PL249228B1

PL249228B1 - Sposób oznaczania biomarkerów białkowych MMP-1 i SP-A idiopatycznego włóknienia płuc w płynach ustrojowych i chemosensor do selektywnego oznaczania biomarkerów idiopatycznego włóknienia płuc

Info

Publication number: PL249228B1
Application number: PL446053A
Authority: PL
Inventors: Katarzyna Bartołd; Krzysztof Noworyta; Andrzej Ardasiewicz; Piyush Sindhu Sharmaa; Włodzimierz Kutner
Original assignee: Inst Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2023-09-07
Filing date: 2023-09-07
Publication date: 2026-03-09
Also published as: PL446053A1

Abstract

Przedmiotem niniejszego zgłoszenia jest sposób jednoczesnego molekularnego wdrukowania trzech epitopów MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) w polimerze i osadzenia tego molekularnie wdrukowanego polimeru w postaci cienkiej warstwy na elektrodzie złotej albo na złoconej płytce szklanej, sposób oznaczania białkowego biomarkera MMP-1 idiopatycznego włóknienia płuc w płynach ustrojowych, sposób oznaczania biomarkerów białkowych MMP-1 i SP-A idiopatycznego włóknienia płuc w płynach ustrojowych oraz jednostka rozpoznawania molekularnego do selektywnego oznaczania biomarkerów idiopatycznego włóknienia płuc.

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu oznaczania biomarkerów białkowych MMP-1 i SP-A idiopatycznego włóknienia płuc w płynach ustrojowych i chemosensora do selektywnego oznaczania biomarkerów idiopatycznego włóknienia płuc.

Twórcy niniejszego wynalazku opracowali i przetestowali stosunkowo szybką i prostą procedurę oznaczania biomarkerów białkowych MMP-1 i SP-A samoistnego (idiopatycznego) włóknienia płuc (ang. idiopathic pulmonary fibrosis, IPF). Ich podwyższone stężenie w płynach ustrojowych wskazuje na występowanie IPF. IPF to choroba postępująca, której śmiertelne żniwo jest prawie takie samo, jak np. raka piersi. Ostatnio koronawirus przyczynił się do zaostrzenia objawów u pacjentów cierpiących na IPF. W niniejszych badaniach cząsteczki wybranych epitopów białkowych biomarkerów IPF zostały molekularnie wdrukowane w przewodzące polimery jako korzystna alternatywa wdrukowania podatnych na uszkodzenie całych cząsteczek tych biomarkerów. Aby zbudować selektywnie rozpoznający biomarkery IPF czujnik chemiczny (chemosensor), który nadawałby się do zastosowania jako urządzenie diagnostyczne do przeprowadzania oznaczeń w miejscu opieki (ang. point-of-care testing, POCT) pacjenta, jednostkę rozpoznającą czujnika w postaci cienkiej warstwy przewodzącego polimeru molekularnie wdrukowanego (ang. molecularly imprinted polymer, MIP) jednym lub kilkoma epitopami scalono z rozszerzoną bramką tranzystora polowego (ang. extended-gate field-effect transistor, EG-FET). Wdrukowanie pojedynczego epitopu umożliwiło oznaczanie biomarkera MMP-1 w liniowym dynamicznym zakresie stężeń 10-250 nM z granicą wykrywalności (ang. limit of detection, LOD) wynoszącą 7,5 nM MMP-1. Chemosensor ten był selektywny względem innych białek występujących w surowicy w tym innych biomarkerów IPF. Równoczesne wdrukowanie trzech epitopów biomarkera MMP-1 obniżyło LOD, korzystnie, do 0.1 nM, co umożliwiło oznaczenie tego biomarkera w próbkach surowicy. Ponadto, aby wykazać wszechstronność procedury molekularnego wdrukowania epitopu w polimer, przez wdrukowanie pojedynczego epitopu, zbudowano chemosensor do oznaczania biomarkera SP-A. Chemosensor ten nadawał się do selektywnego oznaczania SP-A z LOD = 1,9 nM SP-A, tj. korzystnie, z wykrywalnością na tyle niską, że umożliwiała ona oznaczanie tego biomarkera w płynach ustrojowych.

Tło wynalazku

Samoistne (idiopatyczne) włóknienie płuc (ang. idiopathic pulmonary fibrosis, IPF), postępująca choroba śmiertelna charakteryzująca się nadmiernym rozkładem miąższu i włóknieniem płuc, niszczy je, powodując nieodwracalną utratę zdolności płuc do wchłaniania tlenu (Peng, Z. et al., ACS Pharmacol. Transi. Sci. 2022, 5, 548). Liczba zgłoszonych przypadków odzwierciedla powagę sytuacji. Łączna liczba zdiagnozowanych przypadków IPF w USA, Niemczech, Hiszpanii, Francji, Włoszech i Japonii w 2021 roku wyniosła 194 878 (Idiopathic Pulmonary Fibrosis - Market Insight, Epidemiology and Market Forecast - 2032. 2022). Oczekuje się, że liczba ta wzrośnie. Najwyższą liczbę zdiagnozowanych przypadków IPF, tj. 94 736, odnotowano w USA. Szacuje się, że na całym świecie na chorobę tę cierpi 3 miliony osób (Martinez, F. J. et al., Nat. Rev. Dis. Primers 2017, 3, 17074). Pacjenci z IPF umierają w ciągu 2-3 lat od postawienia diagnozy (Vij, R. et al., Transl. Res. 2012 159, 218). Oczekiwana roczna liczba zgonów z powodu IPF tylko w samych Stanach Zjednoczonych (Raghu, G. et al., Am J. Respir. Crit. Care Med. 2006, 174, 810) wkrótce osiągnie liczbę zgonów, których przyczyną jest rak piersi. Liczba ta ostatnio dodatkowo rośnie z powodu infekcji wirusowych, np. COVID-19 (Fadista, J. et al., EBioMedicine 2021, 65, 103277). Dlatego opracowanie szybkiej i niezawodnej metody diagnozowania IPF jest ze wszech miar pożądane.

Metaloproteinazy macierzy (ang. matrix metalloproteinases, MMPs) pozakomórkowej należą do najszerzej badanych proteaz występujących w wielu chorobach przewlekłych, w tym w nowotworach, chorobach kardiometabolicznych i chorobach płuc (Ahmad, N. et al., Sensors 2019, 19, 1677; Hua, Y. and Nair, S., Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis. 2015, 1852, 195). Podejrzewaną przyczyną patofizjologii IPF jest rozregulowanie i wydzielanie MMP przez stymulowane komórki zapalne (Gueders, M. M. et al., Eur. J. Pharmacol. 2006, 533, 133). Jednakże wciąż brak dokładnego wyjaśnienia mechanizmu tego procesu. Zaproponowano, że w IPF dochodzi do ekspresji genów MMP-1, MMP-2 i MMP-7 (Pardo, A. and Selman, M., Proc. Am. Thorac. Soc. 2006, 3, 383). Dlatego MMPs są traktowane jako biomarkery. Wczesne wykrywanie i kontrolowanie aktywności tych biomarkerów może przyczynić się do skutecznej terapii IPF.

Pęcherzyki płucne są wyściełane obniżającym napięcie powierzchniowe płucnym środkiem powierzchniowo czynnym (surfaktantem). Zapobiega on niedodmie podczas oddychania. Środek ten zawiera fosfolipid dipalmitoilofosfatydylocholiny i cztery związane z nim białka (ang. surfactant-associated proteins, SPs), tj. SP-A, SP-B, SP-C i SP-D (Han, S. and Mallampalli, R. K., Ann. Am. Thorac. Soc. 2015, 12, 765). Białka SP-A i SP-D należą do rodziny lektyn osocza krwi typu C, wrodzonych białek odpornościowych zwanych kolektynami (Crouch, E. et al., Immunol. Rev. 2000, 173, 52; Crouch, E. and Wright, J. R., Annu. Rev. Physiol. 2001, 63, 521). W wielu chorobach płuc występują nieprawidłowości w wytwarzaniu lub funkcjonowaniu surfaktantu, a infekcje płuc zmieniają jego metabolizm. Polimorfizmy genetyczne SP-ów wpływają na częstsze występowanie IPF (Lawson, W. E. et al., Thorax 2004, 59, 977; Selman, M. et al., Hum. Genet. 2003, 113, 542).

Test immunoenzymatyczny (ang. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) jest głównie przeznaczony do oznaczania MMP-ów i SP-ów w próbkach klinicznych (Kowalczyk, A. et al., J. Mater. Chem. B 2022, 10, 8696). Jednakże przygotowanie przeciwciał do tego testu jest pracochłonne i kosztowne. Ponadto wytworzone przeciwciała są stosunkowo nietrwałe, a ich aktywność może ulec zablokowaniu, przez co wyniki testów ELISA mogą być zafałszowane (Sakamoto, S. et al., J. Nat. Med. 2018, 72, 32).

Techniki elektrochemiczne są w drugiej kolejności wśród najczęściej stosowanych sposobów oznaczania aktywnych form MMP-ów (Kou, B.-B. et al., Anal. Chem. 2017, 89, 9383; Kowalczyk, A. et al., J. Mater, Chem. B 2022, 10, 8696; Xi, X. et al., Chem. Commun. 2020, 56, 6039). Ostatnio opracowano układ czujników elektrochemicznych wykorzystujący białka do oznaczenia MMP-1 (Kowalczyk, A. et al., J. Mater. Chem. B 2022, 10, 8696). W czujnikach tych aktywna postać MMP hydrolizowała wiązanie peptydowe i uwalniała kowalencyjnie związany znacznik elektrochemiczny, co prowadziło do obniżenia prądu faradajowskiego. Obniżenie to było zależne od stężenia MMP w roztworze badanym.

