oksytetracykliny i rimocydyny. O izolowaniu szczepów licznych promieniowców wytwarzajacych oksytetracykline donosi równiez praca wloska (Silvestri: R. C. Ist.Sup Sanita, Roma, 1955, 18, 1227). Obie przyto¬ czone prace, zwlaszcza praca wloska, zwracaja uwage na pewne podobienstwo, jakie zachodzi miedzy szczepem Streptomyces rimosus i zna¬ nym gatunkiem promieniowca Streptomyces griseoflavus.W trakcie poszukiwan antagonistycznych pro¬ mieniowców w Polsce izolowano szczep promie¬ niowca, który swymi cechami morfologicznymi, hodowlanymi i fizjologicznymi wyraznie sie rózni od szczepów dotychczas opisanych w pismiennic¬ twie patentowym i naukowym. Szczep ten pod¬ dano bardzo dokladnym badaniom taksonomicz- Tablica 1 nym, stosujac wszystkie wspólczesne testy uzywa¬ ne do identyfikacji gatunków (species), rodzaju (genus) promieniowców (Actinomyces, tSrepto- myces). Przekonano siie, ze badany szczep nalezy do nowego, nie opisanego dotychczas gatunku, dla którego zaproponowano nazwe Actinomyces var- soviensis sp. nov. Zróznicowanie przeprowadzono z nastepujacymi gatunkami promieniowców, wy¬ twarzajacymi oksytetracykline: Streptomyces gri- secflavus, Streptomyces rimosus, Streptomyces armillatus, Streptomyces platensis i Streptomy¬ ces vendargensis.Ponizsza tablica 1 podaje cechy hodowlane i niektóre cechy fizjologiczne szczepu Actinomy¬ ces varsoviensis sp. nov. oraz szczepu Strepto¬ myces rimosus 2234. Zaznacza sie, ze w celu prze¬ prowadzenia badan taksonomicznych Actinomy¬ ces vairsoviensis sp. nov., w stosowanych testach poslugiwano sie nie tylko podlozami „natural¬ nymi", takimi jak ziemniak, agar ziemniaczany etc., lecz uzyto równez podlozy dobrze zdefinio¬ wanych czyli tzw. „syntetycznych4*. Actinomyces varsoviensis sp. nov. rózni sie wybitnie od ga¬ tunku Streptomyces rimosus. którego szczep wzorcowy uzyskano z kilku kolekcji zagranicz¬ nych, a mianowicie: American Type Culture Collection i National Collection of Industrial Bacteria, Teddzngton, Anglia oraz Nothern Re- gional Research Laboratory, Peoria, 111.Act 1 Podloze 1 Agair asparaginowy z glukoza (plytki) 1 Agar Sabouraud z maltoza 1 Agar Czapek-Doxa 1 z sacharoza 1 Agar z dekstryna 1 v Ziemniak 1 Agar ziemniaczany 1 z glukoza 1 Agar z platkami owsianymi 1 Podloze tryptoncwe stale 1 Podloze cytrynianowe 1 Podloze Lindenbeina inomyces varsoviens.is sp.Stopien wzrostu +++ 120 +++ 120 +++ 120 48—72 +++ 72 +++ 72 +++ 72 +++ 48 +++ 72 i +++ 72 Grzybnia powietrzna biala biala biala biala biala biala biala biala biala biala nov.Grzybnia, podstawowa bezbarwna bezbarwna bezbarwna bezbarwna lniana <12 B-2) bezbarwna bezbarwna bezbarwna bezbarwna bezbarwna Pigment 1 rozpuszczalny I brak 1 koloru siarki 1 (12 L-4) 1 brak 1 brak 1 brak I brak 1 brak 1 brak 1 brak J brak 1 - 2 -^ ..^^-M.,- <---- ,~ ¦-%¦* ^*+J* 2^^^S__^^± 1 Podloze 1 Podloze tryptonowe plynne I Podloze Emersona plynne syntetyczny z peptonem I BuAffi mi$ny I Agar ze skrobia 1 Mleko z lakmusem 1 Zelatyna I Agar z krória 1 Agar z azotanami *^^^^^^^^^^^^ Stopien p wzrostu +++ 48 4$—72 +++ 72 24—48 +++ 120 72 72 72 ++/+++ 4*j—72 | ^^^^^^^*«*l^j Grzybnia- powietrzna ^?^ss^jMSSiui^iiij^^si i Gr?#Afa \ podstawowa biala bezbarwna wydziela .siarkowodór biala biala biala biala bezbarwna bez&arwna kremowa bezbarwna ?*» , ,l * * y ^»^n4*H **¦* Pigment 1 Rozpuszczalny 1 brak 1 brak 1 ciemnozólty 1 (12 1-5) 1 brak 1 brak 1 alkalizuje, scina 1 ni e u p l y n n i a (po dluzszym czasie 1 uplynnls czesciowo) 1 nie wywoluje hemolizy krwinek 1 biala* | bezbarwna 1 koloru pirytu (Y) 1 rnie r&fufruje azotanów | (12 1-3)' 1 1 Sfreptomyces rmSbsus NJf.S.L. 2234 ' | I Agar asparaginowy z glukoza; m i Agar Sabouraud z maltaza i I z sacharoza 1 Agar z dekstryna I Ziemniak I Agar ziemniaczany 1 z glukoza I Agar z platkami owsianymi I Podloze tryptonowe stale I Podloze cyitryttlialnowe 1 Podloze Lindenbeina |! Podloze tryptonowe plynne 1 Podloze Emersona 1, Agar syntetyczny z peptbfhem L Bulion miesny 1 Agar ze skrobia. 1 Mleko z lakmusem 1 Zelatyna 1 A£istf z krwitf 1' Agar z azol^nami ++ 48—72 +++ 12ft ++.+ 120 ++ 72—06 ++"+ 72 +++ 72 +++ 120 +++ 120 4+ 120 , 120 +++ 48 48—72 24-^8 24—48 ++ 96 24—72 48 48 ++ 1 48 brak brak brak brak biala braK brak brak bratf brak bezowa bazantowa (13 1^12) bezbarwna jasnobrazowa (13 D-4) orzech Tacowy (13 J-9) bezbarwna zielonozólta (12 D-2) zóltozielona 02 ^-2) jasnozol& (12 E-5) oizech laskowy cytrynowy (T) \ (10 J-2) 1 siena , 1 (13 L.-1Ó) 1 brak 1 braz peruwianski 1 (13 I10) I bazantÓwy 1 (13 L-12) I orzech lalkowy I <13 J-#) - Isabelia 1 (13 K-7) 1 oliwkowy I (12 L-2) 1 brak 1 antyczne zloto I (12 L-2) I nie Wydziwia siarkowodoru I biala brak brak brak ZStftwA bezbarwna bezbarwna bezbarwna wierzbowa (12.L-6) 1 brak 1 Isabelia I (13 £-7) 1 brak I tenis I (12 Lr-6) I mt i^btf^rzaje I caBwwflSe uplymiia 1 w^woluW fmtóm krWinek ] biató f jMHfttf^a 1 tenis 1 p m S-S)1. 