PL249355B1

PL249355B1 - Sposób wytwarzania węglowych kropek kwantowych o przesuniętym spektrum emisji fluorescencji

Info

Publication number: PL249355B1
Application number: PL448517A
Authority: PL
Inventors: Łukasz JANUS; Łukasz Janus; Julia RADWAN-PRAGŁOWSKA; Julia Radwan-Pragłowska; Aleksandra Sierakowska-Byczek
Original assignee: Politechnika Krakowska im. Tadeusza Kościuszki
Priority date: 2024-05-09
Filing date: 2024-05-09
Publication date: 2026-03-30
Also published as: PL448517A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania modyfikowanych węglowych kropek kwantowych na drodze N-podstawienia związków z grupy kumaryn, który polega na tym, że węglowe kropki kwantowe otrzymane na drodze karbonizacji biomasy stanowiącej m.in. 1 substancję biologiczne czynną posiadające wolne grupy karboksylowe modyfikuje się na drodze wytworzenia wiązania amidowego w środowisku wodnym, warunkach normalnych, a następnie oczyszcza przy użyciu membran dializacyjnych. Podczas szczepienia stosunek barwnika do EDC wynosi 1 do 1,1. Zgłoszenie dotyczy także węglowych kropek kwantowych o spektrum emisji fluorescencji w zakresie 380 - 800 nm, otrzymanych tym sposobem.

Description

Opis wynalazku

DZIEDZINA TECHNIKI

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania węglowych kropek kwantowych i ich modyfikacji związkami organicznymi z grupy kumaryn w środowisku wodnym oraz węglowe kropki kwantowe o przesuniętym spektrum emisji fluorescencji, otrzymane tym sposobem, nadające się do zastosowania jako środki do biodetekcji komórek nowotworowych, elementy systemów teranostycznych, wykrywania kationów oraz związków chemicznych o wysokiej i niskiej masie molowej, bioobrazowania organelli komórkowych i całych komórek eukariotycznych oraz prokariotycznych, element biosensorów i sensorów, światłowodów, systemów kontrolowanego dostarczania i uwalniania leków, tuszy i biotuszy do druku 3D, a także do monitorowania procesów chemicznych i biochemicznych online i offline.

STAN TECHNIKI

Zerowymiarowe nanomateriały węglowe stanowią ważną grupę nanomateriałów ze względu na swoje unikalne właściwości fizykochemiczne, w tym optoelektroniczne oraz biologiczne. Cechują się one rozmiarem poniżej 10 nm, dzięki czemu mogą penetrować błonę komórkową oraz ulegać bioakumulacji w wybranych organellach komórkowych. Co istotne, pozbawione są one rdzenia metalicznego, dzięki czemu cechują się dużo niższą cytotoksycznością i z powodzeniem mogą znaleźć zastosowanie w medycynie i farmacji jako elementy układów teranostycznych umożliwiających jednoczesną diagnostykę oraz terapię, a także systemów kontrolowanego dostarczania i uwalniania leków czy sond fluorescencyjnych. Ze względu na obecność hydrofilowych grup funkcyjnych, takich jak grupa hydroksylowa, aminowa czy karboksylowa, są one rozpuszczalne w wodzie, co znacząco zwiększa ich aplikacyjność w zastosowaniach zarówno in vitro, jak i in vivo. Unikalną cechą nanokropek węglowych jest zależność emisji fluorescencji od długości fali wzbudzającej. Nanokropki, w przeciwieństwie do organicznych barwników molekularnych, wykazują odporność na fotobielenie i fotostarzenie.

Jednym z najważniejszych parametrów nanomateriałów węglowych jest zakres emisji fluorescencji, który decyduje o ich aplikacyjności. Właściwości fluorescencyjne są efektem zarówno zaburzeń w sieci krystalicznej, deformacji struktury powierzchni, jak i właściwości molekularnych wynikających z obecności układu wiązań sprzężonych C=C oraz heteroatomów N, S, O.

Do najbardziej znanych dwuetapowych metod modyfikacji powierzchni tej grupy nanomateriałów o rdzeniu węglowym zalicza się:

1. funkcjonalizację powierzchni nanokropek węglowych otrzymanych w wyniku utleniania sadzy kwasem azotowym, za pomocą pochodnych amin;

2. utlenianie powierzchniowe nanokropek węglowych prowadzące do ich autopasywacji otrzymanych w procesie elektrolizy elektrody grafitowej;

3. pasywację powierzchni nanokropek kwantowych otrzymanych w wyniku ablacji laserowej grafitu za pomocą poli(glikolu etylowego).

Do najbardziej znanych metod jednoetapowej modyfikacji powierzchni węglowych kropek kwantowych zalicza się:

1. autopasywację powstającego rdzenia węglowego nanokropek heteroatomami takimi jak S, N, O pochodzącymi z biomasy stanowiącej substrat; oraz

2. modyfikację powstającego rdzenia węglowego nanokropek poprzez tworzenie wiązań chemicznych obecnych na jego powierzchni, głównie estrowych, amidowych, ze związkami chemicznymi zawierającymi heteroatomy N, O czy S.

Opisane strategie modyfikacji węglowych kropek kwantowych na drodze funkcjonalizacji wymagają stosowania toksycznych rozpuszczalników lub związków modyfikujących, a także są niepowtarzalne pod kątem charakterystyki końcowego produktu, co znacząco utrudnia ich skalowalność oraz komercyjne użycie w diagnostyce czy farmacji.