Polimery wdrukowane molekularnie (ang. molecularly imprinted polymers, MIPs), „sztuczne przeciwciała”, coraz częściej są stosowane jako jednostki rozpoznające w chemosensorach (Mustafa, Y. L. et al., J. Mater. Chem, B 2022, 10, 7418). Są one stosowane jako zamienniki bioreceptorów, np. enzymów i przeciwciał. MlP-y są selektywne (nie są specyficzne), ponieważ zawierają, wdrukowane przez szablony, molekularne wnęki z miejscami rozpoznawania generowanymi przez te szablony. Struktura tych wnęk zależy od struktury pre-polimeryzacyjnego kompleksu szablonu z monomerami funkcyjnymi (ang. functional monomers, FMs). O postępie w badaniach molekularnego wdrukowania w polimery świadczy szybko rosnąca na ten temat liczba publikacji (Chen, H. et al., Adv. Sci. 2022, 9, 2202038). MIP-y są szeroko stosowane do selektywnego rozpoznawania zarówno związków nisko- jak i wysokocząsteczkowych (Piletsky, S. et al., Trends Biotechnol. 2020, 38, 368; Sikolenko, T. et al., Curr. Opin, Electrochem. 2022, 36, 101151; Ayerdurai, V. et al., TrAC - Trends Anal. Chem. 2023, 158, 116830).

Testy POCT obejmują medyczne badania diagnostyczne w czasie i miejscu opieki pacjenta, a nie w laboratorium klinicznym (Tu, J. et al., Adv. Funct. Mater. 2020, 30, 1906713). POCT-y zastępują nieporęczne, z uwagi na swoją wielkość i masę, przyrządy kliniczne i testy wymagające wysokich umiejętności ich przeprowadzenia. Urządzenia POCT natomiast można obsługiwać po krótkim i prostym przeszkoleniu, umożliwiającym szybkie uzyskanie dokładnych wyników (Shaw, J. L. V., Practic. Lab. Med. 2016, 4, 22). Wychodzą one naprzeciw oczekiwaniom systemom opieki zdrowotnej, którym zależy na szybkiej, terminowej diagnostyce. Jednak z przeprowadzeniem POCT-ów wiąże się kilka niedogodności. Na ogół POCT-y są mniej czułe i często zebrane dane są zafałszowane zakłóceniami. Na przykład na wskazania glukometru, jednego z najczęściej stosowanych urządzeń typu POCT, ma wpływ poziom hematokrytu (wskaźnika określającego objętościowy stosunek krwinek czerwonych do krwi pełnej) i kwasu askorbinowego we krwi pacjenta (Shaw, J. L. V., Practic. Lab. Med. 2016, 4, 22). Dlatego urządzenia POCT-ów wymagają podwyższenia selektywności.

Ostatnio wiele różnych MIP-ów scalono z przenośnymi układami analitycznymi w celu wytworzenia urządzeń typu POCT (Beduk, T. et al., Front Chem. 2022, 10, 833899; Huang, C.-Y. et al., Biosens. Bioelectron. 2007, 22, 1694; Venkatesh, S. et al., J. Hazard. Mater. 2021,410, 124609; Raziq, A. et al., Biosens. Bioelectron. 2021, 178 113029; McClements, J. et al., ACS Sens. 2022, 7, 1122; Cennamo, N. et al., Sensors 2015, 15, 8499). Głównie służyły temu potencjostaty (Beduk, T. et al., Front. Chem. 2022, 10, 833899; Huang, C.-Y. et al., Biosens. Bioelectron. 2007, 22, 1694; Raziq, A. et al., Biosens. Bioelectron . 2021, 178 113029).

Celem niniejszego wynalazku było zatem opracowanie sposobu selektywnego oznaczania biomarkerów MMP-1 i SP-A w płynach ustrojowych, sposobu jednoczesnego molekularnego wdrukowania trzech epitopów MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) do zastosowania w sposobie selektywnego oznaczania biomarkera MMP-1 w płynach ustrojowych oraz sposobu molekularnego wdrukowania epitopu FSSNGQSIT (SEQ ID NO: 5) i sposobu molekularnego wdrukowania epitopu YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6) do zastosowania w sposobie

PL 249228 Β1 selektywnego oznaczania biomarkera SP-Aw płynach ustrojowych oraz opracowanie czujnika chemicznego do selektywnego oznaczania biomarkerów MMP-1 i SP-Aw płynach ustrojowych.

Cel ten został zrealizowany przez przedmioty niniejszego wynalazku.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób jednoczesnego molekularnego wdrukowania trzech epitopów MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) w polimerze i osadzenia tego molekularnie wdrukowanego polimeru w postaci cienkiej warstwy na elektrodzie złotej albo na złoconej płytce szklanej, obejmujący etapy, w których: - przygotowuje się roztwór trzech epitopów MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) jako szablonów do wdrukowania, każdy o stężeniu 10-30 μΜ, korzystnie 20 μΜ, stosując mieszaninę acetonitrylu, toluenu i wody dejonizowanej o stosunku objętościowym korzystnie wynoszącym 6,0 : 3,7 : 0,3;

FM CLM

- przygotowuje się roztwór kompleksu pre-polimeryzacyjnego dodając do powyżej przygotowanego roztworu trzech epitopów, kwas {5E-5-[4-(difenyloamino)benzylideno]-4-okso-2-tioksotiazolidyn-3ylojoctowy jako monomer funkcyjny FM, osiągając jego stężenie 180 pM, 2,2',3,3'-tetrahydro-5,5'-bitieno[3,4-b][1,4]ditlenekjako monomer sieciujący CLM, osiągając jego stężenie 740 μΜ oraz (TBA)CIO4 jako elektrolit podstawowy, osiągając jego stężenie 0,1 M, w stosunku molowym FM : CLM : szablon, wynoszącym 3:4:1;

- w celu jednoczesnego wytworzenia molekularnie wdrukowanego polimeru i osadzenia go w postaci cienkiej warstwy na elektrodzie złotej albo złoconej płytce szklanej, otrzymaną powyżej mieszaninę prepolimeryzacyjną poddaje się elektropolimeryzacji za pomocą pięciu cykli potencjodynamicznych w zakresie od 0 do 1,0 V względem srebrowej elektrody quasi-odniesienia, przy szybkości polaryzacji 50 mV s¹; - po osadzeniu, warstwę molekularnie wdrukowanego polimeru dokładnie przepłukuje się mieszaniną acetonitrylu i toluenu w celu usunięcia niezwiązanych składników kompleksu pre-polimeryzacyjnego i elektrolitu podstawowego;

- po czym epitopy-szablony ekstrahuje się z molekularnie wdrukowanego polimeru za pomocą 0,5 mM trietyloaminy w czasie od 30 minut do 1,5 godziny.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób oznaczania białkowego biomarkera MMP-1 idiopatycznego włóknienia płuc w płynach ustrojowych obejmujący etapy, w których:

- przygotowuje się elektrodę złotą pokrytą warstwą molekularnie jednocześnie wdrukowanych w polimer trzech epitopów MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) sposobem zdefiniowanym powyżej;

- otrzymaną powyżej elektrodę złotą pokrytą warstwą molekularnie jednocześnie wdrukowanych trzech epitopów doprowadza się do kontaktu z próbką badanego płynu ustrojowego w układzie pomiarowym mierzącym zmianę natężenia prądu drenu przy zadanym napięciu bramki.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób oznaczania biomarkerów białkowych MMP- 1 i SP-A idiopatycznego włóknienia płuc w płynach ustrojowych obejmujący etapy, w których:

- przygotowuje się pierwszą elektrodę złotą pokrytą warstwą molekularnie wdrukowanych jednocześnie w polimer trzech epitopów MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) sposobem zdefiniowanym powyżej;

- przygotowuje się drugą elektrodę złotą z warstwą molekularnie wdrukowanych epitopów FSSNGOSIT (SEQ ID NO: 5) albo epitopu YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6) albo dwóch epitopów FSSNGOSIT (SEQ ID NO: 5) i YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6) w polimerze sposobem zdefiniowanym powyżej;

- otrzymaną powyżej pierwszą elektrodę złotą z warstwą molekularnie wdrukowanych trzech epitopów doprowadza się do kontaktu z próbką badanego płynu ustrojowego w układzie pomiarowym mierzącym natężenie prądu drenu przy zadanym napięciu bramki;

- otrzymaną powyżej drugą elektrodę złotą z warstwą molekularnie wdrukowanego epitopu FSSNGQSIT (SEQ ID NO: 5) albo epitopu YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6) albo dwóch epitopów FSSNGQSIT (SEQ ID NO: 5) i YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6) doprowadza się do kontaktu z próbką badanego płynu ustrojowego w układzie pomiarowym mierzącym natężenie prądu drenu przy zadanym napięciu bramki.

Kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest jednostka rozpoznawania molekularnego do selektywnego oznaczania biomarkerów idiopatycznego włóknienia płuc obejmująca złotą elektrodę z warstwą molekularnie wdrukowanego polimeru otrzymaną sposobem zdefiniowanym powyżej, przy czym jako szablon epitopu zastosowano:

- mieszaninę epitopów MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) albo

- którykolwiek z epitopów FSSNGQSIT (SEQ ID NO: 5) i YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6) albo

- mieszaninę dwóch epitopów FSSNGQSIT (SEQ ID NO: 5) i YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6).

Według niniejszego wynalazku opracowano sposób selektywnego oznaczania biomarkerów MMP-1 i SP-A w płynach ustrojowych z wykorzystaniem nowego przenośnego chemosensorowego urządzenia tranzystorowego. W chemosensorze tym zastosowany został przetwornik sygnału w postaci sparowanych 8 tranzystorów polowych z rozszerzonymi bramkami (ang. extended-gate field-effect transistors, EG-FETs) zintegrowanymi z jednostkami rozpoznawania molekularnego w postaci warstw MIP-ów. Tranzystory EG-FET zyskują coraz większą popularność w zastosowaniu do budowy chemo- i biosensorów z uwagi na ich niski koszt, niskie zużycie energii, wysoką odporność na czynniki zewnętrzne, np. zmiany oświetlenia i temperatury, łatwość scalenia z jednostkami rozpoznającymi chemicznie i biochemicznie oraz łatwość miniaturyzacji (Iskierko, Z. et al., Biosens. Bioelectron. 2018, 109, 50; Pullano, S. A. et al., Sensors 2018, 18, 4042; Bartold, K. et al., Biosens. Bioelectron. 2022, 208, 114203). Niniejszy wynalazek nie wykorzystuje wrażliwych na uszkodzenia makromolekularnych jednostek rozpoznawania biochemicznego, takie jak białka, do selektywnego oznaczania biomarkerów, natomiast jako te jednostki stosowane są syntetyczne receptory typu MIP. Do przygotowania tych MIP-ów zastosowano monomery funkcyjne i sieciujące zdolne do elektropolimeryzacji. Jako szablony wdrukowania wybrano epitopy, tj. krótkie peptydy występujące na obrzeżach cząsteczki białka, jako alternatywę wdrukowania całej, wrażliwej na uszkodzenia, cząsteczki białka (Khumsap, T. et al., RSC Advances 2021, 11, 11403-11414; Yang, K. et al., Adv. Mater. 2019, 31,1902048). Dzięki temu udało się uniknąć ograniczeń narzuconych przy wdrukowaniu całych cząsteczek białek.

