PL249479B1 - Sposób pobierania próbki oddechu i sposób analizy próbki materiału biologicznego pod kątem wykrywania obecności stanu chorobowego pacjenta - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób pobierania próbki oddechu za pomocą aparatu do pobierania kondensatu wydychanego powietrza oraz sposób analizy próbki materiału biologicznego pod kątem wykrywania obecności stanu chorobowego pacjenta w kierunku różnicowania etiologii zakażeń.

W stanie techniki ujawniono rozwiązania dotyczące zbierania wydzieliny stanowiącej kondensat pary wodnej zawartej w wydychanym przez pacjenta powietrzu. W międzynarodowym zgłoszeniu wynalazku WO 2019/018121 ujawniono urządzenie do zbierania i przechowywania próbek w postaci kondensatów wydychanego powietrza. Jednak urządzenie to nie zawiera elementów chłodzących zebrany oddech.

W opisie wynalazku ITMI20111422A1 ujawniono urządzenie do zbierania próbki powietrza, które zawiera skraplacz, gdzie następuje chłodzenie próbki. Jednak jest to urządzenie drogie w swojej eksploatacji i posiada odmienny sposób sterowania temperaturą bloku chłodzącego.

W opisie wynalazku GB2548122 A ujawniono z estaw części do urządzenia zbierającego kondensat wydychanego powietrza, który składa się z modułu ustnika zawierającego kanał oddechowy określony w module ustnika, zapewniający przewodzenie płynu z portu wlotowego ustnika w celu odbierania wydychanego powietrza do używanego portu wylotowego ustnika. Zestaw zawiera ponadto naczynie zbiorcze do umieszczenia w urządzeniu w celu chłodzenia. Naczynie zbiorcze stanowi szczelną i możliwą do ponownego zamknięcia komorę używaną do zbierania kondensatu wydychanego powietrza. Naczynie zbiorcze posiada wlot powietrza, służący do wpuszczania wydychanego powietrza do komory. Zestaw części jest skonfigurowany w taki sposób, że naczynie zbiorcze: można włożyć do urządzenia w konfiguracji pobierania próbki, w której wlot od dechowy naczynia jest otwarty i ma płynne połączenie z portem wylotowym oddechu w ustniku modułu ustnika; i wyjmowany z urządzenia w konfiguracji przechowywania próbki, w której komora naczynia zbiorczego jest ponownie uszczelniana.

We wszystkich znanych rozwiązaniach w zakresie zbierania wydzieliny wykorzystuje się zjawisko kondensacji pary wodnej zawartej w wydychanym powietrzu. W tym celu należy schłodzić powietrze do temperatury poniżej temperatury punktu rosy. Głównym elementem różnicującym poszczególne istniejące rozwiązania jest metoda chłodzenia oraz sposób regulacji temperatury komory, w której zbiera się kondensat. Urządzenia do skraplania pary wodnej z powietrza można podzielić na konstrukcje posiadające zintegrowany lub zewnętrzny system odprowadzania ciepła z komory chłodzącej (układy aktywne) i takie, w których blok chłodzący jest wstępnie zamrażany, następnie w trakcie procesu skraplania ciepło z komory nie jest już odprowadzane (chłodzenie pasywne).

Efektywność procesu zbierania kondensatu jest bezpośrednio uzależniona od możliwości utrzymania przez urządzenie stabilnej niskiej temperatury. Wraz z powietrzem wydychanym przez pacjenta podczas badania następuje ogrzewanie komory chłodzącej, istnieje zatem potrzeba poszukiwania rozwiązań zapewniających stabilne utrzymanie niskiej temperatury próbki kondensatu wydychanego powietrza.

W toku prowadzonych badań Twórcy wynalazku rozwiązali problem pozyskania odpowiedniej jakości próbki kondensatu wydychanego powietrza, zapewniając sposób zbierania próbki wydychanego powietrza za pomocą opracowanego do tego celu aparatu. Ponadto okazało się, że próbka kondensatu wydychanego powietrza zebrana sposobem według wynalazku umożliwia analizę jakościową i ilościową zawartych w niej substancji biologicznych, przydatną do diagnostyki etiologii zakażeń.