1 (12 1^6) 1 redukuje azotany do azotynów 1W.tablicy 1: ++ oznacza sredni stopien wzrostu. -|-++ oznacza obfity stopien wzrostu.Liczby oznaczaja godziny hcdowli, w których stwierdzono oznaczony sto¬ pien wzrostu. Barwy oznaczono we¬ dlug ,.dictionary of cclor" Maerza i Paula, Mc Graw-Hill, New York, 1950.Ponizej podana jest tablica porównawcza mie- mosus i streptomyces albus dzy actinomyces varsoviensis, streptomyces ri- Tablica 2 1 x^ ctrnomyces 1 varsoviansis 1 1 Grzybnia powietrzna 1 skapa f Grzybnia powietrzna 1 biala [ Wyglad kolonii 1 i hodowli gladki i Ziemniak: grzybnia 1 podstawowa koloru 1 lnianego 1 : Mleko: koagulacja, 1 peptonizacja 1 Zelatyna: nie uplynnia 1 lub po dluzszym czasie 1 czesciowe uplynnienie 1 Azotany: nie redukuje 1 co azotynów 1 Skrobia: brak hydrolizy H2S w podlozu trypto.no- 1 wym: nie wydziela 1 Krwinki czerwone: 1 nie hemolizuje 1 Wytwarza oksytetra- 1 cykline Streptomyces rimosus Grzybnia powietrzna skapa Grzybnia powietrzna nie calkiem biala Charakterystyczny wyglad kolonii i hodowli Ziemniak: grzybnia podstawowa, zólta Mleko: hydroliza, peptonizacja Zelatyna: nie calkowite uplynnienie Azotany: redukcja do azotynów Skrobia: lekka hydroliza HjS w podlozu tryptoo- nowym: nie wydziela1) Krwinki czerwone: hemolizuje*) Wytwarza oksytetracy- kline Streptomyces albus 1 (Rossi Doria amend. j Krainsky) 1 Waksman, Henrici 1 Grzybnia powietrzna J bogata 1 Grzybnia powietrzna I biala 1 Wyglad kolonii nie I charakterystyczny I Ziemniak: kolonie biale 1 Mleko: koagulacja^ 1 peptonizacja 1 Zelatyna: intensywne 8 uplynnienie 1 Azotany: redukcja do 1 azotynów 1 Skrobia: hydroliza lub | ibrak hydrolizy J — i — 1 Wytwarza aktynomycyne. 1 endomycyne, tiafoityne 1 Objasnienie: Kreska oznacza brak danych; cyframi 1) i 2) oznaczono dane dla szczepu Streptomyces rimosus N.R.R.L. 2234. Inne dane dotycza¬ ce S. albus i S. rimosus. pochodza z niemieckiego opisu patentowego nr 862.047 oraz z publikacji Ber- gey^s Manual of Determinative Biacteriology Williama Wilkirts, Baltimore, 1948. - 4 -W tablicy 3 zestawiono dane odnoszace sie do szczepu Streptomyces armillatus, a uzyskane na podstawie opisu zawartego w pracy Mancy- Objasnienie: stopien wzrostu c bardzo slaby, -|- (obfity).Actinomyces varsoviensis sp. nov. wykorzystuje nastepujace zródla wegla: fruktoze, glukoze, ga- laktoze, mannoze, trehaloze, glicerol, mannitol, toMrsatynian sodu. Slabo wykorzystywane sa: ra- finoza, sacharoza, laktoza, inozytol oraz octan sodowy. Actinomyces varsoviensis nie wykorzy¬ stuje r ramnozy, maltozy, dulcytolu i skrobii. o -CourtiUet D. i Piimert-Sindico S : „Une nóuvelle a espeee de Streptomyces: Sti'eptomyces armilla¬ tus", Ann. Inst. Pasteur, 1954, 87, 580.Tablica 3 - slaby, +-(- sredni, +++ dobry do b. dobry i Z podloza „syntetycznego" Streptomyces ar¬ millatus wykorzystuje nastepujace zródla wegJa: , glukoze, galaktoze, mannoze, glicerol, erytryt.Slabiej wykorzystywane sa: arabinoza, rafinoza, i mannitol, octan sodowy, cytrynian sodowy i skrobia. Streptomyces armillatus nie wykorzy¬ stuje nastepujacych zródel wegla: ksyiloey, ram¬ nozy, lewulozy, sachairozy, maltozy, laktozy, sor- bitolu, dulcytolu, inozytolu i winianu sodowego.Actinomyces varsoviensis sp. nov. 1 Podloze 1 Agar asparaginowy z glukoza | Agar Czapek-Doxa z sacharoza 1 Podloze z glukoza i peptonem 1 Podloze Emerscna 1 Ziemniak 1 Podloze ze skrobia 1 Podloze z azotanami 1 Zelatyna 1 Mleko w temperaturze 26°C 1 Agar asparaginowy z glukoza 1 Agar Czapek-Doxa z sacharoza 1 Pcdloze z glukoza i peptonem 1 Podloze Emersona 1 Ziemniak 1 Podloze ze skrobia I Podloze z azotanami 1 Zelatyna 1 Mleko w temp. 26°C Stopien wzrostu +++ +++ +++ ++/+++ ^+++ +++ ++/+++ +++ +++ Streptomyce +++ + +++ +++ ++ + + + + ++ Grzybnia powietrzna biala biala biala biala biala biala Grzybnia podstawowa bezbarwna bezbarwna tiezbarwna bezbarwna lniana (PI 12, B-2) bezbarwna Pigment 1 rozpuszczalny brak brak ciemnozólty (PI 12, 1-5) brak brak brak nie redukuje azotanów do azotynów nie uplynnia zelatyny, po dluzszym czasie czesciowo uplynnia koaguluje, peptoniziuje. zakwasza is armillatus slabo rozw. biala brak slabo rozw. biala slabo iozw slabo rozw. szarozóltawa, bezowa bezbarwna szarozóltawa, gladka zóltoszara, gladka szarozóltawa, gladka brak brak brak bladorózowy przechodzacy w bladobrazowy brak nie hydrolizuje skrobii nie redukuje azotanów do azotynów czesciowe uplynnienie po 40 dniach | koaguluje, p?eptonizuje, zakwasza - 5 -Cechy fizjologiczne szczepu Actinomyces var- soviensis,. odnoszace sie do je^o zdolnosci przy¬ swajania zródel wegla z podlozy „syntetycznych" (met. Pridhama-Gottlieba) przedstawia tablica 4.Tablica 4 Wykorzystanie zródel wegla z agaru „syntetycznego" przez A. varsoviensis, S. armillatus i S. rimosus: 1 Zródlo wegla 1 Glukcza 1 Galaktoza 1 Mawnoza 1 Fruktoza 1 Maltoza 1 Sacharoza 1 Rafinoza 1 Ramnoza 1 Trehaloza ¦ Skrobia 1 Glicerol 1 Mannitol i Duleytol 1 Inozytol 1 Bursztynian sodu 1 Octan sodu Actinomyces varsoviensis sp. nov.+++ +++ +++ +++ ++ — + + — +++ — +++ +++ — • +++ +++ Streptomyces armillatus +++ +++ +++ • — — — ++ — — ++ +++ ++ — — • ++ Streptomyces j rimosus 2234 I +++ i +++ j ++ +++ ++ 1 + 1 + I ++ 1 - 1 ++ ++ +++ ++ 1 - j | ++ ++ 1 Objasnienie: znaki +, +, ++, -f++ oznaczaja stopien wykorzystania zródla we¬ gla, okreslony stopien wzrostu ba¬ danego szczepu. — oznacza brak wzrostu . oznaczenia nie wykonano Dane dotyczace S. armillatus, S. rimosus i S. griseoflavus pochodza z pracy Mancy-Cour- tillet D. i Pinnert-Sindico S. (Ann. Inst. Pasteur, 1854, 87, 580). Dane dotyczace Actinomyces var- Soviensis sp. nov. wskazuja na to, ze szczep ten jest zblizony niektórymi swymi cechami do szczepu Streptomyces armillatus (brak redukcji aizotanów do azotynów, brak hydrolitycznych wlasciwosci dla skrobii). Od szczepu tego rózni sie zachowaniem na zelatynie i charakterem wzrostu na niektórych podlozach, jak to wynika z danych zawartych w tablicy5. » Na podstawie przytoczonych danych szczep; Actinomyces