PL248944B1 - Polipeptyd i jego zastosowanie jako środek bakteriobójczy wobec bakterii Rothia sp. - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest polipeptyd o właściwościach bakteriobójczych, specyficzny wobec szczepów bakterii Rothia sp. Przedmiotem zgłoszenia jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca rzeczony polipeptyd, a także zastosowanie wspomnianego polipeptydu do zapobiegania i leczenia chorób wywołanych zakażeniem szczepami bakterii Rothia sp. takich jak zapalenie wsierdzia, zapalenie płuc, zapalenie otrzewnej, sepsa, zapalenie opon mózgowych, zapalenie płuc, mukowiscydoza lub infekcje związane z protezami.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd pochodzenia bakteriofagowego o właściwościach bakteriobójczych, specyficzne wobec bakterii Rothia sp.

Endolizyny, zwane też lizynami, to enzymy produkowane przez bakteriofagi (wirusy atakujące bakterie) pod koniec cyklu namnażania bakteriofagów w komórce bakterii. Endolizyny produkowane wcytoplazmie przedostają się do peptydoglikanu powodując jego rozkład, a tym samym lizę bakterii i uwolnienie nowych cząstek bakteriofagowych. Wykazano, że rekombinowane i oczyszczone lizyny bakteriofagowe dodawane z zewnątrz również posiadają aktywność lityczną. Zjawisko to nazywa się „lizą z zewnątrz” i wykorzystuje sieje do niszczenia bakterii patogennych (D. Dams, 2019; M. Schmelcher, 2012; H. Oliveira, 2018). Skuteczność działania rekombinowanych lizyn bakteriofagowych w zwalczaniu bakterii chorobotwórczych potwierdzono in vitro oraz na zwierzętach. Lizyny mogą być skuteczne przeciwko takim patogenom jak MRSA, Listeria monocytogenes, szczepom Staphylococcus czy Pseudomonas aeruginosa (D. Nelson, 2001; Rashel M, 2007; Tassell ML, 2017; Zhang, Y, 2018; Guo, M, 2017; Shah SU, 2020; Bae JY, 2019).

Lizyny, dzięki swoim właściwościom przeciwbakteryjnym stanowią alternatywę dla antybiotyków w walce z zakażeniami bakteryjnymi. Ponadto, lizyny bakteriofagowe działają w inny sposób niż antybiotyki; lizyny specyficznie hydrolizują ścianę komórkową zabijając w ten sposób bakterie (Liu, H., 2023), zaś antybiotyki mogą hamować wzrost bakterii lub zabijać bakterie poprzez ukierunkowanie na określone procesy komórkowe (Haddad Kashani H, 2017).

Zaletami stosowania lizyn bakteriofagowych są: (i) specyficzność - lizyny działają selektywnie niszcząc określone bakterie, podczas gdy antybiotyki mają szerokie spektrum działania i mogą zabijać zarówno bakterie patogenne jak i nieszkodliwe a nawet niezbędne bakterie stanowiące mikrobom zdrowego człowieka (Murray E, 2021; Mondal SI, 2020; Liu, H., 2023); (ii) ograniczenie nabywania oporności - brak doniesień o bakteriach rozwijających oporność na lizyny bakteriofagowe, natomiast powszechne stosowanie antybiotyków doprowadziło do pojawienia się bakterii wysoce opornych na działanie antybiotyków (Murray E, 2021; Blasco, L., 2020; Wong KY, 2022); (iii) niższe ryzyko wystąpienia działań niepożądanych - lizyny bakteriofagowe rzadziej powodują skutki uboczne niż antybiotyki, ponieważ są bardziej specyficzne (Schmelcher, 2021); (iv) lizyny wykazują synergistyczne działanie z innymi środkami przeciwbakteryjnymi (np. antybiotykami) zwiększając ich skuteczność działania (Wong, KY, 2022).

Pierwsze preparaty oparte na lizynach, takich jak P128, N-Rephasin® SAL200 i CF-301, są testowane odpowiednio w fazie II, lla i III w leczeniu zakażeń Staphylococcus aureus.

Lizyny mają również zastosowanie w technologii żywności (Love MJ, 2018).

Ponadto, na rynku europejskim jest już dostępny pierwszy produkt kosmetyczny oparty na lizynach - GLADSKIN™ (Rodriguez-Rubio L, 2015).

W Tabeli 1. Przedstawiono podmioty zajmujące się produkcją lizyn.

Tabela 1

Podmiot	Kraj	Profil działania
Lysando GmbH	Niemcy	Produkcja przeciwdrobnoustrojowych białek.
Micreos	Holandia	Produkcja endolizyn dla medycyny, bezpieczeństwa żywności, rolnictwa, weterynarii
Gladskin	Holandia	Sprzedaż lizyn do leczenia problemów skórnych u ludzi - np. Staphefekt™
ContraFect	USA	Produkcja terapeutycznych białek (w tym lizyn pochodzenia fagowego, np. CF-301) skutecznych przeciw lekoopornym mikroorganizmom.

