PL248487B1

PL248487B1 - Sposób wytwarzania makroporowatego implantu kostnego na bazie zeolitu Na-X sfunkcjonalizowanego za pomocą chitozanu

Info

Publication number: PL248487B1
Application number: PL449568A
Authority: PL
Inventors: Paulina Kazimierczak; Agata Przekora-Kuśmierz; Alicja Wójcik; Wojciech Franus; Jakub Matusiak; Rafał Panek
Original assignee: Lubelska Polt; Univ Medyczny W Lublinie
Priority date: 2024-08-22
Filing date: 2024-08-22
Publication date: 2025-12-15
Also published as: PL449568A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest makroporowaty implant kostny według wynalazku, który charakteryzuje się tym, że stanowi go chitozan, agaroza, hydroksyapatyt w postaci proszku lub nanoproszku oraz zeolit Na-X sfunkcjonalizowany za pomocą chitozanu (Na-X-chitozan) w postaci proszku lub nanoproszku, rozprowadzone w 2% (v/v) wodnym roztworze kwasu octowego, przy czym proporcje wagowe stałych komponentów wynoszą odpowiednio 2% (w/v) chitozanu, 5% (w/v) agarozy, 20% (w/v) hydroksyapatytu w postaci proszku lub nanoproszku oraz 20% (w/v) zeolitu Na-X-chitozan w postaci proszku lub nanoproszku w odniesieniu do kwasu octowego. Zgłoszenie obejmuje też sposób wytwarzania implantu kostnego według wynalazku, który polega na tym, że agarozę, hydroksyapatyt w postaci proszku lub nanoproszku oraz zeolit Na-X sfunkcjonalizowany za pomocą chitozanu (Na-X-chitozan) w postaci proszku lub nanoproszku rozprowadza się w roztworze chitozanu przygotowanym w kwasie octowym. Następnie do jednolitej masy dodaje się wodorowęglan sodu (NaHCO3) jako porogen. Otrzymany rodzaj pasty poddaje się działaniu wysokiej temperatury, a następnie zamrożeniu oraz procesowi liofilizacji. Po liofilizacji, otrzymany biomateriał namacza się w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) i suszy na powietrzu.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania makroporowatego implantu kostnego stymulującego regenerację na bazie sfunkcjonalizowanego zeolitu Na-X (Na-X-chitozan), hydroksyapatytu, agarozy i chitozanu do zastosowań w medycynie regeneracyjnej kości. Otrzymany według wynalazku biomateriał może znaleźć zastosowanie jako implant kostny do leczenia złamań kości o różnej etiologii, który będzie wspierał adhezję osteoblastów (komórek kościotwórczych) i ich aktywność kościotwórczą.

W rozwijającej i starzejącej się populacji wciąż występuje wiele przypadków ciężkich złamań kości, które wymagają interwencji chirurgicznej z zastosowaniem biomateriału wspierającego regenerację tkanki w miejscu implantacji. Dotychczas nie zostały opracowane i opisane w dostępnej literaturze naukowej implanty kostne zawierające w swoim składzie zeolity sfunkcjonalizowane za pomocą chitozanu, bioceramikę fosforanowo-wapniową, agarozę oraz chitozan.

Przedmiotem wynalazku jest implant kostny zawierający w swoim składzie zeolit typu X (Na-X) sfunkcjonalizowany za pomocą chitozanu (Na-X-chitozan), hydroksyapatyt, agarozę oraz chitozan. Zastosowanie połączenia zeolitu Na-X z chitozanem stwarza korzystne mikrośrodowisko wspierające procesy kościotwórcze. Chitozan to polimer pochodzenia naturalnego stosowany w wielu aplikacjach medycznych ze względu na cenne biologiczne właściwości, takie jak brak toksyczności, biokompatybilność, biodegradowalność, hydrofilowość oraz działanie bakteriostatyczne, bakteriobójcze i przeciwgrzybicze (Chung Y.C., Chen C.Y., Bioresource Technology, 99 (8), 2806-2814, 2008). Istnieje jednak potrzeba poprawy jego właściwości mechanicznych, zwłaszcza w zastosowaniach inżynierii tkankowej kości. Osiągane jest to poprzez łączenie chitozanu z bioceramiką fosforanowo-wapniową (Raz M. i wsp., Silicon, 10(2), 277-286, 2018). Bioceramika fosforanowo-wapniowa obecna w rusztowaniach kostnych wpływa również korzystnie na potencjał osteokonduktywny oraz bioaktywny biomateriałów (Dhivya S. i wsp., Journal of Nanobiotechnology, 13:40, 2015).

