PL249026B1

PL249026B1 - Pochodna azetydyno-2,4-dionu, sposób jej otrzymywania i zastosowanie

Info

Publication number: PL249026B1
Application number: PL443102A
Authority: PL
Inventors: Krzysztof Zbigniew Łączkowski; Beata Donarska
Original assignee: Uniwersytet Mikołaja Kopernika W Toruniu
Priority date: 2022-12-09
Filing date: 2022-12-09
Publication date: 2026-02-23
Also published as: PL443102A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest nowa pochodna azetydyno-2,4-dionu, sposób otrzymywania nowej pochodnej azetydyno-2,4-dionu i zastosowanie nowej pochodnej azetydyno-2,4-dionu.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest pochodna azetydyno-2,4-dionu, sposób otrzymywania i zastosowanie.

Neutrofile stanowią najliczniejszą grupę białych krwinek i poprzez szybkie uwalnianie cytokin, chemokin, reaktywnych form tlenu oraz proteaz pomagają w obronie przed infekcją bakteryjną i regulowaniu stanu zapalnego. Jednak przedłużona aktywacja neutrofili przyczynia się do zmian patofizjologicznych w płucach i powoduje ostre lub przewlekłe choroby zapalne, takie jak ostre uszkodzenie płuc (ALI), zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), przewlekłą obturacyjną chorobę płuc (POChP) i rozstrzenie oskrzeli w zespole ostrej niewydolności oddechowej.

Ludzka neutrofilowa elastaza (HNE, EC 3.4.21.37) jest cytotoksyczną proteazą serynową o masie 29 kDa, składającą się z polipeptydów o pojedynczych łańcuchach i 218 aminokwasach z czterema wewnątrzcząsteczkowymi wiązaniami dwusiarczkowymi łączącymi osiem reszt półcystynowych. Elastaza uwalniana jest przez degranulację neutrofili lub podczas tworzenia zewnątrzkomórkowej sieci neutrofili pełniących funkcję pułapek dla patogenów. Pełni ona również funkcję regulatora odpowiedzi zapalnej, przez co może degradować wszystkie białka macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak elastyna, kolageny, a także może aktywować komórki nabłonka płucnego do produkcji zapalnych cytokin, które mogą dalej aktywować neutrofile, a następnie spowodować ostre uszkodzenie płuc oraz ich zwłóknienie.

Wysoka aktywność elastazy neutrofilowej jest wskaźnikiem złego rokowania w raku piersi, raku jelita grubego i niedrobnokomórkowym raku płuc. Dlatego hamowanie aktywności elastazy neutrofilowej można uznać za nową strategię leczenia farmakologicznego w chorobach nowotworowych i zapalnych.

Z tego względu w ostatnich latach wzrosło zainteresowanie poszukiwaniem nowych grup związków będących inhibitorami ludzkiej neutrofilowej elastazy.

Obecnie sivelestat sodu (ONO-5046) jest jedynym klinicznie zarejestrowanym, chemicznie syntetyzowanym selektywnym inhibitorem HNE. Łagodzi choroby płuc i poprawia pracę płuc. ONO-5046 jest klinicznie stosowany w leczeniu zapalenia płuc i ALI wywołanego przez infekcje wirusowe. Jednak użycie ONO-5046 jest ograniczone ze względu na słabą farmakokinetykę i potencjalne ryzyko toksyczności narządowej. Innym selektywnym i odwracalnym inhibitorem ludzkiej neutrofilowej elastazy jest alvelestat (MPH966), który obecnie jest w drugiej fazie badań klinicznych. Oczekuje się, że zahamowanie aktywności ludzkiej elastazy zmniejszy uszkodzenie płuc i może spowolnić postęp choroby genetycznej u pacjentów z niedoborem alfa 1-antytrypsyny (AATD).

W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 2017102674 A1 opisano związki triazolinonu jako inhibitory HNE. W kolejnym międzynarodowym zgłoszeniu WO 2014095700 A1 opisano pochodne pirymidynonu jako inhibitory HNE. Natomiast w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO2017207433 A1 opisano pochodne imidazolonu i pirazolonu jako inhibitory HNE. Synteza nowych inhibitorów ludzkiej neutrofilowej elastazy została również opisana w pracach: Antonio J.P.M. et al., ACS Omega 2018, 3, 7418-7423; Crocetti L. et al., J. Med. Chem. 2013, 56, 6259-6272; Butt A.R.S. et al., Bioorg. Chem. 2019, 86, 197-209; Zheng Q. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2019, 116, 18808-18814.