PL 248944 Β1

GangaGen	USA/Indie	Produkcja lizyn przeciwko lekoopornym bakteriom (m.in. szczepy Staphylococcus, np. P128)
iNtOTheWorld	USA	Produkcja endolizyn do leczenia zakażeń bakteryjnych (S. aureus, P. pneumoniae) u ludzi

Rothia sp. to bakterie Gram-dodatnie, otoczkowe, nieruchliwe, niesporulujące, katalazo-dodatnie, ureazo-dodatnie, należące do typu Actinobacteria (Franconieri et al., 2021; Fatahi-Bafghi, 2021). Są zdolne do wzrostu w warunkach tlenowych oraz mikroaerofilnych. W1967, George i Brown jako pierwsi wprowadzili rodzaj Rothia (George and Brown, 1967), w celu uwzględnienia wcześniej znanych mikroorganizmów znanych jako Actinomyces dentocariosus (Onishi, 1949) oraz Nocardia salivae (Davis and Freer, 1960). Do dziś zidentyfikowano 15 gatunków Rothia (Fernandes de Oliveira et al., 2022). Rothia mucilaginosa (wcześniej znana jako Staphylococcus salivarius, Micrococcus mucilaginosus i Stomatococcus mucilaginosus (Bruminhent J, 2013), Rothia dentocariosa (wcześniej znana jako Nocardia dentocariosa), Rothia aeria, Rothia kristinae (wcześniej znana jako Kocuria kristinae) i Rothia koreensis (wcześniej znana jako Kocuria koreensis) mogą powodować zakażenia u ludzi (Franconieri, 2021; Tsuzukibashi, 2017; Fatahi-Bafghi, 2021; Źivković Zarić, 2019). Rothia mucilaginosa i Rothia dentocariosa kolonizują jamę ustną oraz górne i dolne drogi oddechowe u ludzi (Fernandes de Oliveira et al., 2022; Fatahi-Bafghi, 2021), natomiast Rothia kristinae często występuje na ludzkiej skórze (Stackebrandt, 1995).

Rothia jest patogenem oportunistycznym, szczególnie niebezpiecznym u pacjentów z obniżoną odpornością (Khan, 2014; Lim, 2013a; Ramanan P, 2014; Cunniffe, 1994) jednak uważa się, że powszechne traktowanie bakterii z tego rodzaju jako prawidłowej ludzkiej mikrobioty oraz niepoprawna identyfikacja bakterii na podstawie fenotypu może być powodem niedoszacowania rzeczywistej liczby zachorowań wywołanych Rothia (Fatahi-Bafghi, 2021; Lim, PlosOne 2013a Mechanistic Model of Rothia mucilaginosa...; Bruminhent J, 2013). Rothia związana jest z takimi jednostkami chorobowymi jak zapalenie wsierdzia, zapaleniem płuc, zapaleniem otrzewnej, sepsą, zapaleniem opon mózgowych, zapaleniem płuc lub infekcjami związanymi z protezami (Fatahi-Bafghi, 2021; Lim, 2013a; Franconieri, 2020; Tsuzukibashi, 2017; Ochi, 2021; Cho, 2013; Ramanan, 2014). Obecność i aktywność metaboliczną Rothia mucilaginosa obserwowano w drogach oddechowych u osób chorych na mukowiscydozę (Tunney, 2008; Gao, 2018; Lim, 2013 (Clinical insights); Silveira, 2021; Coburn, 2015). Ponadto, Rothia mucilaginosa posiada właściwości, które mogą wpływać na nasilenie przewlekłych zaburzeń oddechowych, w szczególności u pacjentów z mukowiscydozą, tworząc środowisko sprzyjające rozwojowi Pseudomonas aeruginosa. Rothia mucilaginosa produkuje substancje niezbędne Pseudomonas aeruginosa, tworzy podobne do Pseudomonas aeruginosa biofilmy oraz może łagodzić stany zapalne, tak by móc skutecznie przystosować się do środowiska płuc chorych na mukowiscydozę (Gao, 2018; Silveira CB, 2021; Rigauts, 2022; Willis, 2021).

Do tej pory nie zidentyfikowano lizyny bakteriofagowej specyficznej wobec bakterii Rothia sp. Zatem celem wynalazku jest dostarczenie wysoce efektywnego i specyficznego środka przeciwbakteryjnego wobec bakterii Rothia sp. stanowiącego alternatywę dla antybiotykoterapii.

Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 1.

Korzystnie, polipeptyd jest identyczny w 95% lub 90% z sekwencją SEQ ID NR.: 1.

Przedmiotem wynalazku jest również kwas nukleinowy kodujący polipeptyd określony powyżej, zawierający sekwencje wybrane spośród SEKW. NR ID. 2, SEKW. NR ID. 3 lub SEKW. NR ID. 4.

Przedmiotem wynalazku jest również polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 1 albo sekwencję identyczną w 95% lub 90% z SEKW.NR ID.: 1 do stosowania w leczeniu i zapobieganiu chorobom wywołanym przez zakażenie bakteriami Rothia sp.