Przedmiotem wynalazku jest sposób pobierania próbki oddechu obejmujący wydychanie powietrza z płuc i zbieranie próbki przy zastosowaniu aparatu zawierającego zespół doprowadzający powietrze wdechowe oraz zespół odbieralnika próbki, przy czym zespół doprowadzający powietrze wdechowe obejmuje ustnik połączony od dołu ze zbieraczem śliny i zaopatrzony na wylocie w rurkę; przy czym zespół odbieralnika próbki obejmuje probówkę na kondensat wydychanego powietrza, połączoną rozłącznie od dołu z blokiem chłodzącym, zaopatrzonym w komorę chłodzącą z czujnikiem temperatury i ogniwem Peltiera połączonym systemem rurek cieplnych z jednostką rozpraszania ciepła, gdzie blok chłodzący zasilany jest przez jednostkę zasilania i sterowany za pomocą programowalnej jednostki sterującej zawierającej wyświetlacz LCD z klawiaturą; przy czym zespół doprowadzający powietrze wdechowe jest połączony rozłącznie z zespołem odbieralnika próbki przez kanał wlotowy, sposób charakteryzuje się tym, że przed pobraniem próbki oddechu komorę chłodzącą schładza się do zadanej temperatury T1, wynoszącej -10°C, a następnie zmniejsza się moc zasilania ogniwa Peltiera w celu utrzymania temperatury komory chłodzącej na zadanym poziomie, po czym blok chłodzący podłącza się do zespołu doprowadzającego powietrze wdechowe i do zespołu odbieralnika próbki, po czym przez ustnik powietrze wydychane z płuc doprowadza się do zespołu odbieralnika próbki za pomocą rurki i kanału wlotowego, a następnie schładza się je w bloku chłodzącym do temperatury poniżej punktu rosy, w wyniku czego następuje kondensacja pary wodnej zawartej w wydychanym powietrzu, przy czym kondensat pary wodnej zbiera się w probówce, a przez wymuszacz przepływu jednokierunkowego odprowadza się gazy, nastę pnie, po zebraniu odpowiedniej ilości kondensatu wydychanego powietrza, probówkę odłącza się od aparatu a uzyskany kondensat poddaje się analizie lub dalszej obróbce w celu jej utrwalenia poprzez zamrożenie lub liofilizację.

W sposobie według wynalazku aparat do pobierania próbki oddechu posiada aktywny, zintegrowany system chłodzenia, dzięki czemu zapewnia się właściwe parametry jakościowe zbieranej próbki kondensatu powietrza.

Znaczącym elementem różnicującym rozwiązanie od znanych urządzeń jest sposób st erowania temperaturą bloku chłodzącego. Najczęściej jest ono realizowane metodą dwustanową, która polega na sztywnym zdefiniowaniu dolnej (T1) i górnej (T2) wartości temperatury komory chłodzącej. W momencie, gdy komora chłodząca uzyska zadaną temperaturę T1, ogniwo zostaje wyłączone i pozostaje nieaktywne do momentu osiągnięcia temperatury granicznej T2. Następuje wtedy załączenie ogniwa i jego praca do momentu ponownego uzyskania temperatury T1. W praktyce jednak, ze względu na bezwładność cieplną układu, pomimo działającego układu chłodzącego, temperatura komory przez pewien czas jeszcze wzrasta powyżej granicznej temperatury T2. Może powodować to duże skoki temperatury prowadzące do obniżenia wydajności procesu skraplania wydzieliny i jakości kondensatu.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób analizy próbki materiału biologicznego pod kątem wykrywania obecności stanu chorobowego pacjenta poprzez pobranie próbki jego oddechu sposobem jak określono powyżej, charakteryzujący się tym, że próbkę oddechu powyżej postaci kondensatu pary wodnej poddaje się analizie ilościowej lub jakościowej obejmującej analizę profilu aminokwasów w celu różnicowania etiologii zakażeń.