Obecnie znane i stosowane są metody modyfikacji CQDs na drodze szczepienia lub podstawiania, jednak skutkują one jedynie zwiększeniem wydajności kwantowej fluorescencji w zakresie niepozwalającym na zastosowanie w połączeniu z barwnikami występującymi w ludzkich tkankach. To sprawia, że poszukiwane są nowe metody modyfikacji węglowych kropek kwantowych, których efektem będzie zmiana zakresu emisji fluorescencji, tak aby nie pokrywała się ona z zakresem emisji związków luminescencyjnych naturalnie występujących w organizmie ludzkim takich jak oksy- i deoksyhemoglobina oraz melanina.

Spośród znanych sposobów modyfikacji węglowych kropek kwantowych najbardziej do rozwiązania według niniejszego wynalazku zbliżony jest sposób przedstawiony w polskim opisie patentowym PL 243214 B1, który ujawnia metodę syntezy nanokropek węglowych z wykorzystaniem reaktora mikrofalowego ciśnieniowego. Według tego opisu, nanomateriały węglowe otrzymuje się w wyniku karbonizacji chitozanu, glukozy lub sacharozy w podwyższonym ciśnieniu w polu promieniowania mikrofalowego, oczyszcza, a następnie poddaje reakcji modyf ikacji powierzchniowej barwnikiem organicznym w polu promieniowania mikrofalowego w podwyższonej temperaturze 140-200°C i ponownie oczyszcza.

W artykule pt. „A coumarin-modified graphene quantum dot-based luminogen for the detection of cysteine in aqueous media”, Deepa Sebastian, Kala Ramakrishnan, Photochemistry and Photobiology, 2023, 1-12, przedstawiono metodę modyfikacji powierzchni grafenowych kropek kwantowych w reakcji amidowania wspomaganej sonikacją z tlenkiem grafenu jako źródłem węgla prowadzącą do otrzymania nanomateriałów cechujących się cyjanową fluorescencją. W skrócie, około 50 mg GQD rozpuszczono w 20 ml wody dejonizowanej (Dl-Water) i poddano reakcji z 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidem (EDC, 76,8 mg), a następnie dodawano 0,01 M roztwór HCI aż do uzyskania pH 5 i mieszano przez 30 minut. Następnie dodano N-hydroksysukcynimid (NHS, 23,0 mg) i pH uregulowano do 9, dodając 0,01 N roztwór NaOH i mieszano przez 30 minut. Na koniec dodano 69,20 mg 3-aminokumaryny i poddano działaniu ultradźwięków przez 30 minut.

Podobny przykład stanowi artykuł pt. „Coumarin-Modified Graphene Quantum Dots as a Sensing Platform for Multicomponent Detection and Its Applications in Fruits and Living Cells”, Zhaochuan Yu, Wenhui Ma, Tao Wu, Jing Wen, Yong Zhang, Liyan Wang, Yuqian He, Hongtao Chu, and Minggang Hu ACS Omega 2020 5 (13), 7369-7378, gdzie również opisano syntezę CGQD wykazujących cyjanową fluorescencję. W skrócie, GQDs w ilości 50 mg zmieszano z 20 ml DMF (dimetyloformamid) i poddano działaniu ultradźwięków przez 1 godzinę w celu utworzenia jednorodnej dyspersji, po czym do układu dodano EDC (76,8 mg, 0,4 mmol). Następnie do powyższego roztworu wkroplono 0,01 M HCI, aż pH układu osiągnęło wartość 5. Po energicznym mieszaniu przez 30 minut w temperaturze 25°C, do dyspersji dodano NHS (23,0 mg, 0,2 mmol) i 0,01 M NaOH celem podniesienia wartości pH układu do 9 oraz poddano aktywacji przez 3 godziny. Następnie, do mieszaniny dodano kumarynę (69,2 mg, 0,2 mmola) i stale mieszano przez 48 godzin w temperaturze 25°C. Na koniec roztwór reakcyjny zdyspergowano w 100 ml wody i wielokrotnie ekstrahowano CH2CI2. Wyekstrahowaną fazę wodną dalej oczyszczano za pomocą membrany dializacyjnej (1000 Da) przez 48 godzin, a następnie poddano liofilizacji w celu otrzymania C-GQD (46 mg) w postaci proszku.

Kolejny przykład kropek kwantowych modyfikowanych powierzchniowo barwnikiem z grupy kumaryn stanowi ten opisany w publikacji pt. „Fluorescence spectrum-based dual-parameter detection method for pH and DO in cancer cell metabolic fluid”, Yanli Hu, Chao Zheng, Wei Tao, Hui Zhao, Journal of Nanoparticle Research, 2020, 22, 186, 1-8. W skrócie, otrzymane kropki kwantowe CdSe zawierające rdzeń z CdSe oraz powłokę zbudowaną z ZnS zmodyfikowano powierzchniowo w wyniku reakcji sprzęgania z wykorzystaniem EDC. Gotowy produkt wykazywał cyjanową fluorescencję oraz potencjalne zastosowanie we wczesnej diagnostyce raka dzięki wykazaniu zależności fluorescencji od pH i stężenia rozpuszczonego w analizowanym medium (buforze fosforanowym) tlenu.