Z opisu patentu PL242079B1 znany jest materiał w postaci stopu tytanu Ti6A14V z przeznaczeniem na implant kostny, który został pokryty warstwą zeolitową zawierającą bisfosfonian w postaci ryzedronianu. Sposób otrzymywania charakteryzuje się tym, że materiał tytanowy pokrywa się zeolitem poprzez umieszczenie w mieszaninie glinianu sodu, krzemianu sodu i wodorotlenku sodu w podwyższonej temperaturze, po czym materiał tytanowy poddaje się wymianie jonowej z jonami Ca²⁺, a następnie po wymianie jonowej, materiał tytanowy umieszcza się w roztworze ryzedronianu na jeden tydzień w temperaturze 35°C.

Znany jest sposób otrzymywania rusztowania kostnego złożonego z chitozanu, zeolitu zawierającego jony Ca²⁺, hydroksyapatytu oraz ryzedronianu sodu. Sposób produkcji biomateriału polega na wymieszaniu roztworu chitozanu w kwasie octowym z hydroksyapatytem oraz zeolitem o strukturze Ca-X, który otrzymano w wyniku wymiany jonowej z zeolitu komercyjnego Na-X. Otrzymaną masę poddano zamrożeniu i kolejno liofilizacji. Następnie zliofilizowany biomateriał poddano moczeniu w roztworze ryzedronianu sodu w celu jego adsorpcji na powierzchni rusztowania (M. Sandomierski i wsp., Int J Biol Macromol 223:812-820, 2022.

Z opisu patentu PL217897B1 znany jest sposób otrzymywania kompozytowych materiałów implantacyjnych opartych na fosforanie trójwapniowym (α-TCP) i chitozanie. Sposób charakteryzuje się tym, że do roztworu chitozanu w wodnym roztworze kwasu octowego, wprowadza się w jego skład modyfikujące jony Ca²⁺, Mg²⁺ i/lub PO4^3-, a następnie tak sporządzony roztwór dodaje się do wyjściowego proszku a-TCP.

Z opisu patentu PL235822B1 znany jest sposób otrzymywania makroporowatego rusztowania kostnego na bazie chitozanu w roztworze kwasu octowego oraz bioceramiki fosforanowo-wapniowej, które charakteryzuje się tym, że stanowi go chitozan, agaroza oraz bioceramika fosforanowo-wapniowa w postaci proszku lub nanoproszku, rozprowadzone w 0,5-3% wodnym roztworze kwasu octowego, przy czym proporcje wagowe stałych komponentów wynoszą odpowiednio 0,5-4% (w/v) chitozanu, 0,5-5% (w/v) agarozy oraz 1-70% (w/v) bioceramiki fosforanowo-wapniowej w odniesieniu do kwasu octowego.

Z opisu patentu PL227996B1 znany jest sposób wytwarzania materiału kompozytowego na bazie chitozanu, hydroksyapatytu i krzemionki, przeznaczonego na substytuty kości. Sposób otrzymywania materiału kompozytowego polega na tym, że roztwór wodny soli chitozanowej miesza się z nanoproszkiem hydroksyapatytowym oraz ewentualnie z glicerofosforanem wapnia za pomocą ultradźwięków do uzyskania homogenicznej pasty, którą wprowadza się następnie do zolu kwasu metakrzemowego.

Znany jest sposób wytwarzania rusztowania na bazie chitozanu i agarozy. Sposób obejmuje przygotowanie roztworu chitozanu w wodnym roztworze kwasu octowego oraz wodnego roztworu agarozy przygotowanego w temperaturze 90°C. Następnie do roztworu agarozy, dodawano roztwór chitozanu i całość zamrażano w temperaturze -80°C. Po zamrożeniu biomateriał liofilizowano. Otrzymany w ten sposób biomateriał zastosowano w inżynierii tkanki chrzęstnej (Merlin Rajesh Lal L.P. i wsp., Society For Biomaterials, 105(7), 1845-1855, 2017).

