PL248905B1 - Kompozycja farmaceutyczna do doszklistkowego podawania zawierająca co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, kompleks elektrostatyczny zawierający co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik oraz jego zastosowanie - Google Patents

Kompozycja farmaceutyczna do doszklistkowego podawania zawierająca co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, kompleks elektrostatyczny zawierający co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik oraz jego zastosowanie

Info

Publication number
PL248905B1
PL248905B1 PL446343A PL44634323A PL248905B1 PL 248905 B1 PL248905 B1 PL 248905B1 PL 446343 A PL446343 A PL 446343A PL 44634323 A PL44634323 A PL 44634323A PL 248905 B1 PL248905 B1 PL 248905B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
bdnf
hsa
peg
concentration
cells
Prior art date
Application number
PL446343A
Other languages
English (en)
Other versions
PL446343A1 (pl
Inventor
Bogusław MACHALIŃSKI
Bogusław Machaliński
Maria Dąbkowska
Iga STUKAN
Iga Stukan
Alicja Kosiorowska
Original Assignee
Pomorski Uniwersytet Medyczny W Szczecinie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pomorski Uniwersytet Medyczny W Szczecinie filed Critical Pomorski Uniwersytet Medyczny W Szczecinie
Priority to PL446343A priority Critical patent/PL248905B1/pl
Publication of PL446343A1 publication Critical patent/PL446343A1/pl
Publication of PL248905B1 publication Critical patent/PL248905B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest kompozycja farmaceutyczna do doszklistkowego podawania zawierająca co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, charakteryzująca się tym, że zawiera polielektrolit, którym jest glikol polietylenowy (PEG), nośnikiem jest albumina surowicy ludzkiej (HSA), a substancję aktywną stanowią neurotrofiny BDNF oraz NT3, przy czym neurotrofiny BDNF oraz NT3 są połączone elektrostatycznie z albuminą (HSA) oraz glikolem polietylenowym (PEG) tworząc kompleks elektrostatyczny HSA-NT3-BDNF-PEG. Kolejnym przedmiotem zgłoszenia jest kompleks elektrostatyczny zawierający co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, charakteryzujący się tym, że stanowi kompleks HSA-NT3-BDNF-PEG składający się z albuminy ludzkiej (HSA), neurotrofiny NT3, neurotrofiny BDNF oraz glikolu polietylenowego (PEG). Kolejnym przedmiotem zgłoszenia jest kompleks elektrostatyczny według wynalazku do stosowania w zapobieganiu lub leczeniu chorób oczu.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna przeznaczona do podawania w formie doszklistkowej. Jest to kompleks elektrostatyczny zawierający co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik co wpływa na jego zastosowanie.
Neurotrofiny są to białka warunkujące prawidłowy rozwój i przeżycie komórek układu nerwowego. Potencjał terapeutyczny neurotrofin pozostaje ograniczony ze względu na krótki okres półżycia (Han i in. 2023; The BDNF Study Group (Phase III) 1999).
Wiele publikacji w literaturze fachowej poświęca się białku BDNF (z ang. Brain-derived neurotrofic factor, pl. Czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego), które jest kluczowe dla indukcji genów związanych z wzrostem i różnicowaniem komórek neuronalnych. Ponadto, posiada właściwości antyoksydacyjne, które wpływają hamująco na rozwój stanu zapalnego oraz niedotlenienia, charakterystycznych dla chorób mózgu (Rosenblum i in. 2015).
Postuluje się użycie białka BDNF w leczeniu szerokiego spektrum chorób neurodegeneracyjnych takich jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona, autyzm, stwardnienie zanikowe boczne, a także depresja (Nagahara i Tuszyński 2011). Efekt terapeutyczny BDNF osiągany jest głównie dzięki pobudzeniu receptora TrkB (z ang. Tropomyosin receptor kinase). Jednoczesne użycie BDNF oraz dodatkowych neurotrofin, takich jak neurotrofina-3 (NT3), pozwala na aktywację innych izoform receptora Trk, co potencjalnie wzmacnia sygnał i może wspomóc potencjał terapeutyczny. W badaniach in vivo pokazano, że połączenie białka BDNF oraz NT3 sprzyja odbudowie komórek nerwowych zwoju spiralnego ślimaka, co pozwalało uniknąć utraty słuchu (St Peter i in. 2022).
Opisywane w literaturze sposoby dostarczania BDNF oraz NT3 opierają się o transfer genu (St Peter i in. 2022; Arora, Kanekiyo, i Singh 2022; Lopes i in. 2017; Budenz i in. 2015). Nieliczne opisują dostarczenie samego białka BDNF przy użyciu nanocząstek opartych o polimery biozgodne takie jak poli(amidoaminę) (PAMAM) albo polimery biodegradowalne takie jak poli(d,1-laktyd-ko-glikolid) (PLGA) (Dąbkowska i in. 2020; Arranz-Romera i in. 2021; Machaliński, Dąbkowska, i Rogińska 2018). BDNF był również dostarczany przy użyciu warstw polielektrolitowych (10.1116/1.3656249; 0.1021/acs.langmuir.5b01667), cząsteczek poli (kwasu L-glutaminowego) (10.1371/joumal.pone.0164867) albo nanocząsteczek na bazie krzemionki (22610659).
Pomimo wielu perspektywicznych zastosowań niskocząsteczkowych białek, takich jak BDNF oraz NT3, rozwój efektywnych technologii umożliwiających terapię celowaną obejmującą transport powyższego białka na biokompatybilnym nośniku, a następnie jego uwolnienie w określonym miejscu organizmu, nie został w dostatecznym stopniu określony. Żaden z obecnie opisanych systemów nie proponuje też jednoczesnego dostarczenia białka NT3 oraz BDNF. Wśród głównych przyczyn można wyróżnić (1) brak dostatecznej wiedzy na temat podstaw fizykochemicznych kontrolujących proces transportu, adsorpcji i desorpcji w układach koloidalnych. W szczególności brakuje zrozumienia oddziaływań pomiędzy makromolekułami takimi jak albumina ludzka, która pełni rolę nośnika, a neurotrofinami, które stanowią białka terapeutyczne, oraz biodegradowanymi łańcuchami polielektrolitu PEG; (2) brak podejścia interdyscyplinarnego w badaniach naukowych, dotyczących aspektów kinetycznych procesów adsorpcji/desorpcji białek na/z biokompatybilnych nośników w warunkach oddziaływania intensywnych sił ścinania, podobnych do tych jakie występują w warunkach in vivo; (3) brak doniesień naukowych dotyczących tworzenia, w zdefiniowanych warunkach transportu dyfuzyjnego, biokompatybilnych oraz stabilnych koniugatów białkowych, o różnych ładunkach powierzchniowych i aktywności zaadsorbowanych makromolekuł.
Surowicza albumina ludzka jest białkiem globularnym o masie 66.439 kDa, rozpuszczalnym w wodzie. Jej unikatowa struktura przestrzenna, umożliwia transport wielu różnorodnych chemicznie substancji, w tym związków o aktywności biologicznej pochodzenia egzogennego, takich jak antykoagulanty, antybiotyki czy leki przeciwzapalne. Albumina surowicza posiada też długi okres półżycia, wynoszący 19 dni, a jej metabolizm nie jest toksyczny (Spada i in. 2021). Charakteryzuje ją niska immunogenność, jednak celem obniżenia ryzyka fagocytozy przez komórki układu odpornościowego, powszechnie stosuje się glikol polietylenowy (PEG) (Fahrlander i in. 2015). Z tych powodów albumina surowicza stanowi bardzo dobry nośnik leków oraz substancji leczniczych.
Jedną z chorób neurodegeneracyjnych, dla których eksploruje się użycie terapeutyczne białka BDNF jest zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). AMD stanowi wiodącą przyczynę utraty wzroku u ludzi powyżej 65 roku życia. Chociaż dokładne przyczyny choroby nie są do końca poznane, charakteryzuje ją centralna utrata wzroku, spowodowana postępującą utratą fotoreceptorów oraz komórek nabłonka barwnikowego siatkówki. U pacjentów cierpiących na AMD stężenie BDNF w szklistce jest niskie i koreluje ze spadkiem grubości siatkówki. Leczenie choroby jest ograniczone. W postaci wysiękowej stosuje się podania doszklistkowe inhibitorów wzrostu nabłonka (VEGF) albo kombinacji inhibitorów VEGF oraz terapii fotodynamicznej. Jednakże nie wszyscy chorzy odpowiadają na leczenie (Ricci i in. 2020).
Częściej niż postać wysiękowa występuje postać sucha, dla której również nie ma dobrych sposobów leczenia. Potencjalne leki takie jak inhibitor białka C3 układu dopełniacza Pegcetacoplan (Liao i in. 2020) oraz syntetyczna witamina A ALK-001 (Saad i Washington 2016) znajdują się na etapie badań klinicznych.
Celem wynalazku jest dostarczenie substancji i postaci leków nadających się do doszklistkowego podawania leków okulistycznych, zwłaszcza przeznaczonych do leczenia lub zapobiegania chorobom neurodegeneracyjnym siatkówki oka.
Istotą wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do doszklistkowego podawania zawierająca co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, charakteryzująca się tym, że zawiera polielektrolit, którym jest glikol polietylenowy (PEG). Nośnikiem jest albumina surowicy ludzkiej (HSA) a substancję aktywną stanowią neurotrofiny BDNF oraz NT3, przy czym neurotrofiny BDNF oraz NT3 są połączone elektrostatycznie z albuminą (HSA) oraz glikolem polietylenowym (PEG) tworząc PEG-ylowany kompleks elektrostatyczny HSA-NT3-BDNF.
Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera albuminę surowicy ludzkiej w stężeniu 2-200 mg mL-1, (b) BDNF w stężeniu 0,001-0,1 mg mL-1, (c) NT3 w stężeniu 0,001-0,1 mg mL-1, (d) glikol polietylenowy (PEG) w stężeniu 0,2-20 mg mL-1.
Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera albuminę surowicy ludzkiej w stężeniu 20 mg mL-1, (b) BDNF w stężeniu 0,01 mg mL-1, (c) NT3 w stężeniu 0,01 mg mL-1, (d) glikol polietylenowy (PEG) w stężeniu 2 mg mL-1.
Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera płyn Ringera, korzystnie w objętości od 2,16 do 216 mL.
Kolejną istotą wynalazku jest kompleks elektrostatyczny zawierający co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, charakteryzujący się tym, że stanowi kompleks HSA-NT3-BDNF-PEG składający się z albuminy ludzkiej (HSA), neurotrof iny NT3, neurotrofiny BDNF oraz glikolu polietylenowego (PEG).
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompleks elektrostatyczny według wynalazku do stosowania w zapobieganiu lub leczeniu chorób oczu.
Korzystnie chorobą oczu jest choroba neurodegeneracyjna siatkówki oka, zwłaszcza zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD).
Korzystnie kompleks elektrostatyczny według wynalazku do stosowania według wynalazku jest stosowany w kompozycji farmaceutycznej do podawania doszklistkowego, zwłaszcza w postaci kompozycji farmaceutycznej o stopniowym uwalnianiu neurotrofiny BDNF oraz NT3.