varsoviemsis sp. nov. rózni sie wy¬ bitnie od szczepów Streptomyces rimosus i Strep¬ tomyces griseoflavus.Tablica 5 1 Podloze 1 Podloze 1 syntez 1 tyczne 1 Ziemniak 1 Zelatyna 1 Mleko w 1 temp. 1 26°C i Podloze | Emer- j sona 1 \ l 1 Azotany 1 Skrobia Actinomyces varsoviensis slaby wzrost, brak pigmentu grzybnia podsta¬ wowa, barwy lnianej, lekko pomarszczona, brak pigmentu jplynnienie cze¬ sciowe po dluz- sz3m czasie alkalizuje, scina, peptonizuje, za¬ kwasza grzybnia podsta¬ wowa, bezbarw¬ na, gladka, pig¬ mentu brak iub bladozólty brak redukcji den azotynów brak hydrolizy Streptomyces armillatus slaby wzrost, brak pigmentu grzybnia podsta¬ wowa, szarozól- ta, gladka, brak pigmentu uplynnienie po¬ wolne, pigment braz. rózowy sciecie, peptoniza- cja, zakwaszenie Streptomyces rimosus brak wzrostu grzybnia podsta¬ wowa, brunat¬ na, pomarszczcH na, pigment bla¬ dozólty uplynnienie cze¬ sciowe, brak pigmentu nie zmienia grzybnia podsta- 1 grzybnia podsta¬ wowa, szarozól- wowa, pomaran- tawa, gladka, 1 czowa, popeka- pigment blado- na, pigment rózowy 1 zólto-braz. brak redukcji do azotynów brak hydrolizy redukcja do azo¬ tynów lekka hydroliza Streptomyces 1 griseoflavus grzybnia podsta- 1 wowa, pomaran-l czowa lub brarl zowo-rózowa, I pigment blado¬ zólty grzybnia podsta- 1 wowa, typu po-! rostu, kremowa lub brazowo- i -rózowa, brak I pigmentu | uplynnienie sla- I be, pigment I bladozóltawy szybka peptoniza-] cja bez koagu- 1 lacji. 1 grzybnia podstar 1 wowa, typu po^' rostu, kremowa] lub brunatna, j pigment zólta- 1 wy. 1 redukcja do azo- 1 tynów 1 ograniczona hj- 1 droliza 1 Na podstawie przytoczonych danych dotycza¬ cych charakterystyki hodowli tizech porówny¬ wanych szczepów promieniowców, mozna stwier¬ dzic zasadnicze róznice miedzy Actiniomyces var- soviensis i dwoma pozostalymi szczepami (patrz tablica 6 i 7). W przytoczonym porównaniu szczep Actinomyces varsoviensis sp. nov. latwiej wy¬ twarza grzybnie powietrzna, niz dwa porówr.y- wane szczepy, cechuje sie raczej bezbarwna lub lekko zólta grzybnia podstawowa oraz wytwa¬ rza skape ilosci zóltego pigmentu dyfundujacego do podloza. W rzeczywistosci róznice miedzy po¬ równywanymi szczepami, zwlaszcza miedzy Ac¬ tinomyces varsoviensis i Streptomyces rimosus sa bardziej wyrazne i dotycza cech fizjologicz¬ nych. Róznice te wskazuje tablica 7.Dane dotyczace Streptomyces vendargensis i Streptomyces rimosus pochodza z szwajcarskie¬ go opisu patentowego nr 331.998. Opisy szczepów tam podanych nie sa wystarczajace, gdyz nie wlaczono do nich charakterystyki podstawowych cech fizjologicznych. Zróznicowanie miedzy S. vendargensis i S. rimosus oparto w przyltoczo- nym opisie patentowym glównie na tym, ze S. vendargensis wytwarza obok oksytetracykliny jeszcze inny antybiotyk „vengicid", podczas gdy S. rimosus obok oksytetracykliny wytwarza drugi adtybdotyk ,,rimociddn". Obydwa anty¬ biotyki „yengicid" i „rimoeidin" róznia sie od siebie cechami fizykochemicznymi i biologicz¬ nymi.Tablica 6 Actinomyces varsoviensis sp. nov. 1 Podloze 1 Agar z maka owsiana 1 Agar Emersona 1 Agar Satwoiraiid* 1 Agar ziemniaczany 1 Agar z cytrynianem sodu 1 Agar z glukoza i azotanami 1 Ziemniak Grzybnia powietrzna biala biala biala biala biala biala biala biala Grzybnia podstawowa bezbarwna bezbarwna bezbarwna bezbarwna bezbarwna bezbarwna lniana (12 B-2) bezbarwna Pigment 1 lozpuszczalny 1 brak i brak 1 i koloru siarki 1 1 (12 Lr-4) 1 brak 1 brak 1 koloru pirytu 1 (12 L-3) 1 brak 1 brak 1 1 Streptomyces vendargensis 1 1 Podloze 1 Agar z maka owsiana 1 Agar Emersona 1 Agar Sabouraud 1 Agar ziemniaczany 1 Agar z cytrynianem sodu 1 Agar z glukoza i azotanami 1 Ziemniak 1 Agar ze skrobia.Grzybnia powietrzna brak biala biala brak brak brak . biala biala Grzybnia podstawowa jasnozólta (11 F-4) jasnobrazowa (13 D-5) zóltawa (12 E-3) brazowa biala (2 A-l) iasnozólta (10 B-l) zólta lub brazowa! (12 D-5), (13 L-7)| jasna, bezbarwna' Pigment 1 rozpuszczalny 1 brak 1 brak 1 brak 1 brak 1 brak 1 brak 1 brak 1 brak 1Tablica ^ 1 Podloze J Agar z maka 1 owsiana m 1 1 Agar Emersona i Agar Sabouraud ] I A.gar ziemniaczany 1 1 Agar z cytrynia- 1 nem sodu 1 1 1 Agar z glukoza 1 i azotanami 1 Ziemniak 1 1 i i I Agar ze skrobia Actinomyces varsoviensis A B P A B P A B P A B P A B P A B P A B A B P biala bezbarwna Drak biala jasnohrazowa (13 T-5) brak biala bezbarwna koloru siarki (12 L-4) biala bezbarwna brak biala bezbarwna brak biala bezbarwna koloru pirytu 112 Lr-3) biala lniana (12 B-2) biala bezbarwna brak 1 Streptomyces vendargensis A B P A.B P A B P A B P A B P A B P A B A B P brak jasnozólta (11 F-4) brak biala jasnobrazowa (U D^5) brak biala zóltawa (12 E-3) brak brak brazowa brak brak biala (2 A-l) brak biala jasnozólta (10 B-l) brak biala zólta lub brazowa (12 D-5, 13 L-7) biala jasna, bezbarwna brak Streptomyces 1 rimosus I A B P B P A B P A B P A B P A B P A B A B P biala 1 ciemnobrazowa 1 (8 C-12) 1 ciemny 1 biala 1 ciemnobrazowa 1 (15 A-12) 1 ciemny 1 zólto-biala 1 czarno-brazowa 1 ciemny 1 biala 1 brazowa 1 do fioletowej 1 brak 1 brak ¦ szarozielona 1 (3 A-l; 13 J-5) | brak 1 brak 1 brazowa (13 K-9) 1 zólty 1 biala 1 zólta (12 E-5) 1 biala 1 brazowa I zólto-brazowy I -* Objasnienie: A — grzybniapowietrzna P — pigment rozpuszczalny w pod- B — grzybnia podstawowa lozu - 9 - /r Do nowo opisanego sposobu wytwarzania oksy- i tetracykliny nadaja sie obok Actinomyces varso- I viensis sp. nov. równiez niektóre