Twórcy wynalazku przeprowadzili analizę kondensatów wydychanego powietrza zebranych sposobem według wynalazku wśród pacjentów pediatrycznych z ostrą białaczką limfoblastyczną (ALL), dzieci z cukrzycą typu 1 oraz pacjentów bariatrycznych. Odnotowano istotne statystycznie różnice w profilach aminokwasów mierzonych w wydychanym powietrzu (przed i po leczeniu).

Szczególnie interesujące okazały się wyniki analiz profilu aminokwasów próbek kondensatów wydychanego powietrza uzyskane od pacjentów leczonych z rozpoznaniem zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS). Wykazano, że na podstawie analizy różnic w poziomach aminokwasów możliwe jest różnicowanie etiologii chorób, zwłaszcza zakażeń wirusowych, w tym tych wywoływanych przez SARS-COV 2. Rozwiązanie według wynalazku może zatem znaleźć potencjalnie zastosowanie w rozpoznawaniu chorób o podłożu wirusowym, takich jak zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) lub COVID-19.

Ocena gotowości technologicznej proponowanego rozwiązania określana za pomocą skali TRL osiągnęła poziom VII.

Przedmiot wynalazku uwidoczniony jest na figurze rysunku, na której

Fig. 1 przedstawia schemat ideowy budowy aparatu do pobierania próbki wydychanego powietrza firmy Medivac Turbo DECCS. Strzałkami zaznaczono przepływ powietrza.

Fig. 2 przedstawia układ sterowania bloku chłodzącego 5.

Fig. 3 przedstawia schemat procedury upochadniania aminokwasów.

Wynalazek zilustrowano na przykładzie wykonania, który nie ogranicza zakresu ochrony wynalazku.

Przykład 1

Do realizacji sposobu pobierania próbki oddechu zastosowano aparat zawierający zespół doprowadzający powietrze wdechowe oraz zespół odbieralnika próbki połączony z blokiem chłodzącym, przy czym element aktywny w bloku chłodzącym 5 stanowi ogniwo Peltiera 5b.

Przed pobraniem próbki schłodzono komorę chłodzącą 5a do zadanej temperatury T1, wynoszącej -10°C, po czym zmniejszono moc zasilania ogniwa Peltiera 5b aby utrzymać temperaturę bloku chłodzącego 5 na zadanym poziomie, następnie blok chłodzący 5 podłączono do zespołu doprowadzającego powietrze wdechowe i do zespołu odbieralnika próbki. Pacjent wydychał powietrze z płuc do ustnika przez 20 minut, powietrze po doprowadzeniu do bloku chłodzącego 5 uległo schłodzeniu do temperatury -7°C, w wyniku czego nastąpiła kondensacja pary wodnej zawartej w wydychanym powietrzu, a na ściankach probówki 6 zaczęła zbierać się wydzielina w postaci kondensatu wydychanego powietrza, przeznaczona do dalszych badań, wydychane gazy odprowadzano z probówki 6 przez wymuszacz przepływu jednokierunkowego 8. Jednostkę sterującą 5e nastawiono tak żeby utrzymać zadaną temperaturę na stabilnym poziomie, z niewielkim zakresem oscylacji temperatury rzędu ±3°C, co pozwala na utrzymanie stanu równowagi cieplnej bloku chłodzącego 5.

Przykład 2

Badania nad kondensatem wydychanego powietrza (ang. exhaled breath condensate, EBP)

Próbki EBC są cennym materiałem diagnostycznym, pobieranym od pacjentów w sposób całkowicie nieinwazyjny i bezpieczny. Pozyskiwanie próbek wydychanego powietrza odbywa się podczas normalnego spokojnego oddechu, w żaden sposób nie jest uciążliwe ani męczące dla pacjenta [1].

