PL249076B1

PL249076B1 - Sposób biologicznego wytwarzania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota przy pomocy lizatu bakteryjnego oraz zastosowanie lizatu bakterii do biologicznego wytwarzania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota

Info

Publication number: PL249076B1
Application number: PL430984A
Authority: PL
Inventors: Witold Uhrynowski; Wiktor Lewandowski; Łukasz DREWNIAK; Łukasz Drewniak; Michał Wójcik; Paweł JARMUŁA; Paweł Jarmuła
Original assignee: Univ Warszawski
Priority date: 2019-08-29
Filing date: 2019-08-29
Publication date: 2026-02-23
Also published as: WO2021040549A1; PL430984A1; EP4022075A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób biologicznego wytwarzania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota z zastosowaniem przez redukcję tlenku grafenu i prekursora nanocząstek złota lizatem bakterii szczepu Shewanella sp. O23S. Wynalazek dotyczy również zastosowania lizatu bakterii szczepu Shewanella sp. O23S do wytwarzania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota.

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu biologicznego wytwarzania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota przy pomocy lizatu bakteryjnego oraz zastosowania lizatu bakterii do biologicznego wytwarzania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota. Stan techniki

Materiały kompozytowe typu „zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki metali” (ang. reduced graphene oxide/nanoparticles, RGO/NP) są intensywnie badane pod kątem zastosowania w optycznych i elektrochemicznych sensorach (P. T. Yin, T.-H. Kim, J.-W. Choi, i K.-B. Lee, Phys. Chem. Chem. Phys., 2013, 15, 12785-99), magazynowaniu energii (H. Wang i H. Dai, Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 3088-113), katalizie w ogniwach paliwowych (C. Tan, X. Huang, i H. Zhang, Mater. Today, 2013, 16, 29-36; Y. Liang, Y. Li, H. Wang, i H. Dai, J. Am. Chem. Soc., 2013, 135, 2013-36), celowanym dostarczaniu leków (S. Goenka, V. Sant, i S. Sant, J. Control. Release, 2014, 173, 75-88), oraz innych specyficznych zastosowaniach, takich jak, na przykład, w wysoce-giętkich wyświetlaczach (Y.-K. Kim, H.-K. Na, Y. W. Lee, H. Jang, S. W. Han, i D.-H. Min, Chem. Commun. (Camb)., 2010, 46, 3185-7), superkondensatorach (L. Zheng, G. Zhang, M. Zhang, S. Guo, i Z. Liu, J. Power Sources, 2012, 201, 376-381), czy do magazynowaniu wodoru (C.-C. Huang, N.-W. Pu, C.-A. Wang, J.-C. Huang, Y. Sung, i M.-D. Ger, Sep. Purif. Technol, 2011,82, 210-215). Jednym z głównych problemów z komercjalizacją tych technologii są obecnie ograniczone możliwości taniej i łatwej produkcji wysokiej jakości materiałów kompozytowych typu RGO/NP na dużą skalę.

Obecnie dostępne strategie wytwarzania materiałów kompozytowych zawierających zredukowany tlenek grafenu najczęściej wykorzystują chemiczne sposoby syntezy (H. Bai, C. Li, i G. Shi, Adv. Mater., 2011,23, 1089-115), które obejmują następujące etapy:

A. synteza tlenku grafenu (ang. graphene oxide, GO) poprzez utlenienie i eksfoliację grafitu

B. dodatek prekursorów nanocząstek (soli metali) do roztworu GO

C. redukcja soli metali do nanocząstek, oraz

D. redukcja GO do RGO, przy czym etapy C i D prowadzone są jednocześnie.

W etapach C i D wytwarzane są nanocząstki metali oraz zredukowany tlenek grafenu. Opisana powyżej metoda jest szczególnie korzystna, ponieważ grupy tlenowe znajdujące się na powierzchni tlenku grafenu są miejscami, w których zachodzi nukleacja nanocząstek, w wyniku czego otrzymywany materiał kompozytowy charakteryzuje się nie tylko równomiernym rozłożeniem nanocząstek na powierzchni zredukowanego tlenku grafenu, ale również stabilnym połączeniem pomiędzy obydwoma komponentami.

Z punktu widzenia jakości uzyskiwanego materiału, kluczowym etapem syntezy jest proces redukcji. W ostatnich latach opracowano wiele wariantów tej reakcji (H. Bai, C. Li, i G. Shi, Adv. Mater., 2011,23, 1089-115; S. Pei i H.-M. Cheng, Carbon N. Y„ 2012, 50, 3210-3228; C. K. Chua i M. Pumera, Chem. Soc. Rev., 2014, 43, 291-312), jednak przytaczane metody wykorzystują niebezpieczne związki chemiczne, i często wymagają użycia wysokiej temperatury, a zatem są kosztowne energetycznie. Stosowanie ich stanowi zatem zagrożenie dla środowiska naturalnego i jest stosunkowo drogie. W związku z tym, intensywnie poszukiwane są wydajne i jednocześnie przyjazne środowisku metody redukcji.

Korzystne jest, na przykład, prowadzenie redukcji z wykorzystaniem mikroorganizmów, takich jak bakterie. Bakterie były już wcześniej wykorzystywane do przeprowadzenia reakcji redukcji samego tlenku grafenu GOARGO lub redukcji prekursorów metali do nanocząstek.

W Tabeli 1 poniżej, przedstawiono zestawienie publikacji dotyczących wykorzystania bakterii do redukcji tlenku grafenu, wraz ze wskazaniem rodzaju stosowanych bakterii oraz stężenia GO.

Tabela 1. Reakcje bakteryjnej redukcji tlenku grafenu do zredukowanego tlenku grafenu

Publikacja	Bakterie	Stężenie GO
E. C. Salas, Z. Sun, A. Liittge, i J. M. Tour, ACS Nano, 2010, 4, 4852-6	Shewanella oneidensis MR-la Shewanella putrefaciens CN32a Shewanella amazonensis SB2Ba Shewanellaputrefaciens W3-18-1 a She w ane Ha baltica 10735Tb	film GO i roztwory