jego „natural- \ ne" mutanty oraz mutanty „sztuczne5' induko¬ wane za pomoca znanych, silnie dzialajacych mutagenów, jak promienie nadfioletowe, pro¬ mienie Roentgena, iperyt azotowy i inne. Mu¬ tanty te róznia sie niekiedy znacznie od uprzed¬ nio opisanego szczepu macierzystego Actinomy¬ ces varsoviensis sp, nov. Najistotniejsze róznice odnosza sie do zabarwienia grzybni podstawo¬ wej, pigmentu rozpuszczalnego w podlozu, spo¬ sobów wykorzystania zródel wegJa i azotu z pod¬ lozy „syntetycznych", a przede wszystkim rózni¬ ce te odnosza sie do aktywnosci antybiotycznej.Do selekcji „naturalnych" i „sztucznych" mu¬ tantów zastosowano po raz pierwszy wsród pro¬ mieniowców sposób charakterystyki szczepu, któ¬ ry nazwano „wzorem populacyjnym". Pozwala on nie tylko na dokladny opis populacji danego mutanta, lecz równiez na próby odnalezienia Izwiazku miedzy cechami morfologicznymi popu¬ lacji i jej aktywnoscia antybiotyczna. Sposób ten w znacznym stopniu ulatwia selekcje wysoko wydajnych pod wzgledem antybiotycznym szcze¬ pów w przypadku Actinomyces varsoviensis sp. nov.Zastosowano tez nowa i dotychczas nieopisana metode szybkiej selekcji wysoko wydajnych pod wzgledem antybiotycznym kolonii za pomoca me¬ tody „dwu bloków agarowych o róznej sredni¬ cy" (o stosunku 1:2 lub 1:4), pozwalajaca na po¬ równawcze, ilosciowe okreslenie antybiotyku — oksytetracykliny, wytwarzanej przez badany mu¬ tant. Jest to prosta, tania i szybka metoda po¬ równawcza, pozwalajaca w ciagu 18 godzin na wyselekcjonowanie z populacji mutantów o wy¬ dajnosci wyzszej od tej, jaka wykazuje macie¬ rzysty szczep Actinomyces varsoviensis sp. nov.Szczególowy opis obydwu metod selekcji podano na jednym z przykladów, dotyczacych badan nad zmiennoscia szczepu Streptomyces rimosus 8229, w Biuletynie Informacyjnym Instytutu Antybio¬ tyków, Warszawa- 1959, 2, zesz. 6.Na podstawie przytoczonych danych porów¬ nawczych ze szczepami promieniowców: Strepto¬ myces albus, S. griseoflavus. S. rimosus^ S. ar- miHatus, S. plaitensis i S. vendaigensis, stwier¬ dzono, ze A. vairsoviensis sp. nov. nie jest iden¬ tyczny z zadnym z wymienionych gatunków.Actinomyces varsoviensis sp. nov. jest nowym, dotychczas nieopisanym gatunkiem promieniow¬ ca, wytwarzajacym oksytetracykline.Dla otrzymania oksytetracykliny szczep Ac¬ tinomyces varsoviensds sp. nov. hoduje sie pod- powierzchniowo w cieklych podlozach na trze- sawce, w zamknietych naczyniach zabezpiecza¬ jacych hodowle od zanieczyszczenia innymi drob¬ noustrojami, a równoczesnie zapewniajacych odpowiedni dostep jalowego powietrza lub tlenu.Nizej podano warunki, w jakich odbywa sie hodowla szczepu Actinomyces varsoviensis sp. nov. korzystna dla biosyntezy oksytetracykliny i dotyczace cyklu biosyntezy, podlozy, tempera¬ tury hodowli, wlasciwej fermentacji i czasu jej trwania, warunków napowietrzania i innych.Szczep Actinomyces varsoviensis sp. noV. prze¬ chowuje sie na odpowiednim podlozu sporula- cyjnym, albo w postaci zliofilizowanej.Szczepy Actinomcyes vairsoviensis sp nov. na agarach z podlozem sporulacyjnym mozna prze¬ chowywac bez zmian okolo 6 tygodni w zamra¬ zarce (—20°C) i chlodni (+4°C) oraz okolo 3—6 miesiecy w temperaturze pokojowej (okolo -f-18°C). Przy przechowywaniu w temperaturze pokojowej, w celu unikniecia ewentualnych nie¬ korzystnych zmian, jakie moga zachodzic w ho¬ dowli, wlewa sie do probówek z agarem skos¬ nym kilka ml cieklej, wyjalowionej parafiny, która powinna pokryc cala powierzchnie hodowli.Actinomyces varsoviensis sp. nov. mozna lio¬ filizowac w odpowiednim nosniku bialkowym, weglowodanowym, w roztworach aminokwasów lut? niektórych kwasów organicznyeh, czesto z dodatkiem substancji „ochronnej" dla unik¬ niecia strat zywotnosci przy przywracaniu zlio- filizowanego materialu do stanu cieklego. Stwier¬ dzono, ze najlepszym nosnikiem dla zarodni¬ ków Actinomyces varsoviensis jest mieszanina 19% roztworu sacharozy i 1% roztworu zelatyny.Wilgotnosc koncowa zliofilizowanego materialu powinna sie wahac w granicach od 0,2 — 1%, Ampulki lub flaszki, w których przechowuje sie liofilizowane zarodniki. Actinomyces varsovien- sis sp. nov. powinny byc szczelnie zamkniete (za¬ topione) pod zmniejszonym cisnieniem, wyno¬ szacym od 30 do 100|ui Hg lub powinny zostac na¬ pelnione azotem.Zarodniki szczepu Actinomyces varsoviensis sp. nov. mozna tez przechowywac w mieszaninie ziemi z piaskiem w temperaturze pokojowej (okolo +18°C) lub w temperaturze chlodni (oko* lo +4°C). Ziemia z piaskiem, do której wprowa¬ dzono zawiesine zarodników moze zostac powoli wysuszona w temperaturze pokojowej, lub wy¬ suszona ze stanu zainrozenia w wysokiej prózn}.Innym wreszcie sposobem przechowywania zarodników szczepów Actinomyces vairsoviensis sp. nov. jest 'przechowywanie ich na uprzednio wyjalowionych i wysuszonych produktach ros- - 10 -linnych, np. na róznego rodzaju kaszach (jagly).Zarodniki;po uprzedniej kilkudniowej inkubacji w odpowiedniej temperaturze (24—26°C) roz¬ mieszczaja sie na calej kulistej powierzchni zia¬ ren roslinnych i moga byc nastepnie zawieszone w wodzie i sluzyc do zaszczepienia plynnego podloza posiewowegoi Wymienione sposoby przechowywania szczepu Actinomyces varsoviensis sp. ncv. zabezpieczaja ten szczep przed zmiennoscia jego cech fizjolo¬ gicznych i wlasciwosci antybiotycznych. . Podloze sporulacyjne dla szczepu Actinomyces Tarsoviensis sp. ncv. moze zawierac obok natu¬ ralnych zródel azotu np. wyciagu ziemniaczane¬ go, wyciagu z otrebów pszenicznych oraz innych wyciagów roslinnych lub zwierzecych, równiez aminokwasy, siarczan amonowy lub azo/tan so¬ dowy. Zródlem wegla moga byc cukry proste lub wielocukry, alkohole wyzsze, meiasa, wyciag slo¬ dowy i inne. Ponad to podloze sporulacyjne mc- ze zawierac dodatek soli mineralnych oraz do¬ datek mikroelementów, np. soli kobaltu w ilosci od 0,1 do 1 mg %. Wreszcie podloze zawiera od 1,5 — 3% agaru.Jako inoculum sluzace do szczepienia podloza posiewowego, sluzyc moze 6—14-diniowa hodo¬ wla Actinomyces varsoviensis sp. nov. w tempe¬ raturze optymalnej 26°C, z której sporzadza sie zawiesine zarodników.Sklad podlozy spekulacyjnych dla Actinomyces Tarsoviensis sp. nov.: Podloze 1 Glukoza 10 g CoCl2 0,0005 g Agar 25 g Wyciag ziemniaczany 1000 ml Wyciag z ziemniaków (otrzymuje sie przez 2—3-gcdzinna ekstrakcje w parze bie¬ zacej, 1 (Czesci wagowej ziemnilaików z 1 czescia wagowa wody pH naturalne) Podloze 2 Wyciag namokowy kukurydzy (50%) Skrobia ziemniaczana (NH4)2S04 KH2PO4 Ca003 Agar Woda destylowana pH 6,6—6,8 4 g 15 g 4 g 2 g 3 g 15 g 1000 ml W biosyntezie oksytetracykliny przez szczep Actinomyces varsoYiensis sp. nov. na skale prze- myslojwa; stosuje sie trójetapowy cykl hodowla¬ ny zlozony z przygotowania wegetatywnego ma¬ terialu posiewowego na trzesawce, przygotowa¬ nia wiekszej objetosci inoculum posiewowegóy wegetatywnego w tanku fermentacyjnym i z wla¬ sciwej fermentacji, podczas której Actinomyces varsoviensis sp. nov. wytwarza antybiotyk — ok- sytetracykline. ' We wszystkich trzech etapach biosyntezy na skale przemyslowa stosuje sie podpowierzchnio- wa hodowle zarówno irajrzesawce, jak i w tan¬ kach fermentacyjnych róznej objetosci. Tanki te powinny byc odpowiedniej budowy, zaopatrzone w urzadzenia pozwalajace na ciagle napowietrza¬ nie hodowli za pomoca jalowego powietrza, mie- sezamie podloza, utrzymywanie stalej, zadanej temperatury oraz w urzadzenia pozwalajace ra kontrole' i rejestracje przebiegu' fermentacji.Urzadzenia te umozliwiaja oznaczanie i utrzy¬ mywanie optymalnego pH podloza, uzupelnienie skladników podloza wyczerpanych w czasie fer¬ mentacji, np. zródel wegla, wprowadzania zwiaz¬ ków pobudzajacych wytwarzanie oksytetracykli¬ ny przez Actinomyces varsoviensis sp. nov., srod¬ ków przeciw pienieniu sie podloza itp.Poszczególne etapy cyklu hodowlanego Actino^ myces varsoviensis sp. nov. przy otrzymynwajniu oksytetracykliny w skali przemyslowej cechuja sie odmiennym skladem i odmiennym pH pozy¬ wek, odmienna temperatura i czasem hodowli oraz odmiennymi warunkami jej napowietrzania.Podloze posiewowe i wlasciwe podloze pro¬ dukcyjne powinno zawierac zródlo azotu orga¬ nicznego lub nieorganicznego, lub zródlo bedace mieszanina uprzednio wymienionych, zródlo we¬ gla, zródlo soli mineralnych, zródio mikroel^ mentów oraz weglan wapniowy.Dla wytworzenia grzybni i antybiotyku oksy¬ tetracykliny, szczep Actinomyces varsoviensis sp. movAS jego „naturalne" lub „sztuczne" mu¬ tanty pokrywaja na ogól swe zapotrzebowanie na sole mineralne i mikroelementy z tzw. „na¬ turalnych" skladników podloza pochodzenia ro¬ slinnego lub zwierzecego, stanowiacych glówne ziódlo azotu w pozywce (np. wyciag namokowy kukurydzy, wyciag miesny itp.).Z najczesciej uzywanych zródel azotu wymie¬ nic nalezy wyciag miesny, pepton, make rybna, drozdze, wyciag drozdzowy, hydrolizat drozdzo¬ wy, kazeine, kwasny hydrolizat kazeiny, kazeine trawiona zaczynem trzustkowym, wyciag namo¬ kowy kukurydzy, make sojowa, wyciagi i hy¬ drolizaty z tej maki, make z orzeszków ziem¬ nych, zmielone orzeszki ziemne, wyciagi i hydro- lizaty z orzeszków ziemnych, make z nasion ba¬ welny, make z nasion slonecznikowych i inne - 11 -naturalne zródla azotu pochodzenia roslinnego i zwierzecego oraz wyciagi, namoki i hydroliza¬ ty z nich sporzadzone. Zamiast lub obok wymie¬ nionych zródel azotu moga byc uzyte, jako sklad¬ niki podloza siarczan amonowy lub azotany. Do¬ datek niektórych z wymienionych zródel azotu np. wyciagu namokowego kukurydzy do pozyw¬ ki, w której glównym zródlem azotu sa zmielone arzesdki ziemne, posiada pobudzajacy wplyw na wytwarzanie oksytetracykliny przez Actiinomyces varsoviensis sp. nov.Sposród zródel wegla mozna uzyc rozpuszczal¬ nych lub nierozpuszczalnych weglowodanów, np. sacharozy, maltozy, glukozy i innych cukrów prostych lub ich mieszaniny, skrobii, maki ziem¬ niaczanej, maki kukurydzianej, wyciagu slodo¬ wego lub mieszaniny z wymienionymi uprzed¬ nio cukrami prostymi. Jako zródla wegla mozna uzyc tez alkoholi wyzszych, jak np. glicerol, manrndtol itp. Dla niektórych „naturalnych" i „sztucznych" mutantów Actinomyces varsovien- sis sp. nov. odpowiednim zródlem wegla okazaly sie oleje roslinne, mp. olej arachidowy, sojowy, slonecznikowy. Procent poszczególnych skladni¬ ków podloza powinien byc dla kazdego mutanta ustalony oddzielnie. Dla cukrów prostych wy¬ nosi on 0,5—5%, dla olejów (jako zródla wegla) 0,5-^3%.Ppnizej podano krótka charakterystyke trój- etapowego cyklu hodowli Actinomyces varsovien- sis sp. nov. prowadzacego do biosyntezy oksyte¬ tracykliny w skali przemyslowej.I etap cyklu fermentacyjnego trwa 24—48 go¬ dzin w zaleznosci od ilosci zarodników Actino¬ myces varsoviensis sp. nov. uzytych do posiewu, od skladu podloza, temperatury hodowli, inten¬ sywnosci napowietrzania hodowli, która z kolei zalezy od typu itrzesaiwki, (liczby wsrtrzasów wzglednie obrotów oraz skoku) wreszcie od