Zwięzły opis figur rysunku

Przedmioty niniejszego wynalazku przedstawiono na figurach rysunku, gdzie:

na Fig. 1a pokazano „wybuchowy” i złożeniowy widok modułu EG8-COATER z ponumerowanymi i opisanymi częściami składowymi;

na Fig. 1b pokazano „wybuchowy” i złożeniowy widok modułu EG8-POWER z ponumerowanymi i opisanymi częściami składowymi;

na Fig. 1c pokazano fotografię matrycy 16 złotych minielektrod;

na Fig. 2 przedstawiono przepływ sygnałów pomiędzy funkcjonalnymi podzespołami modułu EG8-POWER;

na Fig. 3 pokazano krzywe potencjodynamiczne pięciu cykli prądowo-potencjałowych zastosowanych w celu jednoczesnej elektropolimeryzacji i osadzania na matrycy złotych minielektrod warstwy (a) MIP-u molekularnie wdrukowanych epitopowym szablonem AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) i (b) warstwy NIP-u;

na Fig. 4 pokazano obrazy AFM niepokrytej mikroelektrody złotej i warstw MIP-ów z szablonem epitopu MMP-1 przed i po ekstrakcji szablonu oraz warstwy NIP-u przed i po opłukaniu roztworem do ekstrakcji;

na Fig. 5 pokazano obrazy AFM warstw MIP-ów zawierających szablony epitopów biomarkera SP-A;

na Fig. 6 pokazano krzywe kalibracyjne skonstruowane przy zastosowaniu chemosensora EG-FET z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą MIP-u;

na Fig. 7 pokazano skorygowaną na prąd tła zmiana prądu drenu EG-FET (Δ/ds) w czasie, krzywą kalibracyjną dla analitu MMP-1 oraz krzywe kalibracyjne dla białek MMP-1, SP-A i MMP-7;

na Fig. 8 pokazano krzywe kalibracyjne skonstruowane przy zastosowaniu chemosensora EG-FET z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą MIP-u, molekularnie wdrukowanego szablonem FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3);

na Fig. 9 pokazano zmiany w czasie prądu drenu chemosensora EG-FET z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą MIP-u z wdrukowanym a następnie wyekstrahowanym epitopowym szablonem FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) oraz krzywe kalibracyjne dla różnych biomarkerów IPF, skonstruowane przy użyciu chemosensora EG-FET z rozszerzoną bramką pokrytą MIP-em z molekularnie wdrukowanym a następnie wyekstrahowanym epitopowym szablonem FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3);

na Fig. 10 pokazano zmiany prądu drenu EG-FET po dodaniu do roztworu badanego biomarkera MMP-1 o coraz większych stężeniach dla warstwy MIP-u jednocześnie wdrukowanej szablonami trzech epitopów, tj. MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) oraz krzywą kalibracyjną dla analitu MMP-1;

na Fig. 11 pokazano krzywą kalibracyjną dla analitu SP-A;

na Fig. 12 pokazano zmianę w czasie prądu drenu dla białka SP-A o coraz większych stęże- niach;

na Fig. 13 pokazano krzywe kalibracyjne dla biomarkera MMP-1 skonstruowane przy użyciu chemosensorów EG-FET z rozszerzonymi bramkami przed i po przechowywaniu w szczelnym pojemniku z powietrzem nasyconym parami acetonitrylu przez dwa tygodnie.

PRZYKŁADY

Materiały i procedury

Reagenty i odczynniki

Wybrane epitopy biomarkera MMP-1, tj. AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3), oraz epitopy biomarkera SP-A, tj. FSSNGQSIT (SEQ ID NO: 5) i YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6), o czystości klasy HPLC, zakupiono w firmie Yao-Hong Biotechnology Inc. (New Taipei City, Tajwan). Pozostałe dwa epitopy MMP-1, tj. MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1) i HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2), o czystości klasy HPLC, dostarczyła firma Thermo Fisher Scientific (Warszawa, Polska). Monomer sieciujący (ang. cross-linking monomer, CLM), 2,2',3,3'-tetrahydro-5,5'-bitieno[3,4-b][1,4]ditlenek (bis-EDOT), zakupiono w firmie Fluorochem (Glossop, Wielka Brytania). Monomer funkcyjny, kwas trifenyloaminorodanino-3-octowy, zsyntetyzowano zgodnie z procedurą opisaną w literaturze (Lee, M.-H. et al., Biosens. Bioelectron.: X 2023, 13, 100258; Yang, C.-H. et al., Electrochem. Commun. 2009, 11, 335). Rekombinowane ludzkie białko MMP-1 i bezwodne rozpuszczalniki, tj. acetonitryl, toluen i trietyloaminę, zakupiono w firmie Sigma-Aldrich. Białko SP-A otrzymano z firmy Abcam (ab254309). Etanol pochodził z firmy POCH (Gliwice, Polska). Kwas 2-( N-morfolino)etanosulfonowy (MES) o czystości przewyższającej 99% zakupiono w firmie Roth (Karlsruhe, Niemcy).

Elektrochemiczne zestawy pomiarowe i przenośne układy pomiarowe EG-FET

Matrycę złotych minielektrod pracujących, w postaci mozaiki nadrukowanych ośmiu par dyskowych minielektrod, każda o powierzchni 1,81 mm² (Fig. 1c), zakupiono, na zamówienie, w firmie Satland Prototype (Gdańsk, Polska). Przed użyciem matrycę przepłukano acetonem, następnie metanolem, po czym poddano działaniu ultradźwięków w acetonie przez 10 minut. Następnie matrycę tę zamontowano w domowej konstrukcji cylindrycznym mininaczynku elektrochemicznym o objętości ~1 ml, wykonanym z polieteroeteroketonu [ang. poly(ether ether ketone), PEEK], Matryca ta stanowiła denko tego mininaczynka. Jako elektrodę quasi-odniesienia i przeciwelektrodę zastosowano, odpowiednio, prosty drut Ag i zwinięty w spiralę drut Pt. Przeciwelektrodę umieszczono równolegle do poziomo zamontowanej matrycy minielektrod. Mininaczynko to najpierw zamontowano w module EG8-COATER firmy AndArd Elektronika, Warszawa, Polska (Fig. 1a). Następnie wypełniono je roztworem kompleksu pre-polimeryzacyjnego, aby z wykorzystaniem elektropolimeryzacji potencjodynamicznej tego kompleksu wytworzyć MlP-y i jednocześnie osadzić je na złotych minielektrodach. W tym celu minielektrody, kolejno lub wszystkie jednocześnie, utrzymywano przy stałym potencjale z wykorzystaniem potencjostatu SP-300 Modular Research Grade Potentiostat (Bio-Logic Science Instruments) kontrolowanego przez oprogramowanie EC-lab tego samego producenta.

Po usunięciu z mininaczynka roztworu do elektropolimeryzacji, przepłukaniu minielektrod, a następnie wyekstrahowaniu szablonów epitopów z warstw MIP-ów, mininaczynko przeniesiono do modułu EG8-POWER firmy AndArd Elektronika, Warszawa, Polska (Fig. 1b). Moduł ten to elektroniczne urządzenie pomiarowe, które kontroluje, gromadzi i przetwarza dane pozyskane z minielektrod. Na Fig. 2 przedstawiono przepływ sygnałów pomiędzy funkcjonalnymi podzespołami modułu EG8-POWER. Następnie mininaczynko napełniono roztworem badanym, aby oznaczyć w nim anality - biomarkery i ich epitopy. W tym oznaczaniu minielektrody pokryte warstwami polimerów służyły jako rozszerzone bramki chemosensora EG8-POWER, zawierającego dwa sparowane tranzystory MOSFET typu n model ALD210808 (Advanced Linear Devices, Inc.). Warstwa złota na zewnątrz 16 minielektrod (Fig. 1c) spełniała rolę elektrody odniesienia w pomiarach z wykorzystaniem (EG-FET)-a. Tranzystory z rozszerzonymi bramkami pokrytymi warstwami MIP-ów scharakteryzowano elektrycznie przy użyciu mininaczynka wypełnionego buforem MES (pH = 6,4) o objętości 0,5 ml.

Na Fig. 1a pokazano „wybuchowy” i złożeniowy widok modułu EG8-COATER z ponumerowanymi i opisanymi częściami składowymi, przy czym wskazanymi poniżej numerami oznaczono odpowiednio:

1. Matryca 16 złotych minielektrod, 2x8,

2. O-ring, 13x1,

3. Mininaczynko (PEEK),

4. Śruby,

5. Pokrywki (Teflon),

6. Przeciwelektroda z drutu platynowego (zatopionego w szklanej rurce),

7. Uchwyt,

8. O-ring, 0,74x1,02,

9. Gwintowana zatyczka (Teflon), M4,

10. Elektroda quasi-odniesienia z drutu srebrnego,

11. O-ring, 6x2,

12. Gwintowana zatyczka (Teflon), M11/1,

13. Elektroda pracująca (WE),

14. Elektroda odniesienia (RE),

15. Przeciwelektroda (CE),

16. Uziemienie.

Na Fig. 1b pokazano „wybuchowy” i złożeniowy widok modułu EG8-POWER z ponumerowanymi i opisanymi częściami składowymi, przy czym wskazanymi poniżej numerami oznaczono odpowiednio:

1. Matryca 16 złotych minielektrod, 2x8,

2. O-ring, 13x1,

3. Mininaczynko (PEEK),

4. Śruby,

5. Przeciwelektroda z drutu platynowego (zatopionego w szklanej rurce),

6. Uchwyt,

7. O-ring, 0,74x1,02,

8. Gwintowana zatyczka (Teflon), M4,

9. Elektroda quasi-odniesienia z drutu srebrnego,

10. O-ring, 6x2,

11. Gwintowana zatyczka, M11/1,

12. Pokrywki (Teflon),

13. Kabel USB,

14. Zasilacz,

15. Znacznik pomiaru,

16. LED,

17. Włącznik/wyłącznik;

Na Fig. 2 przedstawiono przepływ sygnałów pomiędzy funkcjonalnymi podzespołami modułu EG8-POWER.