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania makroporowatego implantu kostnego, znamienny tym, że tworzy się zawiesinę w taki sposób, że do 2% (w/v) roztworu chitozanu przygotowanego w 2% (v/v) wodnym roztworze kwasu octowego, dodaje się kolejno:

- -5% (w/v) agarozy,

- -20% (w/v) hydroksyapatytu w postaci proszku lub nanoproszku

- -20% (w/v) zeolitu Na-X sfunkcjonalizowanego za pomocą chitozanu otrzymanego poprzez zmieszanie sproszkowanego zeolitu w stosunku 1 części proszku do 20 części (w/v) 1% roztworu chitozanu w 0,1 M kwasie octowym, do którego podczas mieszania dodaję się 20 mL roztworu NaOH (1 M) do uzyskania pH=9, a następnie otrzymany materiał suszy się i miele.

Tak otrzymaną zawiesinę miesza się do uzyskania jednorodnej masy oraz dodaje się 2% roztwór (w/v) NaHCO3 i ponownie miesza. W dalszej kolejności masę przenosi się do formy odpornej na wysoką i niską temperaturę, i formę inkubuje się w temperaturze 90-95°C, przez 15-25 minut, a następnie chłodzi w łaźni lodowej w temperaturze 4°C. W dalszej kolejności ostudzoną próbkę zamraża się w -80°C przez 12 godzin, a następnie liofilizuje się pod ciśnieniem 10^-2-10³ mbar przez 18 godzin lub do całkowitego wysuszenia. Ostatecznie po liofilizacji biomateriał wyjmuje się z formy, zanurza w buforze PBS na 5-15 minut do całkowitego namoczenia, po czym suszy w temperaturze pokojowej.

Korzystnym skutkiem wynalazku jest to, że ze względu na swoje bardzo dobre właściwości mikrostrukturalne i biologiczne, otrzymany według wynalazku implant kostny może znaleźć zastosowanie w leczeniu złamań kości o różnej etiologii, gdzie będzie sprzyjał procesom regeneracyjnym w miejscu implantacji.

Przedmiot wynalazku ilustrują przedstawione poniżej przykłady:

Przykład I

Do 0,04 g chitozanu dodano 2 ml 2% (v/v) wodnego roztworu kwasu octowego i mieszano. Do uzyskanej masy dodano 0,1 g agarozy, całość zmieszano, a następnie dodano 0,4 g hydroksyapatytu w postaci nanoproszku oraz 0,4 g zeolitu Na-X sfunkcjonalizowanego chitozanem w postaci proszku, otrzymanego w ten sposób, że przygotowuje się matrycę, w której skład wchodzi:

- -sproszkowany zeolit Na-X, który miesza się w proporcji 1 część proszku do 20 części (w/v) 1% roztworu chitozanu w kwasie octowym o stężeniu 0,1 M, po czym mieszając dodaje się wodnego roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 1 M w ilości 20 ml do uzyskania pH=9 a następnie zmodyfikowany zeolit odsącza się z roztworu, suszy i mieli otrzymując Na-X-chitozan.

Całość mieszano do uzyskania jednolitej masy. Następnie dodano 0,04 g NaHCO3, starannie wymieszano, po czym otrzymaną masę umieszczono w formie odpornej na działanie wysokiej i ultraniskiej temperatury. Formę inkubowano w łaźni wodnej w temperaturze 95°C przez 15 minut, a następnie ostudzono w łaźni lodowej w temperaturze 4°C. Ostudzony biomateriał umieszczono w zamrażarce w temperaturze -80°C na okres 12 godzin. Zamrożoną próbkę poddano procesowi liofilizacji w średniej próżni (6 x 10^-2 mbar) przez okres 18 godzin. Biomateriał wyciągnięto z formy, moczono 7 minut w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) i następnie pozostawiono na powietrzu w temperaturze pokojowej w celu wysuszenia.

Otrzymany implant kostny charakteryzuje się makroporowatą mikrostrukturą (0 porów > 100 μm, porowatość > 40%). Ocena cytotoksyczności w stosunku do osteoblastów linii komórkowej hFOB 1.19 zgodnie z normami ISO dla wyrobów medycznych (ISO 1099-5:2009 oraz ISO 10993-12:2012) wykazała, że otrzymany implant kostny jest nietoksyczny (żywotność komórek eksponowanych przez okres 24 godzin na ekstrakt z implantu wynosiła 82% w porównaniu do negatywnej kontroli cytotoksyczności). Na podstawie przeprowadzonych badań udowodniono również, że otrzymany implant sprzyja adhezji i proliferacji osteoblastów na jego powierzchni. Uwalnianie ryzedronianu z implantu do środowiska zachodzi tylko pod wpływem kwaśnego pH (< 6,0).