ksztaltu naczynia i stosunku objetosci naczynia do objetosci zawartej w nim pozywki.Dla Actinomyces yarsoviensis sp. nov. opty¬ malnymi w I etapie okazaly sie nastepujace wa¬ runki: 2—5% zawiesiny zarodników 1 skosnego agami o podanym uprzednio skladzie; podloze zawierajace wyciag namokowy kukurydzy, ma¬ ke z orzeszków ziemnych, siarczan amonowy, skrobie, chlorek sodowy i weglan wapniowy w odpowiednim stosunku, 80 ml tego podloza umieszcza sie w kolbach Erlenmeyera o pojem¬ nosci 500 ml, zaszczepia zarodnikami, umieszcza na trzasawce obrotowej o 180 obrotach na mi¬ nute, o skoku 3—5 cm i inkubuje w temperar turze 28°C najczesciej przez 24 godziny.Czesto stosuje sie w tym etapie dwa -przesie¬ wy z podloza bardziej ubogiego na podloze za¬ wierajace wiecej zródla wegla.Podloze 3 Ghikoza 10 g Chlorek kobaltowy 0,0006 g Weglan wapniowy 4 g Wyciag z ziemniaków 1000 ml Olej sojowy 5 ml pH naturalne Podloze 4 Wyciag namokowy kukurydzy 5 g Mielone wytloki arachidowe 10 g Maka ziemniaczana 25 g Siarczan amonowy 4 g Clcrek sodowy 5 g Weglan wapniowy 5 g Woda destylowana 1000 ml pH 5,7—5,8 Podloze 5 Wyciag namokowy kukurydzy 7 g Wytloki arachidowe 20 g Maka ziemniaczana 45 g Siarczan amonowy 4 g Weglan wapniowy 7 g Siarczan kobaltowy 0,02 g Woda destylowana 1000 mi pH 6,0—6,2 II etap cyklu hodowlanego szczepu Actinomy¬ ces vairsoviensis sp. nov. trwa równiez od 24 do 48 godzin, w zaleznosci od warunków fermen¬ tacyjnych. W tanku fermentacyjnym 1000-litro- wym zawierajacym okolo 600 1 odpowiedniego podloza, w temperaturze 28°C, czas hodowli wy¬ nosi okolo 30 godzin. Podloze sklada sie z mie¬ szaniny odpowiednich ilosci wyciagu namoko¬ wego kukurydzy, siarczanu amonowego, maki ziemniaczanej, chlorku sodowego /weglanu wap¬ niowego i oleju arachidowego (jako srodka prze¬ ciw pienieniu sie podloza). Objetosc inoculuia wegetatywnego pochodzacego z I etapu hodowli na trzesawce wynosi powyzej 0,05% (od 0,1 do 1%) calkowitej objetosci pozywki posiewowej tanku 1000 L Warunki napowietrzania hodowli: 0,2—0,6 objetosci powietrza na 1 objetosc po¬ zywki na minute. Liczba obrotów mieszadla wy¬ nosic powinna od 200—360 na minute.Podloze 6 Maka z orzeszków ziemnych 20 g Wyciag namokowy kukurydzy 4 g Wyciag slodowy 2 g Siarczan amonowy 2 g Chlorek sodowy 4 g - 12 -Weglan wapniowy Olej sojowy pH naturalne 10 g 5 ml III etaip cyklu hodowli szczepu Actinomyces varsoviensis sp. nov. bedacy wlasciwa fermenta¬ cja, podczas której sizczep ten wytwarza oksy- tetracykline, trwa w zaleznosci od warunków hodowli 140—150 godzin. W tanku fermentacyj¬ nym o objetosci 15.000 1, zawierajacym 10.000 1 pozywki zlozonej z maki arachidowej, wyciaga namokowego kukurydzy, siarczanu amonowego, maki ziemniaczanej, soli kobaltu, weglanu wap¬ niowego i oleju arachidowego (jako srodlka za- ipobiegajacego plenieniu sie pozywki) czas fer¬ mentacji wynosi 144 godziny, w temperaturze 28^, przy napowietrzaniu hodowli wynoszacym 0,6—0,8 objetosci powietrza1 na 1 objetosc po¬ zywki na 1 minute. W tym czasie stwieandza sie maksymalne nagromadzenie oksytetracykliny -w podlozu.Podloze 7 Wyciag namokowy kukurydzy (50%) 5 g Maka ziemniaczana 37,5 g Siarczan amonowy 6 g Chloreksodowy 5 g Woda wodociagowa 1000 ml Olej sojowy 2 g pH 6,0—6,2 Wydajfnosc podloza po 168 godzinach fermen- 1acji przy zastosowaniu szczepu Actinomyces var- soviensis sp. nov.: 282 j w 1 ml; pH 7,1.Podloze 8 Maka z orzeszków ziemnych 20 g Wyciag namokowy kukurydzy (50%) 4 g Siarczan sodowy 2 g Wyciag slodowy 2 g Chlorek sodowy 4 g Weglan wapniowy 10 g Olej sojowy 10 g Woda wodociagowa 1000 ml pH naturalne Podloze 9 Mielone wytloki arachidowe 22,5 g Wyciag namokowy kukurydzy 6,3 g Maka ziemniaczana 40,0 g Siarczan amonowy 3„6 g Siarczan kobaltowy 0,018 g Olej arachidowy 1,8 g Weglan wapniowy 6,3 g Woda wodociagowa 1000 ml pH 6,3—6,5 W 48 i 60 godzinie fermentacji dodaje sie po 2,5 g oleju sojowego. W .podlozu 8-ym olej so¬ jowy jest podobnie, jak wyciag slodowy, zród¬ lem wegla.Wydajnosc podlozy po 120 godzinach fermen¬ tacji w kolbach na trzesawce przy zastosowaniu Actinomyces varsoviensis sp. nov. wynosi 320 ] w 1 ml przy pH — 6,8 dla podloza 8-ego oraz 365 j w 1 iml przy pH 6,9 dila podloza 0.Przy trójetapowej hodowli Actinomyces var- soviensis sp. nov. prowadzacej w III etapie do biosyntezy oksytetracykliny, dwa pierwsze etapy sluza do przygotowania odpowiedniej objetosci wlasciwego pod wzgledem jakosciowym inocu- lum do posiewu pozywki etapu III, tj. do posie- wlasciwego podloza fermentacyjnego.We wszystkich etapach hodowli inoculum jest kontrolowane za pomoca odpowiednich metod cytochemicznych (m. in. barwienie metoda Gra¬ ma— w preparatach zabarwionych ta metoda inoculum posiewowe powinno byc w 90% Gram — dodatnie). Wazna role odgrywa równiez kontrola i utrzymywanie odpowiedniego pH hodowli w po¬ szczególnych etapach hodowli, zwlaszcza pH po- siewanego inoculum i pH w czasie 'wlasciwej fermentacji. W etapie III to jest w okresie wla¬ sciwej fermentacji, w czasie której Actinomy¬ ces varsoviensis sp. nov. wytwarza oksytetracy- kline, pH pozywki powinno sie utrzymywac w nastepujacych granicach: przed zaszczepieniem za pomoca inoculum posiewowego, pochodzacego z tanku 1000 litrowego pil pozywki powinno le¬ zec w granicach 6,2—6f9, w czasie fermentacji inoze wzrosnac do 6,8—8,8 i w koncu fermentacji powinno sie miescic w granicach wartosci wyj¬ sciowych 6,2—6,9.Za pomoca chromatografii bibulowej w ukla¬ dach rozwijajacych