Zastosowanie azetydyno-2,4-dionów, znanych również jako 4-okso-beta-laktamy jako selektywnych inhibitorów ludzkiej elastazy zostało już przedstawione w pracach naukowych: Mulchande J. et al., J. Med. Chem. 2008, 51, 1783-1790; Nunes A. et al., Pharmaceutics 2020, 12, 358; Donarska B. et al., Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 7566.

Celem wynalazku jest opracowanie pochodnej azetydyno-2,4-dionu, która będzie mogła mieć zastosowanie jako składnik leków o aktywności inhibitorów ludzkiej neutrofilowej elastazy. Związek ten nie były opisany jak dotąd w literaturze ani pod względem jego budowy, ani jako inhibitor ludzkiej neutrofilowej elastazy.

Istotą wynalazku jest pochodna azetydyno-2,4-dionu stanowiąca 3-(4-(3,3-dietylo-2,4-dioksoazetydyn-1-ylo)-1-oksoizoindolin-2-ylo)-piperydyno-2,6-dion o wzorze 1.

Istotą wynalazku jest także pochodna azetydyno-2,4-dionu o wzorze 1 do zastosowania w leczeniu nowotworu piersi, nowotworu jelita grubego i niedrobnokomórkowego nowotworu płuc.

Istotą wynalazku jest także sposób otrzymywania pochodnej azetydyno-2,4-dionu o wzorze 1 charakteryzujący się tym, że 3-(4-amino-1-oksoizoindolin-2-ylo)piperydyno-2,6-dion poddaje się reakcji w atmosferze azotu lub argonu z dichlorkiem kwasu dietylomalonowego oraz trietyloaminą w stosunku od 0,8:1:3,2 do 1,5:3:10,5 korzystnie 1:1,5:6, podając mieszaniu w temperaturze od 18°C do 25°C, podgrzewa otrzymany roztwór w temperaturze od 35°C do 40°C najkorzystniej 40°C a następnie po odparo waniu rozpuszczalnika otrzymany produkt poddaje się oczyszczaniu w procesie chromatografii kolumnowej z użyciem eluentu dichlorometanu i metanolu w stosunku od 90:10 do 98:2 korzystnie 95:5. Korzystnie mieszanie prowadzi się w czasie od 10 h do 30 h najkorzystniej 20 h.

Związek według wynalazku wykazuje silne hamowania aktywności enzymatycznej ludzkiej neutrofilowej elastazy, tak więc może znaleźć zastosowanie do wytwarzania nowych leków.

Wynalazek został ujawniony w poniższych przykładach wykonania.

Przykład I

Sposób otrzymywania 3-(4-(3,3-dietylo-2,4-dioksoazetydyn-1-ylo)-1-oksoizoindolin-2-ylo)piperydyno-2,6-dionu.

W kolbie kulistej o poj. 50 ml w atmosferze azotu umieszcza się 10 ml suchego dichlorometanu oraz 3-(4-amino-1 -oksoizoindolin-2-ylo)piperydyno-2,6-dion w ilości 1,93 mmol dodaje się dichlorek kwasu dietylomalonowego w ilości 2,90 mmol, a następnie dodaję się trietyloaminę w ilości 11,60 mmola. Mieszaninę reakcyjną miesza się znanymi metodami przez 20 godzin w temperaturze pokojowej 22°C. Podgrzewa się otrzymany roztwór w temperaturze 40°C. Po tym czasie rozpuszczalnik się odparowuje a produkt oczyszcza poprzez chromatografię kolumnową z wykorzystaniem eluentu dichlorometanu i metanolu w stosunku 95:5. Chromatografię kolumnową prowadzi się w ten sposób, że produkt rozpuszcza się w niewielkiej ilości dichlorometanu a następnie wprowadza się na adsorbent będący żelem krzemionkowym o średnicy złoża (230-400 mesh) umieszczony w cylindrycznej kolumnie. Przepływ eluentu może być grawitacyjny lub wymuszony za pomocą pompy ciśnieniowej. Składniki przemieszczając się ku dołowi kolumny ulegają rozdziałowi na poszczególne frakcje, które analizuje za pomocą chromatografii TLC. Rozpuszczalnik z czystej frakcji się odparowuje i uzyskuje czysty produkt. Otrzymano 0,32 g związku (43,2% wydajności teoretycznej) o temperaturze topnienia 102-105°C. Właściwą budowę związku oraz jego czystość potwierdzono na podstawie analizy widm 1H i ¹³C NMR oraz HRMS.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 1.01 (t, 6H, 2CH3, J = 7,2 Hz); 1.86 (q, 4H, 2CH2, J = 7,3 Hz); 1,95-2,05 (m, 1H, CH2); 2,37-2,46 (m, 1H, CH2); 2,54-2,63 (m, 1H, CH2); 2,84-2,93 (m, 1H, CH2); 4,53 (q, 2H, CH2, J = 18,0 Hz); 5,12 (dd, 1H, CH, J = 5,2 Hz, J = 13,2 Hz); 7,64-7,69 (m, 1H, CHAr); 7,58-7,81 (m, 2H, 2CHAr); 10.99 (bs, 1H,NH).

¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 9,41 (2CHs); 22,77 (CH2); 23,12 (2CH2); 31,63 (CH2); 52,26 (CH); 70,63 (C); 123,48 (C), 126,53 (C); 126,97 (C); 129,93 (C); 134,30 (C); 135,16 (C); 167,41 (CO); 171,29 (CO); 171,78 (CO); 173,28 (CO).

HRMS (m/z) obliczono dla C20H22N3O5: 384,1559 [M+H]+. Wartość zmierzona 384,1560.

W wyniku sposobu otrzymano nową pochodną 3-(4-(3,3-dietylo-2,4- dioksoazetydyn-1-ylo)-1-oksoizoindolin-2-ylo)-piperydyno-2,6-dion o wzorze 1.

Oznaczenie zdolności inhibicji ludzkiej neutrofilowej elastazy związku według wzoru 1.

Ocena potencjalnej aktywności biologicznej opiera się na zdolności neutrofilowej elastazy pochodzącej z ludzkich leukocytów (E8140, Sigma-Aldrich) do rozkładu niefluorescencyjnego substratu MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC (Carbiochem) specyficznego dla tego enzymu, którym jest peptyd połączony z fluoroforem 7-amino-4-metylokumaryną (AMC). Degradacja substratu-AMC przez elastazę związana jest z uwolnieniem fluoroforu, którego ilość jest wprost proporcjonalna do aktywności enzymu. Wzrost fluorescencji spowodowany aktywnością enzymu był monitorowany przy długości fali wzbudzenia 380 nm i emisji 460 nm za pomocą czytnika mikropłytek (Spektrofluorymetr FP-8500, JASCO). Jako inhibitor referencyjny wykorzystano Sivelestat - zarejestrowany inhibitor elastazy neutrofilowej.

Reakcję przeprowadzono w buforze testowym składającym się z 200 mM roztworu Tris-HCl (pH 7,5), 0,01% albuminy wołowej (BSA) oraz 0,05% Tween 20. Początkowo różne stężenia badanego związku (10-100 nM) inkubowano z 20 mU/ml roztworem elastazy neutrofilowej w 25°C. W celu rozpoczęcia reakcji dodano 25 μΜ roztworu substratu. Jako próbę kontrolną wykorzystano mieszaninę enzymu ze substratem bez dodatku inhibitora. Objętość końcowa mieszaniny reakcyjnej wynosiła 100 μΚ Wzrost fluorescencji monitorowano przy długości fali wzbudzenia 380 nm i emisji 460 nm na 96-dołkowej płytce przez 30 min. Doświadczenie wykonano w trzech powtórzeniach, a wyniki przedstawiono w Tabeli 1.

W celu wyznaczenia wartości względnej fluorescencji (RFU) dla próby kontrolnej i badanej, w liniowym zakresie wskazań utworzonego wykresu, wybrano dwa punkty czasowe (T1 i T2) i odczytano odpowiednie wartości fluorescencji (R1 i R2), które podstawiono do równania: ARFU = R2-R1/T2-T1. Procent inhibicji aktywności elastazy przez badany związek wyznaczono wg. wzoru:

PL 249026 Β1 % Inhibicji elastazy = , 4flro_{prłtaładana χ 10}θ_% hRFU_!iontroi_a

Stężenie inhibitora powodujące 50% inhibicję reakcji enzymatycznej (IC50) wyznaczono za pomocą regresji nieliniowej (program Graph Pad Prism), wykreślając % inhibicji w stosunku do badanych stężeń inhibitora. Przedstawione dane są średnimi wartościami uzyskanymi w co najmniej trzech niezależnych eksperymentach.

Tabela 1. Aktywność inhibicyjna dla pochodnej według wzoru 1 oraz inhibitora referencyjnego, rozcieńczonych seryjnie w buforze testowym.