Wynalazek dostarcza następujących korzyści:
• Kompleks według wynalazku oraz kompozycja według wynalazku stabilizują białka terapeutyczne, pozwala na dłuższą biodostępność i efektywne, stopniowe uwalnianie w czasie oraz pozwala uniknąć zastosowania wektorów wirusowych;
• Wysoka stabilność kompleksu oraz kompozycji według wynalazku;
• Białka terapeutyczne BDNF oraz NT3 uwalniane są z wynalazku stopniowo w czasie do 28 dni po jednorazowym podaniu doszklistkowym u myszy, co pozwala uniknąć wielokrotnych podań i zwiększania dawek substancji czynnej;
• Wynalazek powodował efektywnie wzrost stężenia neurotrofin BDNF oraz NT3 w mysim ciele szklistym;
• Dostarczenie BDNF oraz NT3 przy pomocy wynalazku przyspieszało regenerację komórek ARPE-19 po indukcji stresu oksydacyjnego;
• Minimalizacja toksyczności: Wykorzystanie HSA jako nośnika nanocząsteczek zmniejsza toksyczność układu i ogranicza potencjalne działania niepożądane, dzięki jej naturalnemu pochodzeniu i zgodności z organizmem ludzkim. PEGylacja dodatkowo minimalizuje reakcje immunologiczne, co czyni te nanocząsteczki bardziej bezpiecznymi;
• Optymalne właściwości fizykochemiczne: PEGylowany kompleks HSA-NT3-BDNF charakteryzuje się dobrze określonymi/powtarzalnymi właściwościami fizykochemicznymi, co sprzyja ich dystrybucji, przechowywaniu i zastosowaniu w terapii.
Szczegółowy opis wynalazku
W rozumieniu wynalazku frazę „w wykonaniu” należy rozumieć jako w jednym lub więcej wykonań. Ponadto cechy występujące w poszczególnych wykonaniach, w tym w „niektórych wykonaniach”, mogą być ze sobą łączone. Opisy wykonań wynalazku w niniejszym zgłoszeniu są podane w formie przykładu i nie mają na celu ograniczenia zakresu wynalazku. Opisane wykonania obejmują różne cechy, z których nie wszystkie są wymagane we wszystkich wykonaniach wynalazku. Niektóre wykonania wykorzystują tylko niektóre z cech lub możliwie kombinacje cech. Opisane warianty wykonań wynalazku oraz wykonania wynalazku obejmujące różne kombinacje cech wymienionych w opisanych wykonaniach, przyjdą na myśl znawcom w dziedzinie. Zakres wynalazku jest ograniczony jedynie przez zastrzeżenia.
Zgodnie z wynalazkiem uzyskano kompleks oraz kompozycję umożliwiające efektywne dostarczenie substancji i postaci leków nadających się do doszklistkowego podawania leków okulistycznych, zwłaszcza przeznaczonych do leczenia lub zapobiegania chorobom neurodegeneracyjnym siatkówki oka.
W pierwszym aspekcie wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej do doszklistkowego podawania zawierającej substancję aktywną w postaci neurotrofiny BDNF oraz NT3, nośnik, którym jest albumina surowicy ludzkiej (HSA) oraz polielektrolit, którym jest glikol polietylenowy (PEG) pełniący rolę stabilizatora. Przy czym, neurotrofiny BDNF oraz NT3 są połączone elektrostatycznie z albuminą (HSA) oraz glikolem polietylenowym (PEG) tworząc kompleks elektrostatyczny HSA-NT3-BDNF-PEG. Kompozycja według wynalazku stabilizuje białka terapeutyczne, pozwala na ich stopniowe uwalnianie w czasie oraz pozwala uniknąć zastosowania wektorów wirusowych.
W jednym wykonaniu kompozycja według wynalazku zawiera albuminę surowicy ludzkiej w stężeniu 2-200 mg mL-1, (b) BDNF w stężeniu 0,001-0,1 mg mL-1, (c) NT3 w stężeniu 0,001-0,1 mg mL-1, (d) glikol polietylenowy (PEG) w stężeniu 0,2-20 mg mL-1.
W innym wykonaniu kompozycja według wynalazku zawiera albuminę surowicy ludzkiej w stężeniu 20 mg mL-1, (b) BDNF w stężeniu 0,01 mg mL-1, (c) NT3 w stężeniu 0,01 mg mL-1, (d) glikol polietylenowy (PEG) w stężeniu 2 mg mL-1.
W jednym wykonaniu kompozycja według zawiera ponadto płyn Ringera, w którym zawieszony jest kompleks HSA-NT3-BDNF-PEG. W korzystnych wykonaniach wykorzystuje się płyn Ringera w objętości od 2,16 do 216 mL.
W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy kompleksu elektrostatycznego zawierającego co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, który stanowi kompleks HSA-NT3-BDNF-PEG składający się z albuminy ludzkiej (HSA), neurotrofiny NT3, neutrofiny BDNF oraz glikolu polietylenowego (PEG).
Kompleks według wynalazku został przeanalizowany pod kątem jego korzystnych właściwości. Przy czym, badania koncentrowały się na tworzeniu nanocząstek przy użyciu prostego podejścia opartego na wykorzystaniu wiedzy o oddziaływaniach elektrostatycznych między cząsteczkami neurotrofin, powierzchnią albuminy surowicy ludzkiej i makrojonami PEG. Takie podejście upraszcza syntezę i przypomina niekowalencyjne oddziaływanie między jednostkami biologicznymi, takimi jak białka, receptory, wirusy i powierzchnie komórek. Aby potwierdzić stabilność nanocząstek, określono różne właściwości fizykochemiczne mierzone za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), wielokątowego dynamicznego i elektroforetycznego rozpraszania światła (MADLS/ELS). Ponadto zbadano, czy rodzaj neurotrofin wpływa na powinowactwo wiązania z nośnikiem HSA w układzie bezkomórkowym poprzez zmianę profili uwalniania BDNF/NT3 z nanocząstek. Następnie oceniono podstawową cytotoksyczność HSA-NT3-BDNF-PEG w badaniach in vitro w liniach komórkowych. Na koniec określono profil uwalniania BDNF i NT3 in vivo w oku mysim, aby ocenić jego potencjalne przełożenie kliniczne i potencjalne przyszłe zastosowanie w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych, takich jak AMD. Przeprowadzone analizy potwierdziły korzystny potencjał kompleksu według wynalazku.
W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy zastosowania kompleksu według wynalazku do stosowania w zapobieganiu lub leczeniu chorób oczu.
W jednym wykonaniu chorobę oczu stanowi choroba neurodegeneracyjna siatkówki oka. W innym korzystnym wykonaniu chorobę stanowi zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD).
W jednym wykonaniu kompleks elektrostatyczny według wynalazku do stosowania według wynalazku jest stosowany w kompozycji farmaceutycznej do podawania doszklistkowego, zwłaszcza w postaci kompozycji farmaceutycznej o stopniowym uwalnianiu neurotrofiny BDNF oraz NT3.
Wynalazek przedstawiono w przykładach wykonania na rysunku, na którym:
Fig. 1 przedstawia fizykochemiczną charakterystykę nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG(NT3 10 mg mL-1, BDNF 10 mg mL-1) po syntezie. Rozkład wielkości cząstek mierzono na podstawie intensywności (A) i liczby (B), określono stężeń nanocząstek (C) i potencjału zeta w płynie Ringera, pH 4,9, siła jonowa 0,15 M. Intensywność (w procentach) wskazuje rozkład średni hydrodynamicznych najczęściej występujących w zawiesinie cząstek. Wszystkie syntezy przeprowadzono piętnaście razy, a słupki błędów przedstawiają wartości średnie ± odchylenie standardowe (SD). Poszczególne krzywe wskazują rozkład średnic NP dla 24 próbek. Obrazy SEM nanocząstek odpowiadają powiększeniu 100 000x (E) i 50 000x (F). Pasek skali wynosi 100 nm;
Fig. 2 przedstawia stabilność nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG (NTs 10 mg mL-1) w ciągu 90 dni po syntezie. Rozkład wielkości cząstek mierzono na podstawie intensywności (A) i liczby (B), potencjał zeta (C), a stężenie BDNF i NT3 mierzono testem ELISA (D). Intensywność (w procentach) wskazuje częstotliwość występowania danych nanocząstek. Wszystkie syntezy przeprowadzono sześć razy, a słupki błędów reprezentują średnią ± odchylenie standardowe (SD). Poszczególne krzywe wskazują rozkład średnic NPs z 8 próbek. Obrazy SEM nanocząstek po 24 godziny po przeprowadzonej syntezie (E) i 90 dni po syntezie (F) odpowiadają powiększeniu 100 000x. Pasek skali wynosi 100 nm. Należy zauważyć, że mierzone właściwości zawiesiny PEGylowanych nanocząstek HSA-NT3-BDNF utrzymuje się przez 90 dni. Stężenie białka recombinant human NT3 (NT3) i białka recombinant human BDNF (BDNF) w produkcie końcowym w czasie 0 (T0), po zamrożeniu przez 72 godziny (72 godz.) i po 3 miesiącach. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe. Analiza statystyczna przy użyciu testu Kruskala-Wallisa nie wykazała istotnych zmian stężenia stężenia białek w czasie (p > 0.05);
Fig. 3 przedstawia kinetykę uwalniania BDNF (koło w kolorze czarnym) i NT-3 (kwadrat w kolorze szarym) w zawiesinie nanocząstek HSA-BDNF-NT3-PEG;
Fig. 4 przedstawia wpływ nanokapsułki HSA-NT3-BDNF-PEG na żywotność komórek ARPE-19 w zależności od stężenia białek NT3 oraz BDNF po 48 godzinach w komórkach linii ARPE-19. Eksperyment wykonano w co najmniej trzech niezależnych powtórzeniach, w pięciokrotnym powtórzeniu technicznym. Analiza statystyczna przy użyciu jednostronnego testu ANOVA (GraphPad Prism) nie wykazała istotnych statystycznie różnic;
Fig. 5 przedstawia wpływ nanokapsułki HSA-NT3-BDNF-PEG na żywotność komórek L-929 w zależności od stężenia białek NT3 oraz BDNF po 48 godzinach. Eksperyment wykonano w co najmniej trzech niezależnych powtórzeniach, w pięciokrotnym powtórzeniu technicznym. Analiza statystyczna przy użyciu jednostronnego testu ANOVA (GraphPad Prism) nie wykazała istotnych statystycznie różnic;
Fig. 6 przedstawia kinetykę uwalniania neurotrofin BDNF (koło w kolorze czarnym) i NT-3 (kwadrat w kolorze szarym) z nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG w linii komórkowej ARPE-19 do medium zawierającego 1% FBS (A) i 10% FBS (B) w odstępach czasowych: 30 min, 2 godz., 24 godz., 48 godz., 72 godz.;
Fig. 7 przedstawia pobieranie BDNF oraz NT3 z nanocząsteczki HSA-NT3-BDNF-PEG w komórkach linii ARPE-19 po 72 godzinach inkubacji. Komórki ARPE-19 wysiano w płytkach 6-dołkowych. Po 24 godzinach preinkubacji do komórek dodawano zawiesinę nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG, zawiesinę nanocząstek HSA-PEG albo PBS (kontrola, “control”). Po 72 godzinach przeprowadzano lizę komórek i izolowano z nich białko. Białko całkowite mierzono przy pomocy testu BCA (Abeam), a następnie oznaczano stężenie neurotrofin NT3 oraz BDNF przy użyciu specyficznego testu immunoenzymatycznego ELISA (R&D) w 1 ąg białka całkowitego. Na rysunku 7A pokazano średnie stężenie ± odchylenie standardowe stężenie białka BDNF (Cbdnf ąg L-1), a na fig. 7B pokazuje średnie stężenie = odchylenie standardowe białka NT3 (Cnt3 ąg L-1). Eksperyment wykonano w co najmniej trzykrotnym niezależnym powtórzeniu. Analizę statystyczną przeprowadzono używając jednoczynnikowego testu ANOVA (GraphPad Prism). **** p < 0.0001.