Badane próbki EBC uzyskano od zdrowych ochotników, uczestników projektu badawczego realizowanego we współpracy z Kliniką Immunologii GUMed, za zgodą Komisji Bioetycznej nr 274/2018. Wszyscy uczestnicy biorący udział w badaniu wyrazili pisemną zgodę oraz zostali poproszeni o wypełnienie krótkiej ankiety. Próbki EBC były pobierane tego samego dnia w warunkach ambulatoryjnych w Klinice Chirurgii Ogólnej, Endokrynologicznej i Transplantacyjnej znajdującej się w Centrum Medycyny Inwazyjnej (CMI) GUMed. Pobieranie próbek odbywało się pod nadzorem lekarzy klinicystów. Próbki oddechu pobierane były przez wykwalifikowany personel medyczny podczas wizyty u lekarza. Uzyskany materiał tego samego dnia przewożono do Katedry i Zakładu Chemii Farmaceutycznej GUMed i przechowywano w warunkach głębokiego zamrożenia w temp. -80°C aż do czasu analizy LC-MS/MS.

Pobranie próbek EBC prowadzono za pomocą aparatu jak w przykładzie 1 oraz komercyjnie dostępnego aparatu Medivac Turbo DECCS, zgodnie z instrukcją producenta.

Próbki EBC poddano analizie ilościowej aminokwasów obecnych w kondensacie.

Procedura upochodnienia aminokwasów

Aminokwasy to związki małocząsteczkowe i trudne do oznaczania w odwróconym układzie faz (RP). Ze względu na charakter hydrofilowy w takich warunkach nie ulegają rozdzieleniu. W celu poprawy detekcji poddano je procesowi upochadniania, co spowodowało wzrost masy monitorowanych jonów. W wyniku tego nastąpiła poprawa ich identyfikacji przez detektor mas, tym samym poprawa czułości metody, sygnał analitu uległ zwiększeniu kosztem zmniejszonych sygnałów pochodzących od szumów. Wynikiem tego było uzyskanie niskiej wartości LOD rzędu fmol) [2]. Również zmianie uległy właściwości aminokwasów z hydrofilowych na lipofilowe, co umożliwiło zastosowanie kolumny C18 i doskonałe rozdzielenie oznaczanych analitów w odwróconym układzie faz. Derywatyzację przeprowadzono w trybie przedkolumnowym z użyciem chloromrówczanu propylu jako odczynnika upochadniającego. Ze względu na krótki czas trwania derywatyzacji i łagodne warunki (1 min, temp. pokojowa) wyróżnia się on na tle innych reagentów wcześniej stosowanych w literaturze.

W tym celu do probówek szklanych o pojemności 1,2 mL za pomocą pipety automatycznej przenoszono próbkę celem poddania jej procesowi derywatyzacji (upochodnianiu).

Przygotowywano roztwór składający się z NaOH i 3-pikoliny w n-propanolu w stosunku objętościowym 3:2 (v/v) w objętości 200 μL/próbkę. Końcówki do pipety wypełnione złożem łączono ze strzykawką. Za jej pomocą naciągano rozwór wewnątrz probówki na sorbent, na którym zachodziła adsorpcja analitów. Po tym etapie przemywano złoże za pomocą 200 μΕ n-propanolu. Z użyciem wcześniej przygotowanego roztworu wymywano złoże z końcówki do probówki szklanej. Dodawano 50 μΕ odczynnika upochadniającego - chloromrówczanu propylu w chloroformie. Mieszano za pomocą wytrząsarki do uzyskania białej emulsji około 8 sekund. Po minucie mieszano ponownie. Następnie dodawano 100 μΕ izooktanu i mieszano. Za pomocą pipety automatycznej pobierano górną warstwę organiczną (około 150 μυ>, którą odparowywano w 30°C przez 15 min pod próżnią. Suchą pozostałość rozpuszczano w 100 μΕ mieszaniny faz ruchomych (faza A jako 10 mM mrówczan amonu : faza B jako 10 mM mrówczan amonu w metanolu (33:67, v/v) i poddawano analizie EC-MS/MS. Schemat procedury derywatyzacji aminokwasów przedstawiono na Fig. 3.