PL 249076 BI

Publikacja	Bakterie	Stężenie GO
G. Wang, F. Qian, C. W. Saltikov, Y. Jiao, i Y. Li, NanoRes., 2011, 4, 563-570	Shewanella oneidensis MR-1 (ATCC 700550) Shewanella sp. ANA-3	0,3 mg/ml
Y. Jiao, F. Qian, Y. Li, G. Wang, C. W. Saltikov, i J. a Gralnick, J. Bacteriol., 2011, 193, 3662-5	Shewanella oneidensis MR-1, mutanty mtr	0,8 mg/ml
Y. Tanizawa, Y. Okamoto, K. Tsuzuki, Y. Nagao, N. Yoshida, R. Tero, S. Twasa, a Hiraishi, Y. Suda, H. Takikawa, R. Numano, H. Okada, R. Ishikawa, i a Sandhu, J. Phys. Conf. Ser., 2012,352, 012011	mikroorganizmy izolowane z wybrzeża rzeki w pobliżu kampusu Tempaku Politechniki Toyohashi
O. Akhavan i E. Ghaderi, CarbonN. K, 2012, 50, 18531860	Escherichia coli (ATCC 25922)	film GO
S. Gurunathan, J. W. Han, V. Eppakayala, i J.-H. Kim, Colloids Surf. B. Biointerfaces, 2013, 102, 772-7 '	Escherichia coli	0,5 mg/ml
Y.-C. Yong, Y.-Y. Yu, X. Zhang, i H. Song, Angew. Chem. hit. Ed. Engl., 2014, 53, 4480-3	Shewanella oneidensis MR-1	0,2 mg/ml
M. Fan, C. Zhu, Z.-Q. Feng, J. Yang, L. Liu, i D. Sun, Nanoscale, 2014, 6, 4882-8	głównie Staphylococcus, beztlenowy osad ściekowy z Instalacji do oczyszczania ścieków Nanjing;	1 mg/ml

Zastosowanie bakterii do wytwarzania nanocząstek metali w reakcji redukcji sól metaluAnanocząstki metali było opisane, na przykład, w publikacjach K. B. Narayanan i N. Sakthivel, Adv. Colloid Interface Sci., 2010, 156, 1-13 i N. Pantidos, J. Nanomed. Nanotechnol., 2014, 05. Do wytwarzania nanocząstek metali często wykorzystuje się bakterie z rodzaju Shewanella (K. B. Narayanan i N. Sakthivel, Adv. Colloid Interface Sci., 2010, 156, 1-13; Y. Konishi, K. Ohno, N. Saitoh, T. Nomura, i S. Nagamine, w 2006 Bio Micro and Nanosystems Conference, IEEE, 2006, s. 29-29).

W stanie techniki istnieją również znikome doniesienia dotyczące bakteryjnej syntezy materiału typu RGO/NP. W publikacji CN104004788A opisano trzyetapową syntezę obejmującą:

a. hodowlę bakterii redukujących dysymilacyjnie metale;

b. przygotowanie roztworu tlenku grafenu jako prekursora grafenu;

c. syntezę biologiczną materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu nanocząstki złota, w której prowadzi się mieszanie wodnego roztworu tlenku grafenu z roztworem zawierającym Au (III) przez co najmniej 1 godzinę, następnie dodaje się bakterie redukujące dysymilacyjnie metale w fazie wzrostu logarytmicznego i przeprowadzi reakcję w 25 - 35°C przy 150 - 250 rpm przez 24 - 72 godziny z wytworzeniem materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota, przy czym stężenie tlenku grafenu w roztworze bakterii wynosi 0,1 g/l - 0,3 g/l, a stężenie Au(lll) w roztworze bakterii wynosi 0,5 - 1,5 mM. W syntezie tej wykorzystano szczep Shewanella oneidensis MR-1.

Dużą niedogodnością wynikającą z prowadzenia syntezy biologicznej z zastosowaniem żywych mikroorganizmów jest ograniczenie warunków prowadzenia procesów do warunków ich optymalnego wzrostu. Ponadto wykorzystanie żywych mikroorganizmów wiąże się z koniecznością prowadzenia skomplikowanych sposobów oczyszczania syntetyzowanych przez nie materiałów, ze względu na obecność dużych ilości pozostałości materiału komórkowego, który uniemożliwia dalsze zastosowanie tych materiałów.

Istnieje zatem duże zapotrzebowanie na sposób wytwarzania materiału typu RGO/NP, który byłby nie tylko przyjazny środowisku, ale również stosunkowo prosty i możliwy do stosowania w różnych warunkach.

Opis wynalazku

Twórcy niniejszego wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że szczep bakterii Shewanella sp. O23S (określany dalej również jako szczep O23S), który został wyizolowany z mat mikrobiologicznych z kopalni złota w Złotym Stoku (Drewniak L. 2009. Charakterystyka bakterii arsenowych wyizolowanych z kopalni złota w Złotym Stoku. Praca doktorska. Wydział Biologii. Uniwersytet Warszawski), opisany w patencie PL220839 i zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych IBPRS w Warszawie pod nr depozytu KKP 2045p, może znaleźć zastosowanie do wytwarzania materiału kompozytowego typu RGO/NP, w szczególności kompozytu zredukowany tlenek grafenu / nanocząsteczki złota, nie tylko w postaci żywej hodowli, ale przede wszystkim w postaci lizatu bakteryjnego.

Przedmiotem wynalazku jest zatem sposób biologicznego wytwarzania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota z zastosowaniem materiału bakteryjnego przez redukcję tlenku grafenu i prekursora nanocząstek złota, obejmujący zmieszanie wodnej zawiesiny tlenku grafenu i wodnego roztworu prekursora nanocząstek złota z lizatem bakterii szczepu Shewanella sp. O23S, przy czym stężenie tlenku grafenu w mieszaninie reakcyjnej zaraz po jej otrzymaniu wynosi od 0,01 mg/ml do 3 mg/ml, a stężenie jonów złota w mieszaninie reakcyjnej zaraz po jej otrzymaniu wynosi od 0,1 do 5 mM, i pozostawienie tak otrzymanej mieszaniny reakcyjnej do wytworzenia osadu materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota.

Korzystnie, sposób obejmuje dodatkowo etap izolowania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota z mieszaniny reakcyjnej.

Korzystnie, odizolowany materiał kompozytowy zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota poddaje się dalszemu oczyszczaniu.

Korzystnie, oczyszczanie prowadzi się przez co najmniej jednokrotne przeprowadzenie następujących etapów: rozpuszczenia odizolowanego materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / / nanocząstki złota w wodzie, sonikacji tak otrzymanej zawiesiny, i jej wirowania, a następnie usunięcia supernatantu wraz z materiałem niezwiązanym z powierzchnią zredukowanego tlenku grafenu.

Korzystnie, stosuje się lizat bakterii szczepu Shewanella sp. O23S otrzymany przez lizę komórek bakteryjnych oddzielonych z hodowli szczepu Shewanella sp. O23S prowadzonej w warunkach tlenowych.

Korzystnie, lizę komórek bakterii szczepu Shewanella sp. O23S prowadzi się w roztworze hipotonicznym.

Korzystnie, stężenie stosowanej wodnej zawiesiny tlenku grafenu wynosi od 10 mg/ml do 20 mg/ml.

Korzystnie, stosuje się tlenek grafenu otrzymany w zmodyfikowanej reakcji Hummersa.

Korzystnie, prekursorem nanocząstek złota są zawarte w roztworze jony złota.

Korzystnie, źródłem jonów złota w roztworze są sole wybrane z grupy zawierającej AuCl3 i Na3Au(S2O3)2 lub kwas HAuCk i jego sole.

Korzystnie, stężenie jonów złota w stosowanym wodnym roztworze prekursora nanocząstek złota wynosi od 5 mM do 15 mM.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie lizatu bakterii szczepu Shewanella sp. O23S do biologicznego wytwarzania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota.