Moduł EG8-POWER - Funkcjonalny opis budowy i działania modułu zasilania i pomiaru parametrów pracy matrycy chemosensorów EG-FET

Moduł EG8-POWER to elektroniczne urządzenie pomiarowe, które zarządza sterowaniem, naborem i przetwarzaniem danych uzyskanych z miniaturowego elektrochemicznego naczynka pomiarowego, którego denko stanowi wymienialna płytka z nadrukowaną mozaiką ośmiu par złotych minielektrod dyskowych, każda o powierzchni 1,81 mm². Zamieszczony na Fig. 2, poniżej, schemat blokowy EG8-POWER obrazuje przepływ sygnałów pomiędzy blokami funkcjonalnymi układu pomiarowego.

Cały układ pomiarowy jest sterowany przez mikroprocesorowy kontroler MICRO CONTROLLER. Kontroler ten ustala tryb pracy układu, odczytuje dane pomiarowe i przesyła je przez złącze USB pod nadzorem oprogramowania EG8-SYSTEM do nadrzędnego komputera.

Przetworniki C/A bloku MEASURING VOLTAGE generują napięcia pomiarowe Vds i Vgs przykładane do układu minielektrod w naczynku pomiarowym. Dla Vds napięcie to jest generowane w zakresie od 0 do 7,5 V z wydajnością do 10 mA a dla Vgs od 0 do 5 V. Rozdzielczość nastaw tych napięć wynosi 10 mV.

Selektor CHOICE OF USE PAIR EG-FET umożliwia wybór pary numer n, z 8 par (EG-FET)-ów, biorącej czynny udział w eksperymencie. Przepływ mierzonego prądu Δ/ds wymuszany jest na wybranych chemosensorach.

Blok MATRIX CHECK kontroluje obecność matrycy minielektrod w dedykowanym uchwycie, sygnalizując i blokując pomiar w przypadku braku jej obecności.

Blok MEASURING RANGE l-V ustala zakres pomiaru mierzonego prądu Δ/ds. Umożliwia on wybór między zakresem 10 a 3,33 mA. Pozwala to na pomiar z rozdzielczością, odpowiednio, 0,3 lub 0,1 μA.

Selektor MEASURING MODE ustala tryb pracy poszczególnych par chemosensorów. Pary te mogą pracować w trybie różnicowym lub indywidualnie.

Blok MESURING RESOLUTION umożliwia podwyższenie wzmocnienia toru pomiarowego w trybie różnicowym, co prowadzi do podwyższenia rozdzielczości pomiaru prądów do poziomu ~6 nA.

Blok MUX INPUT kolejno przetwarza zebrane sygnały do postaci cyfrowej za pomocą przetwornika A/C o rozdzielczości 15 bitów. Δ

Blok AC/DC CONVERTERS SET przetworników napięć zasilania układu zasilany jest z zewnętrznego zasilacza wtyczkowego AC ADAPTER.

Na wczesnym etapie niniejszych badań jako rozszerzone bramki układu sensorycznego EG-FET zastosowano warstwy MIP-ów wdrukowanych szablonem epitopu, osadzone na płytkach szklanych pokrytych warstwą złota na podłożu tytanowym o powierzchni ~24 mm². Układ ten służył do oznaczania analitów-epitopów w roztworze badanym. W tym celu wykorzystano dwukanałowe programowalne źródło mierzące SourceMeter Keithley 2636A (Keithley Instruments, Inc. OH, USA) i komercyjny tranzystor polowy z półprzewodnikowego tlenku metalu (ang. metal-oxide semiconductor field-effect transistor, MOSFET) model CD4007UB (Texas Instruments). Konfiguracja pomiarowa (EG-FET)-u obejmowała jednostkę rozpoznającą chemicznie w postaci warstwy MIP-u z wdrukowanym epitopowym szablonem zintegrowaną z jednostką przetwarzania sygnału - rozszerzoną bramką - w postaci płytki szklanej pokrytej warstwą złota na podłożu tytanowym. Złocona płytka szklana o powierzchni ~24 mm², niepokryta warstwą MIP-u, służyła jako elektroda odniesienia. Zamontowano ją w odległości ~10 mm, równolegle do rozszerzonej bramki pokrytej warstwą polimeru.

Przygotowanie warstw MIP-ów molekularnie wdrukowanych epitopami białek MMP-1 i SP-A

Białko można selektywnie oznaczyć rozpoznając kilka jego charakterystycznych epitopów. Z wcześniejszego zaawansowanego modelowania komputerowego (Bartold, K. et al., Biosens. Bioelectron. 2022, 208, 114203) wynika, że cztery najbardziej odpowiednie epitopy białka MMP-1 to MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3). Sposób molekularnego wdrukowania dwóch pierwszych z nich, tj. MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1) i HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) został już opracowany (Bartold, K. et al., Biosens. Bioelectron. 2022, 208, 114203). W niniejszych badaniach opracowana została metoda wdrukowania dwóch kolejnych epitopów, tj. AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3). Tutaj sprawdzono również, czy jednoczesne wdrukowanie kilku epitopów tego samego biomarkera białkowego poprawia selektywność i wykrywalność opracowanego i wytworzonego chemosensora typu MIP. FM-y i CLM-y odpowiednie do wdrukowania epitopów MMP-1 zostały wybrane wcześniej (Bartold, K. et al., Biosens. Bioelectron. 2022, 208, 114203). Wcześniejsze modelowanie komputerowe potwierdziło przydatność {5E-5-[4 kwasu-(difenyloamino)benzylideno]-4-okso-2-tiokso-tiazolidyn-3-ylo}octowego jako FM-u (Bartold, K. et al., Biosens. Bioelectron. 2022, 208,114203).

PL 249228 Β1

FM CLM

Powyżej przedstawione są wzory strukturalne monomeru funkcyjnego (FM), kwasu {5E-5-[4-(difenyloamino)benzylideno]-4-okso-2-tiokso-tiazolidyn-3-ylo}octowego i monomeru sieciującego (CLM), 2,2',3,3'-tetrahydro-5,5'-bitieno[3,4-b][1,4]ditlenku (b/s-EDOT) stosowanych do molekularnego wdrukowania epitopów MMP-1 i SP-A.

Aby osadzić warstwę MIP-u na elektrodzie, przygotowano roztwór 20 pM epitopu-szablonu (AQDDIDGIOAI (SEQ ID NO: 4) lub FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) w mieszanych rozpuszczalnikach, acetonitrylu, toluenu i wody dejonizowanej o stosunku objętościowym wynoszącym 6,0 : 3,7 : 0,3. Aby w tym roztworze powstał pre-polimeryzacyjny kompleks szablonu z FM, do 0,1 M (TBA)CIO4 roztworu elektrolitu podstawowego dodano roztwór FM-u, CLM-u i szablonu w stosunku molowym FM : CLM : : szablon, wynoszącym 3:4:1. Następnie, w celu jednoczesnego wytworzenia MIP-u i osadzenia go w postaci cienkiej warstwy na elektrodzie złotej, kompleks ten poddano elektropolimeryzacji z wykorzystaniem pięciu cykli potencjodynamicznych w zakresie od 0 do 1,0 V względem srebrowej elektrody quasi-odniesienia, przy szybkości polaryzacji 50 mV s¹ (Fig. 3a).

Po osadzeniu, warstwę MIP-u dokładnie przepłukano mieszaniną acetonitrylu i toluenu w celu usunięcia niezwiązanych składników kompleksu pre-polimeryzacyjnego i elektrolitu podstawowego. Następnie epitopy-szablony wyekstrahowano z MIP-u roztworem 0,5 mM trietyloaminy. Krótka (30 minutowa) ekstrakcja wystarczyła do usunięcia cząsteczek epitopu z molekularnie wdrukowanych wnęk MIP-u. Podobną procedurę zastosowano do przygotowania warstwy kontrolnego polimeru nie wdrukowanego epitopem (ang. non-imprinted polymer, NIP). W procedurze tej do roztworu do elektropolimeryzacji nie dodano szablonu (Fig. 3b).

W celu przygotowania układu do oznaczania SP-A, do wdrukowania molekularnego wybrano dwa epitopy tego białka, tj. FSSNGOSIT (SEQ ID NO: 5) i YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6). Procedura osadzania warstwy MIP-u a następnie ekstrahowania szablonów epitopów SP-A były takie same jak w przypadku epitopów MMP-1.

Do jednoczesnego wdrukowania wieloepitopowego zastosowano tylko trzy epitopy MMP-1, tj. MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3), ponieważ okazało się, że obecność epitopu AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) w ΜΙΡ-ie niekorzystnie (niesynenergetycznie) wpływała na działanie chemosensora. Aby wytworzyć kompleksy prepolimeryzacyjne, przygotowano roztwór trzech epitopów, każdy o stężeniu 20 pM, stosując mieszaninę acetonitrylu, toluenu i wody o składzie jak wyżej. Następnie roztwór ten doprowadzono do stężenia 180 pM względem FM, 740 pM względem CLM i 0,1 M względem (TBA)CIO4. Pozostałe warunki przygotowania chemosensora były takie same jak w przypadku wdrukowania pojedynczego epitopu, ale późniejsza ekstrakcja szablonów z MIP-ów w celu całkowitego usunięcia z nich epitopowych szablonów była bardziej czasochłonna, wymagała bowiem aż 1 godziny.