Korzystnie, choroby wywołane są szczepami Rothia mucilaginosa oraz Rothia dentocariosa.

Korzystnie, choroby wywołane przez bakterie Rothia sp. obejmują zapalenie wsierdzia, zapalenie płuc, zapalenie otrzewnej, sepsę, zapalenie opon mózgowych, zapalenie płuc, mukowiscydozę, lub infekcje związane z protezami. Korzystnie, skuteczne terapeutycznie stężenie polipeptydu w dawce wynosi 25-100 pg/ml.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 1 albo sekwencję identyczną w 95% lub 90% z SEKW. NR ID.: 1 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna określona powyżej do stosowania w leczeniu i zapobieganiu chorobom wywołanym zakażeniem bakteriami Rothia sp., zwłaszcza Rothia mucilaginosa oraz Rothia dentocariosa.

Korzystnie, skuteczna terapeutycznie zawartość polipeptydu w dawce wynosi 25-100 μg/ml.

Rozwiązanie wg wynalazku zapewnia polipeptyd nazwany dalej „białkiem PolaR”, który jest lizyną pochodzenia bakteriofagowego o właściwościach bakteriobójczych, aktywną wobec Rothia sp., o sekwencji przedstawionej jako SEKW. NR ID. 1. Korzystnie, białko PolaR według wynalazku jest stosowane do zabijania bakterii Rothia sp. PolaR jest pierwszą endolizyną pochodzenia bakteriofagowego aktywną wobec Rohia sp.

Gen kodujący sekwencję białka PolaR zidentyfikowano w fageomie żołądka pacjentów zgłaszających się do Pracowni Endoskopii w Wojewódzkim Szpitalu Specjalistycznym we Wrocławiu z dolegliwościami układu pokarmowego. PolaR wykazuje aktywność lityczną wobec Rothia dentocariosa PCM 2348 (ATCC 14189), Rothia dentocariosa PCM 2349 (ATCC 17931), Rothia mucilaginosa PCM 2403, Rothia mucilaginosa PCM 2415 (ATCC 25296). Rothia mucilaginosa oraz Rothia dentocariosa są ludzkimi patogenami oportunistycznymi; mogą powodować m.in. zapalenie wsierdzia, zapalenie płuc, zapalenie otrzewnej, sepsę, zapalenie opon mózgowych lub infekcje związane z protezami. Jej obecność i aktywność metaboliczną stwierdzono w płucach pacjentów z mukowiscydozą.

Białko PolaR o wyżej wspomnianym zastosowaniu jest białkiem, którego ekspresja jest łatwa i wydajna. Jest to endolizyną pochodzenia bakteriofagowego, którego sekwencja została zidentyfikowana jako sekwencja kodująca potencjalną lizynę bakteriofagową specyficzną wobec Rothia mucilaginosa w sekwencji fageomu żołądka pacjentów z chorobami układu pokarmowego. Lizyna PolaR składa się ze 193 aminokwasów i ma masę 21,8 kDa. Sekwencja białka PolaR zawiera sygnatury HMM (ukryte modele Markowa, z ang. Hidden Markov Models) białka rozpoznającego peptydoglikan (PGRP, cd06583) i amidazy N-acetylomuramoilo-L-alaniny (Amidase_2, PF01510), które zwykle wiążą i hydrolizują peptydoglikan (PGN) niektórych bakterii Gram -dodatnich. Analizując aktywność białka PolaR wobec gatunku Rothia stwierdzono, że PolaR jest zdolne do zabijania szczepów należących do Rothia mucilaginosa oraz Rothia dentocariosa. Wskazaniem dla tej właściwości były wyniki badań fluorometryc znych z zastosowaniem barwnika SYTOX Green. Zidentyfikowana zdolność PolaR do zabijania Rothia sp. ma potencjalne zastosowanie w leczeniu zakażeń wywołanych tym patogenem.

Białko PolaR jest zdolne do zabijania Rothia sp. poprzez rozpoznanie PGN Rothia sp. oraz hydrolizowanie PGN Rothia sp. Znane zastosowania białek bakteriofagowych o właściwościach litycznych, które posiadają sygnaturę białka rozpoznającego peptydoglikan i amidazy N-acetylomuramoilo-L-alaniny, różnią się od przedmiotowego wynalazku specyficznością wobec zabijanego patogenu.

Białko PolaR zostało zastosowane w formie z C-końcową metką 6xHis-tag, która służy do izolacji PolaR z komórek bakteryjnych Escherichia coli. Sekwencję nukleotydową z metką 6xHis-tag przedstawiono jako SEKW. NR ID. 4.