Szczegółowy opis wynalazku

Przez biologiczny sposób wytwarzania lub biologiczny sposób redukcji należy rozumieć sposób wykorzystujący mikroorganizmy, dzięki któremu stosowanie nieprzyjaznych środowisku odczynników jest ograniczone lub całkowicie wyeliminowane. Określenie to odnosi się nie tylko do sposobów wykorzystujących żywe mikroorganizmy, ale również produkty pochodzące z takich mikroorganizmów, takie jak lizaty komórkowe czy wyselekcjonowane enzymy.

Jak wskazano powyżej, szczep Shewanella sp. O23S, jego właściwości oraz sposób jego wytwarzania były wcześniej szczegółowo opisane w rodzinie zgłoszeń patentowych czerpiących pierwszeństwo ze zgłoszenia P.404376. Bakterie szczepu Shewanella sp. O23S są bakteriami Gramujemnymi, u których cytochromy typu C biorące udział w procesach redoks, w tym również w procesie wytwarzania nanocząstek, znajdują się w peryplazmie (Jiao Y et al., J. Bacteriol., 2011, 193, 3662-5), jak i na zewnętrznej stronie błony komórkowej. Shewanella sp. O23S, zostały wyizolowane z osadów dennych systemów odwadniających nieczynnej kopalni złota w Złotym Stoku (izolat środowiskowy). Szczep ten został zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych IBPRS w Warszawie pod nr depozytu KKP 2045p, a jego szczegółowa charakterystyka fizjologiczna i genomiczna została przedstawiona w następujących publikacjach: Drewniak et al., Int. J. Mol. Sci. 2015, 16(7), 14409-14427 i Uhrynowski et al., Int. J. Mol. Sci. 2019, 20(5), 1018). Na podstawie wstępnych analiz wykazano, że szczep ten charakteryzuje się wysoką opornością na arsen oraz szereg metali ciężkich, i potrafi wykorzystywać szerokie spektrum związków nieorganicznych i organicznych jako akceptorów elektronów w procesach oddechowych (redukcja dysymilacyjna). Ponadto szczep ten jest zdolny do biosorpcji, bioakumulacji, a także tworzenia wewnątrz i zewnątrzkomórkowych agregatów tych metali.

Twórcy niniejszego wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że szczep O23S jest także zdolny do redukcji tlenku grafenu i wytwarzania nanocząstek złota. Powstałe nanocząstki lub zredukowany tlenek grafenu mogą akumulować się na powierzchni komórek O23S, co może w znaczący sposób ułatwić późniejszy proces oczyszczania produktów, niż w przypadku ich wewnątrzkomórkowego powstawania. W związku z tym, szczep ten może znaleźć zastosowanie w sposobie wytwarzania nie tylko RGO i nanocząstek złota, ale i innych materiałów, w tym także materiału kompozytowego typu RGO/NP. Ponadto w trakcie badań nad zdolnością szczepu Shewanella sp. O23S do redukcji tlenku grafenu i wytwarzania nanocząstek złota nieoczekiwanie stwierdzono, że szczep ten może znaleźć zastosowanie w sposobie wytwarzania zredukowanego tlenku grafenu, nanocząstek złota i/albo materiału kompozytowego typu RGO/NP, w postaci nie tylko aktywnych komórek (hodowla w fazie logarytmicznego wzrostu), ale i lizatu bakteryjnego, w szczególności lizatu uzyskiwanego w fazie stacjonarnej. Ten ostatni aspekt stanowi podstawę rozwiązań według wynalazku.

Dla celów niniejszego zgłoszenia określenie „zredukowany tlenek grafenu” (RGO) ma znaczenie standardowo stosowane w dziedzinie i oznacza materiał otrzymany przez redukcję tlenku grafenu, w którym ilość atomów tlenu została zmniejszona z zastosowaniem biologicznego sposobu redukcji. „Tlenek grafenu” oznacza natomiast jednowarstwowy materiał węglowy, w którym proporcja atomowego węgla do tlenu wynosi poniżej 3 (A. Bianco et al., Carbon, 2013, 65, 1-6). Określenie „nanocząstki” ma znaczenie standardowo stosowane w dziedzinie i oznacza cząstki, których co najmniej jeden wymiar wynosi poniżej 100 nm. Określenie „mieszanina reakcyjna” oznacza mieszaninę otrzymaną przez zmieszanie reagentów, w szczególności zawiesiny tlenku grafenu i roztworu wodnego prekursora nanocząstek złota oraz lizatu bakterii szczepu Shewanella sp. O23S, w których zachodzi reakcja redukcji prowadząca do wytworzenia materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota, jak również mieszaninę zawierającą reszki nieprzereagowanych reagentów oraz produkt reakcji redukcji, tj. materiał kompozytowy zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota.

Korzystnie, sposób według wynalazku obejmuje dodatkowo etap izolowania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota z mieszaniny reakcyjnej. Korzystniej, odizolowany w ten sposób materiał kompozytowy zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota poddaje się dalszemu oczyszczaniu. W korzystnej postaci wykonania oczyszczanie prowadzi się przez co najmniej jednokrotne przeprowadzenie następujących etapów: rozpuszczenia odizolowanego materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota w wodzie, sonikacji tak otrzymanej zawiesiny, i jej wirowania, a następnie usunięcia supernatantu wraz z materiałem niezwiązanym z powierzchnią zredukowanego tlenku grafenu. Korzystniej, etapy oczyszczania powtarza się dwukrotnie lub trzykrotnie. Szczególnie korzystnie, w procesie oczyszczania etap sonikacji prowadzi się w płuczce ultradźwiękowej przez 5 - 15 minut, korzystniej 10 minut, a etap wirowania prowadzi się przez 2 - 15 minut, korzystniej 10 minut, przy prędkości 5 000 - 12 000 rpm, korzystniej przy 8 000 rpm. W ten sposób możliwe jest prawie całkowite usunięcie pozostałości komórkowych, przy jednoczesnym zminimalizowaniu strat kompozytu zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota. W celu zwiększenia efektywności procesu oczyszczania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota, pozostałości komórek bakteryjnych można trawić enzymatycznie (z wykorzystaniem enzymów proteolitycznych, lipolitycznych i innych) lub chemicznie. Przy czym stosowanie w procesie oczyszczania dodatkowych czynników może mieć wpływ na wielkość i kształt nanocząstek złota. Korzystnie, przy wykorzystaniu procesu enzymatycznego trawienia resztek komórek bakteryjnych stosuje się również sączenie na membranie o porach 0,2 μm.

