PL248607B1 - Sposób wytwarzania wielowarstwowej kompozytowej pianki - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób wytwarzania wielowarstwowej kompozytowej pianki o podwyższonych właściwościach biologicznych i ograniczonej rozpuszczalności na bazie biopolimerów i przy wykorzystaniu liofilizacji, która charakteryzuje się tym, że sporządza się roztwór biopolimeru, o stężeniu w zakresie od 3% do 5%, poddaje się go mrożeniu w temperaturze w zakresie od -24°C do -45°C w czasie 12 h lub 24 h godzin, po czym poddaje się go liofilizacji, po czym przygotowaną piankę zanurza się w roztworze innego biopolimeru lub mieszanki biopolimerów w określonych proporcjach i stężeniu w zakresie od 3% do 5%, zawierającej dodatek substancji aktywnej w ilości 0,5% — 3% w stosunku do masy biopolimeru, poddaje się go mrożeniu w temperaturze w zakresie od -24°C do -45°C w czasie 12 h lub 24 h godzin, po czym tak przygotowany materiał poddaje się liofilizacji, następnie otrzymaną piankę poddaje się modyfikacji powierzchniowej metodą osadzania warstwy atomowej z użyciem tlenku tytanu stosując liczbę cykli depozycji z zakresu 150 — 1600.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wielowarstwowej kompozytowej pianki mającej na celu podwyższenie jej właściwości biologicznych i ograniczenie rozpuszczalności. Wynalazek znajduje zastosowanie zwłaszcza w medycynie regeneracyjnej, inżynierii tkankowej oraz w zabiegach sterowanej regeneracji kości i tkanek (GBTR).

Z opisu patentowego nr PL221277B1 znany jest sposób wytwarzania wysokoporowatej pianki z alginianu sodu, soli metalu dwuwartościowego kwasu alginowego lub kwasu alginowego. Pianki te przeznaczone są do celów medycznych i charakteryzują się podwyższoną sorpcją wilgoci i rozpuszczalnością w wodzie. Próbki zostały zamrożone w temperaturze -32°C, a następnie poddane liofilizacji.

W opisie patentowym US 5840777 opisany został sposób wytwarzania pianek z polisacharydów, takich jak alginian, chitozan, skrobia czy hialuronian. Do wodnego roztworu polisacharydu wprowadzany jest gaz, stanowiący środek porotwórczy oraz addytywny środek porotwórczy w postaci jonowego lub niejonowego surfaktantu, np. stearynian lub laurylosiarczan sodu. W zależności od zastosowanych dodatków uzyskany produkt może mieć różną grubość, wielkość i rozkład porów oraz możliwa jest kontrola jego rozpuszczalności.

Z opisu patentowego US 5851461 znane jest wytwarzanie pianek z polisacharydów (alginian, chitozan, skrobia, hialuronian) do zastosowań jako materiały opatrunkowe. Metoda formowania pianek polega na sporządzeniu wodnego roztworu polisacharydu i stabilizatora (stearynian amonu, alkohol dodecylowy) i wprowadzeniu do niego gazu. Następnie produkt jest suszony gorącym powietrzem i sieciowym bądź koagulowany dwu- lub trójwartościowym środkiem kationowym. Możliwe jest również uzyskanie pianki nierozpuszczalnej w wodzie poprzez umieszczenie jej w wodnym roztworze jednowartościowego kationu, a następnie wypłukanie w roztworze zawierającym alkohol.

W opisie patentowym AU 2019246910B2 ujawniono sposób wytwarzania sprężystej pianki zawierającej polianionowy polisacharyd, o strukturze otwartoporowej. Produkt ten po kontakcie z wodą tworzy tiksotropowy hydrożel, który może być nakładany na ranę lub tkankę jako opatrunek. Możliwe jest zastosowanie dowolnego polianionowego polisacharydu, odpowiedniego do produkcji estrów polisacharydowych, np. karboksymetylocelulozę, karboksymetylomielozę, alginian, heparynę, siarczan heparyny lub dowolną ich kombinację.

Makroporowate pianki alginianowe o połączonej strukturze porów zostały wytworzone przez połączenie techniki liofilizacji ze spienianiem gazowym, co zostało opisane w czasopiśmie Carbohydrate Polymers, 202, 72-83 (2002). Alginian usieciowano mieszaniną jonów Sr²⁺ i Ca²⁺. Badania biologiczne wykazały, że wytworzone rusztowania zwiększają proliferację komórek (Catanzano et al., 2018).

Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania wielowarstwowej kompozytowej pianki, która charakteryzuje się podwyższonymi właściwościami biologicznymi i ograniczoną rozpuszczalnością. Sposób według wynalazku umożliwia otrzymanie kompozytowej pianki na bazie biopolimerów o podwyższonych właściwościach biologicznych oraz ograniczonej rozpuszczalności. Wzrost właściwości biologicznych pianki wytworzonej sposobem według wynalazku następuje w wyniku zastosowania dodatku substancji aktywnych w tworzywie pianki, a ograniczenie rozpuszczalności następuje w wyniku zastosowania modyfikacji powierzchniowej z użyciem tlenku tytanu.

Sposób wytwarzania wielowarstwowej kompozytowej pianki na bazie biopolimerów i przy wykorzystaniu liofilizacji według wynalazku charakteryzują się tym, że sporządza się roztwór biopolimeru, o stężeniu w zakresie od 3% do 5%, w postaci wodnego roztworu kolagenu rybiego o masie cząsteczkowej od 500 do 2000 Da, ewentualnie zawierającego 1,5% alginianu sodu oraz 5% żelatyny, oba w stosunku do wagi kolagenu, otrzymanego poprzez zmieszanie go z wodą destylowaną w ilości do 1 dm³, kolejno roztwór odgazowuje się pozostawiając go na 24 h, następnie poddaje się go mrożeniu w temperaturze w zakresie od -24°C do -45°C w czasie 12 h lub 24 h godzin, po czym poddaje się go liofilizacji w temperaturze półki -50°C, po czym przygotowaną piankę zanurza się w wodnym roztworze hialuronianu sodu o stężeniu 3% i masie cząsteczkowej 1,8-2,0 MDa, ewentualnie zawierającym dodatek substancji aktywnej w postaci wyciągu z aloesu w ilości 1% m/m otrzymanego poprzez zmieszanie go z wodą destylowaną w ilości do 1 dm³, kolejno roztwór odgazowuje się pozostawiając go na 24 h, następnie poddaje się go mrożeniu w temperaturze w zakresie od -24°C do -45°C w czasie 12 h lub 24 h godzin, po czym tak przygotowany materiał poddaje się liofilizacji w temperaturze półki -50°C, następnie otrzymaną piankę poddaje się modyfikacji powierzchniowej metodą osadzania warstwy atomowej z użyciem tlenku tytanu stosując liczbę cykli depozycji z zakresu 150-1600.

Sposobem według wynalazku powstała wielowarstwowa kompozytowa pianka w postaci rusztowania zawierająca trzy warstwy funkcjonalne. Pierwsza, stanowiąca podstawę rusztowania, składa się z biopolimerów białkowych, jednocześnie imitujących strukturę macierzy pozakomórkowej (ECM). Druga warstwa, służąca do utrzymania sprzyjającego środowiska, wilgotności, elastyczności oraz wspomagająca wzrost i proliferację komórek, wytworzona jest na bazie kwasu hialuranowego i innych biopolimerów oraz wzbogacona jest o wybrane związki aktywne. Trzecia warstwa stanowi funkcjonalną powłokę o właściwościach bakteriobójczych, bakteriostatycznych i redukujących hydrofilowość, którą otrzymano w wyniku modyfikacji tlenkiem tytanu.

Zaletą kompozytowej pianki wytworzonej sposobem zgodnie z wynalazkiem jest jej wielowarstwowa i kompozytowa struktura, mająca za zadanie imitować naturalnie występujące tkanki, jak również zastosowanie do jej wytworzenia biokompatybilnych polimerów o wyjątkowych właściwościach biologicznych oraz zastosowanie modyfikacji powierzchniowej w celu ograniczenia rozpuszczalności materiału w warunkach biologicznych. Tak przygotowane kompozytowe pianki mogą służyć jako rusztowania do hodowli komórkowych, charakteryzujące się podwyższonymi właściwościami biologicznymi i bardziej korzystnymi właściwościami powierzchniowymi względem rusztowań niemodyfikowanych.

Sposób według wynalazku ilustrują poniższe przykłady z powołaniem się na rysunek, na którym Fig. 1 przedstawia wykres widma FTIR-ATR wielowarstwowych pianek z różną grubością naniesienia TiO2 po 200, 600 i 1200 cykli naniesienia, Fig. 2 - strukturę mikroskopową, Fig. 3 - elementarny skład chemiczny powierzchni kompozytowej pianki po 1200 cyklach naniesienia TO2 za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej oraz mikroanalizy rentgenowskiej EDS, Fig. 4 - analizę rozpuszczalności pianek w roztworze PBS.