octan etylowy nasycony wo¬ da oraz octan buitylowy-Hketon metyloizobuty- lowy-n-butanol w stosunku 5:15:2, stwierdzcno w brzeczkach fermentacyjnych szczepiu Actino¬ myces varsoviensis sp. nov. obecnosc tylko jed¬ nej substancji przeciwbakteryjnej, przy biolo¬ gicznym wywolaniu chromatcgramu za pomoca BaciUus subtilis 6633. Polozenie tej substancji na pasku bibuly odpowiadalo polozeniu strefy zahamowania, wywolanej przez oksytetracykli¬ na Po zakonczeniu fermentacji brzeczki przez Ac¬ tinomyces varsoviensis sp. nov. oksytetracyklina mozna wydzielic z cieczy fermentacyjnej róznymi znanymi sposobami.W celu oddzielenia grzybni zakwasza sie brze¬ czke fermentacyjna do pH 1,8 kwasem szczawiowym przy ciaglym mie^ - 13 -feaniu. W tych granicach pH nastepuje rozklad powstalyich w czasie fermentacji kompleksowych soli oksytetracykliny z wapniem i magnezem i calkowite przejscie antybiotyku do roztworu.W tych warunkach zachodzi równiez czesciowe stracenie substancji bialkowych i innych zanie¬ czyszczen zawartych iw brzeczce, co z kolei ulat¬ wia? Saczenie i powoduje otrzymanie przejrzys¬ tego przesaczu. Po zakwaszeniu brzeczki dodaje sie okolo 6% ziemi okrzemkowej, jako srodka ulatwiajacego saczenie, calosc energicznie miesza sie iprzez 30 minut, po czym grzybnie odsacza sie razem z wytraconym szczawianem walpnia.Z przejrzystego przesaczu antybiotyk mozna wydzielic jedna z ogólnie znanych metod izolacji i oczyszczania antybiotyków.Oksytetracyklina, jako zwiazek amfóteryczny majajcy w swej strukturze grupy kwasowe i za¬ sadowe, posiadajacy stale dysocjacji równe pK 3,5; 7,6; 9,2; wykazuje zdolnosc adsorpcji na wymieniaczach jonowych.Jako wymieniacz jonowy mozna zastosowac ibitionit CBC-3 o srednicy ziarna od 0,2 do 8,5 mm, którym wypelnia sie kolumn^ do wy¬ sokosci 20 cm. Stosunek srednicy kolumny do jej wysokosci wynosi 1:10. Szybkosc przeplywu przesaczu brzeczki przez kolumne jonitowa wy¬ nosi 200 mi/cm2/godz. Wydajnosc adsorpcji anty- Cfiotyku na wymieniaczach jonowych zalezy w duzej mierze od stezenia oksytetracykliny w brzeczce fermentacyjnej i waha sie od 20Ó do 1000 mg na gram wymieniacza.S*o ukonczonej adsorpcji kolumne jonitowa z zaadsorbowanym antybiotykiem przemywa sie kolejno woda destylowana i metanolem i na¬ stepnie eluuje sie zaadsorbowana oksytetracykli- ne metanolem nasyconym HCl. Szybkosc prze¬ plywu kwasnego metanolu wynosi 30 mI/cm2/godz.Wydajmosc procesu eluacji zalezy od stezenia zaadsorbowanego antybiotyku na wymieniaczach jonowych i wynosi 50—97%.Kontrole przebiegu procesni adsorpcja i eluacji prowadzi sie pobierajac próbki z poszczególnych frakcji i oznaczajac w nich zawartosc antybioty¬ ku ogólnie znanymi metodami chemicznymi i bio- Jo|£icznymL Kwasny eluat metanolowy zawierajacy zaad- sorfeowany antybiotyk mozna zobojetnic roztwo¬ rem NaOH, ale sposób ten powoduje dodatkowe wprowadzenie soli nieorganicznych do roztworu, co utrudnia oczyszczanie antybiotyku.Lepiej zastosowac do zobojetniania kwasnego eiuatu ainionit, np. AH-2 Md EÓE-10 o charafc- t&rze zasadowym. Zobojetnienie na aniónicie przebiega z zaadserbowaniem z roztworu jenów chlorowych i z wydzielaniem sie wedy. Zobo¬ jetnienie prowadzi sie tak, aby metanolowy roztwór antybiotyku osiagnal pH = 3,0—3,5.W czasie zobojetniania straty antybiotyku do¬ chodza do 7%. Zobojetniony eluat zageszcza sie w wyparce prózniowej w temperaturze 35—40DC do niewielkiej objetosci i nastepnie wytraca chlorowodorek oksytetracykliny stezonym kwa¬ sem solnym. Wytracony osad po przesaczeniu i przemyciu kolejno metanolem i acetonem su¬ szy sie w temperaturze 40°C. Chlorowodorek oksytetracykliny otrzymuje sie z wydajnoscia okolo 36%. Moc otrzymanego chlorowodorku oksytetracykliny wynosi okolo 670 meg/mg.Wcelu uzyskania produktu o wyzszej mocy mozna go przekrystalizowac ogólnie znanymi me¬ todami (patrz przyklad IV).Przyklad I. 10 1 brzeczki fermentacyjnej Ac- tinomyces varsoviensis sp. nov. zakwasza sie- kwasem szczawiowym do pH 2,0 stale mieszajac.Nastepnie dodaje sie 500 g ziemi okrzemkowej i miesza calosc przez 30 minut, po czym brzecz¬ ke oddziela sie na wirówce. W przypadku met¬ nego przesaczu, saczenie nalezy powtórzyc.Klarowny przesacz o pH = 2,0^2,5 przepusz¬ cza sie przez kolumne wypelniona kationitem CBC-3 z szybkoscia 200 ml/cm2/godz. Po prze¬ puszczeniu (brzeczki, kolumne przemywa sie 500 ml wody destylowanej i nastepnie 250 ml metanolu. Zaadsorbowainy antybiotyk na kaitió- nicie aluuje sie 1500 ml 1 n roztworem HCI w metanolu z szybkoscia przeplywu 30 ml/cm2/ /godz.Zebrany eluat oksytetracykliny zawiera 2,19 g oksytetracykliny tj. 49% pierwotnej ilosci.Kwasny eluat zobojetnia sie za pomoca anio- nitu do pH 3,0—3,5 i nastepnie zageszcza w wy¬ parce prózniowej w temperaturze 35—40°C do objetosci 50 ml.Metanolowy "koncentrat oksytetracykliny za¬ daje sie stezonym kwasem solnym, przy czym nastepuje wysalanie chlorowodorku oksytetra¬ cykliny. Odsaczony osad przemywa sie kolejno metanolem i eterem i nastepnie suszy wT tempe¬ raturze 40CC.Otrzymano 1,6 g oksytetracykliny o mocy 670 meg/mg.Inny sposób izolacji oksytetracykliny z brzecz¬ ki fermentacyjnej Aotinomyces varsoviensis sp. nov. polega na ekstrakcji antybiotyku z fazy wod¬ nej organicznym rozpuszczalnikiem nie miesza¬ jacym sie z woda przy odpowiednim pH, dosto¬ sowanym do uzytego rc^puszczalnika. Jako roz- - 14 -puszczalniki moga byc stosowane alkohole: bu¬ tylowy, amylowy i ich estry oraz mieszaniny