W sposobie według wynalazku stosuje się lizat bakterii szczepu Shewanella sp. O23S otrzymany korzystnie przez lizę komórek bakteryjnych oddzielonych z hodowli szczepu Shewanella sp. O23S prowadzonej w warunkach tlenowych. Należy przy tym podkreślić, że hodowla może być prowadzona nie tylko warunkach tlenowych, ale również mikroaerofilnych i beztlenowych. Hodowla może być prowadzona na dowolnym podłożu umożliwiającym wzrost szczepu O23S, ale korzystnie jest prowadzona na podłożu płynnym LB. Hodowlę dla celów uzyskania lizatu prowadzi się do momentu, w którym następuje koniec logarytmicznej fazy wzrostu. Ponadto, korzystnie hodowlę prowadzi się z wytrząsaniem w zakresie 150 - 300 rpm, korzystniej przy 250 rpm, przez co najmniej 8 godzin, a maksymalnie 48 godzin, a korzystniej przez 24 godziny. Czas prowadzenia hodowli zależy od warunków jej prowadzenia. Temperatura prowadzenia hodowli wynosi korzystnie 22 - 30°C, a korzystniej 26°C. Korzystnie początkowa gęstość optyczna hodowli (OD 600 nm), tj. po zaszczepienia podłoża inokulum, wynosi 0,06 - 0,08. Również korzystnie gęstość optyczna hodowli w momencie jej zakończenia (OD 600 nm) wynosi 0,8 1,6, a korzystniej 1,0 - 1,2 co w odpowiada końcowej fazie logarytmicznego wzrostu.

Lizat komórek bakterii szczepu Shewanella sp. O23S stosowany w korzystnej postaci wykonania wynalazku otrzymuje się w wyniku lizy komórek bakterii szczepu O23S prowadzonej się w roztworze hipotonicznym. Szczególnie korzystnie, lizat komórkowy otrzymuje się poniżej opisanym sposobem. Hodowlę szczepu O23S pod koniec logarytmicznej fazy wzrostu po 8 - 48 godzinach, a korzystniej 24 godzinach, poddaje się odwirowaniu w niskiej temperaturze 4 - 10°C, a korzystniej 4°C, przy prędkości od 4000 do 6000 rpm, a korzystniej 5000 rpm, przez 5 do 15 min, a korzystniej 10 minut. Po zdekantowaniu supernatantu do osadu z komórek dodaje się 1 - 10 ml wody destylowanej, a korzystniej 5 ml, w której osad bakteryjny ulega zawieszeniu. Zawiesinę komórkową poddaje się ponownie wirowaniu w tych samych warunkach, a korzystniej przez 5 min przy 5000 rpm w temperaturze 4°C. Cała procedura powtarzana jest łącznie 2 - 5 razy, a korzystniej 3 razy. Po ostatnim usunięciu supernatantu do osadu dodaje się 5 - 30 ml, korzystnie 10 - 20 ml, a najkorzystniej 15 ml wody destylowanej, z wytworzeniem zawiesiny komórkowej, którą następnie inkubuje się przez 12 do 48 godzin, a korzystniej 24 godziny, w temperaturze 20 - 30°C, a korzystniej 25°C. Dla celów zastosowania w sposobie według wynalazku, możliwe jest również przygotowanie lizatu komórek bakterii szczepu Shewanella sp. O23S innymi, znanymi specjaliście w dziedzinie sposobami.

W korzystnej postaci wykonania w sposobie według wynalazku od przygotowania mieszaniny reakcyjnej stosuje się wodną zawiesinę tlenku grafenu o stężeniu od 10 mg/ml do 20 mg/ml. Stężenie tlenku grafenu w mieszaninie reakcyjnej zaraz po jej otrzymaniu (tj. zaraz po zmieszaniu wszystkich reagentów) wynosi od 0,01 mg/ml do 3 mg/ml, korzystniej od 0,5 - 1 mg/ml, a najkorzystniej wynosi 0,5 mg/ml.

Korzystnie, tlenek grafenu stosowany w sposobie według wynalazku otrzymany jest w zmodyfikowanej reakcji Hummersa, chociaż może być również otrzymywany innymi sposobami, na przykład, metodą Brodiego, Staudenmaiera, i niezmodyfikowaną metodą Hummersa. W zmodyfikowanej reakcji Hummersa, prekursor - proszek grafitowy o średnicy ziaren od 20 do 160 μm jest utleniany za pomocą nadmanganianu potasu w środowisku stężonego kwasu siarkowego, w temperaturze nieprzekraczającej 20°C. Po dodaniu KMnO4 reakcja prowadzona jest przez 12 - 24 godziny w temperaturze pomiędzy 30 a 50°C. W następnym etapie roztwór przenoszony jest do zlewki zawierającej kruszony lód i dodawany jest do niego wodny roztwór nadtlenku wodoru w ilości niezbędnej do uzyskania żółtego zabarwienia roztworu (tj. do odbarwienia roztworu). W celu oczyszczenia materiału prowadzany jest proces dekantacji, a otrzymany osad jest poddawany wielokrotnemu przemywaniu za pomocą roztworu kwasu solnego i wody destylowanej z następującym po nim wirowaniem, aż do momentu uzyskania obojętnego odczynu supernatantu.

W korzystnej postaci wykonania sposobu według wynalazku prekursorami nanocząstek złota są zawarte w roztworze jony złota, których źródłem są korzystnie sole wybrane z grupy zawierającej AuCl3 i Na3Au(S2O3)2 lub kwas HAuCk i jego sole. Szczególnie korzystne stężenie jonów złota w wodnym roztworze prekursora nanocząstek złota stosowanym w sposobie według wynalazku wynosi od 5 mM do 15 mM. Stężenie jonów złota w mieszaninie reakcyjnej zaraz po jej otrzymaniu (tj. zaraz po zmieszaniu wszystkich reagentów) wynosi od 0,1 do 5 mM, korzystniej od 0,5 do 1 mM złota, a najkorzystniej wynosi 0,5 mM.

W korzystnej postaci wykonania mieszaninę reakcyjną otrzymaną przez zmieszanie wodnej zawiesiny tlenku grafenu i wodnego roztworu prekursora nanocząstek złota z lizatem bakterii szczepu Shewanella sp. O23S pozostawia się na 6 godzin. Czas ten jest wystarczający do otrzymania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota.

Materiał kompozytowy zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota otrzymywany sposobem według wynalazku został scharakteryzowany w wykorzystaniem transmisyjnego mikroskopu elektronowego oraz spektroskopii fotoelektronów.

Opracowany przez Twórców sposób według wynalazku ma szereg zalet w porównaniu do sposobów znanych ze stanu techniki:

1. Skrócenie czasu prowadzenia etapu redukcji GO i prekursorów metali, dzięki uniezależnieniu tego procesu od hodowli bakteryjnej;

2. Ułatwienie procesu oczyszczania dzięki użyciu lizatów bakterii, a nie bakterii z hodowli;

3. Oszczędność kosztów związana ze stosowaniem warunków tlenowych vs. warunki beztle- nowe (np. stosowanie taniego, odpadowego podłoża hodowlanego);

4. Zmniejszenie kosztów dzięki możliwości wykorzystania odpadowych substancji do hodowli bakteryjnej;

5. Możliwość prowadzenia procesu w trybie ciągłym, w szerokim zakresie temperatur (proces nie zależy od aktywności bakterii); oraz

6. Możliwość prowadzenia syntezy przy wyższych stężeniach reagentów (brak ograniczeń związanych z toksycznością reagentów dla żywych bakterii).