Jak wskazują doniesienia z literatury fachowej i patentowej, obecnie nie jest znana metoda otrzymywania modyfikowanych węglowych kropek kwantowych o przesuniętym spektrum emisji fluorescencji na drodze reakcji sprzęgania CQDs z barwnikiem organicznym w warunkach normalnych z wykorzystaniem EDC w środowisku wodnym.

CEL WYNALAZKU

Celem wynalazku było opracowanie sposobu modyfikacji węglowych kropek kwantowych otrzymywanych na drodze reakcji hydrotermalnej poprzez N-podstawienie związków kumarynowych w środowisku wodnym celem zmiany spektrum emisji fluorescencji na niepokrywające się z barwnikami biologicznymi występującymi in vivo, tak aby mogły zostać użyte jako środki do biodetekcji komórek nowotworowych, elementy systemów teranostycznych, wykrywania kationów oraz związków chemicznych o wysokiej i niskiej masie molowej, bioobrazowania organelli komórkowych i całych komórek eukariotycznych oraz prokariotycznych, element biosensorów i sensorów, światłowodów, systemów kontrolowanego dostarczania i uwalniania leków, tuszy i biotuszy do druku 3D, a także do monitorowania procesów chemicznych i biochemicznych online i offline, a ponadto uzyskanie modyfikowanych powierzchniowo węglowych kropek kwantowych podstawionych wybranymi kumarynami, tak aby zmienić ich zakres fluorescencji, i by mogły nadawać się do wskazanych powyżej zastosowań.

Przeprowadzanie reakcji modyfikacji chemicznej CQDs z aminowymi pochodnymi kumaryn z zastosowaniem czynnika sprzęgającego EDC wyłącznie w roztworze wodnym w temperaturze pokojowej pod ciśnieniem atmosferycznym w dowolnym naczyniu reakcyjnym (otwarte naczynia szklane / teflonowe) eliminując tym samym procesy ogrzewania oraz przeprowadzania procesów chemicznych w aparatach ciśnieniowych. Dodatkowo, istnieje możliwość dowolnego zmniejszania / zwiększania skali procesu chemicznej modyfikacji CQDs z aminową pochodną kumaryny oraz czynnika sprzęgającego 1- etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC).

ISTOTA WYNALAZKU

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania węglowych kropek kwantowych o przesuniętym spektrum emisji fluorescencji modyfikowanych związkami organicznymi z grupy kumaryn obejmujący etapy, w których:

a) wytwarza się węglowe kropki kwantowe zawierające wolne grupy karboksylowe, stosując co najmniej jedną substancję biologicznie aktywną jako źródło węgla,

b) otrzymane w etapie a) węglowe kropki kwantowe zawierające wolne grupy karboksylowe poddaje się modyfikacji przy użyciu pochodnych kumaryny zawierających w pierścieniu aromatycznym wolną grupę aminową, z wytworzeniem wiązania amidowego pomiędzy węglowymi kropkami kwantowymi a aminową pochodną kumaryny, charakteryzujący się tym, że węglowe kropki kwantowe zawierające wolne grupy karboksylowe otrzymuje się w reakcji karbonizacji, korzystnie hydrotermalnej albo termicznej, wyżej otrzymane węglowe kropki kwantowe zawierające wolne grupy karboksylowe poddaje się reakcji chemicznej sprzęgania z aminową pochodną kumaryny przy użyciu czynnika chemicznego 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu w środowisku wodnym, w temperaturze pokojowej, pod ciśnieniem normalnym, a następnie oczyszcza za pomocą membran dializacyjnych, korzystnie o MWCO = 1000 Da.

Korzystnie, jako surowiec do produkcji węglowych kropek kwantowych stosuje się biomasę zawierającą co najmniej jeden substrat o aktywności biologicznej.

Korzystnie, do reakcji modyfikacji węglowych kropek kwantowych aminową pochodną kumaryny oraz 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu wykorzystuje się roztwór niezmodyfikowanych węglowych kropek kwantowych zawierających na swojej powierzchni wolne grupy karboksylowe jako roztwór wodny w stężeniu 2-5 mg/ml.

Korzystnie, na każdy 1 mg węglowych kropek kwantowych stosuje się od 3 do 3,7 μmol barwnika fluorescencyjnego z grupy kumaryn zawierającego wolną grupę aminową w pierścieniu aromatycznym, korzystnie 7-amino-4-metylokumarynę oraz 7-amino-4-(trifluorometylo)kumarynę, stosując stężenie barwnika w zakresie 0,2-1,0 mg/ml, korzystnie 1 mg/ml.

Korzystnie, na każdy 1 mol barwnika fluorescencyjnego z grupy kumaryn zawierającego jedną grupę aminową w pierścieniu aromatycznym stosuje się 1-1,2 mola czynnika sprzęgającego EDC, korzystnie 1,1 mola czynnika EDC w postaci roztworu wodnego.

Korzystnie, do modyfikacji chemicznej węglowych kropek kwantowych w celu wizualizacji struktur biologicznych metodą mikroskopii fluorescencyjnej w zakresie widzialnym stosuje się nietoksyczną aminową pochodną kumaryny o zakresie emisji fluorescencji w zakresie 380-800 nm.

Korzystnie, reakcję karbonizacji prowadzi się w zamkniętym, naczyniu reakcyjnym w polu promieniowania mikrofalowego o mocy 200 W przez 60 minut, pod ciśnieniem 9-10 Atm.