Przykład 1

Przygotowano wodny roztwór kolagenu rybiego o masie cząsteczkowej 500 Da i stężeniu 5% zawierający 1,5% alginianu sodu oraz 5% żelatyny, oba w stosunku do wagi kolagenu. W tym celu naważkę 5 g kolagenu, 0,075 g alginianiu oraz 0,25 g żelatyny wprowadzano małymi porcjami do 1 dm³ wody destylowanej przy jednoczesnym mieszaniu mieszadłem mechanicznym w temperaturze pokojowej. Po uzyskaniu jednorodnego roztworu całość pozostawiano na 24 h w celu odgazowania. Tak przygotowany roztwór przelano do pojemników do mrożenia i mrożono w temperaturze -45°C w czasie 24 h godzin, po czym materiał poddano liofilizacji w temperaturze półki -50°C.

Po procesie liofilizacji przygotowaną piankę zanurza się we wcześniej przygotowanym wodnym roztworze hialuronianu sodu o stężeniu 3% i masie cząsteczkowej 1,8-2,0 MDa, zawierającym dodatek substancji czynnej - 1% m/m wyciągu z aloesu. W tym celu naważkę 3 g hialuronianu sodu oraz 0,03 g wyciągu z aloesu wprowadzano małymi porcjami do 1 dm³ wody destylowanej przy jednoczesnym mieszaniu mieszadłem mechanicznym, w temperaturze pokojowej. Po uzyskaniu jednorodnego roztworu całość pozostawiono na 24 h w celu odgazowania. Zanurzoną piankę kolagenową w roztworze hialuronianu sodu poddaje się mrożeniu w specjalnie do tego przeznaczonych pojemnikach o średnicy 6 cm w temperaturze -45°C w czasie 24 h godzin, po czym materiał poddaje się liofilizacji w temperaturze półki -50°C.

Następnie otrzymaną piankę poddaje się modyfikacji powierzchniowej metodą osadzania warstwy atomowej (ALD - z ang. atomie layer deposition) z użyciem tlenku tytanu stosując liczbę cykli depozycji 1200.

W celu zbadania budowy chemicznej kompozytów otrzymanych według przykładu wykonano ich widma FTIR korzystając z przystawki wielokrotnego odbicia (ATR). Analiza FTIR-ATR została przeprowadzona za pomocą urządzenia Thermo Scientific, Nicolet 6700, rozdzielczość pomiarowa wynosiła 4 nm, a w trakcie pomiaru zostały wykonane 32 skany. Wyniki analizy ilustruje Fig. 1.

Na spektrogramach obserwuje się niewielkie zmiany pasm absorpcyjnych typowe dla modyfikacji typu niesień powierzchniowych tj. podwyższenie linii widma w zakresie 700-1100 cm^-1 oraz pojawianie się nowych pasm ok. 1110, 895, 820 i 740 cm^-1 pochodzące od naniesionego TO2. Porównując widma FTIR-ATR pianki niemodyfikowanej oraz widma pianki otrzymanej według przykładu z różną liczbą cykli nanoszenia, zaobserwowano wzrost ww. pasm wraz ze wzrostem liczby cykli nanoszenia do 1200. Zauważono sukcesywne podwyższanie widma w zakresie ok. 1000-850 cm^-1 co jest efektem nanoszenia warstw TO2 metodą ALD. Jednocześnie następuje maskowanie pasm pochodzących od niemodyfikowanej tą metodą pianki w zakresie ok. 1000-1200 cm^-1.

Zbadano budowę chemiczną oraz strukturę makroskopową kompozytowych pianek przed i po depozycji TiO2 otrzymanych według opisu w przykładzie. Strukturę makroskopową kompozytu otrzymanego zgodnie z opisem w przykładzie zbadano wykorzystując skaningowy mikroskop elektronowy Nova NanoSEM 230 firmy FEI (działo typu FEG - emisja polowa) doposażonego w mikroanalizator rentgenowski typu EDS model Apollo 40 SDD firmy EDAX. Zdjęcia z mikroskopu skaningowego pianki przedstawiono na Fig. 2. W obrazie mikroskopowym widoczna jest warstwowa i porowata struktura wytworzonych pianek. Widmo EDS przedstawione na Fig. 3 potwierdza obecność warstwy tlenku tytanu na powierzchni pianek, a mapy chemiczne potwierdzają równomierne pokrycie powierzchni depozytem.