Przykład II

Do 0,08 g chitozanu dodano 4 ml 2% (v/v) wodnego roztworu kwasu octowego i mieszano. Do uzyskanej masy dodano 0,2 g agarozy, całość zmieszano, a następnie dodano 0,8 g hydroksyapatytu w postaci nanoproszku oraz 0,8 g zeolitu Na-X sfunkcjonalizowanego chitozanem w postaci nanoproszku, otrzymanego w ten sposób, że przygotowuje się matrycę, w której skład wchodzi:

- sproszkowany zeolit Na-X, który miesza się w proporcji 1 część proszku do 20 części (w/v) 1% roztworu chitozanu w kwasie octowym o stężeniu 0,1 M, po czym mieszając dodaje się wodnego roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 1 M w ilości 20 ml do uzyskania pH=9 a następnie zmodyfikowany zeolit odsącza się z roztworu, suszy i mieli otrzymując Na-X-chitozan.

Całość mieszano do uzyskania jednolitej masy. Następnie dodano 0,08 g NaHCO3, starannie wymieszano, po czym otrzymaną masę umieszczono w formie odpornej na działanie wysokiej i ultraniskiej temperatury. Formę inkubowano w łaźni wodnej w temperaturze 90°C przez 20 minut, a następnie ostudzono w łaźni lodowej w temperaturze 4°C. Ostudzony biomateriał umieszczono w zamrażarce w temperaturze -80°C na okres 12 godzin. Zamrożoną próbkę poddano procesowi liofilizacji w średniej próżni (6 x 10^-3 mbar) przez okres 18 godzin. Biomateriał wyciągnięto z formy, moczono 7 minut w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) i następnie pozostawiono na powietrzu w temperaturze pokojowej w celu wysuszenia.

Otrzymany implant kostny charakteryzuje się makroporowatą mikrostrukturą (0 porów > 100 μm, porowatość > 40%). Ocena cytotoksyczności w stosunku do osteoblastów linii komórkowej hFOB 1.19 zgodnie z normami ISO dla wyrobów medycznych (ISO 1099-5:2009 oraz ISO 10993-12:2012) wykazała, że otrzymany implant kostny jest nietoksyczny (żywotność komórek eksponowanych przez okres 24 godzin na ekstrakt z implantu wynosiła 80% w porównaniu do negatywnej kontroli cytotoksyczności). Na podstawie przeprowadzonych badań udowodniono również, że otrzymany implant sprzyja adhezji i proliferacji osteoblastów na jego powierzchni. Uwalnianie ryzedronianu z implantu do środowiska zachodzi tylko pod wpływem kwaśnego pH (< 6,0).

W przykładach przedstawiono jedyne możliwe zastosowanie proporcji poszczególnych składników wynalazku, które skutkuje optymalnymi właściwościami biologicznymi implantu oraz zachowaniem wysokiej żywotności komórek.

Claims

1. Sposób wytwarzania makroporowatego implantu kostnego, znamienny tym, że tworzy się zawiesinę w taki sposób, że do 2% (w/v) roztworu chitozanu przygotowanego w 2% (v/v) wodnym roztworze kwasu octowego, dodaje się kolejno:

- -5% (w/v) agarozy,

- -20% (w/v) hydroksyapatytu w postaci proszku lub nanoproszku

- -20% (w/v) zeolitu Na-X sfunkcjonalizowanego za pomocą chitozanu otrzymanego poprzez zmieszanie sproszkowanego zeolitu w stosunku 1 części proszku do 20 części (w/v) 1 % roztworu chitozanu w 0,1 M kwasie octowym, do którego podczas mieszania dodaję się 20 ml roztworu NaOH (1 M) do uzyskania pH=9, a następnie otrzymany materiał suszy się i miele, po czym tak otrzymaną zawiesinę miesza się do uzyskania jednorodnej masy oraz dodaje się 2% (w/v) roztwór NaHCO3 i ponownie miesza, zaś w dalszej kolejności masę przenosi się do formy odpornej na wysoką i niską temperaturę, i formę inkubuje się w temperaturze 90-95°C, przez 15-25 minut, a następnie chłodzi w łaźni lodowej w temperaturze 4°C, w dalszej kolejności ostudzoną próbkę zamraża się w -80°C przez 12 godzin, a następnie liofilizuje się pod ciśnieniem 10^-2-10³ mbar przez 18 godzin lub do całkowitego wysuszenia, ostatecznie po liofilizacji biomateriał wyjmuje się z formy, zanurza w buforze PBS na 5-15 minut do całkowitego namoczenia, po czym suszy w temperaturze pokojowej.