Wyniki i dyskusja

Osadzanie polimerów molekularnie wdrukowanych różnymi szablonami epitopowymi

Przygotowano pre-polimeryzacyjne jedno- i wieloepitopowe kompleksy szablonów z FM-ami, w obecności CLM-ów, w roztworach mieszaniny acetonitrylu, toluenu i wody o stosunku objętościowym jak wyżej. Ta kombinacja trzech rozpuszczalników była konieczna do rozpuszczenia wszystkich składników roztworu. Z roztworów tych polimery osadzano na minielektrodach Au z wykorzystaniem elektropolimeryzacji potencjodynamicznej. Prądowy pik anodowy przy ~0,70 V względem srebrowej elektrody quasi-odniesienia w pierwszym cyklu potencjodynamicznym (Fig. 3a) odpowiada nieodwracalnemu elektroutlenianiu fragmentów 2,2'-bitienylowych i trifenyloaminowych odpowiednio, bis-EDOT-u i FM-u.

PL 249228 Β1

W kolejnych cyklach pik ten nieznacznie malał, co wskazuje na osadzanie się warstwy MIP-u na powierzchni elektrody. Co więcej, przesunął się on w stronę niższych potencjałów, tak jakby przeniesienie elektronu stawało się coraz łatwiejsze wraz z osadzaniem warstwy. Osadzanie warstwy NIP-u (Fig. 3b) przebiegało podobnie. Jednak w pierwszym cyklu potencjał piku anodowego był nieco wyższy, co sugeruje, że w nieobecności epitopowego szablonu elektropolimeryzacja FM-u i CLM-u była łatwiejsza niż w jego obecności.

Usuwanie szablonu z polimeru wdrukowanego molekularnie

Aby opróżnić wdrukowane molekularnie wnęki i w ten sposób udostępnić je do rozpoznawania biomarkerów, szablony epitopów wyekstrahowano z warstw MIP-ów.

Ekstrakcję epitopów MMP-1 z wdrukowanych nimi MIP-ów potwierdzono z wykorzystaniem rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej (ang. X-ray photoelectron spectroscopy, XPS). Obecność pierwiastków C, N i S w widmach XPS warstw MIP-ów i NIP-ów (Tabela 1) potwierdziła kopolimeryzację CLM-u i FM-u. W polimerze epitop i FM są źródłami azotu, a siarka pochodzi z monomerów FM i CLM. Dlatego oczekiwano, że stosunek procentowej zawartości atomowej azotu do siarki zmniejszy się po ekstrakcji szablonu. I rzeczywiście, dla MIP-ów wdrukowanych szablonami AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3), po ekstrakcji tych szablonów stosunek ten zmniejszył się, odpowiednio, ~1,6 i ~2,2 razy, pośrednio potwierdzając usunięcie tych szablonów (Tabela 1). Jednakże, zgodnie z oczekiwaniami, płukanie warstwy NIP-u roztworem ekstrakcyjnym praktycznie nie zmieniło tego stosunku (Tabela 1).

Podobnie, ekstrakcję epitopów SP-A z wdrukowanych nimi MIP-ów potwierdzono z wykorzystaniem analizy XPS. Sygnały pochodzące od pierwiastków C, N i S były wyraźnie widoczne na widmach XPS warstw MIP-ów (Tabela 2). W przypadku warstwy MIP-u wdrukowanej szablonem YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6), atomowy stosunek azotu do siarki zmniejszył się ~1,5 raza po ekstrakcji tego szablonu (Tabela 2). To obniżenie pośrednio potwierdziło usunięcie szablonu z warstwy MIP-u.

Tabela 1. Analiza elementarna XPS powierzchni warstw MIP-ów wdrukowanych epitopowymi szablonami AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) biomarkera MMP-1 przed i po ekstrakcji szablonu, a także warstwy NIP-u przed i po opłukaniu roztworem do ekstrakcji.

Polimer	Pierwiastek	Stężenie atomowe, %	Stosunek atomowy azotu do siarki
AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)-MIP przed ekstrakcją szablonu	O	19.07	1.56
	N	2.88
	C	73.64
	S	4.50
AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)-MIP po ekstrakcji szablonu	O	21.94	1.02
	N	4.45
	C	68.96
	s	4.55
FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3)-MIP przed ekstrakcją szablonu	O	21.20	5.50
	N	1.16
	C	71.26
	s	6.37

PL 249228 Β1

FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3)-MIP po ekstrakcji szablonu	O	22.67	2.65
	N	2.14
	C	69.52
	s	5.67
NIP przed opłukaniem roztworem ekstrakcyjnym	O	18.41	1.15
	N	2.99
	c	75.14
	s	3.45
NIP po opłukaniu roztworem ekstrakcyjnym	O	32.68	1.16
	N	3.25
	c	60.15
	s	3.80

Tabela 2. Analiza elementarna za pomocą XPS warstwy MIP-u molekularnie wdrukowanego epitopem FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) przed i po ekstrakcji tego epitopu.

Polimer	Pierwiastek	Stężenie, % atomowy	Stosunek atomowy azotu do siarki
YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6)-l*llP przed ekstrakcją epitopu	O	10.56	0.57
	N	1.94
	C	86.38
	s	1.10
YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6)-MIP po ekstrakcji epitopu	o	9.59	0.39
	N	2.29
	c	87.23
	s	0.89

Charakteryzowanie morfologii warstw polimerów z wykorzystaniem mikroskopii sil atomowych

Fig. 4 i 5 przedstawiają obrazy mikroskopii sił atomowych (ang. atomie force microscopy, AFM) warstw wszystkich MIP-ów i NIP-ów.

Na Fig. 4 pokazano obrazy AFM (a) niepokrytej mikroelektrody złotej i warstw MIP-ów z szablonem epitopu MMP-1 przed ekstrakcją szablonu, (b) warstwy MIP-u z szablonem AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4), (c) warstwy MIP-u z szablonem FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) i po ekstrakcji szablonu (b') warstwa AODDIDGIOAI (SEQ ID NO: 4)-MIP (c') warstwa FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3)-MIP. Warstwa NIP-u (d) przed i (d') po opłukaniu roztworem do ekstrakcji.

Na Fig. 5 pokazano obrazy AFM warstw MIP-ów zawierających szablony epitopów biomarkera SP-A. Warstwa (a) MIP-u wdrukowanego szablonem FSSNGOSIT (SEQ ID NO: 5) i (b) MIP-u wdrukowanego szablonem YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6) przed ekstrakcją szablonu, jak również te warstwy (a') i (b') po ekstrakcji tych szablonów.

PL 249228 Β1

Zobrazowano również powierzchnię niepokrytej polimerem mikroelektrody złotej, aby porównać zmianę jej morfologii po pokryciu jej różnymi polimerami. Okazało się, że powierzchnia niepokrytego złota była stosunkowo szorstka (Tabela 3 poniżej).

Tabela 3. Grubość i szorstkość warstw MIP-ów, przed i po ekstrakcji epitopowych szablonów, wyznaczona za pomocą AFM.

Polimer	Przed ekstrakcją epitopu	Po ekstrakcji epitopu
Grubość, nm	Szorstkość (R_a), nm	Grubość, nm	Szorstkość (Ra), nm
Niepokryta elektroda złota	-	173±38	-	-
FSSNGQSIT (SEQ ID NO: 5)-MIP	731+104	143±16	681±85	153±27
YSDGTPYNYTNWYR (SEQ ID NO: 6)-MIP	645+91	152±7	541±55	169±22
AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)-MIP	736+186	143±11	477±41	233±59
FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3)-MIP	630+163	262±86	538±77	257±90
NIP	640+138	197±44	429±37	191±49

R, - średnia arytmetyczna szorstkości, nm.

Natomiast morfologia warstw MIP-ów różniła się od morfologii niepokrytej polimerem minielektrody złotej (Fig. 4a, 4b i 4c oraz 4b' i 4c'). Dalsze badania wykazały, że warstwy MIP-ów osadziły się na ziarnach złota, otaczając je. Po połączeniu, otoczki te utworzyły warstwę. Morfologia warstwy NIP-u była podobna (Fig. 4d i 4d'). Przed ekstrakcją, warstwy polimerów zbudowane były z większych ziaren z wystającymi mniejszymi ziarenkami. Po ekstrakcji szablonu z MIP-u i opłukaniu NIP-u roztworem do ekstrakcji, pozostały tylko większe ziarna z wyraźnie zaznaczonymi brzegami. Oszacowana grubość warstw MIP-ów po ekstrakcji szablonu zmniejszyła się (Tabela 3). Bardzo podobnie zmniejszyła się grubość warstwy kontrolnej NIP-u.

Po ekstrakcji szablonu, szorstkość warstw wszystkich MIP-ów wzrosła, potwierdzając wywołane tą ekstrakcją zmiany morfologiczne. Po usunięciu drobin polimeru nie związanych z warstwą polimeru pojawiły się wyraźne kuliste twory, podwyższające szorstkość tych warstw (Tabela 3).

Oznaczanie biomarkera MMP-1 z wykorzystaniem chemosensora z przetwornikiem EG-FET

ΜΙΡ-y z wdrukowanym jednym epitopem

Aby uprościć badania wstępne, do osadzania warstw MIP-ów z pojedynczo wdrukowanymi epitopami początkowo zastosowano złocone płytki szklane, które stanowiły rozszerzone bramki EG-FET-a. Następnie tak przygotowaną bramkę zanurzano w roztworze badanym i przykładano do niej napięcie dodatnie (l/_gs = 2,0 V) z wykorzystaniem źródła mierzącego. Dlatego bramka przyciągała elektrony jako dominujące nośniki ładunku w heterostrukturze EG-FET otwierając kanał przewodzenia elektronów między źródłem a drenem. Napięcie drenu (Vd_S) zmieniano z 0 na 4,0 V, co wymuszało zmianę skorygowanego o prąd tła prądu drenu (Δ/ds) w czasie. Po ustabilizowaniu się Δ/ds, do roztworów badanych dodawano roztwory epitopów o różnych stężeniach. Oddziaływanie epitopów z ΜΙΡ-em zmieniało Δ/ds, tzn. Δ/ds stopniowo wzrastała wraz ze stopniowym wzrostem stężenia epitopu (krzywe 1-4 na Fig. 6). Odpowiedź chemosensora EG-FET z warstwą MIP-u wdrukowaną epitopem AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4), który następnie został wyekstrahowany, (AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)-MIP) na obecność analitu AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) była liniowa w zakresie stężeń od 10 do 250 nM ze współczynnikiem korelacji, R² = 0,967 (krzywa 1 na Fig. 6). Zależność tę opisuje następujące równanie regresji liniowej: Δ/ds [pA] = 10,53 (±1,30) [pA] + 0,10 (±0,009) [pA nM¹] c [nM],

Na Fig. 6 pokazano krzywe kalibracyjne skonstruowane przy zastosowaniu chemosensora EGFET z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą MIP-u, molekularnie wdrukowanego szablonem AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4), dla (krzywa 1) analitu AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4), jak również epitopów przeszkadzających, w tym (krzywa 2) HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2), (krzywa 3) FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) i (krzywa 4) MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1). (Krzywa 5) Krzywa kalibracyjna dla chemosensora EG-FET z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą NIP-u. Każde oznaczenie analitu-epitopu powtórzono trzykrotnie. Napięcie przyłożone do rozszerzonej bramki wynosiło 2,0 V a powierzchnia bramki ~24 mm².