Białko PolaR zostało wytworzone w ekspresyjnym systemie Escherichia coli i oczyszczone za pomocą technik chromatograficznych z powstającego w toku produkcji typowego zanieczyszczenia endotoksynami (Przykład 1). Aktywność bakteriolityczną białka PolaR oceniono za pomocą testu fluorometrycznego (Przykład 2, oparty o metodę opisaną w Harhala i wsp., 2021). W testach fluorometrycznych zastosowano barwnik kwasów nukleinowych SYTOX Green (SYTOX Green nucleic acid stain, Thermo Fisher Scientific). SYTOX Green jest barwnikiem, który z łatwością penetruje uszkodzone bakteryjne błony komórkowe charakterystyczne dla komórek traktowanych endolizynami bakteriofagowymi, wiąże się z kwasami nukleinowymi i w efekcie daje jasnozieloną fluorescencję. Barwnik SYTOX Green nie wnika do komórek aktywnych metabolicznie, a gdy następu je całkowita liza komórki, SYTOX Green wiąże się również z DNA uwolnionym do lizatu bakteryjnego. Testy fluorometryczne wykonano stosując pięć szczepów Rothia oraz różne stężenia białka PolaR. Uzyskane wyniki przedstawiono na Fig. 1. Z otrzymanych krzywych zależności wartości RFU (jednostka fluorescencji, ang. relative fluorescence units) od czasu wynika, że cztery spośród pięciu badanych szczepów Rothia jest zabijane po traktowaniu białkiem PolaR; są to dwa szczepy Rothia mucilaginosa oraz dwa szczepy Rothia dentocariosa. Na podstawie uzyskanych wyników stwier

PL 248944 Β1 dzono również, że aktywność lityczna PolaR jest zależna od dawki; w badanych stężeniach najlepsze efekty bakteriobójcze uzyskano dla stężeń 25 oraz 100 pg/ml. Otrzymane wyniki pokazały, że białko PolaR posiada aktywność bakteriolityczną co może mieć znaczenie praktyczne. Białko PolaR może być wykorzystywane jako środek przeciwbakteryjny w zakażeniach spowodowanych Rothia mucilaginosa lub Rothia dentocariosa.

SEKW. NR ID 1: sekwencja aminokwasowa białka PolaR

MKYVDITEYNATSFTEANRTIDDIDTIVIHHWGDDNQRFEKVCEFFAGGPGTSAHFVVEAGRCA QL\^IKDIAWHAGNWAANQRSIGIECRPEMSNEDFETVAQVIADLETFYGKSFYVHGHKDFFAT ACPGRWYDQLDRLIDRVNAIKEGKVERGVENVPAPLDKAEVSALRASWEKLQNAVDELGKEID HA

Sekwencja NR ID 2: sekwencja DNA kodująca białko PolaR zidentyfikowana w fageomie żołądka pacjenta.

SEKW. NR ID 3: sekwencja DNA kodująca białko PolaR zidentyfikowana w fageomie żołądka pacjenta z zamienionymi na częściej występujące w E. coli kodonami z kodonem STOP

SEKW. NR ID 4: sekwencja DNA kodująca białko PolaR z metką 6xHis-tag

CC ATGGG AG G ATC C AG ATCTATG AAGTATGTG G ATATC AC C GAATATAAC G

CG AC C AG CTTC AC C G AAG CG AACC GTAC C ATC GATG ATATC GATAC C ATC

GTGATC C ATC ATTGG G G C G ATGATAAC C AGC GTTTCG AAAAGGTGTG C GA

ATTCTTCGCGGGCGGCCCGGGCACCAGCGCGCATTTCGTGGTGGAAGCG

GGCCGTTGCGCGCAGCTGGTGGAAATCAAGGATATCGCGTGGCATGCGG

GCAACTGGGCGGCGAACCAGCGTAGCATCGGCATCGAATGCCGTCCGGA

AATGAGCAACGAAGATTTCGAAACCGTGGCGCAGGTGATCGCGGATCTGG

AAACCTTCTATGGCAAGAGCTTCTATGTGCATGGCCATAAGGATTTCTTCG

CGACCGCGTGCCCGGGCCGTTGGTATGATCAGCTGGATCGTCTGATCGAT

CGTGTGAACGCGATCAAGGAAGGCAAGGTGGAACGTGGCGTGGAAAACG

TGCCGGCGCCGCTGGATAAGGCGGAAGTGAGCGCGCTGCGTGCGAGCT

GGGAAAAGCTGCAGAACGCGGTGGATGAACTGGGCAAGGAAATCGATCAT

GCGAATAGCGCCGTCGACcatcatcatcatcatcatTGACTCGAG

Nco\

Met-Gly-Gly-SerArg-Ser

Gen PolaR

Asn,-Ser-Ala- Val-Asp

6xHis-tag

stop

X/?ol

Nco\, Xhol - sekwencja miejsc restrykcyjnych rozpoznawana przez enzymy rekstrykcyjne Nco\ orazXhol, dodane do genu kodującego PolaR w celu wprowadzenia genu do wektora ekspresyjnego;

Met-Gly-Gly-Ser-Arg-Ser, Asn,-Ser-Ala-Val-Asp - sekwencje aminokwasowe poprawiające rozpuszczalność białka PolaR