Fig. 8 przedstawia biodystrybucję oraz uwalnianie białek BDNF oraz NT3 z nanocząstki HSANTS-BDNF-PEG w szklistce oraz części neurosensorycznej siatkówki wraz z nabłonkiem barwnikowym. Myszom Balb/c podano zastrzykiem doszklistkowym 1 μΙ zawiesiny nanocząstek HSA-PEG (kontrola) oraz HSA-NT3-BDNF-PEG. W 1, 7 i 28 dniu myszy uśmiercano (n = 6 w każdym punkcie czasowym), a następnie pobierano szklistkę “vitreous body” oraz nabłonek barwnikowy “retina”, z których izolowano białko przy użyciu mirVANA PARIS Kit (Ambion). Poziom neurotrofin został oznaczony przy użyciu testu immunoenzymatycznego ELISA (R&D). Figura 8A i 8B pokazuje średnie stężenie ± odchylenie standardowe odpowiednio białek BDNF (Cbdnf μg L-1) oraz NT3 (Cnt3 μg L-1 w szklistce “vitraeous body”, a fig. 8C i 8D w nabłonku barwnikowym “retina”. Wyniki analizowano przy użyciu jednoczynnikowego testu ANOVA (GraphPad Prism). **** p < 0.0001;
Fig. 9 przedstawia analizę żywotności komórek ARPE-19 po indukcji stresu oksydacyjnego w zależności od obecności nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG z użyciem testu JC1. Komórki ARPE-19 wysiano na płytkę 96-dołkową o czarnych ściankach i przezroczystym dnie. Po 24 godzinach preinkubacji w komórkach indukowano stres oksydacyjny przy użyciu 5 mM jodanu sodu (NalO3). Następnego dnia wymieniano medium na świeżą pożywkę pozbawioną jodanu oraz dodawano zawiesiny nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG z neurotrofinami w stężeniu 10 lub 20 μg L-1 każda buforu PBS (”5 mM NaIO3”). Po 48 godzinach wykonywano test JCl zgodnie z instrukcjami producenta. Obliczony stosunek J-agregatów (“J-aggregates”) i J-monomerów (“J-monomers”) poddano analizie statystycznej przy udziale jednoczynnikowego testu ANOVA (GraphPadPrism). *** p < 0.0001;
Fig. 10 przedstawia analizę apoptozy w komórkach ARPE-19 po indukcji stresu oksydacyjnego w zależności od obecności nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG z użyciem Aneksyny V/jodku propidyny w cytometrii przepływowej. Komórki ARPE-19 wysiano na płytkę sześciodołkową. Po 24 godzinach preinkubacji w komórkach indukowano stres oksydacyjny przy użyciu 5 mM jodanu sodu (NalO3). Następnego dnia wymieniano medium na świeżą pożywkę pozbawioną jodanu oraz dodawano zawiesiny nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG z neurotrofinami w stężeniu 10 lub 20 μg mL-1 każda albo buforu PBS (“5 mM NalO3“). Po 48 godzinach inkubacji w komórkach oznaczano uzewnętrznienie fosfatydyloseryny oraz śmiertelność przy użyciu testu Aneksyna V/jodek propidyny (BD Biosciences), a następnie odczytywano sygnał przy użyciu cytometru przepływowego BD LSR II. Eksperyment wykonano w trzech niezależnych powtórzeniach. Na fig. 10A oznaczono odsetek komórek żywych w populacji (“% viable cells in population”), natomiast na fig. 10B odsetek komórek apoptotycznych (“% apoptotic cells in population”). Jako kontrolę “control” użyto komórek bez stresu oksydacyjnego, bez dodatku neurotrofm. Wyniki analizowano przy użyciu jednoczynnikowego testu ANOVA (GraphPad Prism). * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001.
Wynalazek przedstawiono w przykładach wykonania, a wszystkie opisane poniżej testy i procedury doświadczalne przeprowadzono z zastosowaniem komercyjnie dostępnych zestawów testowych, odczynników i aparatury, postępując zgodnie z zaleceniami producentów stosowanych zestawów, odczynników i aparatury, o ile nie wskazano wyraźnie inaczej. Wszelkie parametry testowe mierzono z zastosowaniem standardowych, powszechnie znanych metod stosowanych w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek.
Przy czym, poniższe przykłady wykonania służą zobrazowaniu przedmiotowego rozwiązania i nie powinny stanowić ograniczenia zakresu ochrony patentowej.
Przykład 1
Otrzymywanie stabilnych kompleksów elektrostatycznych składających się z HSA, białek z rodziny neurotrofin (NT3 i BDNF) oraz polielektrolitu PEG
Procedura syntezy zawiesiny nanokapsułek HSA - NT3 - BDNF — PEG
Zawiesinę nanokapsułek HSA-NT3-BDNF-PEG zsyntezowano z wykorzystaniem adsorpcji fizycznej. W celu otrzymania 24 mL roztworu nanokapsułek zdyspergowanych w płynie Ringera do syntezy użyto roztworów roboczych białek NT3 i BDNF, preparatu Flexbumin oraz polielektrolitu PEG w objętościach podanych w tabeli 1 poniżej:
PL 248905 Β1
Tabela 1. Robocze i końcowe stężenia składników używanych do syntezy zawiesiny nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG: białek (HSA, NT3, BDNF), polielektrolitu (PEG-4000)
Składnik zawiesiny Stężenie wyjściowe roztworu roboczego [pg/mL] Stężenie końcowe w zawiesinie [pg/mL] Odmierzana objętość [pL]
Flexbumin/HSA 200 000 20 000 2400
PEG 4000 100 000 2000 480
Białko BDNF 250 10 960
Białko NT-3 250 10 960
płyn Ringera nd nd 21 600
Natomiast sama procedura obejmowała następujące etapy:
1. Przygotowanie roztworu PEG 4000 o stężeniu 100 000
Odważono na wadze analitycznej 1,00 g PEG 4000 (średnia masa cząsteczkowa 4000 g/mol stosowany w procesie wytwarzania zawiesiny nanocząstek jako substancja stabilizująca, Numer katalogowy: 1546569, GMP-grade, Sigma Aldrich) zgodnie z Instrukcją użytkowania wagi Radwag XA 110.4Y.A PLUS i przeniesiono do probówki o objętości 15 mL (typu falcon, produkowane przez firmę TPP. Numer katalogowy: 391050). Następnie, przy użyciu pipety automatycznej dodano do probówki 10 mL płynu Ringera (wodny roztwór soli mineralnych, którego skład zbliżony jest do składu płynu zewnątrzkomórkowego człowieka. 1000 ml roztworu zawiera 8,6 g chlorku sodu, 0,3 g chlorku potasu i 0,33 g dwuwodnego chlorku wapnia. Osmolarność roztworu wynosi 309 mOsmol/l, a pH mieści się w zakresie od 5,0 do 7,5. Użyty płyn Ringera produkowany jest przez firmę Fresenius Kabi). Zawartość mieszano poprzez siedmiokrotne wstrząśnięcie roztworu, pięciokrotne odwrócenie, a następnie umieszczenie probówki na bujaku i mieszanie przez 15 min (bujak Grant-Bio PTR-35, mieszanie orbitalne, 20 rpm w temperaturze pokojowej). 1 mL tak przygotowanego roztworu pobrano do strzykawki o objętości 2 mL nałożono na strzykawkę filtr Millipore o średnicy porów 0,22 μπι i przefiltrowano roztwór do czystej probówki o objętości 15 ml.
2. Przygotowanie roztworu HSA-Ringer
Za pomocą pipety automatycznej odmierzono 21 600 pL płynu Ringera i przeniesiono do probówki o objętości 50 mL. Następnie pipetą automatyczną pobrano 2400 pL roztworu Flexbumin i zmieszano z 21 600 pL płynu Ringera. Wymieszano roztwór poprzez 10-ciokrotne odwrócenie góra-dół. Następnie z tak przygotowanego roztworu końcowego Flexbumin-Ringer usunięto objętość 2400 pL, tak, żeby objętość pozostała w probówce wynosiła 21 600 pL. Preparat Flexbumin® 200 g/L firmy Takeda Pharma sp. z o.o. jest hiperonkotycznym roztworem do infuzji, który zawiera 20% białka całkowitego, z czego przynajmniej 95% stanowi albumina ludzka. Zawartość substancji pomocniczych: Sodu chlorek 4,3 g/L, Sodu kaprylan 2,7 g/L, Sodu acetylotryptofanian 4,3 g/L, Woda do wstrzykiwać. Całkowita zawartość jonów sodowych wynosi 130-160 mmol/L. W wytwarzanej zawiesinie nanocząstek albuminy ludzkie stanowią substancję pomocniczą wykorzystywaną jako nośnik do adsorpcji białek terapeutycznych BDNF i NT3 w celu zwiększenia powierzchni adsorpcyjnej i stabilności fizykochemicznej nanokapsułek HSA-NT3-BDNF-PEG.
3. Przygotowanie roztworu HSA-Ringer-NT-3-BDNF
Do probówki zawierającej 21 600 pL roztworu Flexbumin-Ringerza pomocą pipety automatycznej należy przenieść 960 pL roztworu roboczego rekombinowanego ludzkiego białka NT-3 (R&D Systems, nr kat. 267-N3-250/CF) o stężeniu 250 μg/mL. Zamknąć probówkę, a następnie wymieszać roztwór poprzez 10-ciokrotne odwrócenie góra-dół (ruch flip-flop). Odstawić roztwór na blat roboczy na 15 minut po czym za pomocą pipety automatycznej należy dodać 960 pL roztworu roboczego rekombinowanego ludzkiego białka BDNF (R&D Systems, nr kat. 248-BDB-250/CF) o stężeniu 250 μg/mL. Zamknięto probówkę, a następnie mieszano roztwór poprzez 10-ciokrotne odwrócenie góra-dół. Odstawiono na blat roboczy na 15 minut.
4. Przygotowanie roztworu HSA-NT-3-BDNF-PEG
Do probówki z roztworem HSA-Ringer-NT-3-BDNF dodano 480 ąL uprzednio przygotowanego i przefiltrowanego roztworu roboczego PEG 4000 o stężeniu 100 000 ąg/mL. Wymieszano roztwór poprzez 10-ciokrotne odwrócenie góra-dół. Odstawia na blat roboczy na 15 minut.
Charakterystyka fizykochemiczna nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG po syntezie • Zastosowana metodyka
Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
Mikroskop elektronowy JEOL JSM-7500F pracujący w trybie transmisyjnym (TEM) posłużył do oceny morfologii i rozkładu wielkości PEGylowanych nanocząstek HSA-NT3 -BDNF (w 0,15 M roztworze Ringera). Mikrofotografie analizowano stosując oprogramowanie Multi Scan (komputerowy system skanujący). Wszystkie obrazy przedstawiają detekcję bezpośrednio z powierzchni próbki, bez powłoki lub zastosowanego kontrastu. Wielkość PEGylowanych nanocząstek HSA-NT3-BDNF z zaadsorbowanymi 10 mg L-1 białek BDNF i 10 mg L-1 NT3 określono za pomocą oprogramowania ImageJ poprzez zebranie liczby i współrzędnych pojedynczych cząsteczek nanocząstek. Ręczne zliczanie PEGylowanych nanocząstek HSA-NT3-BDNF opierało się na porównaniu oryginalnego obrazu i tego samego obrazu zmienionego cyfrowymi filtrami obrazu poprzez odcięcie tła obrazu.