Powyższe i inne zalety i korzyści niniejszego wynalazku staną się bardziej zrozumiałe w oparciu o zamieszczone poniżej przykłady postaci wykonania wynalazku.

Przedmiot wynalazku uwidoczniono na rysunku, na którym:

Figura 1 przedstawia (a) zmiany absorbancji hodowli szczepu O23S oraz kontroli negatywnej w postaci szczepu Escherichia coli TOP 10 (TOP 10) w czasie wzrostu na podłożu LB z dodatkiem tlenku grafenu mierzonej przy długości fali 600 nm (przykładowy wykres dla układu, w którym początkowe stężenie tlenku grafenu w hodowli wynosiło 0,5 mg/ml), oraz (b) zmiany absorbancji hodowli szczepu O23S oraz kontroli negatywnej w postaci szczepu TOP 10 w czasie wzrostu na podłożu LB z dodatkiem jonów złota mierzonej przy długości fali 520 nm (przykładowy wykres dla układu, w którym początkowe stężenie jonów złota w hodowli wynosiło 0,5 mM) (Przykład 3);

Figura 2 przedstawia (a) zmiany absorbancji w lizacie szczepu Shewanella sp. O23S podczas inkubacji z tlenkiem grafenu mierzonej przy długości fali 600 nm (przykładowy wykres dla układu, w którym początkowe stężenie tlenku grafenu w lizacie wynosiło 0,5 mg/ml), oraz (b) zmiany absorbancji w lizacie szczepu Shewanella sp. O23S podczas inkubacji z jonami złota mierzonej przy długości fali 520 nm (przykładowy wykres dla układu, w którym początkowe stężenie jonów złota w lizacie wynosiło 0,5 mM) (Przykład 5);

Figura 3 przedstawia zdjęcie z SEM materiału kompozytowego tlenek zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota wytworzonego sposobem według wynalazku z zastosowaniem lizatu O23S przed oczyszczaniem z pozostałości lizatu komórkowego, na którym widoczny jest fragment zredukowanego tlenku grafenu pokryty nanocząstkami złota oraz pozostałości komórek;

Figura 4 przedstawia zdjęcie z TEM materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu // nanocząstki złota wytworzonego sposobem według wynalazku z zastosowaniem lizatu O23S przed oczyszczaniem;

Figura 5 przedstawia zdjęcia TEM materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota otrzymane sposobem według wynalazku po ich oczyszczeniu sposobem opisanym w Przykładzie 6;

Figura 6 przedstawia wyniki analizy materiału kompozytowego otrzymanego sposobem według wynalazku, za pomocą techniki TEM: (a) zdjęcie spod mikroskopu elektronowego w wysokiej rozdzielczości, (b) wynik mapowania za pomocą techniki EDX (białe kropki oznaczają występowanie atomów Au), (c) zdjęcie obszaru mapowanego.

Figura 7 przedstawia analizę XPS materiału kompozytowego. Przedstawione są wysokorozdzielcze skany: (a) dla rejonu C1s tlenku grafenu (substrat używany w syntezie), (b) dla rejonu C1s uzyskanego materiału kompozytowego oraz (c) dla rejonu Au 4f uzyskanego materiału kompozytowego.

Przykłady

Przykład 1: Synteza tlenku grafenu

Syntezę tlenku grafenu prowadzono za pomocą zmodyfikowanej reakcji Hummersa opisanej w skrócie poniżej. 1 g proszku grafitowego o średnicy ziaren 150 μm dodano do znajdującej się w kolbie mieszaniny zawierającej 120 ml stężonego kwasu siarkowego i 12 ml kwasu fosforowego. Po schłodzeniu do temperatury 0°C, do zawiesiny dodano powoli, ciągle mieszając, 6 g nadmanganianu potasu. Kolbę umieszczono następnie w łaźni olejowej w temperaturze 50°C i pozostawiono na 18 godzin. Po tym czasie, roztwór z kolby przelano do zlewki zawierającej 300 ml pokruszonego lodu, do której następnie powoli dodawano 30% wodny roztwór nadtlenku wodoru, aż do odbarwienia się roztworu. Otrzymaną wodną zawiesinę tlenku grafenu pozostawiono na 24 godziny, po czym supernatant zdekantowano. Do otrzymanego przez zdekantowanie osadu dodano 10 ml ciepłego (ok. 50°C) 5% kwasu solnego i 240 ml wody destylowanej. Całość poddawano wirowaniu przez 10 minut z przyspieszeniem 10733 x g. Supernatant odrzucono, a osad rozpuszczono w 240 ml wody destylowanej. Proces ten był powtarzany do momentu, w którym papierek uniwersalny nasączony supernatantem zabarwił się na czerwono. Oczyszczony tlenek grafenu został zawieszony w 250 ml wody.

Tlenek grafenu otrzymany powyższą metodą może być poddawany procesowi liofilizacji i przechowywany w postaci zliofilizowanej. Przez dodanie wody destylowanej do liofilizowanego tlenku grafenu otrzymuje się zawiesinę o odpowiednim stężeniu do dalszego zastosowania. W ten sposób przygotowano roztwory/zawiesiny o stężeniu 10 mg/ml lub 20 mg/ml, które były stosowane w dalszych etapach syntezy kompozytu zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota.

Przykład 2: Hodowla szczepu Shewanella sp. O23S

Hodowlę szczepu Shewanella sp. O23S (dalej jako hodowla nocna szczepu O23S) zarówno dla celów stosowania go bezpośrednio w sposobie syntezy biologicznej kompozytu zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota, jak i dla celów przygotowania lizatu stosowanego w syntezie kompozytu grafen / nanocząstki złota prowadzono jak opisano poniżej.

Szczep Shewanella sp. O23S wyizolowany z Kopalni w Złotym Stoku namnażano w warunkach tlenowych w 200 ml podłoża płynnego LB (zawierającego trypton 10 g/l; ekstrakt drożdżowy 5 g/l; NaCl 5 g/l; pH 7,0), w 300 ml kolbach, z wytrząsaniem 150 - 300 rpm (korzystnie 250 rpm) przez 24 godziny. Hodowlę prowadzono w temperaturze 26°C. Początkowa gęstość optyczna (OD 600nm) po zaszczepieniu podłoża inokulum wynosiła 0,06 - 0,08. Gęstość optyczna hodowli w momencie jej zakończenia wynosiła 1,0 - 1,2, co w odpowiada końcowej fazie logarytmicznego wzrostu. Tak przygotowaną hodowlę stosowano do dalszych eksperymentów nad sposobem według wynalazku lub jako inokulum.

Przykład 3: Analiza toksyczności oraz zdolności szczepu Shewanella sp. O23S do redukcji tlenku grafenu i wytwarzania nanocząstek złota (przykład porównawczy)

W celu określenia toksyczności tlenku grafenu i prekursora nanocząstek złota (jony złota) w postaci HAuCl4 lub AuCl3 (tj. wyznaczenia dla tych związków minimalnego stężenia hamującego wzrost, ang. Minimal Inhibitory Concentration, MIC) dla komórek szczepu O23S, wykonano serię hodowli w płytkach 96 dołkowych w 150 - 200 μl podłoża LB z dodatkiem: (i) tlenku grafenu w postaci zawiesiny o stężeniu 10 mg/ml lub 20 mg/ml; stężenie tlenku grafenu w podłożu wynosiło [mg/ml]: 0; 0,01; 0,02; 0,05, 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 0,8; 1; 2; 3; 4; 5; 6 lub (ii) prekursora nanocząstek złota - HAuCk lub AuCl3 w postaci 10 mM roztworu w wodzie destylowanej; stężenie prekursora nanocząstek złota w podłożu wynosiło [mM] 0; 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 0,8.

Jako kontrolę negatywną w eksperymentach nad toksycznością tlenku grafenu i prekursora nanocząstek złota dla szczepu O23S wykorzystano szczep Escherichia coli TOP 10 (F- mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ801acZAM15 AlacX74 recA1 araD139 A(araleu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG) (dalej określany również jako TOP 10), hodowany w analogiczny sposób jak opisano w Przykładzie 2, w podłożu LB z wytrząsaniem, przy czym temperatura inkubacji wynosiła 30 - 37°C.

Do zaszczepienia hodowli wykorzystywano opisane w Przykładzie 2 hodowle nocne szczepu O23S oraz kontroli negatywnej E. coli TOP 10 w ilości odpowiedniej do uzyskania OD600nm 0,06 - 0,08. Hodowle prowadzono w 26°C (O23S) lub 37°C (TOP 10), a pomiarów stężenia dokonywano codziennie przez 3 dni, każdorazowo po 5 - 15 sekundowym wytrząsaniu podłoża bezpośrednio przed pomiarem, przy długości fali: (i) 600 nm - wzrost bakterii oraz redukcja dla tlenku grafenu (ii) 520 nm - wytwarzanie nanocząstek złota. Najniższe stężenie przy którym nie obserwowano wzrostu (aktywności) bakterii definiowano jako MIC dla badanej substancji.

Na podstawie analiz toksyczności stwierdzono, że szczep O23S jest zdolny do wzrostu na podłożach, w których stężenie tlenku grafenu w podłożu nie przekracza 3 mg/ml, a stężenie jonów złota jest mniejsze niż 0,8 mM. W przypadku szczepu kontrolnego, wartości te były odpowiednio niższe i wynosiły 0,5 mg/ml oraz 0,5 mM.

Na tej podstawie wyznaczono maksymalne stężenia, w których można prowadzić proces z wykorzystaniem żywych komórek szczepu O23S. Analiza procesu redukcji GO i produkcji nanocząstek przez O23S wykazała, że najkorzystniejszy stosunek przyrostu gęstości optycznej do stosowanego stężenia GO/jonów złota w hodowli - co warunkuje maksymalną wydajność procesu, uzyskuje się, gdy stężenia GO i/albo jonów złota w hodowli wynoszą odpowiednio 0,5 mg/ml i 0,5 mM.

W celu dalszej optymalizacji procesu redukcji GO i wytwarzania nanocząstek złota, do hodowli Shewanella sp. O23S i E. coli TOP 10, pod koniec logarytmicznej fazy wzrostu, po 24 godzinach prowadzenia hodowli, dodawano: (i) tlenek grafenu (do końcowego stężenia 0,5 mg/ml) lub (ii) roztwór jonów złota (do końcowego stężenia 0,5 mM). Zmiany absorbancji hodowli mierzono codziennie przez 3 dni przy długości fali 600 nm dla wzrostu bakterii/redukcji tlenku grafenu i 520 nm dla redukcji złota. Przykładowe wyniki pomiarów absorbancji przestawiono na Fig. 1 (a) i (b).

Podczas eksperymentu z wykorzystaniem tlenku grafenu, już po jednym dniu stwierdzono zmiany w zabarwieniu osadu hodowli z różowego (charakterystycznego dla Shewanella) na ciemnobrązowy. Zmianie barwy wynikającej z tworzącego się osadu towarzyszyła także zmiana absorbancji całej hodowli, po jednym dniu wartość absorbancji wynosiła 2,6, a po dwóch 2,7. Wyniki te wskazują, że redukcja tlenku grafenu następuje już w pierwszej dobie hodowli, a zmiany w pozostałych dniach są nieznaczne, co świadczy o stabilności produktu. W przypadku kontroli negatywnej (hodowla E. coli TOP 10), ani kontroli chemicznej (podłoże z tlenkiem grafenu, bez bakterii) nie zanotowano znaczącej zmiany w absorbancji, ani widocznych zmian w zabarwieniu osadu w ciągu trwania eksperymentu.

Analogiczne wyniki uzyskano w przypadku dodania do hodowli bakteryjnej roztworu jonów złota. Podczas eksperymentu, stwierdzono zmiany w zabarwieniu płynu z hodowli O23S ze słomkowego na różowy, czemu towarzyszyła zmiana absorbancji przy długości fali 520 nm, osiągając maksymalną, stabilną wartość 2,7. Wyniki te wskazują, że w przypadku hodowli O23S następuje produkcja stabilnych (bio)chemicznie nanocząstek złota (dających charakterystyczne różowo-fioletowe zabarwienie roztworu). Przez stabilność (bio)chemiczną nanocząstek złota należy rozumieć stan w którym nie ulegają one procesowi aglomeracji (tj. nie dochodzi do zlewania rdzeni nanocząstek). W przypadku kontroli negatywnej (hodowla E. coli TOP 10), ani kontroli chemicznej (podłoże z chlorkiem złota, bez bakterii), nie zanotowano znaczącej zmiany w absorbancji, ani widocznych zmian w zabarwieniu płynów hodowlanych w ciągu trwania eksperymentu.

Przykład 4: Otrzymywanie kompozytu zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota metodą hodowlaną z zastosowaniem szczepu Shewanella sp. O23S (przykład porównawczy)

Materiał kompozytowy zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota otrzymywano w analogiczny sposób do opisanego w Przykładzie 3, z tą różnicą, że do hodowli bakteryjnych szczepu O23S oraz kontroli negatywnej TOP 10 dodawano jednocześnie tlenek grafenu, do końcowego stężenia 0,5 mg/ml, oraz roztwór jonów złota, do końcowego stężenia 0,5 mM. Zmiany w absorbancji hodowli były analogiczne do tych przedstawionych w Przykładzie 3, a w trakcie trwania eksperymentu zaobserwowano wytworzenie ciemno-brązowego osadu, podobnego do osadu otrzymanego po dodaniu tlenku grafenu do hodowli szczepu O23S. Osad ten, po dekantacji płynnej części podłoża hodowlanego, został poddany analizie mikroskopowej, która wykazała obecność zredukowanego tlenku grafenu, na którego powierzchni znajdowały się nanocząstki złota. W ten sposób potwierdzono zdolność szczepu O23S do wytwarzania materiału kompozytowego typu RGO/NP. Należy jednak podkreślić, że mimo zdolności O23S do tworzenia zredukowanego tlenku grafenu, nanocząstek złota jak i materiału kompozytowego, produkty te - w przypadku zastosowania metody hodowlanej - znajdują się w mieszaninie żywych lub zlizowanych komórek bakteryjnych. Utrudnia to zatem wykorzystanie otrzymanego materiału bez przeprowadzenia procesu jego oczyszczania, np. wg. metody opisanej w Przykładzie 6 lub podobnej.

Przykład 5: Otrzymywanie kompozytu zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota metodą z wykorzystaniem lizatu bakteryjnego z Shewanella sp. O23S

W celu zbadania zdolności lizatu bakteryjnego z Shewanella sp. O23S do redukcji tlenku grafenu oraz wytwarzania nanocząstek złota i materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota przygotowano nocne hodowle szczepu O23S jak opisano w Przykładzie 2 i 3.

Hodowlę szczepu O23S pod koniec logarytmicznej fazy wzrostu (po 24 godzinach) odwirowywano w niskiej temperaturze (4°C) przy prędkości 5000 rpm, przez 10 minut. Supernatant zdekantowano, a do osadu z komórek dodano 5 ml wody destylowanej, w której zawieszono osad bakteryjny. Ponownie odwirowano komórki, w tych samych warunkach (5 min przy 5000 rpm w temperaturze 4°C). Całą procedurę powtórzono łącznie 3 razy. Po ostatnim usunięciu supernatantu, w celu przeprowadzenia lizy komórek w roztworze hipotonicznym, do osadu dodano 15 ml wody destylowanej, w której zawieszono osad. Tak przygotowaną zawiesinę inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 25°C. Po zakończeniu inkubacji ponownie zwirowano próbkę, w tych samych warunkach, (5 min przy 5000 rpm w temperaturze 4°C).

Uzyskany w ten sposób supernatant (lizat hipotoniczny komórek szczepu O23S) badano jak opisano w Przykładzie 3 i 4. Do lizatu komórek szczepu O23S dodawano: (i) wodną zawiesinę tlenku grafenu o stężeniu 10 mg/ml lub 20 mg/ml otrzymaną sposobem opisanym w Przykładzie 1 do uzyskania stężenia 0,5 mg/ml tlenku grafenu w mieszaninie; (ii) jony złota (w postaci wodnego 10 mM roztworu chlorku złota AuCl3, kwasu chlorozłotowego HAuCk, lub Na3Au(S2O3)2) do uzyskania 0,5 mM stężenia w mieszaninie; lub (iii) równocześnie zawiesiny tlenku grafenu do uzyskania stężenia końcowego 0,5 mg/ml oraz roztworu wodnego jonów złota do uzyskania stężenia końcowego 0,5 mM. Po zmieszaniu wyżej wskazanych roztworów z lizatem komórek szczepu O23S następuje reakcja redukcji GO i/albo wytwarzanie nanocząstek złota, która prowadzona jest przez maksymalnie 72 godziny. Po tym czasie próbki badano spektrofotometrycznie, mierząc absorbancję przy długości fali 600 nm w przypadku badania redukcji tlenku grafenu oraz 520 nm gdy badano wytwarzanie nanocząstek złota lub materiału kompozytowego. Przykładowe wyniki pomiarów absorbancji przestawiono na Fig. 2 (a) i (b). Ponieważ wstępne analizy przeprowadzone dla szczepu E. coli TOP 10 nie wykazały możliwości jego efektywnego zastosowania do produkcji ww. materiałów, nie przeprowadzano dalszych badań na tym szczepie.

Podczas eksperymentu z zastosowaniem tlenku grafitu stwierdzono istotną zmianę absorbancj i zawiesiny w przypadku lizatu O23S. Po jednym dniu wartość absorbancji wynosiła 1,6, a w kolejnych dniach 1,7. Wyniki te wskazują, że redukcja tlenku grafenu następuje już w pierwszej dobie inkubacji, a zmiany w pozostałych dniach są nieznaczne, co świadczy o stabilności produktu. W przypadku kontroli biologicznej (lizat ze szczepu O23S bez dodatku tlenku grafenu) oraz kontroli chemicznej (zawiesina wody destylowanej z tlenkiem grafenu, bez lizatu z bakterii) nie odnotowano znaczącej zmiany w absorbancji, ani widocznych zmian w zabarwieniu zawiesiny w ciągu trwania eksperymentu.

Analogiczne wyniki uzyskano w przypadku dodania do lizatu bakteryjnego roztworu złota. Po 2 dniach eksperymentu, stwierdzono zmiany w zabarwieniu płynu z lizatu O23S z bezbarwnego (przezroczystego) na różowy, a następnie intensywnie fioletowy, czemu towarzyszyła zmiana absorbancji przy długości fali 520 nm, osiągając maksymalną wartość 1,1. Wyniki te wskazują, że w przypadku wykorzystania lizatu O23S następuje wytwarzanie nanocząstek złota, które powodują charakterystyczne różowo-fioletowe zabarwienie roztworu. W kontrolach nie zanotowano znaczącej zmiany w absorbancji ani widocznych zmian w zabarwieniu zawiesiny w ciągu trwania eksperymentu. Absorbancja kontroli biologicznej (lizat TOP 10) i kontroli chemicznej (roztwór jonów złota, bez lizatu z bakterii) dla próbek lizatu szczepu O23S z jonami złota wynosiła ok. 0,1 (dane na wykresie nakładają się).

Analogiczny eksperyment przeprowadzono dla lizatu O23S z dodatkiem zarówno tlenku grafenu, do stężenia 0,5 mg/ml, oraz roztworu jonów złota, do stężenia 0,5 mM. Zmiany w absorbancji hodowli były analogiczne do tych przedstawionych powyżej dla procesu redukcji tlenku grafenu. W trakcie procesu zaobserwowano wytworzenie ciemnobrązowego osadu. Osad ten, po dekantacji płynnej części lizatu, został poddany analizie mikroskopowej (Fig. 3), która wykazała obecność tlenku grafenu, na którego powierzchni znajdowały się nanocząstki złota. W ten sposób potwierdzono możliwość wykorzystania lizatu szczepu O23S do wytwarzania materiału kompozytowego typu RGO/NP. Należy przy tym podkreślić, że materiał kompozytowy uzyskany sposobem z zastosowaniem lizatu według wynalazku charakteryzuje się wyższą czystością od materiału uzyskanego metodą hodowlaną, choć nie jest całkowicie wolny od zlizowanych komórek bakteryjnych. W celu otrzymania produktu o wysokiej czystości konieczne jest przeprowadzenie procesu jego oczyszczania, np. sposobem opisanym w Przykładzie 6.

Przykład 6: Oczyszczanie kompozytu zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota

Produkt kompozytowy zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota otrzymany sposobem według wynalazku (kompozyt otrzymany w Przykładzie 5), mimo że zawiera mniej zanieczyszczeń niż analogiczny produkt kompozytowy otrzymany z zastosowaniem metody hodowlanej (kompozyt otrzymany w Przykładzie 4), wymaga oczyszczania.

Wstępna analiza materiału kompozytowego otrzymanego metodą według wynalazku materiał kompozytowy (przed oczyszczeniem) metodą transmisyjnej mikroskopii elektronowej wykazała obecność licznych zanieczyszczeń komórkowych. Na Fig. 4 przedstawiono zdjęcie TEM, na którym widoczne jest duże zagęszczenie nanocząstek złota oraz zredukowanego tlenku grafenu, na tle licznych pozostałości komórek bakteryjnych.

Materiał kompozytowy otrzymany sposobem według wynalazku został poddany dwuetapowemu procesowi oczyszczania. W pierwszym etapie osad otrzymany w Przykładzie 5 rozpuszcza się w wodzie i poddaje sonikacji w płuczce ultradźwiękowej przez 10 min. Następnie otrzymaną w ten sposób zawiesinę wiruje się w wirówce przy 8 000 rpm przez 10 min.

Proces oczyszczania powtarzano 3-krotnie dzięki czemu usunięto pozostałości komórkowe prawie całkowicie, przy jednoczesnym zminimalizowaniu strat produktu.

Po przeprowadzeniu procedury oczyszczania jakość materiału kompozytowego jest dobra. W większości fragmenty zredukowanego tlenku grafenu nie są ze sobą połączone, a nanocząstki nie łączą się w agregaty. Szczegółową charakterystykę otrzymanego materiału kompozytowego przedstawiono w Przykładzie 7.

Przykład 7: Charakterystyka materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota

Materiał uzyskany sposobem według wynalazku został poddany szeregowi analiz:

1. Analiza za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (mikrografia oraz analiza występowania atomów Au mierzona techniką EDX) potwierdzająca: (i) powstawanie nanocząstek Au, (ii) osadzanie nanocząstek Au na powierzchni RGO, (iii) wydajną syntezę tworzenia materiału kompozytowego (duża liczba nanocząstek przypadających na powierzchnię zredukowanego tlenku grafenu).

2. Analiza za pomocą spektroskopii fotoelektronów potwierdzająca redukcję GO do RGO oraz obecność Au w materiale. Przypisanie komponentów widma zostało wykonane na podstawie wcześniejszej publikacji (W. R. Collins, W. Lewandowski, E. Schmois, J. Walish, i T. M. Swager, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2011,50, 8848-52).

Na zdjęciach wykonanych za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego na powierzchni zredukowanego tlenku grafenu widoczne są nanocząstki sferyczne o średnicach od 2,8 do 68,7 nm, o średniej d = 12,8 ± 8,7 nm, nanotrójkąty o wielkościach od 31,4 do 274,5 nm, o średniej d = 89,1 ± 61,4 nm, a także nanocząstki o kształcie pomiędzy sferycznym a trójkątnym. Obserwowane są też pojedyncze nanocząstki (poniżej 1%) znajdujące się poza powierzchnią materiału. Przykładowe zdjęcia TEM materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota otrzymane sposobem według wynalazku, po ich oczyszczeniu sposobem opisanym w Przykładzie 6 przedstawiono na Fig. 5. Ponadto na Fig. 6 przedstawiono zdjęcie spod mikroskopu elektronowego w wysokiej rozdzielczości, wynik mapowania za pomocą techniki EDX (białe kropki oznaczają występowanie atomów Au), oraz zdjęcie obszaru mapowanego. Fig. 7 przedstawia wynik analizy XPS oczyszczonego materiału kompozytowego.

Analiza za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (mikrografia oraz analiza występowania atomów Au mierzona techniką EDX) potwierdziła: (i) powstawanie nanocząstek złota, (ii) osadzanie nanocząstek złota na powierzchni RGO, oraz (iii) wydajną syntezę tworzenia materiału kompozytowego (duża liczba nanocząstek przypadających na powierzchnię zredukowanego tlenku grafenu).

Analiza za pomocą spektroskopii fotoelektronów potwierdziła redukcję GO do RGO oraz obecność Au w materiale. Przypisanie komponentów widma zostało wykonane na podstawie wcześniejszej publikacji (W. R. Collins, W. Lewandowski, E. Schmois, J. Walish, i T. M. Swager, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2011,50, 8848-52).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób biologicznego wytwarzania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu // nanocząstki złota z zastosowaniem materiału bakteryjnego przez redukcję tlenku grafenu i prekursora nanocząstek złota, znamienny tym, że obejmuje zmieszanie wodnej zawiesiny tlenku grafenu i wodnego roztworu prekursora nanocząstek złota z lizatem bakterii szczepu Shewanella sp. O23S, przy czym stężenie tlenku grafenu w mieszaninie reakcyjnej zaraz po jej otrzymaniu wynosi od 0,01 mg/ml do 3 mg/ml, a stężenie jonów złota w mieszaninie reak cyjnej zaraz po jej otrzymaniu wynosi od 0,1 do 5 mM, i pozostawienie tak otrzymanej mieszaniny reakcyjnej do wytworzenia osadu materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap izolowania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota z mieszaniny reakcyjnej.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że odizolowany materiał kompozytowy zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota poddaje się dalszemu oczyszczaniu.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że oczyszczanie prowadzi się przez co najmniej jednokrotne przeprowadzenie następujących etapów: rozpuszczenia odizolowanego materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota w wodzie, sonikacji tak otrzymanej zawiesiny, i jej wirowania, a następnie usunięcia supernatantu wraz z materiałem niezwiązanym z powierzchnią zredukowanego tlenku grafenu.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się lizat bakterii szczepu Shewanella sp. O23S otrzymany przez lizę komórek bakteryjnych oddzielonych z hodowli szczepu Shewanella sp. O23S prowadzonej w warunkach tlenowych.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że lizę komórek bakterii szczepu Shewanella sp. O23S prowadzi się w roztworze hipotonicznym.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie stosowanej wodnej zawiesiny tlenku grafenu wynosi od 10 mg/ml do 20 mg/ml.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się tlenek grafenu otrzymany w zmodyfikowanej reakcji Hummersa.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prekursorem nanocząstek złota są zawarte w roztworze jony złota.
10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że źródłem jonów złota w roztworze są sole wybrane z grupy zawierającej AuCl3 i Na3Au(S2O3)2 lub kwas HAuCk i jego sole.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie jonów złota w stosowanym wodnym roztworze prekursora nanocząstek złota wynosi od 5 mM do 15 mM.
12. Zastosowanie lizatu bakterii szczepu Shewanella sp. O23S do biologicznego wytwarzania materiału kompozytowego zredukowany tlenek grafenu / nanocząstki złota.