Zaletą zastosowanego w wynalazku środka do upochadniania aminokwasów chloromrówczanu propylu jest fakt, iż jest to odczynnik łatwo dostępny na rynku i niedrogi. Ponadto proces upochadniania

PL 249479 Β1 aminokwasów jest szybki i można derywatyzować aminokwasy bezpośrednio w roztworze wodnym. Upochodnione związki są następnie ekstrahowane z użyciem rozpuszczalnika organicznego.

Warunki oznaczenia aminokwasów w kondensatach wydychanego powietrza EBC technika LC-MS/MS.

Derywatyzowane aminokwasy oznaczano techniką chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas LC-MS/MS. Spektrometr mas wyposażony był w źródło jonów typu elektrorozpraszania (ang. electrospray, ESI) oraz analizator typu potrójny kwadrupol MS/MS. Aminokwasy rozdzielono na kolumnie C18 Phenomenex EZ:faast AAA-MS o wymiarach 25 x 2,0 mm; 4 μπι w układzie faz odwróconych (ang. reversed phase, RP). Zastosowano elucję gradientową (tab. 2). Fazę ruchomą A stanowiła woda z dodatkiem 10 mM mrówczanu amonu i 0,1% kwasu mrówkowego. Faza B składała się z metanolu z dodatkiem 10 mM mrówczanu amonu i 0,1% kwasu mrówkowego.

Warunki elucji gradientowej
czas, min	% udziału fazy B
0 ->13,5	63 ->85
13,5 -> 13,6	85 ->63
13,6 -> 18	63
przepływ 0,3 mL/min

Zoptymalizowane warunki rozdzielenia analitycznego aminokwasów techniką LC-MS/MS były następujące:

• objętość zadozowana do kolumny: 1 μί • całkowity czas pojedynczej analizy: 18 min • objętościowa prędkość przepływu fazy ruchomej: 0,3 mL/min • temperatura kolumny: 35°C • temperatura w komorze automatycznego podajnika próbek: 4°C • tryb pracy MS: dodatni • temperatura źródła jonów ESI: 300°C • temperatura bloku grzejącego: 400°C • objętościowa prędkość przepływu gazu grzejącego (azot): 10 L/min • objętościowa prędkość przepływu gazu suszącego (azot): 10 L/min • objętościowa prędkość przepływu gazu nebulizującego (rozpraszającego): 3 L/min • temperatura linii desolwatacyjnej (DL): 250°C • napięcie przyłożone do kapilary: 5 kV

Wyniki pomiaru stężenia aminokwasów przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1 - przedstawia wyniki poziomu aminokwasów [ng/mL] oznaczone metodą własną z wykorzystaniem techniki LC-MS/MS. Wyjaśnienie skrótów: Turbo DECCS oznacza aparat do zbierania kondensatów wydychanego powietrza firmy włoskiej, dostępny komercyjnie; aparat PG oznacza urządzenie zaprojektowane i zbudowane przez naukowców Politechniki Gdańskiej, będącego przedmiotem postępowania patentowego; skrót NO wyraża stężenie nie oznaczone (wartość poniżej granicy oznaczalności opracowanej metody analitycznej).