Dynamiczne rozpraszanie światła pod wieloma kątami (MADLS)
Aby określić całkowite stężenie nanocząstek HSA-BDNF-NT3-PEG, zmierzono rozkład wielkości cząstek w zawiesinie, uśrednioną w czasie intensywność rozpraszania światła przez próbkę za pomocą metody dynamicznego rozpraszania światła pod wieloma kątami. MADLS to dobrze ugruntowana technika powalająca zmierzyć rozkład średnicy hydrodynamicznej cząstek koloidalnych rozproszonych w roztworach. Detekcja wielokątowa dostarcza wiarygodnych danych nawet dla polidyspersyjnych próbek, co poprawia rozdzielczość, czułość i dokładność określania rozmiaru cząstek w porównaniu z tradycyjnym jednokątowym dynamicznym rozpraszaniem światła. Pomiary stężenia cząstek, wielkości przeprowadzono dla PEGylowanej nanocząstki HSA-NT3-BDNF otrzymanych w wyniku 24 syntez. Wyniki pomiarów podają hydrodynamiczny rozkład wielkości i stężenia nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG, a wraz z pomiarami potencjału zeta umożliwiają określenie stabilności zawiesiny nanocząstek w czasie.
Elektroforetyczne rozpraszanie światła (ELS)
Potencjał zeta i wskaźnik polidyspersyjności PEGylowanych nanocząstek HSA-NT3-BDNF określono techniką laserowej prędkości dopplerowskiej (LDV) w 25°C za pomocą analizatora cząstek Malvern ZetaSizer Ultra mierząc współczynniki dyfuzji (D) i pomiary ruchliwości elektroforetycznej (ąe). Ruchliwość elektroforetyczna została przeliczona na potencjał ζ przy użyciu równania Henry'ego ważnego dla wyższej siły jonowej, gdzie istotna jest polaryzacja podwójnej warstwy elektrycznej (grubość warstwy podwójnej staje się mniejsza niż wielkość białka).
• Wyniki i wnioski
Określono średnicę hydrodynamiczną PEGylowanych nanocząstek HSA-NT3-BDNF zawierających stężenia obu neurotrofin (10 mg L-1) w zakresie od 7,47 nm do 416 nm i wykazywała niski indeks polidyspersji (PDI) (0,010 ± 0,009). Wyniki przedstawiono na Fig. 1A, 1B i 1C a także w tabeli 2. Dodatkowo porównano średnie rozmiary PEGylowanych nanocząstek HSA-NT3-BDNF zmierzone za pomocą MADLS, gdy cząstki posiadają warstwę hydratacyjną z badania SEM i wykazano, że obie wartości średnic nanocząstek były podobne (Fig. 1E, 1F).
PEGylowane nanocząstki HSA-NT3-BDNF scharakteryzowano fizykochemicznie pod kątem ruchliwości elektroforetycznej/potencjału zeta. Dodatnio naładowana molekuła białka NT3 (5 mV ± 2,5 mV) adsorbowano elektrostatycznie na ujemnie naładowanych cząsteczkach HSA (-20 mV ± 2,5 mV) zgodnie z masowym transportem dyfuzyjnym. Potencjały zeta utworzonych kompleksów HAS-NT3 wynosiły -15,57 mV ± 3,21 mV. Zgodnie z oczekiwaniami, adsorpcja dodatnio naładowanego NT3 na ujemnie naładowanym HSA doprowadziła do zmniejszenia ładunku, w wyniku czego otrzymano naładowane ujemnie koniugaty HSA-NT3. Następnie adsorpcję BDNF (-2 mV ± 2,5 mV) prowadzono zgodnie z masowym transportem dyfuzyjnym zaadsorbowanym przez kompleksy HSA-NT3. Po adsorpcji ujemnie naładowanych łańcuchów PEG (-4 ± 2 mV) otrzymano elektrostatyczne kompleksy HSA-NT3-BDNF o ładunku elektrokinetycznym -8 mV ± 3 mV (Fig. 1D).
PL 248905 Β1
Charakterystyka stabilności nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG do 90 dni no przeprowadzonej syntezie • Zastosowana metodyka
Kinetyczne pomiary parametrów fizykochemicznych dotyczące stabilności zawiesiny nanocząstek Flexbumin-BDNF-NT3-PEG (MADFS, stężenie NPs, EFS i SEM) wykonywano w kilku punktach czasowych do 90 dni po syntezie. W tym celu zsyntezowano trzy serie (każda zawierała minimum 10 produktów końcowych) zawiesiny nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG zawierające 10 pg/mL białka NT3 i 10 pg/mL białka BDNF. Wykonano pomiary: wielkości, stężenia, potencjałów zeta nanocząstek po przygotowaniu produktu oraz w kilku punktach czasowych po zamrożeniu zawiesiny nanocząstek w temperaturze -20°C.
• Wyniki i wnioski
Wyniki badanych parametrów fizykochemicznych w badanym produkcie określające jego stabilność w ciągu 90 dni przedstawiono w poniższej tabeli 2, jak również na Fig. 2A, B, C, E i F.
Tabela 2. Parametry? fizykochemiczne nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG (NTs 10 mg mL'1) do 90 dni po syntezie
Oceniany parametr Wartość liczbowa +/-SD
pH 4.96 +/- 0,2
Średnica nanocząstek (Size) |nm l Peak 1 7,472 nm +/- 1
Peak 2 45,70 nm +/- 10
Peak 3 416,04 nm +/- 50 lub brak
Stężenie nanocząstek (Particie concentration) Iparticle/mLI Peak 1 1.16 xl017+/- 0,5 xl017
Peak 2 2,29 xl012 +/- 5 xl012
Peak 3 1,55 x!07 +/- 3 xl07 lub brak
Potencjał zeta cząstek (Mean zeta potential) [mV1 - 8 mV +/-5
Tabela 2 szczegółowo określa parametry fizykochemiczne charakteryzujące produkt zawiesinę nanocząstek Flexbumin-BDNF-NT3-PEG, w wytworzonej serii w tym parametry kinetyczne jakie produkt musi spełniać w trakcie przechowywania. Opakowania zawierające zawiesinę nanocząstek Flexbumin-BDNF-NT3-PEG, do momentu pomiaru były przechowywane w temperaturze -20°C. Maksymalny okres przechowywania w takich warunkach bez utraty parametrów fizykochemicznych takich jak wielkość, potencjał zeta, indeks polidyspersji, stężenie nanocząstek w zawiesinie wynosi 90 dni (Fig. 2A, B, C, E i F).
Badania SEM i MADLS wy kazały, że średnica PEGylowanych nanocząstek HSA-NT3-BDNF mieściła się w zakresie od 7 nm do 430 nm a wskaźnik polidyspersji był niższy od 0,1 po 90 dniach zamrażania zawiesiny. Średnie stężenie PEGylowanych nanocząstek HSA-NT3-BDNF wynosiło 1017 cząstek/mL dla frakcji nanocząstek o małych średnicach hydrodynamicznych, 1013 cząstek/mL dla frakcji nanocząstek o średnich średnicach hydrodynamicznych i 107 cząstek/ml dla frakcji nanocząstek o dużych średnicach hydrodynamicznych. Stężenia poszczególnych frakcji nanocząstek osiągnęły stałe wartości w ciągu 90 dni od zamrożenia. Ponadto, pomiary ruchliwości mikroelektroforetycznej wykazały, że ładunek elektrokinetyczny PEGylowanych nanocząstek HSA-NT3-BDNF ustabilizował się w ciągu 90 dni, ostatecznie osiągając potencjał zeta -8 mV ± 5 mV.
Stężenie neurotrofin w zawiesinie nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG do 90 dni po przeprowadzonej syntezie • Zastosowana metodyka
Test immunoenzymatyczny ELISA
Test ELISA opiera się na użyciu biotynylowanych przeciwciał, specyficznych dla fragmentów badanego białka. W następnym kroku podawana jest peroksydaza chrzanowa (HRP) sprzężona ze streptawidyną, oddziałującą z cząsteczką biotyny przeciwciała drugorzędowego. Po podaniu substratu zachodzi barwna reakcja enzymatyczna, skutkująca zmianą absorbacji przy długości fali λ = 540 nm oraz λ = 450 nm. Absorbancja przyjmuje tym większe wartości, im wyższe jest stężenie badanego białka w próbce. Stężenie to określa się na podstawie krzywej wzorcowej odpowiedniej dla badanego białka. Odczyt prowadzono przy użyciu czytnika mikropłytek Varioskan LUX Plate Reader (Thermo Fisher Scientific).
Podstawą działania produktu HSA-BDNF-NT3-PEG jest powolne uwalnianie białek terapeutycznych NT3 oraz BDNF w czasie. Dodatkowo w celu oceny stabilności produktu sprawdzono stężenia substancji aktywnych (białek NT3 i BDNF) w zawiesinie HSA-NT3-BDNF-PEG po rozmrożeniu dla trzech serii produktów. Aby ocenić stabilność stężenia białka w produkcie po zamrożeniu i rozmrożeniu, wybrane próbki przechowywano w temperaturze -20°C. Oznaczano stężenie białka po syntezie (przed zamrożeniem), 72 godz. i trzy miesiące po zamrożeniu. Stężenia białek w produkcie końcowym zmierzono przy użyciu testu immunoenzymatycznego ELISA Duo Set (DY992, DY990, DY994, DY999, DY995, WA126, DY006, DY267, DY248 R&D Systems).
• Wyniki i wnioski
Wykonano pomiar stężenia białka po przygotowaniu produktu (oznaczony jako T(0)). Stężenie substancji aktywnej w niezamrożonym produkcie wyniosło średnio odpowiednio 9,95 ± 1,59 μg/mL dla białka NT3 oraz 11,25 ± 1,43 μg/mL dla białka BDNF (fig. 2D). Po 72 godzinach w zamrażarce średnie stężenie białka NT3 wyniosło 11,31 ± 0,35 μg/mL, a białka BDNF 10,12 ± 0,23 μg/mL. Po trzech miesiącach w -20°C odnotowano średnie stężenie NT3 na poziomie 12,02 ± 0,37 μg/mL oraz BDNF na poziomie 9,90 ± 0,335 μg/mL. Analiza statystyczna nie wskazała istotnych różnic pomiędzy stężeniami poszczególnych białek w czasie. Wyniki przedstawiono na Fig. 2D.