Gen PolaR - sekwencja DNA kodująca białko PolaR zidentyfikowana w fageomie żołądka pacjenta z zamienionymi na częściej występujące w E. coli kodonami

6xHis-tag - sekwencja DNA kodująca sześć histydyn stop - sekwencja DNA kodująca kodon stop

Na Fig. 1 zaprezentowano aktywność przeciwbakteryjną PolaR wobec Rothia sp. w czasie. Są to krzywe zależności RFU od czasu dla szczepów (a) Rothia dentocariosa PCM 2348 (ATCC 14189), (b) Rothia dentocariosa PCM 2349 (ATCC 17931 ), (c) Rothia mucilaginosa PCM 2403, (d) Rothia mucilaginosa PCM 2415 (ATCC 25296). Badania wykonano przy pomocy testu fluorymetrycznego stosując barwnik SYTOX Green i trzy różne stężenia PolaR 1,25, 100 μg/ml.

Przykład 1. Otrzymywanie PolaR

Sekwencja kodująca PolaR (SEKW. NR ID. 4) była komercyjnie (BioCat GmbFI, Germany) syntetyzowana de novo i klonowana do plazmidu pBADHisA przy użyciu enzymów restrykcyjnych N col i XhoI w wyniku czego powstał wektor zawierający gen PolaR z metką 6xFlis-tag na C-końcu genu. Ekspresję prowadzono w systemie ekspresyjnym Escherichia coli w szczepie C43(DE3). W tym celu komórki Escherichia coli C43(DE3) transformowano powyższym wektorem. Transformanty przenoszono do pożywki LB (LB Broth, high salt) z dodatkiem ampicyliny o stężeniu końcowym 50 μg/ml i hodowano przez noc w 37°C z wytrząsaniem. Nocną hodowlę bakteryjną dodawano do świeżej pożywki LB z dodatkiem ampicyliny o stężeniu końcowym 50 μg/ml i hodowano bakterie w 37°C z wytrząsaniem do osiągnięcia OD6oo=1.0-1.2. Ekspresja białka była indukowana L-arabinozą do stężenia końcowego 2.5 g/L i prowadzona przez 3 godziny w 30°C z wytrząsaniem. Bakterie były wirowane (7 000 g, 5 min, 4°C), a osad został zawieszony w buforze fosforanowym (50 mM NaH2PO4xH2O, 300 mM NaCI, pH = 8.0) z dodatkiem inhibitora proteaz PMSF do stężenia końcowego 1 mM i lizozymu do stężenia końcowego 1.5 mg/ml, i inkubowane na lodzie przez 6-7 godzin z delikatnym mieszanie m. Zawiesinę bakteryjną mrożono w -80°C przez 48 godzin, a następnie po całkowitym rozmrożeniu inkubowano z dodatkiem DNAzy o stężeniu końcowym 30 μg/mL, jonami Mg²⁺ o stężeniu końcowym 1 mM i RNAzą o stężeniu końcowym 60 μg/mL na lodzie z delikatnym mieszaniem. Rozdział frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej wykonano poprzez wirowanie (12 000 g, 30 min, 4°C). Frakcję rozpuszczalną zebrano i przesączono przez 0.45 μm i 0.22 μm jałowe filtry PES. W celu odseparowania PolaR od innych zanieczyszczeń białkowych zastosowano chromatografię powinowactwa używając złoża agarozowego NiNTA. Frakcję rozpuszczalną z dodatkiem 10 mM immidazolu połączono ze złożem agarozowym NiNTA i prowadzono kilku etapowe płukanie buforem fosforanowym (50 mM NaH2PO4xH2O, 300 mM NaCI, pH = 8.0) z dodatkiem imidazolu o wzrastającym stężeniu: 25 mM (100 ml), 50 mM (15 ml), 75 mM (10 ml), 100 mM (5 ml), 250 mM (5 ml) i 500 mM (5 ml). Frakcje z 100, 250 i 500 mM imidazolem połączono i dializowano do PBS przez noc w 4°C. Następnie prow adzono oczyszczanie z endotoksyn przy użyciu chromatografii powinowactwa stosując złoże EndoTrap® HD. Preparat białkowy inkubowano 3 razy z 20 μl złoża EndoTrap® HD z dodatkiem jonów Ca²⁺ o stężeniu końcowym 1 mM, jednorazowo przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie, przesączono preparat białkowy przez 0.22 μm jałowe filtry PES i oczyszczano stosując chromatografię wykluczenia za pomocą złoża Superdex 75 10/300 GL. Oczyszczony preparat białkowy PolaR zagęszczano przy użyciu koncentratorów wirówkowych z membraną PES o porach 3.5 kDa. Na koniec preparat białkowy PolaR przesączono jałowo przez 0.22 μm filtry PES. Pomiar poziomu endotoksyn wykonano stosując zestaw do oznaczania endotoksyn ENDOZYME II. Stężenie białka oznaczano spektrofotometrycznie.