PL 249479 Β1

Tabela 1

		Stężenie [ng/mL]
Wzorce stęż.50 ng/mL	Osoba 1	Osoba 2	Osoba 3	Osoba 4	Osoba 5
1	ARGININA	49,894	11,412	3,712	3,256	3,398	15,904
2	HOMOARGININA	48,915	NO	NO	NO	NO	NO
3	GLUTAMINA	49,924	0,404	NO	NO	0,733	7,831
4	SERYNA	48,543	21,564	12,242	10,954	2,031	125,313
5	ASPARAGINA	49,212	NO	NO	NO	NO	2,458
6	HYDROKSYPROLINA	49,325	NO	NO	NO	NO	0,135
7	GLICYNA	49,356	10,912	3,712	4,012	2,145	10,563
8	TREONINA	48,632	NO	NO	NO	NO	9,956
9	ALANINA	49,478	81,534	40,506	42,592	17,721	110,584
10	PROLINA	49,525	12,842	5,298	6,032	7,855	59,204
11	METIONINA	48,996	NO	NO	NO	0,204	1,255
12	KWAS ASPARAGINOWY	49,658	NO	NO	NO	NO	13,204
13	HISTYDYNA	49,323	9,036	2,104	3,112	4,108	44,533
14	LIZYNA	49,912	1,098	NO	0,102	0,493	6,724
15	NORWALINA	49,864	28,212	15,012	15,956	13,134	49,996
16	WALINA	50,034	29,298	16,986	17,022	10,554	47,512
17	KWAS GLUTAMINOWY	50,314	1,427	0,542	0,824	1,235	7,974
18	TRYPTOFAN	50,854	NO	NO	NO	NO	2,808
19	LEUCYNA	49,345	8,056	4,036	4,559	5,347	23,755
20	FENYLOALANINA	49,722	NO	NO	NO	NO	7,145
21	IZOLEUCYNA	48,956	NO	2.156	3,535	4,103	23,342
22	CYSTEINA	48,412	0,721	0,496	0,553	0,633	1,511
23	TYROZYNA	50,936	0,808	1,512	3,354	4,574	19,936
24	CYSTYNA	49,204	1,511	2,624	0,856	NO	2,845

Przykład 3

Kondensaty wydychanego powietrza (ana. exhaled breath condensate, EBO - badania porównawcze

Próbki EBC pobrano i przygotowano jak opisano w przykładzie 2. Przeprowadzono analizę stężeń wybranych aminokwasów dla próbek pobranych aparatem wg wynalazku (aparat PG) i komercyjnie dostępnym aparatem Turbo DESO.

Wyniki pomiaru stężenia aminokwasów przedstawiono w Tabeli 2.

PL 249479 Β1

Tabela 2

	Wzorce stęż.50ng/mL	Osoba 1	Osoba 2
Turbo DECCS	AparatPG	Turbo DECCS	Aparat PG	Turbo DECCS	Aparat PG
1	ARGININA	49,064	49,894	10,064	11,412	3,46	3,712
4	SERYNA	48,113	48,543	21,118	21,564	10,568	12,242
10	PROLINA	49,745	49,525	12,744	12,842	5,713	5,298
13	HISTYDYNA	48,943	49,323	8,948	9,036	2,282	2,104
16	WALI NA	49,755	50,034	28,755	29,298	15,413	16,986
17	KWAS GLUTAMINOWY	50,225	50,314	1,223	1,427	0,358	0,542
24	CYSTYNA	48,791	49,204	1,491	1,511	2,485	2,624
		Turbo DECCS	Osoba 3 Aparat PG	Turbo DECCS	Osoba 4 Aparat PG	Turbo DECCS	Osoba 5 Aparat PG
1	ARGININA	2,944	3,256	3,204	3,398	14,032	15,904
4	SERYNA	9,356	10,954	1,651	2,031	123,319	125,313
10	PROLINA	6,492	6,032	8,025	7,855	56,096	59,204
13	HISTYDYNA	3,446	3,112	4,358	4,108	42,049	44,533
16	WALINA	15,758	17,022	9,498	10,554	45,36	47,512
17	KWAS GLUTAMINOWY	0,623	0,824	0,985	1,235	7,116	7,974
24	CYSTYNA	0,746	0,856	NO	NO	2,735	2,845

Wnioski: Dla próbek pobranych aparatem wg wynalazku (aparat PG) uzyskano dokładniejsze wyniki stężeń aminokwasów, co świadczy o tym, że pobieranie próbki aparatem PG w stabilnych warunkach temperaturowych jest istotne dla jakości analizy i dalszej diagnostyki stanu pacjenta.