Przykład 2
Profile uwalniania białek BDNF i NT3
Ocena kinetyki uwalniania neurotrofin NT3 i BDNF z nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG
Kinetykę uwalniania neurotrofin w zawiesinie nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG badano z użyciem metody ELISA po ultrawirowaniu zawiesiny w celu oddzielenia związanych neurotrofin znajdujących się w nanocząstkach od roztworu wolnego od nanocząstek supernatantu, który zawierał niezwiązane neurotrofiny. Wyprodukowano trzy serie nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG o objętości 1,5 mL i zawieszono odpowiednio w płynie Ringer’a. Pobrano próbkę w czasie t0 do późniejszej analizy. Pobraną objętość uzupełniono odpowiednio płynem Ringer’a. Zawiesiny nanocząstek umieszczono w temperaturze 37°C na bujaku i mieszano do czasu pobrania próbki w celu analizy stężeń BDNF i NT3 w kolejnym punkcie czasowym (bujak Grant-Bio PTR-35, mieszanie orbitalne, 99 RPM). Każdorazowo po pobraniu próbki do analizy dodawano płyn Ringer’a tak aby wyjściowa objętość zawiesiny nanocząstek nie ulegała zmianie i aby nie dochodziło do powstawania roztworu nasyconego uwalnianych białek i zachowania warunków ‘sink’. Pobrane każdorazowo próbki odwirowano w ultrawirówce (60000 RPM, 4°C) i pobrano supernatant w objętości, który zamrożono w temperaturze - 20°C do późniejszej analizy testem ELISA. Punkty eksperymentalne : t0 = 0 min, t1 = 30 min, t2 = 1 godz., t3 = 2 godz., t4 = 4 godz., t5 = 8 godz., te = 24 godz., t7 = 48 godz., tg = 72 godz., tg = 7 dni, t10 = 14 dni, tu = 28 dni, t12 = 2 miesiące.
• Wyniki i wnioski
Wyniki zostały przedstawione na Fig. 3. Wyniki kinetyki uwalniania BDNF i NT3 pokazują, że uwalnianie z nanocząstki rozpoczęło się po 30 min inkubacji zawiesin nanocząstek w buforach uwalniających. Po 28 dniach kinetyka reakcji uwalniania osiągnęła plateau utrzymując się na poziomie 30%.
Przykład 3
Badanie toksyczności zawiesiny nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG w modelu in vitro.
1. Procedury stosowane w hodowli komórkowej
1.1. Podstawowa hodowla komórkowa
Do oceny cytotoksyczności wybrano dwie linie komórkowe:
(a) Linia ARPE-19 (CRL-2302™ ATCC) pochodząca z ludzkiego nienowotworowego nabłonka barwnikowego siatkówki.
(b) Linia NCTC klon 929 (L-929, CCL-1 ™ ATCC) pochodząca z mysiej tkanki łącznej podskórnej. Linia powszechnie stosowana do testowania toksyczności substancji.
Hodowla komórek prowadzona była w inkubatorze komórkowym (Nuaire, Plymouth, USA), zapewniającym stałe warunki - temperatura 37°C, atmosfera: 95% powietrze, 5% CO2. Do hodowli komórek ARPE-19 używano medium DMEM/F12 z L-glutaminą, 10% (v/v) FBS oraz 1% (v/v) Pen strep, do hodowli komórek L-929 używano medium EMEM (ATCC) z dodatkiem 10% (v/v) końskiego serum i 1%
PL 248905 Β1 (v/v) Penicylina - streptomycyna. Jeżeli nie wskazano inaczej, odczynniki do hodowli pochodziły z firmy
Gibco (Thermo Scientific). Warunki hodowli linii komórkowych przedstawiono w tabeli 3 poniżej:
Tabela 3. Warunki hodowli linii komórkowych ARPE-19 oraz L929 w trakcie badań cytotoksyczności
Metoda Linia Ilość komórek/dołek Naczynie hodowlane
AlamarBlue ARPE-19 5000 Płytka 96-dołkowa
L929 10 000
JC-1 ARPE-19 5000 Płytka 96-dołkowa czarna z przezroczystym dnem
L929 10 000
1.2. Test żywotności AlamarBlue™
Test Alamar Blue™ (Thermo Fisher Scientific) pozwala oszacować stopień cytotoksyczności badanej substancji na podstawie oceny aktywności procesów oksyredukcyjnych. W teście resazuryna o barwie niebieskiej jest przekształcana w resorufinę o kolorze różowym. Pomiaru dokonuje się przy użyciu spektrofotometru (czytnik mikropłytek). Zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta, do badanych komórek dodaje się sterylnie pełnej pożywki hodowlanej z dodatkiem barwnika AlamarBlue™. Komórki przenosi się z powrotem do inkubatora. Po 6-ciu godzinach inkubacji z reagentem AlamarBlue™ odczytywano absorbancję przy długości fali λ = 560 nm i λ = 590 nm za pomocą czytnika płytek (Varioskan LUX Platę Reader, Thenno Fisher).
1.3. Test polaryzacji błony mitochondrailnej JC-1
Barwnik JC-1 (JC-1 Mitochondrial Membranę Potential Assay Kit, nr ref. 10009172, Cayman Chemical) w niskich stężeniach istnieje jako monomer i charakteryzuje się zieloną fluorescencją. Posiada zdolność akumulacji w mitochondriach, gdzie tworzy J-agregaty, charakteryzujące się czerwoną fluorescencją. Jego akumulacja jest zależna od potencjału błony mitochondrialnej (ΔΨΜ) i charakteryzuje komórki żywotne, podczas gdy wysokie stężenie wolnych monomerów charakteryzuje komórki chore, umierające, o niskim potencjale błony. Spadek polaryzacji błony jest widoczny jako spadek stosunku czerwonej fluorescencji do zielonej. Procedura barwienia zgodna z instrukcjami producenta przebiega następująco, komórki inkubuje się 20 minut w inkubatorze komórkowym z dodatkiem barwnika JC-1 rozcieńczonego w pożywce hodowlanej. Barwnik odpłukuje się przy użyciu dołączonego do zestawu buforu “Assay Buffer”. Po ostatnim płukaniu dodaje się buforu ponownie i dokonuje odczytu.
Fluorescencję czerwoną odczytywano przy długościach fali ekscytacji 535 nm i emisji 595 nm, a fluorescencję zieloną przy długościach fali ekscytacji 485 nm i emisji 535 nm. Do odczytu użyto czytnika płytek (Varioskan LUX Platę Reader, Thermo Fisher).
1.4. Analiza statystyczna
Analizy statystycznej dokonano przy użyciu programu GraphPad Prism ver. 9.5.1 dla Windows (GraphPad Software, San Diego, California USA, www.graDhDad.com).
2. Ocena cytotoksyczności nanokapsułki HSA-NT3-BDNF-PEG w zależności od stężenia neurotrofin w kapsułce
Po 24 godzinach od wysiania komórek, do dołków dodawano 80 μΙ pełnego medium bez antybiotyków, a następnie 20 μΙ zawiesiny nanokapsułek (1) HSA - PEG, (2) HSA - 5 μg mL-1 NT3 - 5 μg mL-1 BDNF - PEG, (3) HSA - 10 μg mL1 NT3 - 10 μg mL1 BDNF - PEG albo (4) HSA - 20 μg mL1 NT3 - 20 μg mL-1 BDNF - PEG. Po 48 godzinach:
(a) medium w dołkach wymieniono na medium z dodatkiem reagentu AlamarBlue i postępowano dalej zgodnie z zaleceniami producenta, zgodnie z opisem w punkcie 1.2 “Test żywotności alamarBlue™”. Eksperyment wykonano minimum w trzech niezależnych powtórzeniach, w n=15. Wyniki przedstawiono na fig. 4A (ARPE-19) oraz B (L-929.
albo (b) medium w dołkach wymieniono na medium z dodatkiem reagentu JC-1. Barwienie przeprowadzono jak opisano w punkcie 1.3 “Test polaryzacji błony mitochondrialnej JC-1”. Eksperyment wykonano minimum w trzech niezależnych powtórzeniach, n=15. Wyniki przedstawiono na fig. 5A (ARPE-19) oraz B (L-929).
Wyniki i wnioski
Po 48 godzinach inkubacji z nanokapsułkami wyniki żadnego z testów nie ujawniły istotnych statystycznie różnic między grupami, zatem nie zaobserwowano cytotoksyczności wywołanej obecnością neurotrofin w zakresie stężeń 5-20 pg mL-1.
Przykład 4
Kinetyka uwalniania oraz pobieranie neurotrofin NT3 i BDNF z nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG in vitro z użyciem linii komórkowej ARPE-19
Hodowla komórkowa została opisana w punkcie 1, przykładu 3. Opis testu immunoenzymatycznego ELISA znajduje się w Przykładzie 1 akapit “Stężenie neurotrofin w zawiesinie nanocząstek HSA-NT3- BDNF-PEG do 90 dni po przeprowadzonej syntezie”.
Profil uwalniania neurotrofin z cząstki • Metodyka
Po 24-godzinnej inkubacji płytek z komórkami ARPE-19 (104 komórek/dołek), odciągnięto medium i dodano przygotowane roztwory nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG w stężeniu 10 mg mL-1 w dwóch różnych roztworach 1) R-r Ringer’a + 1% FBS 2) R-r Ringer’a + 10% FBS. Nanocząstki dostarczono do komórek w medium hodowlanym (1:4; Vnanocząstki:Vmedium hodowlane). Dla każdej badanej substancji wykonano kontrolę z medium hodowlanym oraz 1) 1% FBS i 2) 10% FBS. Po inkubacji z badaną substancją w ustalonym odstępie czasowym usunięto medium z płytki z zawieszonymi w niej substancjami i zamrożono w temperaturze -20°C do późniejszego testu ELISA. Ustalone odstępy czasowe t1 = 30 min, t2 = 2 godz., t3 = 24 godz., t4 = 48 godz., fe = 72 godz. Ilość powtórzeń technicznych dla każdej badanej próbki wynosiła n=3. Wyniki zostały przedstawione na Fig. 6.
• Opis wyników i wnioski
Test ELISA wykazał, że uwalnianie z nanocząstki HSA-NT3-BDNF-PEG zarówno BDNF jak i NT-3 jest na stałym poziomie. Po 30 minutach inkubacji komórek ARPE-19 z nanocząstkami w medium hodowlanym suplementowanym 1% FBS jak i 10% FBS odnotowano szczyt uwalniania białek BDNF i NT3 na poziomie ~80%. Wyniki pokazane na fig. 6 sugerują, że nanocząstka umożliwia stopniowe uwalnianie NT3 i BDNF w stałych stężeniach w warunkach in vitro.
Pobieranie BDNF oraz NT3 pochodzącego z nanocząstki HSA-NT3-BDNF-PEGprzez komórki ARPE19 • Metodyka
Komórki ARPE-19 zostały wysiane w gęstości 2,5 x 105 komórek/dołek w płytce sześciodołkowej. Po 24 godzinach pre-inkubacji, kompletną pożywkę wymieniono na 900 pL DMEM/F12 suplementowanego 10% FBS (v/v; objętość końcowa), a następnie wkroplono 100 pL zawiesiny nanocząsteczek w roztworze Ringera. Po 72 godzinach inkubacji resztki medium odpłukano przy pomocy buforu PBS i nałożono na komórki trypsynę na 5 minut. Enzym deaktywowano przy pomocy medium, które następnie odwirowywano przez 5 minut przy prędkości 300 x g (wirówka Eppendorf 5415R). Aby wyizolować białko, pellet komórkowy zawieszano w buforze RIPA Lysis and Extraction Buffer z dodatkiem HALT™ mieszanki inhibitorów proteaz oraz fosfataz (odpowiednio nr kat. 89901, 87785 oraz 78420 ThermoFisher Scientific). W celu ustalenia stężenia całkowitego białka w próbce użyto testu BCA protein assay kit for low concentrations (ab207002, Abeam, Cambridge, United Kingdom). Następnie celem normalizacji używano 1 pg całkowitego lizatu komórkowego, żeby oznaczyć stężenie białek BDNF i NT3 przy pomocy testu ELISA, tak jak opisano w sekcjach powyżej.
• Wyniki i wnioski
Figura 7 pokazuje średnie stężenie białka (a) BDNF [pg L-1] oraz (b) NT3 [pg L-1] w 1 pg lizatu komórkowego. Stężenie BDNF oraz NT3 w komórce wzrasta w sposób zależny od stężenia. W komórkach po inkubacji z zawiesiną nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG o stężeniu neurotrofin 10 pg L-1 (zarówno NT3 jak i BDNF) znajdowało się 1405.36 ± 140.65 pg L-1 BDNF oraz 869.88 ± 242.60 pg L-1 NT3. W komórkach po inkubacji z zawiesiną nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG (20 pg L-1 NT3 oraz BDNF) stężenie BDNF wyniosło 1800.83 ± 37.96 pg L-1, NT3 1539.79 ± 65.43 pg L-1. Stężenie neurotrofin w kontroli nietraktowanej nanocząstkami oraz w kontroli inkubowanej z cząstkami HSA-PEG było niskie i mieściło się w przedziale 10-28 pg L-1 (BDNF) oraz 5-10 pg L-1 (NT3). Wzrost stężenia neurotrofin w komórkach ARPE19 po traktowaniu zawiesiną nanocząsteczek HSA-NT3-BDNF-PEG był istotny statystycznie.
Przykład 5
Badanie biodystrybucji oraz uwalniania nanocząsteczek HSA-BDNF-NT3-PEG in vivo w siatkówce oraz szklistce oka w modelu mysim • Metodyka
Zwierzęta
Do badania wykorzystano myszy szczepu Balb/C (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Niemcy) obu płci, ważące 27-30 g. Procedury z wykorzystaniem myszy zostały wszczęte po uzyskaniu pozytywnej opinii lokalnej komisji etycznej do spraw doświadczeń na zwierzętach w Poznaniu (uchwała nr 27/2017 z dnia 14.07.2017 roku oraz uchwała nr 53/2017 z dnia 06.10.2017 roku). Hodowlę zwierząt prowadzono w systemie klatek indywidualnie wentylowanych (regał IVC: BIO A.S. Vent II Ehret, Emmendingen, Niemcy), z dwunastogodzinnym cyklem dzień/noc oraz z dostępem do pożywienia i wody ad libitum.
Izolacja białka
W 1., 7. i 28. dobie od doszlistkowego podania 1 ąl zawiesiny nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG (BDNF oraz NT3, każde białko w stężeniu 10 ąg L-1) część myszy poddano eutanazji poprzez dyslokację rdzenia kręgowego i pobrano gałki oczne, z których wypreparowano osobno szklistkę oraz część neurosensoryczną siatkówki, wraz z nabłonkiem barwnikowym. Z otrzymanych bioptatów, przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu miRVANA PARIS (Ambion), #AM1560 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) izolowano białko całkowite. W pierwszym etapie izolacji, zamrożone tkanki przenoszono do 300 ąl buforu lizującego (ang. Cell Disruption Buffer), wzbogaconego o mieszaninę inhibitorów proteaz (Protease Inhibitor Coctail, set III; Merck Millipore, Billerica, MA, USA) i fosfataz (1 mM fluorek sodu oraz 2 mM ortowanad sodu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)). Następnie, tkanki rozdrabniano, posługując się homogenizatorem ręcznym Omni TH zaopatrzonym w końcówki do prób twardych (Omni International, Kennesaw, GA, USA). Aby dokończyć proces lizy, homogenaty pozostawiono na lodzie na dodatkowe 10 min, a następnie wirowano z zachowaniem parametrów: 4°C, 14 000 rpm, 12 min. Uzyskany supernatant poddano spektrofotometrycznej ocenie stężenia białka metodą Bradford (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Ekstrakt białkowy wykorzystano do oceny stężenia BDNF oraz neurotrofiny-3 immunoenzymatyczną metodą ELISA.
Kinetyka desorpcji BDNF oraz neurotrofiny-3 z albuminy surowicy ludzkiej w szklistkach i siatkówkach oczu mysich
Określono poziomy stężeń BDNF oraz NT-3 w oku mysim po doszklistkowym podaniu zawiesiny nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG albo PEG-ylowanego nośnika HSA. Przy pomocy techniki ELISA (Human/Mouse BDNF DuoSet ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, cat.no DY248 and Human NT-3 DuoSet ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, cat.no DY267) w szklistkach mysich określono stężenia BDNF oraz NT-3 w pierwszej, siódmej i dwudziestej ósmej dobie po podaniu zawiesiny nanocząstek co przedstawiono na Fig. 8.
• Wyniki i wnioski
Na Fig. 8A i B przedstawione zostały stężenia białek BDNF (Fig. 8A) oraz NT3 (Fig. 8B) w siatkówkach mysich po doszklistkowym podaniu zawiesiny nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG oraz samego PEG-ylowanego nośnika HSA w 1,7 i 28 dobie po podaniu, a) Stężenie białka BDNF jest podane w jednostce [ąg L-1] b) Stężenie białka NT-3 jest podane w jednostce [ąg L-1].
W pierwszym dniu po podaniu cząstki HSA-NT3-BDNF-PEG stężenie białka BDNF wynosiło 125.4 ± 18.5 ąg L-1, a białka NT3 204.0 ± 33.3 ąg L-1. Stężenie białka BDNF w kontroli było poniżej progu detekcji, natomiast stężenie białka NT3 wyniosło ok. 5.3 ± 14.0. W kolejnych dniach stężenie BDNF ąg L-1 uwolnionego z cząsteczki było poniżej progu detekcji, natomiast stężenie białka NT3 utrzymywało się na poziomie około 20 ąg L-1.
Na Fig. 8C i D przedstawione zostały stężenia białek BDNF (Fig. 8C) oraz NT3 (Fig. 8D) w szklistkach mysich po doszklistkowym podaniu zawiesiny nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG oraz samego PEG-ylowanego nośnika HSA w 1,7 i 28 dobie po podaniu, a) Stężenie białka BDNF jest podane w jednostce [ąg L-1] b) Stężenie białka NT-3 jest podane w jednostce [ąg L-1].
W pierwszym dniu po podaniu cząstki HSA-NT3-BDNF-PEG stężenie białka BDNF w ciele szklistym wynosiło 840.0 ± 275.1 ąg L-1, a białka NT3 263.1 ± 95.5 ąg L-1. W 7. oraz w 28. dniu stężenie BDNF uwolnionego z cząsteczki wyniosło odpowiednio 467.0 ± 49.3 ąg L-1, oraz 213.5 ± 104.5 ąg L-1, natomiast stężenie białka NT3 wyniosło odpowiednio 190.3 ± 60.0 ąg L-1 oraz 60.1 ± 74.9 ąg L-1. Stężenie białka BDNF oraz NT3 w kontroli było poniżej progu detekcji.
Wyniki wskazują, że układ jest stabilny w gałce ocznej oraz pozwala na stopniowe uwalnianie neurotrofin w czasie. Po jednorazowym doszklistkowym podaniu neurotrofiny były wykrywane w oku do 28 dni.
Przykład 6
Wykazanie neuroprotekcyjnego wpływu nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG in vitro w modelu komórkowym związanego z AMD
Procedury stosowane w hodowli komórkowej zostały opisane w Przykładzie 3 w punkcie 1.1.
1.1. Jodan sodu (NaiOs)
Chociaż dokładna patofizjologia AMD nie jest znana, wiadomo, że rozwojowi choroby towarzyszy przewlekły stres oksydacyjny w komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) (Chan i in. 2019). Jodan sodu (NalO3) jest związkiem silnie utleniającym, który selektywnie atakuje komórki RPE, dlatego jego użycie in vitro oraz in vivo stanowi powszechnie uznawany i powtarzalny model choroby AMD (Chan i in. 2019; Nadal-Nicolas i Becerra 2018; Liu i in. 2021).
1.2. Test JC-1
Test JC1 mierzy stosunek J-agregatów i J-monomerów, co pozwala zbadać dobrostan komórki po przebytym stresie. Im wyższy stosunek, tym wyższa polaryzacja błony mitochondrialnej, co świadczy o wysokiej żywotności. Wysiano 104 komórek ARPE-19 na dołek płytki 96-dołkowrej z czarnymi ściankami i przezroczystym dnem. Następnego dnia przygotowywano świeży stężony roztwór roboczy NaIO3 o stężeniu 400 mM poprzez rozpuszczenie 50 mg NalO3 (Sigma-Aldrich, nr kat. 71702) w postaci proszku w 650 ąL czystej pożywki DMEM/F12. Następnie, przygotowywano medium indukujące stres oksydacyjny w komórkach. Medium składało się z DMEM/F12, 1% FBS oraz jodanu sodu (NalO3) w stężeniu 5 mM. Pożywkę w dołkach wymieniano na medium indukujące stres oksydacyjny. Komórki pozostawiano w inkubatorze na 24 godziny. Po tym czasie medium z jodanem sodu wymieniano na DMEM/F12 z dodatkiem FBS do końcowego stężenia 10% (v/v). W proporcji 1:4 (vnanokapsułki:vpożywki) do odpowiednich dołków dodawano zawiesiny nanocząstek HSA - 10 mg L-1 NT3 - 10 mg L-1 BDNF PEG, HSA - 20 mg L-1 NT3 - 20 mg L-1 BDNF - PEG albo buforu PBS (kontrola stresu). Jako “control” oznaczono dołek kontrolny, w którym komórki ARPE-19 nie były poddane stresowi oksydacyjnemu.
W celu określenia żywotności komórek w każdym z wariantów po 48 godzinach inkubacji z zawiesiną nanocząstek, przeprowadzano test JC-1 w sposób opisany w punkcie 1.3. przykładu “Badanie toksyczności zawiesiny nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG w modelu in vitro.”
1.3. Detekcja apoptozy przy użyciu cytometrii przepływowej w komórkach barwionych przy użyciu Aneksyny V - FITC/jodku propidyny (zestaw 556570, BD Biosciences)
W trakcie śmierci błona komórkowa staje się asymetryczna, co oznacza, że w środowisku zewnątrzkomórkowym pojawiają się nietypowe, nieeksponowane zwykle fragmenty błony. Jednym z nich jest fosfatydyloseryna, zlokalizowana wewnątrzkomórkowo w warunkach fizjologicznych. Do fosfatydyloseryny wiąże się silnie białko - aneksyna V. Aneksyna V rozpoznaje specyficznie komórki apoptotyczne w próbce, a dzięki dodaniu do białka izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) możliwa jest detekcja przy użyciu cytometrii przepływowej. Jodek propidyny jest naturalnie fluorescencyjnym, przestrzennie płaskim związkiem interkalującym w strukturę DNA. Jego akumulacja w komórkach charakterystyczna jest dla komórek nekrotycznych albo na późnym etapie apoptozy. Jednoczesne użycie aneksyny V i jodku propidyny pozwala rozpoznać w populacji komórki apoptotyczne oraz ocenić zaawansowanie procesu apoptozy.
Komórki wysiewano w 6-dołkowej płytce w ilości 2.5 x 105 komórek/dołek. Po 24 godzinach występnej inkubacji dodawano medium indukujące stres oksydacyjny, złożone z DMEM/F12 z 1% FBS oraz jodanem sodu w stężeniu 5 mM (roztwór NalO3 sporządzano zawsze na świeżo zgodnie z opisem powyżej). Komórki przenoszono z powrotem do inkubatora na 24 godziny. Po tym czasie medium z jodanem sodu wymieniano na DMEM/F12 z dodatkiem FBS do końcowego stężenia 10% (v/v). W proporcji 1:4 (vnanokapsułki:vpożywki) do odpowiednich dołków dodawano zawiesiny nanocząstek HSA - 10 mg L-1 NT3 - 10 mg L-1 BDNF - PEG, HSA - 20 mg L-1 NT3 - 20 mg L-1 BDNF - PEG albo buforu PBS (kontrola stresu). Jako “control” oznaczono dołek kontrolny, w którym komórki ARPE-19 nie były poddane stresowi oksydacyjnemu.
Po 48 godzinach inkubacji z nanocząstkami do komórek dodawano trypsynę (Gibco, nr katalogowy 25300054) i umieszczano w inkubatorze na 5 minut. Po tym czasie, trypsynę neutralizowano przy użyciu kompletnej pożywki DMEM/F12. Zawiesinę komórek przenoszono do podpisanych wcześniej probówek i wirowano 300 x g przez 5 minut (wirówka Eppendorf 5415R). Następnie komórki zawieszano w dołączonym do zestawu buforze ”Annexin V binding buffer”, i barwiono zgodnie z protokołem producenta. Wybarwione komórki analizowano bezzwłocznie przy pomocy cytometru przepływowego LSR II (BD Biosciences) przy użyciu oprogramowania CellQuest (BD Biosciences, USA).
1.3 Opis wyników i wnioski
Zaobserwowano, że komórki, których nie poddano stresowi oksydacyjnemu posiadają stosunek J-agregatów do J-monomerów na poziomie 19.2 ± 3.3, podczas gdy stosunek w komórkach po stresie jest znacznie obniżony i wynosi 10.0 ± 6.0 (Fig. 9). Dodanie do komórek ARPE-19 po stresie oksydacyjnym zawiesiny nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG, zwiększało stosunek (17.4 ± 1.4 oraz 17.1 ± 2.5 odpowiednio dla stężenia neurotrofin w nanocząstce 10 mg L-1 oraz 20 mg L-1), co świadczy o poprawie żywotności komórek w populacji pod wpływem nanocząstek. Po dodaniu zawiesiny HSA-NT3-BDNF-PEG żywotność komórek nie różniła się istotnie od żywotności komórek nie eksponowanych na stres oksydacyjny (kontrola).
Wyniki analizy apoptozy w komórkach leczonych i nieleczonych przy pomocy nanokapsułki HSA-NT3-BDNF-PEG (Fig. 10A) pokazały, że procent żywych komórek w populacji traktowanej zawiesiną nanocząstek (80,3 ± 5,6% oraz 80,0 ± 4,4% odpowiednio dla stężenia neurotrofin 10 mg L-1 oraz 20 mg L-1) jest istotnie wyższy niż w komórkach oznaczonych jako “5 mM NalO3”, do których dodano jedynie PBS (65.4 ± 3.7%). Odsetek komórek apoptotycznych pozostaje w zgodzie z obserwacją (Fig. 10B). Efekt ten nie był zależny od stężenia neurotrofin w cząstce.
Uzyskane wyniki świadczą o tym, że zawiesina nanocząstek posiada korzystne właściwości wspomagające regenerację komórek nabłonka barwnikowego siatkówki.
Przykład 7
W tym przykładzie wykonania kompozycja według wynalazku zawierająca kompleks elektrostatyczny HSA-NT3-BDNF-PEG charakteryzuje się następującym składem:
a) albumina surowicy ludzkiej w stężeniu 20 mg L-1,
b) BDNF w stężeniu 0,01 mg mL-1,
c) NT3 w stężeniu 0,01 mg mL-1,
d) glikol polietylenowy (PEG) w stężeniu 2 mg mL-1
e) płyn Ringera w objętości 21,6 mL
Przykład 8
W tym przykładzie wykonania kompozycja według wynalazku zawierająca kompleks elektrostatyczny HSA-NT3-BDNF-PEG charakteryzuje się następującym składem:
a) albumina surowicy ludzkiej w stężeniu 2 mg mL-1,
b) BDNF w stężeniu 0,001 mg mL-1,
c) NT3 w stężeniu 0,001 mg mL-1,
d) glikol polietylenowy (PEG) w stężeniu 0,2 mg mL-1
e) płyn Ringera w objętości 2,16 mL
Przykład 9
W tym przykładzie wykonania kompozycja według wynalazku zawierająca kompleks elektrostatyczny HSA-NT3-BDNF-PEG charakteryzuje się następującym składem:
a) albumina surowicy ludzkiej w stężeniu 200 mg mL-1,
b) BDNF w stężeniu 0,1 mg mL-1,
c) NT3 w stężeniu 0,1 mg mL-1,
d) glikol polietylenowy (PEG) w stężeniu 20 mg mL-1
e) płyn Ringera w objętości 216 mL
Przykład 10
Kinetyczne pomiary parametrów fizykochemicznych dotyczące stabilności według przykładów 7-9 wykonano zgodnie z procedurą wskazaną w przykładzie 1. Wyniki sumarycznie przedstawiono w Tabeli 4 poniżej:
PL 248905 Β1
Tabela 4. Parametry? fizykochemiczne nanocząstek HSA-NT3-BDNF-PEG w kompozycjach według przykładu 7-9
Oceniany parametr Wartość liczbowa +/-SD
pH od 4,90 do 5,10
Średnica nanocząstek, (Size) [nmj Peakl od 5 do 10
Peak 2 od 30 do 60
Peak 3 od 0 do 500
Stężenie nanocząstek, (Particie concentration) Iparticle/niLI Peak 1 od 1 xl017 do 2xl017
Peak 2 od 1 xl012 do 6xl012
Peak 3 od0do4xl07
Potencjał zeta cząstek (Mean zeta potential) [mV1 od - 2 do -15
Literatura
Arora, Sanjay, Takahisa Kanekiyo, i Jagdish Singh. 2022. „Functionalized NanoparticlesforBrain Targeted BDNF Gene Therapy to Rescue Alzheimer’s Disease Pathology in Transgenic Mouse Model”. International Journal of Biological Macromolecules 208 (maj): 901-11.
https://doi.Org/10.1016/j.ijbiomac.2022.03.203.
Arranz-Romera, Alicia, Maria Hernandez, Patricia Checa-Casalengua, Alfredo Garcia-Layana, Irene T. Molina-Martinez, Sergio Recalde, Michael J. Young, i in. 2021. „A Safe GDNF and GDNF/BDNF Controlled Delivery System lmproves Migration in Humań Retinal Pigment Epithelial Cells and Survival in Retinal Ganglion Cells: Potential Usefulness in Degenerative Retinal Pathologies”. Pharmaceuticals 14 (1): 50. https://doi.org/10.3390/ph14010050.
Budenz, Cameron L., Hin Tung Wong, Donald L. Swiderski, Seiji B. Shibata, Bryan E. Pfingst, i Yehoash Raphael. 2015. „Differential Effects of AAV.BDNF and AAV.Ntf3 in the Deafened Adult Guinea Pig Ear”. Scientific Reports 5 (marzec): 8619. https://doi .org/10.103 8/srep08619.
Chan, Chi-Ming, Duen-Yi Huang, Ponarulselvam Sekar, Shu-Hao Hsu, i Wan-Wan Lin. 2019. „Reactive Oxygen Species-Dependent Mitochondrial Dynamics and Autophagy Confer Protective Effects in Retinal Pigment Epithelial Cells against Sodium lodate-lnduced Celi Death”. Journal of Biomedical Science 26 (1): 40. https://doi.org/10.1186/s12929-019-0531-z.
Dąbkowska Maria, Karolina Łuczkowska, Dorota Rogińska, Anna Sobuś, Monika Wasilewska, Zofia Ulańczyk, i Bogusław Machaliński. 2020. „Novel Design of (PEG-Ylated)PAMAM-Based Nanoparticles for Sustained Delivery of BDNF to Neurotoxin-lnjured Differentiated Neuroblastoma Cells”. Journal of Nanobiotechnology 18 (1): 120. https://doi.org/10.1186/sl2951-020-00673-8.
Fahrlander, E., S. Schelhaas, A. H. Jacobs, i K. Langer. 2015. „PEGylated Humań Serum Albumin (HSA) Nanoparticles: Preparation, Characterization and Ouantification of the PEGylation Extent”. Nanotechnology 26 (14): 145103. https://doi.org/10.1088/0957-4484/26/14/145103.
Han, Haijie, Su Li, Mingyu Xu, Yueyang Zhong, Wenjie Fan, Jingwei Xu, Tinglian Zhou, Jian Ji, Juan Ye, i Ke Yao. 2023. „Polymer- and Lipid-Based Nanocarriers for Ocular Drug Delivery: Current Status and Futurę Perspectives”. Advanced Drug Delivery Reviews 196 (maj): 114770. https://doi.org/10.1016/j.addr.2O23.114770.
Liao, David S., Federico V. Grossi, Delphine El Mehdi, Monica R. Gerber, David M. Brown, Jeffrey S. Heier, Charles C. Wykoff, i in. 2020. „Complement C3 Inhibitor Pegcetacoplan for Geographic Atrophy Secondary to Age-Related Macular Degeneration: A Randomized Phase 2 Trial”. Ophthalmology 127 (2): 186-95. https://doi.org/10.1016/j.ophtha.2019.07.011.
Liu, Binghua, Weiyan Wang, Arman Shah, Meng Yu, Yang Liu, Libo He, Jinye Dang, i in. 2021. „Sodium lodate Induces Ferroptosis in Human Retinal Pigment Epithelium ARPE-19 Cells”. Cell Death & Disease 12 (3): 230. https://doi.org/10.1038/s41419-021-03520-2.
Lopes, Catia D.F., Nadia P. Gonęalves, Carla P. Gomes, Maria J. Saraiva, i Ana P. Pego. 2017. „BDNF Gene Delivery Mediated by Neuron-Targeted Nanoparticles Is Neuroprotective in Peripheral Nerve Injury”. Biomaterials 121 (marzec): 83-96. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2016.12.025.
Machaliński, Bogusław, Maria Dąbkowska, i Dorota Rogińska. 2018. Kompozycja do doszklistkowego podawania białka leczniczego. Urząd Patentowy Rzeczpospolitej Polskiej P.426662, issued 16 sierpień 2018.
Nadal-Nicolas, Francisco M., i S. Patricia Becerra. 2018. „Pigment Epithelium-derived Factor Protects Retinal Pigment Epithelial Cells Against Cytotoxicity “In Vitro””. W Retinal Degenerative Diseases, zredagowane przez John D. Ash, Robert E. Anderson, Matthew M. LaVail, Catherine Bowes Rickman, Joe G. Hollyfield, i Christian Grimm, 1074:457-64. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cham: Springer International Publishing. https://doi.org/10.1007/978-3- -319-75402-4_56.