alkoholi i ich estrów z niskimi kwasami orga¬ nicznymi. Klarowna brzeczke fermentacyjna za¬ daje sie wsród ciaglego mieszania mieszanina butanolu i octanu buitylewego i nastepnie dodaje sie 20% roztworu NaOH, w celu doprowadzenia do pH = 9,5. W tych warunkach oksytetracykli¬ na przechodzi z fazy wodnej do fazy organicz¬ nej. Po rozdzieleniu faz, faze organiczna zawie¬ rajaca wyekstrahowany antybiotyk zadaje sie {roztworem kwasu siarkowego doprowadzajac pH do 2,0. Antybiotyk przechodzi do fazy wod¬ nej, z której po oddzieleniu fazy organicznej wy- sala sie chlorowodorek oksytetracykliny soia kuchenna przy pH 5,5. Wytracony osad chloro¬ wodorku oksytetracykliny po odsaczeniu prze¬ mywa sie metanolem, a nastepnie eterem.Przyklad II. 10 1 brzeczki fermentacyjnej .Actinomyces varsoviensis sp. nov. zakwasza sie kwasem szczawiowym do pH 1,3 stale mieszajac.Nastepnie dodaje sie 500 g ziemi okrzemkowej i. miesza calosc w ciagu pól ogdziny, po czym odsacza sie grzybnie i wytracony szczawian wap¬ niowy. W przypadku otrzymania metnego lub opalizujacego przesaczu nalezy proces saczenia powtórzyc.Przejrzysty przesacz o pH = l,8 zadaje sie 1000 ml mieszaniny butanolu i octami butylowe- go w stosunku 93:7 i przy stalym mieszaniu do¬ daje do niego w sposób ciagly 20%^owy roztwór NaCH doprowadzajac srodowisko do pH = 9,5.Po ustaleniu (pH calosc miesza sie w ciagu 1 go¬ dziny i nastepnie pozostawia do rozdzielenia sie faz.Wydajnosc z brzeczki do fazy organicznej wy¬ nosi 85%.Oddzielona faze organiczna od fazy wodnej ekstrahuje sie 0,1 n H2SO^ przy stalym miesza- niu i doprowadza sie do pH = 1,8. Po ustaleniu pH calosc mdesza sie w ciagu 1 godziny i na¬ stepnie pozostawia do rozdzielenia faz. Faze wodna zadaje sie krystalicznym NaCl, dopro¬ wadza do pH = 5,5 i pozostawia do wykrystali¬ zowania chlorowodorku oksytetracykliny. Osad odsacza sie, przemywa alkoholem, a nastepnie eterem i soiszy w temperaturze 40°C.Moc otrzymanego chlorowodorku oksytetra¬ cykliny wynosi 640 mog w 1 mg. Wydajnosc pro¬ cesu wynosi 46%, Inny sposób wydzielenia oksytetracykliny z brzeczki pofermentacyjnej polega na wysoleniu antybiotyku scla kuchenna z alkalicznego srodo¬ wiska. Niewielki dodatek butanolu do przesaczu powoduje zwiekszenie czystosci wytraconej okny^ tetracykliny.Odsaczony osad po przemyciu i wysuszeniu rozpuszcza sie w metanolowym roztworze chlor¬ ku wapniowego, z którego wytraca sie osad chlo¬ rowodorku oksytetracykliny stezonym kwasem solnym. Odsaczony osad przemywa sie kolejno metanolem i eterem, a nastepnie suszy w tem¬ peraturze 40°C.Przyklad III. 10 1 brzeczki fermentacyjnej Actinomyces varsoviensis sp. nov. zakwasza sie kwasem szczawiowym do pH = 1,8. Nastepnie dodaje sie 500 g ziemi okrzemkowej i miesza calosc w ciagu 30 minut, po czym brzeczke od- sacza sie na wirówce. W wypadku otrzymania metnego przesaczu, proces saczenia powtarza sie az do uzyskania przejrzystego przesaczu.Do przesaczonej brzeczki dodaje sie przy sta¬ lym mieszaniu 2,5 kg soli kuchennej i 500 mi butanolu, a nastepnie alkalizuje sie roztworem NaOH do pH = 9,0—9,5.Calosc miesza sie w ciagu 1 godziny, a na¬ stepnie pozostawia do rozdzielenia sie faz. W fa¬ zie posredniej na granicy fazy wodnej i orga¬ nicznej zawieszony jest osad kompleksowych soli oksytetracykliny. Po oddzieleniu fazy wod¬ nej, faze organiczna wraz z faza posrednia za¬ daje sie ziemia okrzemkowa i po wymieszaniu odsacza sie osad kompleksowych soli oksyte¬ tracykliny i ziemi okrzemkowej.Po przemyciu i wysuszeniu w temperaturze 40°C otrzymano 27 g osadu kompleksowej soli antybiotyku o mocy 115 meg w 1 mg, co stanowi 72% pierwotnej ilosci antybiotyku. Uzyskany osad ekstrahuje sie pieciokrotnie w 80 ml me¬ tanolowego roztworu chlorku wapniowego, sto¬ sujac do pierwszej ekstrakcji 30 ml, do drugiej i trzeciej po 15 ml, do czwartej i- piatej po 10 ml.Do zebranego przesaczu metanolowego w ilosci 58 ml wkrapla sie 6 ml stezonego kwasu solnego przy stalym mieszaniu. W tych warunkach wy¬ tracaja sie krysztaly chlorowodorku oksytetra¬ cykliny, które po odsaczeniu i przemyciu 99% metanolem suszy sie w temperaturze 40°C.Uzyskano 1,78 g chlorowodorku oksytetracyk¬ liny o mocy 860 meg w 1 mg.Przyklad IV. Sposób rekrystalizacji oksyte¬ tracykliny. Celem otrzymania chlorowodorku oksytetracykliny o wysokiej mocy mozna prze¬ prowadzic rekrystalizacje preparatu z metanolo¬ wego roztworu chlorku wapniowego i trójetylo- aminy: 3,5 g chlorowodorku oksytetracykliny o mocy 670 j w 1 mg zadaje sie 1,2 g trójetylo- - 15 -aminy i 30 ml metanolowego roztworu chlorku wapniowego. Po calkowitym rozpuszczeniu chlo¬ rowodorku oiksytetracykliny dodaje sie 4.5 ml stezonego kwasu solnego. Wytraca sie osad chlorowodorku oksytetracykliny, który po od¬ saczeniu i kolejnymi przemyciu metanolem i eterem suszy sie w tmperatuirze 402C.Otrzymano 2,6 g chlorowodorku oksytetracyk¬ liny o -mocy 920 mcg w 1 mg.Kontrole przeprowadzono ogólnie znanymi me¬ todami chemicznymi i biologicznymi. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania oksytetracykliny na dro¬ dze biosyntezy w warunkach tlenowych w plyn¬ nym podlozu zawierajacym zródla azotu, wegla, soli mineralnych i elementów sladowych, zna¬ mienny tym, ze do biosyntezy stosuje sie szczep Actinomyces vajrsoviensis sp. nov., bedacy no¬ wym gatunkiem promieniowca. Wlodzimierz Kury lowicz Franciszek U1 a Je Zastepcy: Józef Felkner & Wanda Modlibowska rzecznicy .patentowi 441. RSW „Prasa" Kielce. h PL