Co więcej, chemosensor AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)-MIP wykazywał znacznie wyższą czułość względem analitu AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) niż epitopów przeszkadzających HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2), FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) i MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1) (odpowiednio, krzywe 2, 3 i 4 na Fig. 6), tj. jego selektywność względem tych epitopów (odpowiednio, krzywe 3, 4 i 2 na Fig. 6) wynosiła, odpowiednio, 2,85, 10 i 15,5.

Na Fig. 7 pokazano:

(a) skorygowaną na prąd tła zmianę prądu drenu EG-FET (Δ/ds) w czasie mierzoną w celu oznaczenia biomarkera MMP-1 o różnych stężeniach, zaznaczonych liczbami przy pionowych strzałkach oznaczających wstrzyknięcie roztworu tego biomarkera, w 10 mM MES (pH = 6,4) dla warstwy AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)-MIP, (b) krzywą kalibracyjną dla analitu MMP-1 skonstruowaną z wykorzystaniem chemosensora EG-FET z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą (krzywa 1) AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)-(MIP-u) i (krzywa 2) NIP-u; krzywe kalibracyjne dla substancji przeszkadzających (krzywa 3) mioglobiny, (krzywa 4) BSA i (krzywa 5) cytochromu c, skonstruowane przy użyciu chemosensora EG-FET z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)-(MIP-u), (c) krzywe kalibracyjne dla białek MMP-1, SP-A i MMP-7 skonstruowane przy użyciu chemosensora EG-FET z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)-(MIP-u); napięcie bramki, Vgs = 0,95 V, pole powierzchni rozszerzonej bramki - 1,81 mm².

Ponadto, aby potwierdzić wdrukowanie, roztwór epitopu AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) wstrzyknięto do naczynka wypełnionego roztworem badanym, z chemosensorem z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą NIP-u (krzywa 5 na Fig. 6). Wówczas Δ/ds zmieniała się ze stężeniem AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) w stronę przeciwną niż w przypadku AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)-(MIP-u), tj. nachylenie krzywej kalibracyjnej było ujemne. Bezwzględna wartość tej zmiany była mniejsza niż dla bramki pokrytej warstwą AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)-(MIP-u). Wynik ten potwierdza pomyślne wdrukowanie epitopu AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) w MIP.

Następnie, według tej samej procedury, warstwy MIP-ów wdrukowanych szablonem AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) osadzano na złotych minielektrodach. Aby potwierdzić przydatność tego wdrukowania, zastosowano tak przygotowane chemosensory do oznaczania analitu MMP-1 (Fig. 7a). W tym celu do bramki przyłożono dodatnie napięcie 0,95 V (to stosunkowo niskie napięcie wystarczyło do otwarcia kanału przewodzenia elektronów między źródłem a drenem) i zarejestrowano Δ/ds w czasie, aż do ustabilizowania się jej wartości. Wzrost Δ/ds (krzywa 1 na Figurze 7a) wskazywał, że warstwa AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)- (MIP-u) wiązała i w ten sposób rozpoznawała cząsteczki analitu MMP-1 w zakresie stężeń od 10 do 250 nM. Cząsteczka szablonu AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) wygenerowała w MlP-ie wnękę molekularną, która rozpoznawała cząsteczkę białka MMP-1. Krzywa kalibracyjna dla MMP-1 opisana jest następującym równaniem regresji liniowej. Δ/ds [μΑ] = 14,92 (±0,06) [μΑ] + 0,19 (±0,005) [μΑ nM^-1 ] c [nM] (krzywa 1 na Fig. 7b) z R² = 0,990 i LOD = 7,5 nM. Jednakże Δ/ds zmniejszała się po wstrzyknięciu analitu MMP-1 w przypadku bramki pokrytej warstwą NIP-u (krzywa 2 na Fig. 7b). To uniemożliwiło obliczenie współczynnika wdrukowania ze stosunku nachyleń krzywych kalibracyjnych dla MIP-u i NIP-u.

Ponadto sprawdzono działanie chemosensora w złożonym środowisku surowicy krwi, aby sprawdzić, czy obecne tam składniki zakłócają oznaczanie biomarkera MMP-1. Okazało się, że obecność potencjalnych substancji przeszkadzających w oznaczeniach tego biomarkera, tj. mioglobiny, albuminy surowicy bydlęcej (ang. bovine serum albumin, BSA) i cytochromu c nie wpłynęła na sygnał analityczny MMP-1 (krzywe 3-5 na Fig. 7b). Co więcej, chemosensor był selektywny względem biomarkera MMP-7 (Fig. 7c). Dodanie tego biomarkera do roztworu badanego jedynie nieznacznie zmieniło Δ/ds wskazując, że chemosensor ten selektywnie rozróżniał biomarkery MMP-1 i MMP-7 z tej samej rodziny białek.

Jednoczesne oznaczanie biomarkera w mieszaninie biomarkerów jest często trudne. Aby pod tym względem sprawdzić działanie wytworzonego chemosensora EG-FET, przygotowano mieszaninę biomarkerów SP-A i MMP-1 i oznaczono w niej MMP-1 z wykorzystaniem chemosensora z bramką pokrytą warstwą AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)-MIP. Okazało się, że obecność SP-A nie wpłynęła na oznaczanie MMP-1 (Fig. 7c), ponieważ peptyd AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) nie jest epitopem białka SP-A.

Na Fig. 8 pokazano krzywe kalibracyjne skonstruowane przy zastosowaniu chemosensora EG-FET z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą MIP-u, molekularnie wdrukowanego szablonem FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3), dla (krzywa 1) epitopu FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) i peptydów przeszkadzających (krzywa 3) HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2), (krzywa 4) AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4), (krzywa 5) MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1). (Krzywa 2) krzywa kalibracyjna dla FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) skonstruowana przy zastosowaniu chemosensora EG-FET z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą NIP-u. Każde oznaczenie powtórzono trzykrotnie. Napięcie rozszerzonej bramki wynosiło 2,0 V a pole powierzchni bramki ~24 mm².

Aby oznaczyć kolejny epitop biomarkera MMP-1 i również sam biomarker, rozszerzoną bramkę tranzystora pokryto warstwą MIP-u wdrukowaną epitopem-szablonem FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3). Po ekstrakcji tego szablonu, Δ/ds liniowo zmniejszała się ze wzrostem stężenia analitu FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) od 10 do 250 nM (krzywa 1 na Fig. 8). Najwyraźniej chemosensor ten związał w swoich molekularnie wdrukowanych wnękach cząsteczki analitu FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) i w ten sposób rozpoznał go. Skonstruowana krzywa kalibracyjna opisana jest równaniem regresji liniowej Δ/ds [pA] = 0,311 (±0,06) [pA] - 0,0032 (±0,0006) [pA nM^-1] c [nM] przy R² = 0,910 i LOD = 10 nM przy S/N = 3 (krzywa 1 na Fig. 8).

Wdrukowaną szablonem FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) warstwę MIP-u osadzono również na złoconych płytkach szklanych i zbudowano chemosensor FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3)-MIP. Ze wzrostem stężenia analitu FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) w roztworze badanym, Δ/ds zmierzona z wykorzystaniem tego chemosensora zmniejszała się (krzywa 1 na Fig. 8), przeciwnie niż Δ/ds, która ze wzrostem stężenia analitu AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4), zmierzona z wykorzystaniem chemosensora AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)-MIP, nieznacznie rosła (krzywa 4 na Fig. 7b). Zmiany Δ/ds ze wzrostem stężenia analitu w przeciwne strony dla tych epitopów, tj. przeciwne nachylenia ich krzywych kalibracyjnych, można łatwo wytłumaczyć, odwołując się do punktów izoelektrycznych (ang. isoelectric points, p/s) tych epitopów. Wartości tych punktów dla AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) wynoszą, odpowiednio, 3,4 i 9,7. Tymczasem oznaczenia epitopów przeprowadzono przy pH = 6,4. Przy tej wartości pH, epitop AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) jest naładowany ujemnie (jest zdysocjowany), a epitop FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) - dodatnio (jest sprotonowany). Dlatego nachylenia krzywych kalibracyjnych tych epitopów są przeciwne.

Przy pokryciu bramki warstwą NIP-u, Δ/ds tylko nieznacznie malała ze wzrostem stężenia analitu FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) (krzywa 2 na Fig. 8). Ta wyraźna różnica w nachyleniu krzywej dla analitu FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) przy zastosowaniu chemosensora z warstwą FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3)-MIP i NIP potwierdza pomyślne wdrukowanie szablonu epitopu w MIP. Obliczony współczynnik wdrukowania był znaczny, wynosił bowiem 3,80. Chemosensor z warstwą FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3)-MIP był zdolny do selektywnego oznaczania analitu FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3). Jego selektywność względem epitopu HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2), zastosowanego jako substancja przeszkadzająca, wynosiła aż 7,0 (krzywa 3 na Fig. 8). Ale nachylenia krzywych kalibracyjnych dla epitopów AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) i MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1) (odpowiednio, krzywa 4 i 5 na Fig. 8) zastosowanych jako substancje przeszkadzające, były dodatnie. Dlatego ze stosunku nachyleń krzywej kalibracyjnej dla analitu i substancji przeszkadzającej nie można było wyznaczyć współczynników selektywności.