Korzystnie, reakcję karbonizacji prowadzi się w zamkniętym, naczyniu reakcyjnym w polu promieniowania mikrofalowego o mocy 800 W przez 4 minuty.

Istota wynalazku polega na tym, węglowe kropki kwantowe otrzymane na drodze karbonizacji w warunkach hydrotermalnych i termicznych poddaje się modyfikacji poprzez N-postawienie związków organicznych z grupy kumaryn zawierających wolne grupy aminowe w środowisku wodnym, stosując czynnik sprzęgający 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid (EDC), a następnie poddaje się oczyszczaniu na membranach dializacyjnych.

Zgodnie z wynalazkiem, w pierwszym etapie surowiec wyjściowy stanowiący roztwór węglowych kropek kwantowych otrzymanych z biomasy, której co najmniej jeden składnik stanowi związek nisko lub wysokocząsteczkowy o właściwościach bioaktywnych, umieszcza się w naczyniu reakcyjnym szklanym lub teflonowym i poddaje mieszaniu na mieszadle magnetycznym, a następnie dodaje świeżo przygotowany roztwór czynnika sprzęgającego EDC i po jego aktywacji dodaje się wodny roztwór kumaryny i prowadzi reakcję szczepienia przez okres 24 h.

Otrzymane produkty reakcji oczyszcza się od nieprzereagowanych substratów mocznika oraz innych produktów ubocznych, z wykorzystaniem procesu dializy z zastosowaniem membran dializacyjnych (MWCO 1000 Da), stosując wodę destylowaną jako czynnik oczyszczający, otrzymując produkt finalny w postaci roztworu węglowych kropek kwantowych o emisji fluorescencji w zakresie 380 do 800 nm.

Korzystnie w reakcji modyfikacji powierzchni wykorzystuje się wodny roztwór węglowych kropek kwantowych otrzymanych na drodze karbonizacji biomasy o stężeniu 5 mg/ml.

Korzystnie jako surowiec wyjściowy stosuje się węglowe kropki kwantowe otrzymane na drodze karbonizacji hydrotermalnej wykorzystując co najmniej jedną substancję czynną biologicznie jako źródła węgla.

Korzystnie, źródło węgla stanowi związek z grupy aminokwasów, białek, polisacharydów, kannabinoidów, witamin i/lub neuroprzekaźników.

Korzystnie do modyfikacji powierzchni węglowych nanokropek kwantowych stosuje się związki z grupy kumaryn, zawierające w swojej strukturze chemicznej wolne, reaktywne grupy aminowe.

Korzystnie do modyfikacji stosuje się związki z grupy kumaryn o emisji fluorescencji w zakresie 380-800 nm.

Korzystnie, do modyfikacji stosuje się roztwór CQDs o stężeniu od 1 do 5 mg/ml.

Korzystnie, jako czynnik sprzęgający stosuje się EDC o stężeniu 5 mg/ml.

Korzystnie, stosuje się roztwór EDC w ilości od 1,02 do 2,27 ml.

Korzystnie, stosunek EDC do barwnika wynosi 1:1-1,2 mola.

Korzystnie, reakcję modyfikacji prowadzi się przez 24 godziny.

Korzystnie, reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej.

Korzystnie, reakcję prowadzi się pod normalnym ciśnieniem.

Korzystnie, reakcję prowadzi się z zachowaniem ciągłego mieszania 300 obr./min.

Korzystnie, gotowe produkty reakcji oczyszcza się za pomocą membran dializacyjnych MWCO = 1000.

Modyfikowane węglowe kropki kwantowe otrzymywane są sposobem bezpiecznym dla środowiska, w warunkach normalnych poprzez N-podstawienie związkami organicznymi z grupy kumaryn, dzięki czemu są one nietoksyczne dla komórek eukariotycznych i prokariotycznych oraz wykazują fluorescencję z zakresie 380-800 nm.

Rozwiązanie według wynalazku zobrazowano w poniższych przykładach, nieograniczających zakresu jego ochrony.

Przedmiot niniejszego wynalazku przedstawiono na figurach rysunku, gdzie:

na Fig. 1 pokazano schemat reakcji modyfikacji CQDs za pomocą 7-amino-4-metylokumaryny. Etap 1 - aktywacja grup karboksylowych z powierzchni CQDs za pomocą EDC. Etap 2 - reakcja sprzęgania CQDs z 7-amino-4-metylokumaryną skutkująca powstaniem wiązania amidowego między CQDs a wolną grupą aminową pierścienia aromatycznego;

na Fig. 2 pokazano widma fluorescencji niemodyfikowanych CQDs zastosowanych do reakcji modyfikacji uzyskanych według przykładu 1. Wzbudzenie emisji fluorescencji promieniowaniem z zakresu 300-500 nm. Widma fluorescencji zmodyfikowanych CQDs zastosowanych do reakcji modyfikacji uzyskanych według przykładu 1. Wzbudzenie emisji fluorescencji promieniowaniem z zakresu 330380 nm;

na Fig. 3 pokazano widma FTIR CQDs uzyskanych według przykładu 1. Szerokie pasmo absorpcji z zakresu 2400-3600 cm^-1 potwierdza obecność wolnych grup karboksylowych na powierzchni CQDs. Dodatkowo widoczne na widmie pasmo przy 1693 cm^-1 potwierdza obecność wolnych zaszczepionych grup karboksylowych na powierzchni nanomateriału;