Przykład 2. Ocena aktywności bakteriobójczej białka PolaR

Aktywność oczyszczonego preparatu białka PolaR oceniono za pomocą testu fluorometrycznego stosując barwnik kwasów nukleinowych SYTOX Green (Thermo Fisher Scientific) według ustalonej metodyki (Harhala i współpr., 2021). Do testów użyto pięć szczepów Rothia: Rothia dentocariosa PCM 2348 (ATCC 14189), Rothia dentocariosa PCM 2349 (ATCC 17931), Rothia mucilaginosa PCM 2403, Rothia mucilaginosa PCM 2415 (ATCC 25296), Rothia aeria PCM 2669. W skrócie, nocną hodowlą szczepów Rothia zaszczepiono świeżą pożywkę BHI i hodowano do późnej fazy logarytmicznej wzrostu bakterii w 37°C z wytrząsaniem. Wszystkie bakterie zostały zwirowane (7000 g, 7 min, 4°C) i 2 razy przepłukane PBS; ostatni osad zawieszono w PBS do OD600 = 0.6. Próbki do pomiarów przygotowano w następujący sposób: 130 μl zawiesiny bakteryjnej w PBS, 20 μl oczyszczonego preparatu PolaR o końcowym stężeniu 1, 25, 100 μg/ml lub PBS, 50 μl of rozcieńczonego (1/1000) barwnika SYTOX

Green. Analizę prowadzono w czasie, w płytce 96-dołkowej, w temperaturze pokojowej, w czytniku fluorescencyjnym. Wyznaczono krzywe zależności RFU od czasu dla każdego badanego szczepu Rothia oraz dla każdego badanego stężenia preparatu PolaR.

Literatura:

1. Murray E, Draper LA, Ross RP, Hill C. The Advantages and Challenges of Using Endolysins in a Clinical Setting. Viruses. 2021 Apr 15;13(4):680. doi: 10.3390/v13040680. PMID: 33920965; PMCID: PMC8071259.

2. Mondal SI, Draper LA, Ross RP, Hill C. Bacteriophage endolysins as a potential weapon to combat Clostridioides difficile infection. Gut Microbes. 2020 Nov 9; 12(1): 1813533. doi: 10.1080/19490976.2020.1813533. PMID: 32985336; PMCID: PMC7524323.

3. Blasco, L, Ambroa, A., Trastoy, R. et al. In vitro and in vivo efficacy of combinations of colistin and different endolysins against clinical strains of multi-drug resistant pathogens. Sci Rep 10, 7163 (2020).

https://doi.Org/10.1038/S41598-020-64145-7

4. Liu, H., Hu, Z., Li, M. et al. Therapeutic potential of bacteriophage endolysins for infections caused by Gram-positive bacteria. J Biomed Sci 30, 29 (2023).

https://doi.org/10.1186/s12929-023-00919-1

5. Haddad Kashani H, Schmeichler M, Sabzalipoor H, Seyed Hosseini E, Moniri R. Recombinant Endolysins as Potential Therapeutics against Antibiotic-Resistant Staphylococcus aureus: Current Status of Research and Novel Delivery Strategies. Clin Microbiol Rev. 2017 Nov 29;31(1):e00071-17. doi:10.1128/CMR.00071-17. PMID: 29187396; PMCID: PMC5740972.

6. Wong KY, Megat Mazhar Khair MH, Song AA, Masarudin MJ, Chong CM, In LLA, Teo MYM. Endolysins against Streptococci as an antibiotic alternative. Front Microbiol. 2022 Aug 2;13:935145. doi: 10.3389/fmicb.2022.935145. PMID: 35983327; PMCID:

PMC9378833.

7. Mathias Schmelcher, Martin J Loessner. Bacteriophage endolysins - extending their application to tissues and the bloodstream. Current Opinion in Biotechnology, 2021,68, 51-59, https://doi.org/10.1016/j.copbio.2020.09.012.

8. D. Dams, Y. Briers Enzybiotics: enzyme-based antibacterials as therapeutics. Adv Exp Med Biol, 1148 (2019), pp. 23-253

9. M. Schmelcher, D.M. Donovan, M.J. Loessner. Bacteriophage endolysins as novel antimicrobials. Future Microbiol, 7 (2012), pp. 1147-1171

10. H. Oliveira, C. Sao-Jose, J. Azeredo. Phage-derived peptidoglycan degrading enzymes: challenges and future prospects for in vivo therapy. Viruses, 10 (2018), p. 292

11. D. Nelson, L. Loomis, V.A. Fischetti. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme. Proc Natl Acad Sci USA, 98 (2001), pp.

12. Rashel M, Uchiyama J, Ujihara T, Uehara Y, Kuramoto S, Sugihara S, Yagyu K, Muraoka A, Sugai M, Hiramatsu K, Honke K, Matsuzaki S. Efficient elimination of multidrug-resistant Staphylococcus aureus by cloned lysin derived from bacteriophage phi MR11. J Infect Dis. 2007 Oct 15; 196(8): 1237-47. doi: 10.1086/521305. Epub 2007 Sep 11. PMID: 17955443.