Nazwa związku	Stężenie [nM]	% Inhibicji	IC₅₀ [nM] ±SD
3-(4-(3,3-dietylo-2,4dioksoazetydyn-1 ylo)-l- oksoizoindolm-2ylo)piperydyno-2,6dion	10	21,15	21,78 ±0,45
25	53,35
40	75,59
50	83,93
100	94,77
Sivelestat	5	10,22	18,33±0,73
10	35,38
25	60,06
50	77,66
75	86,03

Związek według wzoru 1 we wszystkich zastosowanych stężeniach istotnie hamował aktywność ludzkiej neutrofilowej elastazy, a jego aktywność jest porównywalna do aktywności wzorca jakim jest Sivelestat.

Udowodnione właściwości 3-(4-(3,3-dietylo-2,4-dioksoazetydyn-1-ylo)-1-oksoizoindolin-2-ylo)-piperydyno-2,6-dionu o wzorze 1, uzasadniają jego zastosowanie jako składnik leków o aktywności inhibitorów ludzkiej neutrofilowej elastazy.

Przykład II

Sposób otrzymywania pochodnej azetydyno-2,4-dionu o wzorze 1 polega na tym, że w szklanej kolbie kulistej pochodną 3-(4-amino-1-oksoizoindolin-2-ylo)piperydyno-2,6-dion poddaje się reakcji w atmosferze argonu z dichlorkiem kwasu dietylomalonowego oraz trietyloaminą w stosunku 0,8:1:3,2, podając mieszaniu w temperaturze 18°C w czasie 30 h, podgrzewa otrzymany roztwór w temperaturze 35°C a następnie po odparowaniu rozpuszczalnika otrzymany produkt poddaje się oczyszczaniu w procesie chromatografii kolumnowej z użyciem eluentu dichlorometanu i metanolu w stosunku 90:10.

W wyniku sposobu otrzymano nową pochodną 3-(4-(3,3-dietylo-2,4-dioksoazetydyn-1-ylo)-1-oksoizoindolin-2-ylo)-piperydyno-2,6-dion o wzorze 1.

Przykład III

Sposób otrzymywania pochodnej azetydyno-2,4-dionu o wzorze 1 polega na tym, że w szklanej kolbie kulistej pochodną 3-(4-amino-1-oksoizoindolin-2-ylo)piperydyno-2,6-dion poddaje się reakcji w atmosferze azotu z dichlorkiem kwasu dietylomalonowego oraz trietyloaminą w stosunku 1,5:3:10,5 podając mieszaniu w temperaturze 25°C w czasie 10 h, podgrzewa otrzymany roztwór w temperaturze 38°C a następnie po odparowaniu rozpuszczalnika otrzymany produkt poddaje się oczyszczaniu w procesie chromatografii kolumnowej z użyciem eluentu dichlorometanu i metanolu w stosunku 98:2.

W wyniku sposobu otrzymano nową pochodną 3-(4-(3,3 -dietylo-2,4-dioksoazetydyn-1-ylo)-1-oksoizoindolin-2-ylo)-piperydyno-2,6-dion o wzorze 1.

Claims

1. Pochodna azetydyno-2,4-dionu stanowiąca 3-(4-(3,3-dietylo-2,4- dioksoazetydyn-1-ylo)-1-oksoizoindolin-2-ylo)-piperydyno-2,6-dion o wzorze 1.

2. Pochodna azetydyno-2,4-dionu o wzorze 1 do zastosowania w leczeniu nowotworu piersi, nowotworu jelita grubego i niedrobnokomórkowego nowotworu płuc.

3. Sposób otrzymywania pochodnej azetydyno-2,4-dionu o wzorze 1 znamienny tym, że 3-(4-amino-1-oksoizoindolin-2-ylo)piperydyno-2,6-dion poddaje się reakcji w atmosferze azotu lub argonu z dichlorkiem kwasu dietylomalonowego oraz trietyloaminą w stosunku od 0,8:1:3,2 do 1,5:3:10,5 korzystnie 1:1,5:6 podając mieszaniu w temperaturze od 18°C do 25°C, podgrzewa otrzymany roztwór w temperaturze od 35°C do 40°C najkorzystniej 40°C a następnie po odparowaniu rozpuszczalnika otrzymany produkt poddaje się oczyszczaniu w procesie chromatografii kolumnowej z użyciem eluentu dichlorometanu i metanolu w stosunku od 90:10 do 98:2 korzystnie 95:5.

4. Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że mieszanie prowadzi się w czasie od 10 h do 30 h najkorzystniej 20 h.