Nagahara, Alan H., i Mark H. Tuszyński. 2011. „Potential Therapeutic Uses of BDNF in Neurological and Psychiatric Disorders”. Nature Reviews Drug Discovery 10 (3): 209-19. https://doi.org/10.103 8/nrd3366.
Ricci, Federico, Francesco Bandello, Pierluigi Navarra, Giovanni Staurenghi, Michael Stumpp, i Marco Zarbin. 2020. „Neovascular Age-Related Macular Degeneration: Therapeutic Management and New-Upcoming Approaches”. International Journal of Molecular Sciences 21 (21): 8242. https://doi.org/10.3390/ijms21218242.
Rosenblum, Sahar, Tenille N. Smith, Nancy Wang, Joshua Y. Chua, Erick Westbroek, Kendrick Wang, i Raphael Guzman. 2015. „BDNF Pretreatment of Human Embryonic-Derived Neural Stem Cells Improves Cell Survival and Functional Recovery after Transplantation in Hypoxic-Ischemic Stroke”. Cell Transplantation 24 (12): 2449-61. https://doi.org/10.3727/096368914X679354.
Saad, Leonide, i Ilyas Washington. 2016. „Can Vitamin A Be lmproved to Prevent Blindness Due to Age-Related Macular Degeneration, Stargardt Disease and Other Retinal Dystrophies?” W Retinal Degenerative Diseases, zredagowane przez Catherine Bowes Rickman, Matthew M. LaVail, Robert E. Anderson, Christian Grimm, Joe Hollyfield, i John Ash, 854:355-61.
Advances in Experimental Medicine and Biology. Cham: Springer International Publishing. https://doi.org/10.1007/978-3-319-17121-0_47.
Spada, Alessandra, Jaber Emami, Jack A. Tuszyński, i Afsaneh Lavasanifar. 2021. „The Uniqueness of Albumin as a Carrier in Nanodrug Delivery”. Molecular Pharmaceutics 18 (5): 1862-94. https ://doi.org/ 10.1021/acs.molpharmaceut. 1 c00046.
St Peter, Madeleine, Douglas E. Brough, Anna Lawrence, Jennifer Nelson-Brantley, Peixin Huang, Jennifer Harre, Athanasia Wamecke, i Hinrich Staecker. 2022. „Improving Control of Gene Therapy-Based Neurotrophin Delivery for Inner Ear Applications”. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 10: 892969. https://doi.org/10.3389/fbioe.2022.892969.
The BDNF Study Group (Phase III). 1999. „A Controlled Trial of Recombinant Methionyl Human BDNF in ALS”. Neurology 52 (7): 1427-1427. https://doi.org/10.1212/WNL.52.7T427

Claims (8)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Kompozycja farmaceutyczna do doszklistkowego podawania zawierająca co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, znamienna tym, że zawiera polielektrolit, którym jest glikol polietylenowy (PEG), nośnikiem jest albumina surowicy ludzkiej (HSA) a substancję aktywną stanowią neurotrofiny BDNF oraz NT3, przy czym neurotrofiny BDNF oraz NT3 są połączone elektrostatycznie z albuminą (HSA) oraz glikolem polietylenowym (PEG) tworząc kompleks elektrostatyczny HSA-NT3-BDNF-PEG.
  2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera albuminę surowicy ludzkiej w stężeniu 2-200 mg mL-1, (b) BDNF w stężeniu 0,001-0,1 mg mL-1, (c) NT3 w stężeniu 0,001-1 mg mL-1, (d) glikol polietylenowy (PEG) w stężeniu 0,2-20 mg mL-1.
  3. 3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera albuminę surowicy ludzkiej w stężeniu 20 mg mL-1, (b) BDNF w stężeniu 0,01 mg mL-1, (c) NT3 w stężeniu 0,01 mg mL-1, (d) glikol polietylenowy (PEG) w stężeniu 2 mg mL-1.
  4. 4. Kompozycja według dowolnego z poprzednich zastrz. od 1 do 3, znamienna tym, że zawiera płyn Ringera, korzystnie w objętości od 2,16 do 216 mL.
  5. 5. Kompleks elektrostatyczny zawierający co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, znamienny tym, że stanowi kompleks HSA-NT3-BDNF-PEG składający się z albuminy ludzkiej (HSA), neurotrofiny NT3, neutrofiny BDNF oraz glikolu polietylenowego (PEG).
  6. 6. Kompleks elektrostatyczny określony w zastrz. 5 do stosowania w zapobieganiu lub leczeniu chorób oczu.
  7. 7. Kompleks elektrostatyczny do stosowania według zastrz. 6, znamienny tym, że chorobą oczu jest choroba neurodegeneracyjna siatkówki oka, zwłaszcza zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD).
  8. 8. Kompleks elektrostatyczny do stosowania według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że jest on stosowany w kompozycji farmaceutycznej do podawania doszklistkowego, zwłaszcza w postaci kompozycji farmaceutycznej o stopniowym uwalnianiu neurotrofiny BDNF oraz NT3.
PL446343A 2023-10-10 2023-10-10 Kompozycja farmaceutyczna do doszklistkowego podawania zawierająca co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, kompleks elektrostatyczny zawierający co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik oraz jego zastosowanie PL248905B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL446343A PL248905B1 (pl) 2023-10-10 2023-10-10 Kompozycja farmaceutyczna do doszklistkowego podawania zawierająca co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, kompleks elektrostatyczny zawierający co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik oraz jego zastosowanie

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL446343A PL248905B1 (pl) 2023-10-10 2023-10-10 Kompozycja farmaceutyczna do doszklistkowego podawania zawierająca co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, kompleks elektrostatyczny zawierający co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik oraz jego zastosowanie

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL446343A1 PL446343A1 (pl) 2025-04-14
PL248905B1 true PL248905B1 (pl) 2026-02-09

Family

ID=95337860

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL446343A PL248905B1 (pl) 2023-10-10 2023-10-10 Kompozycja farmaceutyczna do doszklistkowego podawania zawierająca co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, kompleks elektrostatyczny zawierający co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik oraz jego zastosowanie

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL248905B1 (pl)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL239642B1 (pl) * 2018-08-16 2021-12-20 Pomorski Univ Medyczny W Szczecinie Kompozycja do doszklistkowego podawania białka leczniczego

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL239642B1 (pl) * 2018-08-16 2021-12-20 Pomorski Univ Medyczny W Szczecinie Kompozycja do doszklistkowego podawania białka leczniczego

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DĄBKOWSKA, M.; ŁUCZKOWSKA, K.; ROGIŃSKA, D.; SOBUŚ, A.; WASILEWSKA, M.; ULAŃCZYK, Z.; MACHALIŃSKI, B.: "J. Nanobiotechnol. 2020, 18, 120", NOVEL DESIGN OF (PEG-YLATED)PAMAM-BASED NANOPARTICLES FOR SUSTAINED DELIVERY OF BDNF TO NEUROTOXIN-INJURED DIFFERENTIATED NEUROBLASTOMA CELLS, DOI: doi.org/10.1186/s12951-020-00673-8 *
M. DĄBKOWSKA, A. KOSIOROWSKA, B. MACHALIŃSKI: "Pharmaceutics 15 (2023) 2236", THE IMPACT OF SERUM PROTEIN ADSORPTION ON PEGYLATED NT3–BDNF NANOPARTICLES—DISTRIBUTION, PROTEIN RELEASE, AND CYTOTOXICITY IN A HUMAN RETINAL PIGMENTED EPITHELIAL CELL MODEL, DOI: doi.org/10.3390/pharmaceutics15092236 *
ST PETER, MADELEINE, DOUGLAS E. BROUGH, ANNA LAWRENCE, JENNIFER NELSON-BRANTLEY, PEIXIN HUANG, JENNIFER HARRE, ATHANASIA WARNECKE,: "Frontiers in Bioengineering and Biotechnology (2022) 10: 892969", IMPROVING CONTROL OF GENE THERAPY-BASED NEUROTROPHIN DELIVERY FOR INNER EAR APPLICATIONS, DOI: doi.org/10.3389/fbioe.2022.892969 *

Also Published As

Publication number Publication date
PL446343A1 (pl) 2025-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. A superoxide dismutase/catalase mimetic nanomedicine for targeted therapy of inflammatory bowel disease
Bauleth‐Ramos et al. Nutlin‐3a and cytokine co‐loaded spermine‐modified acetalated dextran nanoparticles for cancer chemo‐immunotherapy
Fornaguera et al. Galantamine-loaded PLGA nanoparticles, from nano-emulsion templating, as novel advanced drug delivery systems to treat neurodegenerative diseases
Shahabi et al. Enhancing cellular uptake and doxorubicin delivery of mesoporous silica nanoparticles via surface functionalization: effects of serum
Lozano et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia‐reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function
Pawar et al. Improved chemotherapy against breast cancer through immunotherapeutic activity of fucoidan decorated electrostatically assembled nanoparticles bearing doxorubicin
Xu et al. A hydrogel-based tumor model for the evaluation of nanoparticle-based cancer therapeutics
Chandasana et al. Corneal targeted nanoparticles for sustained natamycin delivery and their PK/PD indices: an approach to reduce dose and dosing frequency
EP3233056B1 (en) Sunitinib formulations and methods for use thereof in treatment of ocular disorders
Gong et al. Hyaluronic acid modified doxorubicin loaded Fe 3 O 4 nanoparticles effectively inhibit breast cancer metastasis
Zhao et al. Dual-functional lipid polymeric hybrid pH-responsive nanoparticles decorated with cell penetrating peptide and folate for therapy against rheumatoid arthritis
US20110189291A1 (en) Dendrimer hydrogels
Yu et al. Nanostructured lipid carrier (NLC)-based novel hydrogels as potential carriers for nepafenac applied after cataract surgery for the treatment of inflammation: design, characterization and in vitro cellular inhibition and uptake studies
Supe et al. Liposome-polyethylenimine complexes for the effective delivery of HuR siRNA in the treatment of diabetic retinopathy
In't Veld et al. Photodynamic cancer therapy enhances accumulation of nanoparticles in tumor-associated myeloid cells
Cotto et al. Cationic-motif-modified exosomes for mRNA delivery to retinal photoreceptors
Üstündağ Okur et al. Development and characterization of voriconazole loaded in situ gel formulations for ophthalmic application Oküler uygulama için vorikonazol yüklü in situ jel formülasyonlarının geliştirilmesi ve karakterizasyonu
Jia et al. Effective gene delivery of sh BMP-9 using polyethyleneimine-based core–shell nanoparticles in an animal model of insulin resistance
CN115282287B (zh) 一种蛋白纳米递送体系及其构建方法和应用
US20200016195A1 (en) Water-soluble nanoceria and methods of making and using the same
Cheng et al. Hyaluronic acid/silk fibroin nanoparticles loaded with methotrexate for topical treatment of psoriasis
Liu et al. Lysosome-Targeting Nanochimeras Attenuating Liver Fibrosis by Interconnected Transforming Growth Factor-β Reduction and Activin Receptor-Like Kinase 5 Degradation
Huang et al. cRGD-conjugated bilirubin nanoparticles alleviate dry eye disease via activating the PINK1-mediated mitophagy
Dang et al. Colloid‐Forming Prodrug‐Hydrogel Composite Prolongs Lower Intraocular Pressure in Rodent Eyes after Subconjunctival Injection
Perez et al. Improved antitumor effect of paclitaxel administered in vivo as pH and glutathione-sensitive nanohydrogels