13. Van Tassell ML, Ibarra-Sanchez LA, Hoepker GP, Miller MJ. Hot topic: Antilisterial activity by endolysin PlyP100 in fresh cheese. J Dairy Sci. 2017 Apr;100(4):2482-2487. doi: 10.3168/jds.2016-11990. Epub 2017 Feb 1. PMID: 28161174.

14. Zhang, Y.; Cheng, M.; Zhang, H.; et al. Antibacterial Effects of Phage Lysin LysGH15 on Planktonic Cells and Biofilms of Diverse Staphylococci. Appl. Environ. Microbiol. 2018, 84.

15. Guo, M.; Feng, C.; Ren, J.; et al. A Novel Antimicrobial Endolysin, LysPA26, against Pseudomonas aeruginosa. Front. Microbiol. 2017, 8, 293

16. Shah SU, Xiong YQ, Abdelhady W, et al.: Effect of the Lysin, Exebacase, on Cardiac Vegetation Progression in a Rabbit Model of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Endocarditis as Determined by Echocardiography. Antimicrob Agents Chemother 2020, 64:e00482-20.

17. Bae JY, Jun Kl, Kang CK, et al.: Efficacy of Intranasal Administration of the Recombinant Endolysin SAL200 in a Lethal Murine Staphylococcus aureus Pneumonia Model. Antimicrob Agents Chemother 2019, 63:e02009-18.

18. Bruminhent J, Tokarczyk MJ, Jungkind D, DeSimone JA Jr. Rothia mucilaginosa prosthetic device infections: a case of prosthetic valve endocarditis. J Clin Microbiol. 2013 May;51(5):1629-32. doi: 10.1128/JCM.03173-12. Epub 2013 Mar 6. PMID: 23467598; PMCID: PMC3647895.

19. Love MJ, Bhandari D, Dobson RCJ, Billington C. Potential for Bacteriophage Endolysins to Supplement or Replace Antibiotics in Food Production and Clinical Care. Antibiotics (Basel). 2018;7. doi:10.3390/antibiotics7010017

20. Rodriguez-Rubio L, Gutierrez D, Donovan DM, Martinez B, Rodriguez A, Garcia P. Phage lytic proteins: biotechnological applications beyond clinical antimicrobials. Crit Rev Biotechnol. 2015; 1-11.

PL 248944 Β1

LISTA SEKWENCJI < 110> Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN < 120> Polipeptyd pochodzenia bakteriofagowego i jego zastosowanie jako środek bakteriobójczy wobec bakterii Rothia sp.

< 130> PZ/9983/AR < 160> 4 < 170> Patentln version 3.5 < 210 1 < 211> 193 < 212> PRT < 213* Phage < 400 1

Met Lys Tyr Val Asp Ile Thr Glu Tyr Asn Ala Thr Ser Phe Thr Glu

1015

Ala Asn Arg Thr Ile Asp Asp Ile Asp Thr Ile Val Ile His His Trp

2530

Gly Asp Asp Asn Gin Arg Phe Glu Lys Val Cys Glu Phe Phe Ala Gly

4045

Gly Pro Gly Thr Ser Ala His Phe Val Val Glu Ala Gly Arg Cys Ala

5560

Gin Leu Val Glu Ile Lys Asp Ile Ala Trp His Ala Gly Asn Trp Ala

70 7580

Ala Asn Gin Arg Ser Ile Gly Ile Glu Cys Arg Pro Glu Met Ser Asn

PL 248944 Β1

Glu Asp Phe Glu Thr Val Ala Gin Val Ile Ala Asp Leu Glu Thr Phe

100 105110

Tyr Gly Lys Ser Phe Tyr Val His Gly His Lys Asp Phe Phe Ala Thr

115 120125

Ala Cys Pro Gly Arg Trp Tyr Asp Gin Leu Asp Arg Leu Ile Asp Arg

130 135140

Val Asn Ala Ile Lys Glu Gly Lys Val Glu Arg Gly Val Glu Asn Val

145 150 155160

Pro Ala Pro Leu Asp Lys Ala Glu Val Ser Ala Leu Arg Ala Ser Trp

165 170175

Glu Lys Leu Gin Asn Ala Val Asp Glu Leu Gly Lys Glu Ile Asp His

180 185190

Ala < 210> 2 < 211> 579 < 212> DNA < 213> Phage < 400> 2 atgaagtatg tcgacatcac cgagtacaac gccacctcgt tcaccgaggc aaaccgcacc 60 atcgacgaca tcgataccat cgtcatccat cactggggcg atgacaacca gcgtttcgag 120 aaggtctgcg agttctttgc tggcggcccc ggcacctctg cacattttgtggtggaggca 180 ggccgctgcg cccagcttgt ggagatcaag gacatcgcct ggcatgcagg caattgggcg 240 gcaaaccagc gctcgattgg catcgaatgc cgccccgaga tgagcaacga agacttcgaa 300 actgtcgccc aggtaatcgc cgatttggag actttctacg gaaagtcctt ctacgtccat 360

PL 248944 Β1 ggccacaagg actttttcgc gactgcttgc cccggccgct ggtacgacca gttggaccgc 420 ctcattgacc gtgtgaacgc aatcaaggag ggtaaggttg agcgcggcgt tgagaatgtc 480 cccgcgccgc tggacaaggc ggaggtttcg gccctgcgtg cgtcgtggga gaagctgcag 540 aacgcggtag atgagctcgg taaggagatt gaccatgcg 579 < 210> 3 < 211> 582 < 212> DNA < 213> Phage < 400> 3 atgaagtatg tggatatcac cgaatataac gcgaccagct tcaccgaagc gaaccgtacc 60 atcgatgata tcgataccat cgtgatccat cattggggcg atgataacca gcgtttcgaa 120 aaggtgtgcg aattcttcgc gggcggcccg ggcaccagcg cgcatttcgt ggtggaagcg 180 ggccgttgcg cgcagctggt ggaaatcaag gatatcgcgt ggcatgcggg caactgggcg 240 gcgaaccagc gtagcatcgg catcgaatgc cgtccggaaa tgagcaacga agatttcgaa 300 accgtggcgc aggtgatcgc ggatctggaa accttctatg gcaagagctt ctatgtgcat 360 ggccataagg atttcttcgc gaccgcgtgc ccgggccgtt ggtatgatca gctggatcgt 420 ctgatcgatc gtgtgaacgc gatcaaggaa ggcaaggtgg aacgtggcgt ggaaaacgtg 480 ccggcgccgc tggataaggc ggaagtgagc gcgctgcgtg cgagctggga aaagctgcag 540 aacgcggtgg atgaactggg caaggaaatc gatcatgcgt ga 582 < 210> 4 < 211> 641 < 212> DNA < 213> Phage < 400> 4 ccatgggagg atccagatct atgaagtatg tggatatcac cgaatataac gcgaccagct 60 tcaccgaagc gaaccgtacc atcgatgata tcgataccat cgtgatccat cattggggcg 120

PL 248944 Β1 atgataacca gcgtttcgaa aaggtgtgcg aattcttcgcgggcggcccg ggcaccagcg 180 cgcatttcgt ggtggaagcg ggccgttgcg cgcagctggt ggaaatcaag gatatcgcgt 240 ggcatgcggg caactgggcg gcgaaccagcgtagcatcgg catcgaatgc cgtccggaaa 300 tgagcaacga agatttcgaa accgtggcgc aggtgatcgcggatctggaa accttotatg 360 gcaagagctt ctatgtgcat ggccataagg atttcttcgc gaccgcgtgc ccgggccgtt 420 ggtatgatca gctggatcgt ctgatcgatc gtgtgaacgc gatcaaggaa ggcaaggtgg 480 aacgtggcgt ggaaaacgtg ccggcgccgc tggataaggc ggaagtgagc gcgctgcgtg 540 cgagctggga aaagctgcag aacgcggtgg atgaactggg caaggaaatc galcatgcga 600 atagcgccgt cgaccatcat catcatcatc attgactcga g 641

Claims (10)

1. Polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 1.

2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest identyczny w 95% lub 90% z sekwencją SEQIDNR.:1.

3. Kwas nukleinowy kodujący polipeptyd jak określono w zastrz. 1, zawierający sekwencje wybrane spośród SEKW. NR ID. 2, SEKW. NR ID. 3 lub SEKW. NR ID. 4.

4. Polipeptyd jak określono w zastrz. 1 albo 2 do stosowania w leczeniu i zapobieganiu chorobom wywołanym przez zakażenie bakteriami Rothia sp.

5. Polipeptyd jak określono w zastrz. 1 albo 2 do stosowania według zastrz. 4, znamienny tym, że choroby wywołane są szczepami Rothia mucilaginosa oraz Rothia dentocariosa.

6. Polipeptyd jak określono w zastrz. 1 albo 2 do stosowania według zastrz. 4, znamienny tym, że choroby wywołane przez bakterie Rothia sp. obejmują zapalenie wsierdzia, zapalenie płuc, zapalenie otrzewnej, sepsę, zapalenie opon mózgowych, zapalenie płuc, mukowiscydozę lub infekcje związane z protezami.

7. Polipeptyd jak określono w zastrz. 1 albo 2 do stosowania według zastrz. 4, znamienny tym, że skuteczne terapeutycznie stężenie polipeptydu w dawce wynosi 25-100 pg/ml.

8. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca polipeptyd jak określono w zastrz. 1 albo 2 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę.

9. Kompozycja farmaceutyczna jak określono w zastrz. 8 do stosowania w leczeniu i zapobieganiu chorobom wywołanym zakażeniem bakteriami Rothia sp., zwłaszcza Rothia mucilaginosa oraz Rothia dentocariosa.

10. Kompozycja farmaceutyczna do stosowania według zastrz. 9, znamienna tym, że skuteczna terapeutycznie zawartość polipeptydu w dawce wynosi 25-100 pg/ml.