Zbadano proces rozpuszczalności wytworzonych pianek modyfikowanych tlenkiem tytanu, co przedstawia Fig. 4. W tym celu próbki po procesie depozycji oraz próbkę referencyjną poddano badaniom rozpuszczalności w roztworze PBS. Proces prowadzono w temperaturze pokojowej. Każda z próbek została umieszczona na szalce Petriego i zalana ok. 10 ml roztworu PBS. Ocena polegała na obserwacji zmian w wyglądzie próbek poddanych działaniu roztworu PBS. Na podstawie poczynionych można stwierdzić, iż proces depozycji TO2 znacząco ograniczył proces rozpuszczania materiału. Po okresie 16 dni próbka niemodyfikowana wygląda jak hydrożel bez widocznej struktury, natomiast próbki po depozycji pomimo dużego spęcznienia nadal zachowały strukturę pianki.

Przykład 2

Przygotowano wodny roztwór kolagenu rybiego o masie cząsteczkowej 1000-2000 Da i stężeniu 3%. W tym celu naważkę 3 g kolagenu wprowadzano małymi porcjami do 1 dm³ wody destylowanej przy jednoczesnym mieszaniu mieszadłem mechanicznym, w temperaturze pokojowej. Po uzyskaniu jednorodnego roztworu całość pozostawiano na 24 h w celu odgazowania. Tak przygotowany roztwór przelano do pojemników do mrożenia i mrożono w temperaturze -24°C w czasie 12 h godzin, po czym materiał poddano liofilizacji w temperaturze półki -50°C.

Po procesie liofilizacji przygotowaną piankę zanurza się we wcześniej przygotowany m wodnym roztworze hialuronianu sodu o stężeniu 3% i masie cząsteczkowej 1,8-2,0 MDa. W tym celu naważkę 3 g hialuronianu sodu wprowadzano małymi porcjami do 1 dm³ wody destylowanej przy jednoczesnym mieszaniu mieszadłem mechanicznym, w temperaturze pokojowej. Po uzyskaniu jednorodnego roztworu całość pozostawiano na 24 h w celu odgazowania. Zanurzoną piankę kolagenową w roztworze hialuronianu poddaje się mrożeniu w specjalnie do tego przeznaczonych pojemnikach o średnicy 6 cm w temperaturze -24°C w czasie 12 h godzin, po czym materiał poddano liofilizacji w temperaturze półki -50°C.

Następnie otrzymaną piankę poddaje się modyfikacji powierzchniowej metodą osadzania warstwy atomowej (ALD - z ang. atomie layer deposition) z użyciem tlenku tytanu stosując liczbę cykli depozycji 1200.

Claims (1)

1. Sposób wytwarzania wielowarstwowej kompozytowej pianki na bazie biopolimerów i przy wykorzystaniu liofilizacji znamienny tym, że sporządza się roztwór biopolimeru, o stężeniu w zakresie od 3% do 5%, w postaci wodnego roztworu kolagenu rybiego o masie cząst eczkowej od 500 do 2000 Da, ewentualnie zawierającego 1,5% alginianu sodu oraz 5% żelatyny, oba w stosunku do wagi kolagenu, otrzymanego poprzez zmieszanie go z wodą destylowaną w ilości do 1 dm³, kolejno roztwór odgazowuje się pozostawiając go na 24 h, następnie poddaje się go mrożeniu w temperaturze w zakresie od -24°C do -45°C w czasie 12 h lub 24 h godzin, po czym poddaje się go liofilizacji w temperaturze półki -50°C, po czym przygotowaną piankę zanurza się w wodnym roztworze hialuronianu sodu o stężeniu 3% i masie cząsteczkowej 1,8-2,0 MDa, ewentualnie zawierającym dodatek substancji aktywnej w postaci wyciągu z aloesu w ilości 1% m/m otrzymanego poprzez zmieszanie go z wodą destylowaną w ilości do 1 dm³, kolejno roztwór odgazowuje się pozostawiając go na 24 h, następnie poddaje się go mrożeniu w temperaturze w zakresie od -24°C do -45°C w czasie 12 h lub 24 h godzin, po czym tak przygotowany materiał poddaje się liofilizacji w temperaturze półki -50°C, następnie otrzymaną piankę poddaje się modyfikacji powierzchniowej metodą osadzania warstwy atomowej z użyciem tlenku tytanu stosując liczbę cykli depozycji z zakresu 150-1600.