Na Fig. 9 pokazano:

(a) zmiany w czasie prądu drenu chemosensora EG-FET z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą MIP-u z molekularnie wdrukowanym a następnie wyekstrahowanym epitopowym szablonem FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3), dla biomarkera MMP-1 o różnych stężeniach, zaznaczonych liczbami przy pionowych strzałkach wskazujących wstrzyknięcie tego biomarkera, w 10 mM MES (pH = 6,4), (b) krzywe kalibracyjne dla różnych biomarkerów IPF, skonstruowane przy użyciu chemosensora EG-FET z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą MIP-u z molekularnie wdrukowanym a następnie wyekstrahowanym epitopowym szablonem FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3); warstwy MIP-ów osadzono przez elektropolimeryzację potencjodynamiczną na dyskowych minielektrodach złotych w zakresie potencjałów od 0 do 1,0 V względem srebrowej elektrody quasi-odniesienia, pole powierzchni rozszerzonej bramki wynosiło 1,81 mm² a napięcie bramki 0,95 V.

Biomarker MMP-1 oznaczono również z wykorzystaniem chemosensora z warstwą FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3)-MIP osadzoną na złotej minielektrodzie. Przy stopniowym dodawaniu roztworu białka MMP-1 o coraz większym stężeniu do roztworu badanego, Δ/ds obniżało się (Fig. 9a), podobnie jak po dodaniu analitu FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) (krzywa 1 na Fig. 8). Jeżeli wziąć pod uwagę wartość p/ dla MMP-1 równą 6,47, oznacza to, że całkowity ładunek cząsteczki tego białka nie był czynnikiem decydującym o zmianach Δ/ds ze wzrostem jego stężenia w roztworze badanym. Natomiast ładunek cząsteczki epitopu związanej w molekularnie wdrukowanej wnęce tym czynnikiem był. Równanie regresji liniowej w postaci Δ/ds [μΑ] = -11,61 (±4,27) [μΑ] -0,21 (±0,03) [μΑ nM^-1] c [nM] opisywało krzywą kalibracyjną dla MMP-1 z R² = 0,970 i LOD = 2 nM przy S/N = 3 (Fig. 9b).

Współczynnik wdrukowania dla chemosensora z warstwą rozpoznającą FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3)-MIP wynosił 3,0 (krzywa 2 na Fig. 8). Chemosensor ten był selektywny względem innych białek występujących w surowicy, w tym biomarkerów MMP-7 i SP-A, wstrzykiwanych oddzielnie lub w mieszaninie białek (Fig. 9b).

MlP-y z jednocześnie wdrukowanymi wieloma epitopami

Aby wykazać, że opracowana procedura umożliwia selektywne rozpoznawanie zarówno cząsteczek epitopów jak i całej cząsteczki biomarkera białkowego MMP-1, w MlP-y wdrukowano pojedyncze epitopy (patrz wyżej). Jednak wartości LOD tych chemosensorów były zbyt wysokie, aby oznaczyć ten biomarker w surowicy, gdzie zakres stężeń występowania tego biomarkera jest znacznie niższy od tego LOD-u. Aby temu zaradzić, w ten sam MIP jednocześnie wdrukowano kilka epitopów tego samego biomarkera, usiłując osiągnąć jego wykrywalność zbliżoną do zakresu stężeń w jakim ten biomarker występuje w surowicy.

Do jednoczesnego (wieloepitopowego) wdrukowania wybrano trzy epitopy MMP-1, tj. MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1) (Bartold, K. et al., Biosens. Bioelectron. 2022, 208, 114203),

HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) (Bartold, K. et al., Biosens. Bioelectron. 2022, 208, 114203) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) (krzywa 1 na Fig. 8). Ze wzrostem stężenia epitopu w roztworze badanym, wszystkie te epitopy obniżały Δ/ds przy użyciu chemosensorów z warstwą MIP-u oddzielnie wdrukowanym każdym z tych epitopów. Natomiast zrezygnowano z jednoczesnego wdrukowania epitopu AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4), ponieważ wzrost jego stężenia w roztworze badanym podwyższał Δ/ds zarejestrowane z wykorzystaniem chemosensora z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4)-MIP (krzywa 1 na Fig. 6).

Wykrywalność oznaczania MMP-1 uległa podwyższeniu, jeśli stężenie każdego epitopu w roztworze kompleksu pre-polimeryzacyjnego było takie jak te stosowane do wdrukowania pojedynczego epitopu, tj. wynosiło 20 pM. Stężenia FM-u i CLM-u w tym roztworze dobrano tak, aby stosunki molowe tych monomerów do epitopów były takie same jak przy wdrukowaniu pojedynczego epitopu.

Na Fig. 10 pokazano:

(a) zmiany prądu drenu EG-FET po dodaniu biomarkera MMP-1, o różnych stężeniach wskazanych liczbami przy strzałkach oznaczających punkty wstrzyknięcia, do roztworu badanego, który był 10 mM względem MES (pH = 6,4), dla warstwy MIP-u jednocześnie wdrukowanej szablonami trzech epitopów, tj. MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3), po ekstrakcji tych szablonów; napięcie bramki wynosiło 0,95 V, (b) krzywą kalibracyjną dla analitu MMP-1 skonstruowaną z wykorzystaniem chemosensora EG-FET z rozszerzoną bramką pokrytą warstwą (krzywa 1) MIP-u i (krzywa 2) NIP-u; pole powierzchni rozszerzonej bramki wynosiło 1,81 mm².

Dla chemosensora z warstwą MIP-u wdrukowaną trzema epitopami, Δ/ds była tym niższa im wyższe było stężenie analitu MMP-1 w roztworze badanym (Fig. 10a). Liniowy dynamiczny zakres stężeniowy rozciągał się od 0,1 do 2,5 nM MMP-1 (krzywa 1 na Figurze 11), a równanie regresji liniowej w następujący sposób opisywało krzywą kalibracyjną. Δ/ds [μΑ] = -6,36 (±0,55) [μΑ] + 1,84 (±0,70) [μΑ nM^-1] c [nM], Co istotne, wdrukowanie wieloepitopowe obniżyło LOD do 0,1 nM, osiągając poziom stężenia MMP-1 wymagany do jego oznaczania w surowicy. Współczynnik wdrukowania, obliczony jako stosunek nachyleń krzywych kalibracyjnych dla chemosensorów, jednego z bramką pokrytą warstwą MIP-u a drugiego NIP-u (odpowiednio, krzywe 1 i 2 na Fig. 10b), wzrósł z 3,0 dla chemosensora z warstwą MIP-u wdrukowanego jednym epitopem do 4,8 z warstwą MIP-u jednocześnie wdrukowaną trzema epitopami. Co więcej, wdrukowanie wieloepitopowe nie tylko obniżyło LOD, ale także podwyższyło czułość oznaczeń. Ta podwyższona sprawność analityczna chemosensorów typu MIP z wdrukowanymi wieloma epitopami w porównaniu z wdrukowaniem jednego epitopu może być związana ze zwiększoną w nich liczbą miejsc oddziaływań z cząsteczkami analitu.

Trwałość warstw MIP-ów

Syntetyczny receptor MIP może konkurować z receptorem naturalnym, takim jak przeciwciało. Jednakże, pomimo często wykazywanej pożądanej specyficzności, przeciwciało często ulega znacznemu wpływowi środowiska, które powoduje jego denaturację. MIP, przeciwnie, wykazuje, korzystnie, wysoką odporność na działanie środowiska i dlatego jego czas przydatności do użycia jest długi.

Do określenia przydatności analitycznej warstw MIP-ów wdrukowanych epitopami, zintegrowanych z rozszerzonymi bramkami chemosensorów typu EG-FET, kluczowe znaczenie ma weryfikacja trwałości tych warstw.

W niniejszych badaniach trwałość warstw MIP-ów określono w następujący sposób. Po trzykrotnym powtórzeniu oznaczenia MMP-1, matrycę minielektrod pokrytych warstwami MIP-ów oddzielnie wdrukowanymi szablonami AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3), po ekstrakcji tych szablonów, zamknięto w szczelnym pojemniku wypełnionym powietrzem nasyconym parami acetonitrylu. Następnie monitorowano trwałość chemosensorów, mierząc ich aktywność analityczną po dwutygodniowym przechowywaniu w tym pojemniku. Po tym czasie przechowywania, krzywe kalibracyjne dla AQDDIDGIQAI (SEQ ID NO: 4) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) były porównywalne z krzywymi dla chemosensorów świeżo przygotowanych (Fig. 13). Pierwotne sygnały Δ/ds zostały zachowane z akceptowalnymi odchyleniami standardowymi w zakresie od 1,2 do 10,6%, co potwierdza trwałość wytworzonych chemosensorów.

Na Fig. 13 pokazano krzywe kalibracyjne dla biomarkera MMP-1 skonstruowane przy użyciu chemosensorów EG-FET z rozszerzonymi bramkami przed i po przechowywaniu w szczelnym pojemniku z powietrzem nasyconym parami acetonitrylu przez dwa tygodnie. Bramki były pokryte warstwami MIP-ów molekularnie wdrukowanych epitopami (a) AQDDIDGIQAI i (b) FKGNKYWAVQGQNV, z których następnie te epitopy wyekstrahowano. Pole powierzchni rozszerzonej bramki wynosiło 1,81 mm² a napięcie bramki 0,95 V.

Chemoczujnik MIP EG-FET do selektywnego oznaczania biomarkera SP-A

Dotychczas nie wykryto biomarkera, który jednoznacznie świadczyłby o występowaniu choroby IPF i przewidywał kierunki jej rozwoju. Stąd do prawidłowego zdiagnozowania IPF należy oznaczyć kilka jego biomarkerów. Dlatego, po opracowaniu procedury oznaczania MMP-1 z wykorzystaniem dedykowanego chemosensora MIP, w niniejszych badaniach opracowano i przygotowano chemosensory typu MIP do oznaczania jeszcze jednego białkowego biomarkera IPF, mianowicie biomarkera SP-A. Znajomość poziomu biomarkerów SP-A i SP-D pomaga przewidzieć szansę przeżycia pacjenta, jeżeli IPF jest zdiagnozowana na wczesnym etapie jej rozwoju (Kinder, B. W. et al., Chest 2009, 135, 1557; Takahashi, H. et al., Am, J, Respir. Crit. Care Med. 2000, 162, 1109). Wzrost wyjściowego poziomu SP-A o 1,9 nM wskazuje na 3,3-krotny wzrost ryzyka zgonu w pierwszym roku po oznaczeniu SP-A (Guiot, J. et al., Lung 2017, 195, 273).