Wykaz oznaczeń:

- ustnik

- zbieracz śliny

- rurka

- kanał wlotowy

- blok chłodzący

- probówka

- kanał wylotowy

- wymuszacz przepływu jednokierunkowego

5a - komora chłodząca

5b - ogniwo Peltiera

5c - czujnik temperatury

5d - jednostka rozpraszania ciepła

5e - programowalna jednostka sterująca z wyświetlaczem i klawiaturą

5f - jednostka zasilania

BIBLIOGRAFIA

[1] I. Horvath, J. Hunt, P.J. Barnes, Exhaled breath condensate: methodological recommendations and unresolved questions, Eur. Resp. J., 26 (2005) 523-548.

[2] Y. Sakaguchi, T. Kinumi, T. Yamazaki, A. Takatsu, A novel amino acid analysis method using derivatization of multiple functional groups followed by liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Analyst 140 (2015) 1965-1973.

Claims (2)

1. Sposób pobierania próbki oddechu obejmujący wydychanie powietrza z płuc i zbieranie próbki przy zastosowaniu aparatu zawierającego zespół doprowadzający powietrze wdechowe oraz zespół odbieralnika próbki, przy czym zespół doprowadzający powietrze wdechowe obejmuje ustnik (1) połączony od dołu ze zbieraczem śliny (2) oraz zaopatrzony na wylocie w rurkę (3);

przy czym zespół odbieralnika próbki obejmuje probówkę (6) na kondensat wydychanego powietrza, połączoną rozłącznie od dołu z blokiem chłodzącym (5), zaopatrzonym w komorę chłodzącą (5a) z czujnikiem temperatury (5c) i ogniwem Peltiera (5b) połączonym systemem rurek cieplnych z jednostką rozpraszania ciepła (5d), gdzie blok chłodzący (5) zasilany jest przez jednostkę zasilania (5f) i sterowany za pomocą programowalnej jednostki sterującej (5e) zawierającej wyświetlacz LCD z klawiaturą;

przy czym zespół doprowadzający powietrze wdechowe jest połączony rozłącznie z zespołem odbieralnika próbki przez kanał wlotowy (4), znamienny tym, że przed pobraniem próbki oddechu komorę chłodzącą (5a) schładza się do zadanej temperatury T1, wynoszącej -10°C, a następnie zmniejsza się moc zasilania ogniwa Peltiera (5b) w celu utrzymania temperatury komory chłodzącej (5a) na zadanym poziomie -10°C, po czym blok chłodzący (5) podłącza się do zespołu doprowadzającego powietrze wdechowe i do zespołu odbieralnika próbki, po czym przez ustnik (1) powietrze wydychane z płuc doprowadza się do zespołu odbieralnika próbki za pomocą rurki (3) i kanału wlotowego (4), a następnie schładza się je w bloku chłodzącym (5) do temperatury poniżej punktu rosy, w wyniku czego następuje kondensacja pary wodnej zawartej w wydychanym powietrzu, przy czym kondensat pary wodnej zbiera się w probówce (6), a przez wymuszacz przepływu jednokierunkowego (8) odprowadza się gazy, następnie, po zebraniu odpowiedniej ilości kondensatu wydychanego powietrza, probówkę (6) odłącza się od aparatu, a uzyskany kondensat poddaje się analizie lub dalszej obróbce w celu jej utrwalenia poprzez zamrożenie lub liofilizację.

2. Sposób analizy próbki materiału biologicznego pod kątem wykrywania obecności stanu chorobowego pacjenta poprzez pobranie próbki jego oddechu jak określono w zastrz. 1, znamienny tym, że próbkę oddechu w postaci kondensatu pary wodnej poddaje się analizie ilościowej lub jakościowej obejmującej analizę profilu aminokwasów w celu różnicowania etiologii zakażeń.