na Fig. 4 pokazano schemat reakcji modyfikacji CQDs za pomocą 7-amino-4-(trifluorometylo)kumaryny. Etap 1 - aktywacja grup karboksylowych z powierzchni CQDs za pomocą EDC, Etap 2 - reakcja sprzęgania CQDs z 7-amino-4-metylokumaryną skutkująca powstaniem wiązania amidowego miedzy CQDs, a wolna grupą aminową pierścienia aromatycznego;

na Fig. 5 pokazano widma fluorescencji niemodyfikowanych CQDs zastosowanych do reakcji modyfikacji uzyskanych według przykładu 2. Wzbudzenie emisji fluorescencji promieniowaniem z zakresu 300-500 nm. Widma fluorescencji zmodyfikowanych CQDs zastosowanych do reakcji modyfikacji uzyskanych według przykładu 2;

na Fig. 6 pokazano widma FTIR CQDs uzyskanych według przykładu 2. Szerokie pasmo absorpcji z zakresu 2400-3600 cm^-1 potwierdza obecność wolnych grup karboksylowych na powierzchni

CQDs, dodatkowo widoczne na widmie pasmo przy 1693 cm^-1 potwierdza obecność wolnych zaszczepionych grup karboksylowych na powierzchni nanomateriału;

na Fig. 7 pokazano widma fluorescencji niemodyfikowanych CQDs zastosowanych do reakcji modyfikacji uzyskanych według przykładu 3. Wzbudzenie emisji fluorescencji promieniowaniem z zakresu 300-450 nm. Widma fluorescencji zmodyfikowanych CQDs zastosowanych do reakcji modyfikacji uzyskanych według przykładu 3;

na Fig. 8 pokazano widma FTIR CQDs uzyskanych według przykładu 3. Szerokie pasmo absorpcji z zakresu 2400-3600 cm^-1 potwierdza obecność wolnych grup karboksylowych na powierzchni CQDs;

na Fig. 9 pokazano widma fluorescencji niemodyfikowanych CQDs zastosowanych do reakcji modyfikacji uzyskanych według przykładu 4. Wzbudzenie emisji fluorescencji promieniowaniem z zakresu 300-450 nm. Widma fluorescencji zmodyfikowanych CQDs zastosowanych do reakcji modyfikacji uzyskanych według przykładu 4. Wzbudzenie emisji fluorescencji promieniowaniem z zakresu 300450 nm. Widma fluorescencji zmodyfikowanych CQDs 7-amino-4-(trifluorometylo)kumaryną według przykładu 4;

na Fig. 10 pokazano widma FTIR CQDs uzyskanych według przykładu 4. Szerokie pasmo absorpcji z zakresu 2400-3500 cm^-1 potwierdza obecność wolnych grup karboksylowych na powierzchni CQDs co dodatkowo potwierdza silny sygnał przy 1708 cm^-1 pochodzący od drgań grupy karbonylowej ugrupowania karboksylowego.

Na załączonym schemacie (Fig. 1) zaprezentowano ścieżkę modyfikacji nanomateriałów węglowych.

PRZYKŁADY

PRZYKŁAD 1

Modyfikacja węglowych kropek kwantowych otrzymanych metodą hydrotermalną za pomocą 7- amino-4-metylokumaryny

Do reakcji modyfikacji chemicznej CQDs użyto nanomateriały uzyskane metodą hydrotermalną z mieszaniny 1 g glukozy, 0,25 g glicyny, 0,1 g kannabidiolu (CBD), 0,5 ml 35% roztworu kwasu solnego i 20 ml wody stosując naczynie reakcyjne, które zamknięto i poddano działaniu pola promieniowania mikrofalowego o mocy 200 W przez 45 minut. Ciśnienie w naczyniu reakcyjnym utrzymywano na poziomie 9-10 Atm. Po zakończeniu reakcji karbonizacji zawartość naczynia reakcyjnego umieszczono w zlewce o pojemności 50 ml, którą zanurzono w łaźni ultradźwiękowej na czas 15 minut. Po zakończeniu procesu ekstrakcji CQDs dodawano do roztworu 10% roztwór NaOH aż do osiągnięcia wartości pH równej 7, co monitorowano za pomocą pH metru wyposażonego w elektrodę szklaną kombinowaną czułą na jony wodorowe. Po zobojętnieniu próbki mieszaninę przesączono przez sączek papierowy, a następnie umieszczono w membranie dializacyjnej (MWCO = 1000 Da). Roztwór CQDs oczyszczano przez 4 doby, do całkowitego oczyszczenia nanomateriału z małocząsteczkowych produktów ubocznych procesu karbonizacji. Reakcję modyfikacji chemicznej CQDs przeprowadzono poprzez dodanie do zlewki szklanej o pojemności 25 ml 5 ml roztworu CQDs o stężeniu 3 mg/ml. Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej za pomocą mieszadła magnetycznego, a następnie dodano wodny roztwór czynnika sprzęgającego EDC (1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid)) przygotowany tuż przed wykonaniem reakcji o stężeniu 5,0 mg/ml w ilości 1,71 ml. Natychmiast po wymieszaniu się roztworów dodano wodny roztwór barwnika 7-amino-4-metylokumaryny o stężeniu 1 mg/ml w ilości 8,8 ml. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono w temperaturze pokojowej na 24 godziny do przereagowania, utrzymując ciągłe mieszanie roztworu z prędkością 300 obr./min. Otrzymany wodny roztwór zmodyfikowanych CQDs następnie oczyszczono z produktów ubocznych oraz nieprzereagowanego barwnika za pomocą procesu dializy, stosując membrany dializacyjne (MWCO = 1000 Da). Jako rozpuszczalnik służący do oczyszczenia zmodyfikowanych CQDs użyto wody dejonizowanej. Produkt reakcji oczyszczano przez 4 doby, uzyskując czysty roztwór CQDs niezawierający niskocząsteczkowych produktów ubocznych reakcji.

PRZYKŁAD 2

Modyfikacja węglowych kropek kwantowych otrzymanych metodą hydrotermalną za pomocą 7- amino-4-(trifluorometylo)kumaryny

Do reakcji modyfikacji chemicznej CQDs użyto nanomateriały uzyskane metodą hydrotermalną z mieszaniny 22 cm³ wody dejonizowanej, a następnie 1 g glukozy, 0,1 g kwasu asparaginowego, 0,2 g glicyny, 0,3 g argininy, 0,5 g CBD, 0,25 g kwasu askorbinowego oraz 0,6 ml 35% roztworu kwasu solnego. Naczynie reakcyjne zamknięto i poddano działaniu promieniowania mikrofalowego o mocy 200 W przez 60 minut. Ciśnienie w naczyniu reakcyjnym utrzymywano na poziomie 9-10 Atm. Po zakończeniu reakcji karbonizacji zawartość naczynia reakcyjnego umieszczono w zlewce o pojemności 50 ml, którą zanurzono w łaźni ultradźwiękowej i poddano działaniu ultradźwięków na czas 15 minut. Po zakończeniu procesu ekstrakcji CQDs dodawano do roztworu CQDs 5% roztwór NaOH aż do osiągnięcia wartości pH równej 7, co monitorowano za pomocą pH metru wyposażonego w elektrodę szklaną kombinowaną czułą na jony wodorowe. Po zobojętnieniu próbki mieszaninę przesączono przez sączek papierowy, a następnie umieszczono w membranie dializacyjnej (MWCO = 1000 Da). Roztwór CQDs oczyszczano przez 4 doby, do całkowitego oczyszczenia nanomateriału z małocząsteczkowych produktów ubocznych procesu karbonizacji. Aby przeprowadzić reakcję modyfikacji chemicznej CQDs za pomocą sprzęgania z 7-amino-4-(trifluorometylo)kumaryną poprzez wiązanie amidowe, do zlewki szklanej o pojemności 25 ml dodano 5 ml roztworu CQDs o stężeniu 2 mg/ml. Roztwór mieszano za pomocą mieszadła magnetycznego, a następnie dodano wody roztwór czynnika sprzęgającego przygotowany tuż przed wykonaniem reakcji o stężeniu 5,0 mg/ml w ilości 1,14 ml. Natychmiast po wymieszaniu się roztworów dodano wodny roztwór barwnika 7-amino-4-(trifluorometylo)kumaryny o stężeniu 1 mg/ml w ilości 7,6 ml. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono w temperaturze pokojowej na 24 godziny do przereagowania, utrzymując ciągłe mieszanie roztworu z prędkością 250 obr./min. Otrzymany wodny roztwór zmodyfikowanych CQDs następnie oczyszczono z produktów ubocznych oraz nieprzereagowanego barwnika za pomocą procesu dializy stosując membrany dializacyjne (MWCO = 1000 Da). Jako rozpuszczalnik służący do oczyszczenia zmodyfikowanych CQDs użyto wody dejonizowanej. Produkt reakcji oczyszczano przez 4 doby, uzyskując czysty roztwór CQDs niezawierający niskocząsteczkowych produktów ubocznych reakcji.

PRZYKŁAD 3

Modyfikacja węglowych kropek kwantowych uzyskanych metodą karbonizacji bezciśnieniowej w polu promieniowania mikrofalowego za pomocą 7-amino-4-(trifluorometylo)kumaryny

W celu uzyskania CQDs do modyfikacji chemicznej do naczynia reakcyjnego wykonanego z porcelany w kształcie tygla o pojemności 50 cm³ dodano 15 cm³ wody, 1 g siarczanu glukozaminy oraz 0,1 g dopaminy. Do mieszaniny dodano 1 cm³ roztworu kwasu solnego o stężeniu 35%. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 40°C aż do całkowitego rozpuszczenia się reagentów. Tygielek poddano działaniu pola promieniowania mikrofalowego o mocy 800 W w czasie 4 minut. Do ostudzonej mieszaniny poreakcyjnej dodano 20 cm³ wody, próbkę umieszczono na łaźni ultradźwiękowej na 5 minut, a następnie dodawano 10% roztwór NaOH aż do uzyskania wartości pH równej 7. pH roztworu kontrolowano za pomocą pH-metru. Roztwory przesączono przez bibułę filtracyjną, a następnie przeniesiono do membran dializacyjnych wykonanych z regenerowanej celulozy (MWCO = 1000 Da). Membranę umieszczono w zlewce zawierającej 500 cm³ wody destylowanej i poddawano procesowi dializy przez 4 doby. W celu przeprowadzenia modyfikacji chemicznej metodą sprzęgania za pomocą czynnika sprzęgającego EDC z 7-amino-4-(trifluorometylo)kumaryną do zlewki szklanej o pojemności 50 ml dodano 5 ml roztworu CQDs o stężeniu 4 mg/ml. Roztwór mieszano za pomocą mieszadła magnetycznego, a następnie dodano wody roztwór czynnika sprzęgającego przygotowany tuż przed wykonaniem reakcji o stężeniu 5,0 mg/ml w ilości 2,27 ml. Natychmiast po wymieszaniu się roztworów dodano wodny roztwór barwnika 7-amino-4-(trifluorometylo)kumaryny o stężeniu 1 mg/ml w ilości 15,3 ml. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono w temperaturze pokojowej na 24 godziny do przereagowania, utrzymując ciągłe mieszanie roztworu z prędkością 300 obr./min. Otrzymany wodny roztwór zmodyfikowanych CQDs następnie oczyszczono z produktów ubocznych oraz nieprzereagowanego barwnika za pomocą procesu dializy stosując rury dializacyjne (MWCO = 1000 Da). Jako rozpuszczalnik służący do oczyszczenia zmodyfikowanych CQDs użyto wody dejonizowanej. Produkt reakcji oczyszczano przez 4 doby, uzyskując czysty roztwór CQDs niezawierający niskocząsteczkowych produktów ubocznych reakcji.

PRZYKŁAD 4

Do naczynia reakcyjnego w kształcie tygla wykonanego z teflonu o pojemności 50 cm³ dodano 15 cm³ wody, 1 g siarczanu glukozaminy oraz 0,1 g dopaminy. Do mieszaniny dodano 1 cm³ roztworu kwasu solnego o stężeniu 35%. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 40°C aż do całkowitego rozpuszczenia się reagentów. Tygiel poddano działaniu pola promieniowania mikrofalowego o mocy 800 W w czasie 4 minut. Do ostudzonej mieszaniny poreakcyjnej dodano 20 cm³ wody, próbkę umieszczono na łaźni ultradźwiękowej na 5 minut, a następnie dodawano 5% roztwór NaOH aż do uzyskania wartości pH równej 7. pH roztworu kontrolowano za pomocą pH-metru. Roztwory przesączono przez bibułę filtracyjną, a następnie przeniesiono do membran dializacyjnych wykonanych z regenerowanej celulozy (MWCO = 1000 Da). Membranę umieszczono w zlewce zawierającej 500 cm³ wody destylowanej i poddawano procesowi dializy przez 4 doby. W celu przeprowadzenia modyfikacji chemicznej CQDs za pomocą 7-amino-4-(trifluorometylo)kumaryny metodą sprzęgania z czynnikiem EDC w roztworze wodnym do zlewki szklanej o pojemności 50 ml dodano 3 ml roztworu CQDs o stężeniu 3 mg/ml. Roztwór mieszano za pomocą mieszadła magnetycznego, a następnie dodano wodny roztwór czynnika sprzęgającego przygotowany tuż przed wykonaniem reakcji o stężeniu 5,0 mg/ml w ilości 1,02 ml. Natychmiast po wymieszaniu się roztworów dodano wodny roztwór barwnika 7-amino-4-(trifluorometylo)kumaryny o stężeniu 1 mg/ml w ilości 6,9 ml. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono w temperaturze pokojowej na 24 godziny do przereagowania, utrzymując ciągłe mieszanie roztworu z prędkością 100 obr./min. Otrzymany wodny roztwór zmodyfikowanych CQDs następnie oczyszczono z produktów ubocznych oraz nieprzereagowanego barwnika za pomocą procesu dializy stosując membrany dializacyjne (MWCO = 1000 Da). Jako rozpuszczalnik służący do oczyszczenia zmodyfikowanych CQDs użyto wody dejonizowanej. Produkt reakcji oczyszczano przez 4 doby, uzyskując czysty roztwór CQDs niezawierający niskocząsteczkowych produktów ubocznych reakcji.

KORZYSTNE SKUTKI WYNALAZKU

Korzystnym aspektem wynalazku jest metoda modyfikacji chemicznej powierzchni węglowych kropek kwantowych o wymiarach 2-10 nm, zawierających na swojej powierzchni grupy karboksylowe, przeprowadzana w roztworze wodnym w temperaturze pokojowej pod ciśnieniem atmosferycznym z zastosowaniem aminowych pochodnych kumaryn o wysokiej wydajności kwantowej fluorescencji, przeprowadzana za pomocą czynnika sprzęgającego EDC rozpuszczalnego w wodzie, czego skutkiem jest powstanie wiązań chemicznych - amidowych pomiędzy cząsteczkami barwnika, a CQDs. Otrzymane z dużą wydajnością w polu promieniowania mikrofalowego metodą ciśnieniową lub bezciśnieniową węglowe kropki kwantowe o niskiej wydajności kwantowej fluorescencji, zawierające na swojej powierzchni grupy karboksylowe poddaje się reakcji modyfikacji chemicznej za pomocą aminowych pochodnych kumaryn wykazujących wysokie wartości wydajności kwantowych fluorescencji, tym samym nadając CQDs polepszone właściwości fluorescencyjne. Dodatkowo zastosowanie łagodnych warunków reakcji sprzęgania (temperatura pokojowa, brak zwiększonego ciśnienia, brak obecności stężonych kwasów czy innych agresywnych reagentów) przyczynia się do zachowania struktury chemicznej oraz morfologii CQDs, skutkując jedynie modyfikacją chemiczną powierzchniowych grup karboksylowych CQDs. Zmniejszenie ilości wolnych grup karboksylowych nie przyczynia się do zmniejszenia rozpuszczalności zmodyfikowanych nanomateriałów w wodzie, ze względu na wysoką zawartość wolnych grup hydroksylowych na powierzchni CQDs, silnie oddziałujących z wodą, umożliwiając szczepienie aminowych pochodnych kumaryn wykazujących niską rozpuszczalność w wodzie. Modyfikacja chemiczna CQDs niewykazujących dużej wydajności kwantowej fluorescencji, umożliwia otrzymanie nanomateriałów wykazujących wysoką wydajność kwantową fluorescencji zdolnych do wizualizacji struktur komórkowych metodą mikroskopii fluorescencyjnej. Sposób według niniejszego wynalazku umożliwia dowolną modyfikację chemiczną powierzchni CQDs barwnikami z grupy kumaryn zawierającymi wolną grupę aminową w pierścieniu aromatycznym, a tym samym nadanie CQDs właściwości fluorescencyjnych o zbliżonej charakterystyce emisji fluorescencji taką, jaką wykazują czyste aminowe pochodne kumaryny w roztworze wodnym. Produkty uboczne powstające podczas reakcji modyfikacji chemicznej CQDs barwnikiem fluorescencyjnym za pomocą czynnika sprzęgającego EDC w roztworze wodnym, są łatwe do dzielenia z zastosowaniem membran dializacyjnych z regenerowanej celulozy (MWCO = 1000 Da), skutkiem czego jest otrzymanie czystego wodnego roztworu zmodyfikowanych chemicznie CQDs. Na żadnym etapie syntezy CQDs oraz ich modyfikacji chemicznej nie jest konieczne stosowanie bezwodnych warunków reakcji chemicznej, tak jak np. w przypadku innych czynników sprzęgających (roztwór dicyklokarbodiimidu (DCC) w tetrahydrofuranie, tym samym możliwe jest stosowanie procesu liofilizacji lub suszenia klasycznego w celu usunięcia wody z CQDs i uzyskanie produktu końcowego w postaci stałej.

Claims

1. Sposób wytwarzania węglowych kropek kwantowych o przesuniętym spektrum emisji fluorescencji modyfikowanych związkami organicznymi z grupy kumaryn obejmujący etapy, w których:

b) otrzymane w etapie a) węglowe kropki kwantowe zawierające wolne grupy karboksylowe poddaje się modyfikacji przy użyciu pochodnych kumaryny zawierających w pierścieniu aromatycznym wolną grupę aminową, z wytworzeniem wiązania amidowego pomiędzy węglowymi kropkami kwantowymi a aminową pochodną kumaryny, znamienny tym, że węglowe kropki kwantowe zawierające wolne grupy karboksylowe otrzymuje się w reakcji karbonizacji, korzystnie hydrotermalnej albo termicznej, wyżej otrzymane węglowe kropki kwantowe zawierające wolne grupy karboksylowe poddaje się reakcji chemicznej sprzęgania z aminową pochodną kumaryny przy użyciu czynnika chemicznego 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu w środowisku wodnym, w temperaturze pokojowej, pod ciśnieniem normalnym, a następnie oczyszcza za pomocą membran dializacyjnych, korzystnie o MWCO = 1000 Da.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako surowiec do produkcji węglowych kropek kwantowych stosuje się biomasę zawierającą co najmniej jeden substrat o aktywności biologicznej.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że do reakcji modyfikacji węglowych kropek kwantowych aminową pochodną kumaryny oraz 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu wykorzystuje się roztwór niezmodyfikowanych węglowych kropek kwantowych zawierających na swojej powierzchni wolne grupy karboksylowe jako roztwór wodny w stężeniu 25 mg/ml.

4. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że na każdy 1 mg węglowych kropek kwantowych stosuje się od 3 do 3,7 μmol barwnika fluorescencyjnego z grupy kumaryn zawierającego wolną grupę aminową w pierścieniu aromatycznym, korzystnie 7-amino-4-metylokumarynę oraz 7-amino-4-(trifluorometylo)kumarynę, stosując stężenie barwnika w zakresie 0,2-1,0 mg/ml, korzystnie 1 mg/ml.

5. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-4, znamienny tym, że na każdy 1 mol barwnika fluorescencyjnego z grupy kumaryn zawierającego jedną grupę aminową w pierścieniu aromatycznym stosuje się 1-1,2 mola czynnika sprzęgającego EDC, korzystnie 1,1 mola czynnika EDC w postaci roztworu wodnego.

6. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-5, znamienny tym, że do modyfikacji chemicznej węglowych kropek kwantowych w celu wizualizacji struktur biologicznych metodą mikroskopii fluorescencyjnej w zakresie widzialnym stosuje się nietoksyczną aminową pochodną kumaryny o zakresie emisji fluorescencji w zakresie 380-800 nm.

7. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-6, znamienny tym, że reakcję karbonizacji prowadzi się w zamkniętym, naczyniu reakcyjnym w polu promieniowania mikrofalowego o mocy 200 W przez 60 minut, pod ciśnieniem 9-10 Atm.

8. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-6, znamienny tym, że reakcję karbonizacji prowadzi się w zamkniętym, naczyniu reakcyjnym w polu promieniowania mikrofalowego o mocy 800 W przez 4 minuty.