Na Fig. 11 pokazano krzywą kalibracyjną dla analitu SP-A skonstruowaną przy użyciu chemosensora EG-FET z bramką pokrytą warstwą (krzywa 1) FSSNGQSIT (SEQ ID NO: 5)-(MIP-u) i (krzywa 2) NIP-u. Krzywe kalibracyjne dla (krzywa 3) MMP-1 i (krzywa 4) MMP-7 skonstruowane przy użyciu chemosensora FSSNGQSIT (SEQ ID NO: 5)-MIP. Pole powierzchni rozszerzonej bramki wynosiło 1,81 mm²a napięcie bramki było 0,95 V.

Na Fig. 12 pokazano zmianę w czasie prądu drenu dla białka SP-A o różnych stężeniach, wskazanych za pomocą liczb w punktach jego wstrzyknięcia oznaczonych pionowymi strzałkam i, w 10 mM buforze MES (pH = 6,4), zarejestrowaną za pomocą chemosensora EG-FET z rozszerzoną bramką w postaci złoconej płytki szklanej pokrytej warstwą MIP-u z molekularnie wdrukowanym a następnie wyekstrahowanym epitopowym szablonem FSSNGQSIT (SEQ ID NO: 5). Pole powierzchni rozszerzonej bramki wynosiło 1,81 mm² a napięcie bramki 0,95 V.

Wraz ze wzrostem stężenia analitu SP-A w roztworze badanym w zakresie stężeń od 10 do 250 nM Δ/ds wzrastało (Fig. 12) co potwierdza, że chemosensor FSSNGQSIT (SEQ ID NO: 5)-MIP rozpoznaje ten biomarker. Dlatego dla tego biomarkera można było skonstruować krzywą kalibracyjną (krzywa 1 na Fig. 11). Najwidoczniej epitop FSSNGQSIT (SEQ ID NO: 5) białka SP-A silnie oddziaływał z molekularnie wdrukowanymi wnękami MIP-u. Zgodnie z oczekiwaniem, Δ/ds dla chemosensora z warstwą NIP-u wzrastała tylko nieznacznie ze wzrostem stężenia analitu SP-A (krzywa 2 na Fig. 11) potwierdzając, że oddziaływanie SP-A z NIP-em było słabe. Obliczony współczynnik wdrukowania był zauważalnie wysoki, wynosił 3,0. Wyznaczony przy S/N = 3 LOD był korzystnie niski, równy 1,9 nM SP-A. Był on wystarczająco niski, aby oznaczyć ten biomarker w surowicach pacjentów chorych na IPF w celu oszacowania szansy ich przeżycia i częstości wystąpienia dysfunkcji płuc. Na przykład, prawdopodobieństwo przeżycia pacjentów z podwyższonym zarówno poziomem MMP-7 (> 0,4 nM) jak i SP-A (> 2,8 nM) było niższe (wskaźnik przeżywalności przez 1 rok wynosił 59%) i częściej (42%) występował spadek aktywności płuc (spadek witalności o ponad 10% w ciągu 6 miesięcy) w porównaniu z osobami o wysokim poziomie tylko jednego biomarkera (przeżywa lność roczna 81%, spadek witalności o 27%) lub niskimi poziomami obu (przeżywalność przez 1 rok 83,3%, spadek witalności o 9%) (Song, J. W. et al., Chest 2013, 143, 1422).

Wyznaczono selektywność chemosensora FSSNGQSIT (SEQ ID NO: 5)-MIP względem biomarkerów MMP-7 i MMP-1 (odpowiednio, krzywe 3 i 4 na Fig. 11). Jak widać, chemosensor ten był niewrażliwy na biomarkery z grupy MMP, charakterystyczne dla IPF, selektywnie odróżniając SP-A od tych biomarkerów.

Wnioski

W niniejszych badaniach, wdrukowane wybranymi epitopami białkowych biomarkerów, MMP-1 i SP-A, MlP-y przygotowano z wykorzystaniem elektropolimeryzacji potencjodynamicznej i jednocześnie osadzono w postaci cienkich warstw na złoconych płytkach szklanych i matrycach złotych minielektrod. MlP-y te zastosowano jako syntetyczne receptory, analogi ulegających łatwej denaturacji naturalnych receptorów - przeciwciał - do opracowania metod oznaczania powyższych biomarkerów. Chemosensory EG-FET z rozszerzonymi bramkami pokrytymi warstwami tych MIP-ów nadawały się do selektywnego oznaczania zarówno epitopów, które użyto jako szablony do wdrukowania molekularnego jak i całych biomarkerów MMP-1 i SP-A. Przygotowane warstwy MIP-ów były trwałe przez co najmniej dwa tygodnie. Wystarczającą do oznaczenia biomarkera MMP-1 wykrywalność w surowicy (LOD = 0,1 nM MMP-1) osiągnięto przez jednoczesne wdrukowanie trzech różnych epitopów tego biomarkera.

Oznaczenie biomarkerów MMP-1 i SP-A z wykorzystaniem MIP-ów o niskich granicach wykrywalności możliwe było dzięki zastosowaniu dedykowanego przenośnego przyrządu EG-FET. Oznaczenie biomarkerów IPF przez molekularne wdrukowanie ich epitopów w opisanych tu polimerach wydaje się obiecujące zarówno dla diagnostyki klinicznej, jak i POCT-ów.

Claims

1. Sposób jednoczesnego molekularnego wdrukowania trzech epitopów MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) w polimerze i osadzenia tego molekularnie wdrukowanego polimeru w postaci cienkiej warstwy na elektrodzie złotej albo na złoconej płytce szklanej, obejmujący etapy, w których:

- przygotowuje się roztwór trzech epitopów MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) jako szablonów do wdrukowania, każdy o stężeniu w zakresie od 10 do 30 pM, korzystnie 20 pM, stosując mieszaninę acetonitrylu, toluenu i wody dejonizowanej o stosunku objętościowym korzystnie wynoszącym 6,0 : 3,7 : 0,3;

Q.jO

FM ^CLM

- przygotowuje się roztwór kompleksu pre-polimeryzacyjnego dodając do powyżej przygotowanego roztworu trzech epitopów kwas {5E-5-[4-(difenyloamino)benzylideno]-4-okso-2-tioksotiazolidyn-3-ylo}octowy, jako monomer funkcyjny FM, osiągając jego stężenie 180 pM, 2,2',3,3'-tetrahydro-5,5'-bitieno[3,4-b][1,4]ditlenek, jako monomer sieciujący CLM, osiągając jego stężenie 740 pM oraz (TBA)CIO4, jako elektrolit podstawowy, osiągając jego stężenie 0,1 M, w stosunku molowym FM : CLM : szablon, wynoszącym 3:4:1;

- w celu jednoczesnego wytworzenia molekularnie wdrukowanego polimeru i osadzenia go w postaci cienkiej warstwy na elektrodzie złotej albo złoconej płytce szklanej, otrzymaną wyżej mieszaninę pre-polimeryzacyjną poddaje się elektropolimeryzacji za pomocą pięciu cykli potencjodynamicznych w zakresie od 0 do 1,0 V względem srebrowej elektrody quasi-odniesienia, przy szybkości polaryzacji 50 mV s¹;

- po osadzeniu, warstwę molekularnie wdrukowanego polimeru dokładnie przepłukuje się mieszaniną acetonitrylu i toluenu w celu usunięcia niezwiązanych składników kompleksu prepolimeryzacyjnego i elektrolitu podstawowego;

2. Sposób oznaczania białkowego biomarkera MMP-1 idiopatycznego włóknienia płuc w płynach ustrojowych obejmujący etapy, w których:

- przygotowuje się elektrodę złotą pokrytą warstwą molekularnie jednocześnie wdrukowanych w polimer trzech epitopów MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) sposobem zdefiniowanym w zastrz. 1;

- otrzymaną wyżej elektrodę złotą pokrytą warstwą molekularnie jednocześnie wdrukowanych trzech epitopów doprowadza się do kontaktu z próbką badanego płynu ustrojowego w układzie pomiarowym mierzącym zmianę natężenia prądu drenu przy zadanym napięciu bramki.

3. Sposób oznaczania biomarkerów białkowych MMP-1 i SP-A idiopatycznego włóknienia płuc w płynach ustrojowych obejmujący etapy, w których:

- przygotowuje się pierwszą elektrodę złotą pokrytą warstwą molekularnie wdrukowanych jednocześnie w polimer trzech epitopów MIAHDFPGIGHK (SEQ ID NO: 1), HGYPKDIYSS (SEQ ID NO: 2) i FKGNKYWAVQGQNV (SEQ ID NO: 3) sposobem zdefiniowanym w zastrz. 1;

- przygotowuje się drugą elektrodę złotą z warstwą molekularnie wdrukowanych epitopów FSSNGOSIT (SEQ ID NO: 5) albo epitopu YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6) albo dwóch epitopów FSSNGQSIT (SEQ ID NO: 5) i YSDGTPVNYTNWYR (SEQ ID NO: 6) w polimerze sposobem zdefiniowanym w zastrz. 1;

- otrzymaną powyżej pierwszą elektrodę złotą z warstwą molekularnie wdrukowanych trzech epitopów doprowadza się do kontaktu z próbką badanego płynu ustrojowego w układzie pomiarowym mierzącym natężenie prądu drenu przy zadanym napięciu bramki

4. Jednostka rozpoznawania molekularnego do selektywnego oznaczania biomarkerów idiopatycznego włóknienia płuc obejmująca złotą elektrodę z warstwą molekularnie wdrukowanego polimeru otrzymaną sposobem zdefiniowanym w zastrz. 1, przy czym jako szablon epitopu zastosowano: