PL248345B1

PL248345B1 - Odwodorniona pochodna dipterokarpolu, sposób jej wytwarzania na drodze enzymatycznej oraz zastosowanie

Info

Publication number: PL248345B1
Application number: PL441592A
Authority: PL
Inventors: Agnieszka Wojtkiewicz; Maciej Szaleniec; Maciej Guzik; Justyna Prajsnar; Gabriela Pacek; Tomasz Witko; Olga Adamczyk; Daria Solarz-Keller
Original assignee: Inst Katalizy I Fizykochemii Powierzchni Im Jerzego Habera Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2022-06-29
Filing date: 2022-06-29
Publication date: 2025-12-01
Also published as: PL441592A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest odwodorniona pochodna dipterokarpolu o nazwie chemicznej 1-dehydrodipterokarpol o wzorze 1. Zgłoszenie obejmuje też sposób wytwarzania 1-dehydrodipterokarpolu na drodze enzymatycznej regioselektywnej dehydrogenacji dipterokarpolu. Zgłoszenie obejmuje również zastosowanie przedmiotowego związku jako leku w leczeniu nowotworów.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowa, nie opisana dotychczas w literaturze pochodna dipterokarpolu o nazwie chemicznej 1-dehydrodipterokarpol (A^1-dipterokarpol, dehydrodipterokarpol, 20e-hydroksydammara-23(24)-en-1,3-dion, o wzorze 1 (fig. 1), będąca odwodornioną formą pozyskaną w wyniku modyfikacji struktury naturalnego triterpenu, dipterokarpolu (20e-hydroksydammara-23(24)-en-3-onu), o wzorze 2 (fig. 2), metabolitu soku drzewa tropikalnego Dipterocarpus alatus oraz składnika łupin orzecha włoskiego Juglans mandshurica. Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania odwodornionej pochodnej dipterokarpolu o wzorze 1 na drodze enzymatycznej, regioselektywnej dehydrogenacji dipterokarpolu o wzorze 2. Wynalazek dotyczy również zastosowania 1-dehydrodipterokarpolu jako leku w leczeniu nowotworów.

Dipterokarpol jest związkiem naturalnym występującym np. w soku drzewa tropikalnego Dipterocarpus alatus czy łupinach orzecha włoskiego Juglans mandshurica. Sposób według wynalazku może znaleźć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym do wytwarzania związku o udowodnionej aktywności biologicznej. Związek 1-dehydrodipterokarpol nie był do tej pory opisany w literaturze. Jak dotąd brak także w literaturze opisu otrzymania nowej pochodnej dipterokarpolu przedstawionej we wzorze 1, będącej przedmiotem wynalazku. Będąca przedmiotem wynalazku nowa pochodna dipterokarpolu, 1-dehydrodipterokarpol, o wzorze sumarycznym C30H48O2, ma postać ciała stałego (żółtawe kryształy), jest słabo rozpuszczalna w wodzie, dobrze rozpuszczalna w alkoholu metylowym i etylowym oraz rozpuszczalnikach organicznych jak chloroform, chlorek metylu, aceton, octan etylu, tetrahydrofuran. Jej temperatura topnienia mieści się w przedziale 50-52°C.

Prekursor nowej pochodnej, dipterokarpol jest głównym metabolitem soku drzewa tropikalnego Dipterocarpus alatus, który również wykazuje aktywność biologiczną. D. alatus to wysokie drzewo lasów tropikalnych Azji, którego żywica wykorzystywana jest np. w medycynie tradycyjnej jako środek odkażający, antyseptyczny czy środek do leczenia chorób układu moczowo-płciowego. W pracy Smirnova I.E., i. in., Chem. Nat. Compd., 2019, 55, 883-889 udowodniono jego immunostymulujące i przeciwwirusowe właściwości. Z kolei w pracy Huong D.T.T. i in., Chem. Nat. Compd., 2013, 49, 58-65 wykazano działanie przeciwnowotworowe. Dodatkowo w pracy Zhou Y. Y. i in., J. Nat. Np., 2019, 73, 800-804 udowodniono, że dipterokarpol można otrzymać w wyniku izolacji z łupin orzecha włoskiego Juglans mandshurica.

Jak dotąd nie opisano w literaturze 1,2-odwodornienia dipterokarpolu lub innej pochodnej dammaranowej z zastosowaniem enzymu.

Opisana w wynalazku metoda dotyczy otrzymania 1-dehydrodipterokarpolu z dipterokarpolu w wyniku nieopisanej dotąd reakcji enzymatycznej z dehydrogenazą 3-ketosteroidową (AcmB2, Anaerobic cholesterol metabolism enzyme B 2, GeneBank: SMB21450) ze Sterolibacterium denitrificans Chol-1S w obecności zewnętrznego akceptora elektronowego biokatalizatora w środowisku wodnym.

Zgłoszenie patentowe PL 439727 ujawnia sposób enzymatycznej syntezy glochidonu z zastosowaniem AcmB2, stanowiąc jak dotąd jedyne doniesienie o użyciu tego katalizatora.

Znana w literaturze dehydrogenaza cholest-4-en-3-onu z S. denitrificans (AcmB) opisana w pracach Wojtkiewicz, A. M. i in., J. SteroidBiochem. Mol. Biol., 2020, 202, 105731 I Chiang, Y. R. I in. Appl. Environ. Microbiol., 2008, 74, 107-113 nie wykazuje aktywności względem dipterokarpolu, co zostało potwierdzone w pracy Wojtkiewicz, A. M. i in., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2020, 202, 105731. Enzymatyczna synteza związków chemicznych cechuje się szeregiem zalet względem tradycyjnej syntezy chemicznej takimi jak: łagodne warunki pracy, ograniczenie produkcji toksycznych odpadów, wysoka regioselektywność sposobu. Dodatkowo, nie jest wymagane wprowadzanie dodatkowych reakcji zabezpieczania grup funkcyjnych.

Dla znanej dehydrogenazy cholest-4-en-3-onu (AcmB) ze Sterolibacterium denitrificans w pracach Chiang, Y. R. i in. Appl. Environ. Microbiol., 2008, 74, 107-113 I. Wojtkiewicz, A. M. I in., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2020, 202, 105731 opisano zdolność do 1,2-odwodornienia steroidów podstawionych różnymi podstawnikami przy C17 np. progesteron, testosteron, cholest-4-en-3-on lub diosgenonu ((25R)-spirost-4-en-3-onu). W sposobie tym wykorzystano 2,6-dichloroindofenol jako akceptor elektronowy biokatalizatora oraz zastosowano pH 6,5 lub 8,0.

W opisach patentowych PL 228517, PL 228070 i PL 228071 ujawniono sposób wytwarzania propionianu androsta-1,4-dien-17e-ol-3-onu, androsta-1,4,6-trien-17e-ol-3-onu i 17a-metyloandrosta-1,4-dien-17e-ol-3-onu z wykorzystaniem preparatu enzymatycznego o aktywności AcmB uzyskanego ze

PL 248345 Β1 szczepu bakterii Sterolibacterium denitrificans Chol-1S DSM: 13999 oraz K3[Fe(CN)s] jako akceptora elektronowego biokatalizatora.

Z kolei w zgłoszeniu patentowym PL 433249 opisano zastosowanie AcmB do produkcji 1-dehydro-diosgenonu stosując różne akceptory elektronowe biokatalizatora (2,6-dichloroindofenol, K3[Fe(CN)s], metylosiarczan fenazyny).

Istota wynalazku polega na przedstawieniu nowej pochodnej dipterokarpolu o potwierdzonej aktywności biologicznej.

Przedmiotem wynalazku jest odwodorniona pochodna dipterokarpolu o nazwie chemicznej 1 -dehydrodipterokarpol o wzorze 1

Wzór 1.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 1-dehydrodipterokarpolu na drodze enzymatycznej regioselektywnej dehydrogenacji dipterokarpolu, charakteryzujący się tym, że enzymatyczną regioselektywną dehydrogenację dipterokarpolu prowadzi się w obecności dehydrogenazy 3-ketosteroidowej (AcmB2) ze Stereolibacterium denitrificans Chol-1S o sekwencji identycznej do SEQ ID NO. 1 lub podobnej do SEQ ID NO. 1 tj. nie różniący się o więcej niż 30% aminokwasów od zaprezentowanej SEQ ID NO. 1, pod warunkiem, że wykazuje aktywność enzymatyczną dla dipterokarpolu, w środowisku wodno-organicznym, które zawiera akceptor elektronowy biokatalizatora, bufor o pH w zakresie 6,5-9,0, solubilizator i rozpuszczalnik organiczny, który to sposób obejmuje następujące etapy:

A. do reaktora mieszalnikowego wprowadza się bufor, solubilizator rozpuszczony w wodzie, akceptor elektronowy biokatalizatora i dipterokarpol rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym;

B. inicjuje się reakcję w temperaturze od 20 do 45°C dodając biokatalizator o aktywności AcmB2;

C. wydziela się uzyskany produkt.

Korzystnie bufor o pH w zakresie 6,5-9,0 jest wybrany z grupy obejmującej: potasowy bufor ortofosforanowy, bufor glicyna - wodorotlenek sodu i bufor chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanowego.

Korzystnie akceptor elektronowy biokatalizatora jest wybrany z grupy obejmującej: 2,6-dichloroindofenol, metosiarczan fenazyny, heksacyjanożelazian III potasu, związki z grupy chinonów, w tym zwłaszcza witamina K3, i ich mieszaniny.

Korzystniej akceptor elektronowy biokatalizatora stanowi 2,6-dichloroindofenol o stężeniu w środowisku reakcji przynajmniej 0,15 mM, przy pH 6,5.

Alternatywnie korzystniej akceptor elektronowy biokatalizatora stanowi metosiarczan fenazyny, heksacyjanożelazian III potasu lub witamina K3 w zakresie stężeń w środowisku reakcji od 0,8 do 15 mM, przy pH 8,0 lub 9,0.

Korzystnie stężenie solubilizatora w środowisku reakcji wynosi 0-20%, korzystniej 4-16% (v/w).

Korzystniej solubilizatorem jest 2-hydroksypropylo-8-cyklodekstryna.

Korzystnie ilość użytego rozpuszczalnika wynosi 1-10% (v/v).

Korzystnie rozpuszczalnik wybrany jest z grupy obejmującej 2-metoksyetanol i 1,4-dioksan.

Korzystnie temperatura w etapie B wynosi 30°C.

PL 248345 Β1

Korzystnie produkt w etapie C wydziela się metodami ekstrakcji lub/i chromatografii.

Jeszcze kolejnym przedmiotem wynalazku jest 1-dehydrodipterokarpol do zastosowania jako lek, korzystnie w leczeniu nowotworu.

Korzystnie nowotwór jest wybrany z grupy obejmującej: raka płuc, raka jelita grubego, raka szyjki macicy i raka przełyku.

W celu oceny porównawczej cytotoksyczności dipterokarpolu i jego nowej pochodnej, będącej przedmiotem wynalazku, zastosowano metodę podwójnego barwienia jodkiem propidyny (PI) i dwuoctanem fluoresceiny (FDA) zgodnie z protokołem opisanym w https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN33_Live_Dead_staining_with_FDA_and_PI.pdf

Jako modelowe linie komórkowe do testów cytotoksyczności wybrano mysie fibroblasty embrionalne (MEF) oraz komórki ludzkiego nowotworu płuca (A549). FDA w żywej komórce jest hydrolizowany przez esterazy cytoplazmatyczne do fluoresceiny, która gromadzi się w cytoplazmie i prowadzi do intensywnej zielonej fluorescencji. W teście można wyróżnić trzy typy komórek: zielone (żywe), niebarwiące się lub słabo wybarwiające się fluoresceiną i niebarwiące się PI (apoptotyczne) oraz barwiące się na czerwono PI i niebarwiące się fluoresceiną (martwe). Komórki zawieszono w standardowym buforze fosforanowym. Następnie do 0,2 ml tej zawiesiny dodano roztwór FDA (0,02 Lig) i PI (0,6 pg). Po 3 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej obserwowano fluorescencję pod mikroskopem i określano procent komórek martwych i żywych. W celu zbadania wpływu nowej pochodnej dipterokarpolu na komórki referencyjne (MEF 3T3) oraz nowotworowe (A549) komórki zawieszono w roztworze zawierającym związek w ilości takiej, że jego końcowe stężenie w roztworze wynosiło odpowiednio 0, 1, 10, 100, 250 oraz 500 pM. Dodatkowo przeprowadzono badania porównawcze w analogicznych warunkach dla dipterokarpolu. Dodatkowo ze względu na chęć wyeliminowania wpływu rozpuszczalnika jakim był dimetylosulfotlenek (DMSO) na otrzymane wyniki, wykonano również ocenę jego cytotoksyczności przy stężeniu 1,76 M. Cytotoksyczność związków oceniano po 24 h inkubacji komórek. W celu oceny istotności statystycznej otrzymanych wyników zastosowano jednoczynnikową metodę analizy wariancji (ANOVA). Na fig. 4 przedstawiono otrzymane wyniki tj. określenie wpływu rozpuszczalnika (DMSO), prekursora (DPC) i nowej pochodnej dipterokarpolu (1DH-DPC) na przeżywalność komórek referencyjnych (MEF 3T3) oraz nowotworowych (A549).

Przeprowadzone testy wykazały, że nowa pochodna dipterokarpolu, będąca przedmiotem wynalazku, podobnie jak dipterokarpol, poniżej stężenia 10 μΜ nie wykazuje działania cytotoksycznego na poprawne komórki ssacze. Nowa pochodna dipterokarpolu przy stężeniach przekraczających 10 μΜ wykazuje dużo silniejsze działanie cytotoksyczne na komórki nowotworowe (A549) niż dipterokarpol. Komórki nowotworowe poddane działaniu nowej pochodnej dipterokarpolu wykazały przeżywalność na poziomie 22,5% zaś dipterokarpol wywołał śmierć niewiele ponad 40% komórek.

Wynik oceny działania biologicznego dla dipterokarpolu i nowej pochodnej dipterokarpolu przy zastosowanym stężeniu 10 μΜ dla komórek referencyjnych i nowotworowych przedstawiono odpowiednio w Tabeli 1 i Tabeli 2.

Tabela 1

Nazwa	Przeżywalność komórek MEF3T3 (referencja)
Dipterokarpol	44,1% ±11,9
Nowa pochodna dipterokarpolu	48,4% ±4,75

Tabela 2

Nazwa	Przeżywalność komórek A549 (linia nowotworowa)
Dipterokarpol	57,4% ± 9,7
Nowa pochodna dipterokarpolu	22,5% ± 7,7

PL 248345 Β1

Nowa pochodna dipterokarpolu charakteryzuje się wykazaną badaniami, aktywnością biologiczną. Dla nowej, nieopisanej dotąd pochodnej dipterokarpolu, 1-dehydrodipterokarpolu wykazano wyższą aktywność cytotoksyczną w kierunku linii nowotworowej A549 (nowotwór płuc) w porównaniu do linii komórkowej normalnej MEF3T3. Przy zastosowaniu 100 μΜ roztworu nowej pochodnej otrzymano przeżywalność dla linii referencyjnej MEF3T3 na poziomie 48,4% ± 4,75, a dla linii nowotworowej A549 na poziomie 22,5% ± 7,7. Tym samym potwierdzono, że nowa pochodna posiada potencjał aplikacyjny w kierunku zwalczania nowotworów.

Uzyskane wyniki wskazują jednoznacznie na to, że nowa pochodna dipterokarpolu wykazuje bezpośrednie działanie cytotoksyczne na komórki nowotworowe poza tym ma trzykrotnie wyższą aktywność w stosunku do linii nowotworowej A549 niż związek wyjściowy tj. dipterokarpol. Dzięki tym właściwościom nowa pochodna dipterokarpolu ma potencjał do zastosowania farmakologicznego jako cytostatyk w terapiach onkologicznych.

Istota wynalazku polega na otrzymywaniu 1-dehydrodipterokarpolu o wzorze 1 na drodze enzymatycznej regioselektywnej A¹'dehydrogenacji (tj. wprowadzeniu podwójnego wiązania pomiędzy atomy C1 i C2) w substracie, którym jest dipterokarpol o wzorze 2. Reakcję prowadzi się według schematu przedstawionego na fig. 3 przy zastosowaniu biokatalizatora o aktywności dehydrogenazy 3-ketosteroidowej (AcmB2), pochodzącego ze Sterolibacterium denitrificans Chol-1S. Reakcję może katalizować dowolny enzym z klasy KSTD (ketosteroidowych dehydrogenaz) o sekwencji podobnej, tj. nie różniący się o więcej niż 30% aminokwasów od zaprezentowanej SEQ ID NO. 1, pod warunkiem, że wykazuje aktywność enzymatyczną dla dipterokarpolu.

SEQ ID NO. 1 - Sekwencja aminokwasowa AcmB2 ze Sterolibacterium denitrificans Chol-1S:

MSGETFDTDIVIVGSGAGGMTAALAAHEAGLRALIVEKTQYYGGSTARSGGGIW

IPNNYLMQRAGVADSFEEARTYLQATVGERSPQASRDAYLTHAVDMIAWLGKE

TDVQCSYMLGYADYYPEKPGGKAEGRAVEPQLFDGKLLGEDLAFLRPPVIPTP

AGLSFTAGEYKQLGLVKRTWQGKATALRIGLRLIAAHLSGKKMLMMGQALIGRL

RLSLKKRGIPLWLDTPLQDLVIENGRWGIEVLKDGQPLTIRATKGWLAAGCFA

RNLEMRLKYQKQPITTEWTVASDGNTGDGIQAGMRIGAAIDLMDEAWWGPSSL

PPNSPPFFHVAERGFPGLIMVNQKGQRFTNESASYVEWQAMYRLHTPDNPHV

PCWFIFDQRYRDNYVFASLFPGQKIPQEMLDSGYIRKADTLAELARQLNIEPAAL

TATVSKFNNSARQGEDVEFGRGQSAYDRYFGDPSVTPNANLAPlEQAPYYAVQ

WAG DLGTKGG LVT D E F A R VKTT DG R11 KG LYCVG N NSASVM G ATYPGPG CTIG PAMAFGYIAARHAAGIERSAV.

Biokatalizator może być wprowadzony do środowiska reakcji w formie oczyszczonego enzymu rekombinowanego, powstałego w procesie nadekspresji genu w zmodyfikowanej bakterii, np. Escherichia coli.

Produkt reakcji korzystnie oczyszcza się metodą ekstrakcji do fazy stałej stosując kolumienki polimerowe oraz 40% metanol do odpłukania cyklodekstryny i 100% metanol jako czynnik elucyjny, a następnie chromatografią preparatywną na kolumnie C18 w fazie acetonitryl/woda otrzymując 1-dehydrodipterokarpol o wzorze 1 z wydajnością co najmniej 36%, przy konwersji substratu według chromatografii cieczowej >90%.

Korzystne jest, gdy sposób prowadzi się w środowisku wodno-organicznym w temperaturze od 20 do 45°C, w pH 6,5-9,0 z zastosowaniem jako akceptora elektronowego biokatalizatora 2,6-dichlorofenoloindofenolu (DCPIP), metylosiarczanu fenazyny (PMS), heksacyjanożelazianu III potasu, witaminy K3 lub mieszaniny DCPIP i PMS, w obecności 2-hydroksypropylo-8-cyklodekstrynyjako solubilizatora substratu. Dodanie rozpuszczalnika organicznego (np. 2-metoksyetanolu lub 1,4-dioksanu) umożliwia łatwiejsze rozpuszczenie substratu i ma pozytywny wpływ na konwersję.

Zasadniczymi zaletami wynalazku jest otrzymanie 1 -dehydrodipterokarpolu z dipterokarpolu, jako jedynego produktu reakcji z blisko 100% konwersją, z wydajnością izolowaną co najmniej 36%, w temperaturze zbliżonej do pokojowej, bez zastosowania toksycznych rozpuszczalników oraz silnych utleniaczy w sposobie wytwarzania.

Przedmiot wynalazku ilustrują przedstawione poniżej przykłady realizacji.

Przykład 1 Przygotowanie biokatalizatora AcmB2 ze Sterolibacterium denitrificans w nadekspresji w Escherichia coli

Gen kodujący dehydrogenazę 3-ketosteroidową z S. denitrificans (AcmB2) został wklonowany do wektora pMCSG7 zgodnie z procedurą opisaną w pracy Sofińskiej K. i innych (BBA - Gen. Subjects, 2019,1863 (6), 1027-1039). Uzyskany konstrukt genetyczny został transformowany do komórek Escherichia coli (BL21(DE3)Magic), potraktowanych chlorkiem wapnia w celu nabycia kompetencji. Następnie założono pre-kulturę tak zmodyfikowanych komórek bakteryjnych na pożywce płynnej 2% Lennox Broth (LB) z dodatkiem ampicyliny i kanamycyny tak by końcowe stężenie antybiotyków wynosiło odpowiednio 100 i 50 μg/ml. Hodowlę pre-kultury prowadzono w inkubatorze z wytrząsaniem (180 rpm, 37°C, 12 h). Uzyskana kultura została rozcieńczona 100-krotnie w medium LB zawierającym ampicylinę i kanamycynę w takich samych stężeniach jak wyżej, a hodowla była kontynuowana aż do osiągnięcia gęstości optycznej OD600 o wartości 0,6. Po osiągnięciu opisanej wartości OD600 obniżono temperaturę w inkubatorze do 16°C i zaindukowano nadekspresję enzymu przez dodatek 0,25 mM e-D-1-tiogalaktopiranozydu izopropylowego (IPTG). Po kolejnych 24 h hodowli komórki zostały oddzielone od pożywki hodowlanej poprzez wirowanie przy 4500 g (1 h, 4°C). Zawiesina komórek została poddana lizie metodą sonikacji (Sonics Vibra-Cell VCX500, cykl przerywany, 5 min, amplituda 40%, energia 150 000 J), a pozostałości komórkowe oddzielono metodą ultrawirowania przy przyspieszeniu kątowym 40 000 g przez 1 godzinę w temperaturze 4°C. Następnie ekstrakt komórkowy zaaplikowano na kolumnę HisTrap HP (5 mL GE Healthcare), by po przepłukaniu buforem podstawowym (50 mM chlorowodorek (tris(hydroksymetylo)aminometanowy (Tris-HCI) pH 8,5, 150 mM chlorek sodu, 10% (w/v) glicerol i 0,5% (w/v) Triton-X 100) z dodatkiem 15 mM imidazolu, wymyć enzym w gradiencie imidazolu od 15 mM do 300 mM. Enzym AcmB2 odsolono z wykorzystaniem dializy w buforze podstawowym bez dodatku imidazolu i zamrożono w -20°C. Stężenie aktywnego enzymu oznaczono spektrofotometrycznie wykorzystując widmo FAD przy 450 nm (ε450 = 13 100 M^-1 cm·¹).

Przykład 2 Otrzymywanie 1-dehydrodipterokarpolu za pomocą oczyszczonego rekombinowanego biokatalizatora AcmB2 ze Sterolibacterium denitrificans oraz heksacyjanożelazianu III potasu jako akceptora elektronowego biokatalizatora w pH 8,0 i w temperaturze 30°C

Do reaktora o pojemności 50 ml, zawierającego 25 mM potasowy bufor ortofosforanowy o pH 8,0 wprowadzono 0,17 g heksacyjanożelazianu III potasu dającą końcowe stężenie 10 mM, 2 g 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny dającą końcowe stężenie 4% (w/v), 0,5 ml 50 mM roztworu dipterokarpolu w 2-metoksyetanolu, tak by finalne stężenie dipterokarpolu w środowisku wyniosło 0,5 mM (a tym samym stężenie 2-metoksyetanolu wynosiło 1% (v/v)) oraz 15 mg rekombinowanego AcmB2 z S. denitrificans . Reakcje prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 30°C, przy ciągłym mieszaniu przez 40 godzin. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (90% ACN, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 30°C) na kolumnie AMT HALO 90 A RP-Amide, 2,7 μm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następowała separacja reagentów, czas retencji 1-dehydrodipterokarpolu to 2,5 min, a dipterokarpolu 2,8 min. Mieszaninę reakcyjną zasilano dwukrotnie dodatkową porcją substratu, 0,5 ml 50 mM roztworu dipterokarpolu w 2-metoksyetanolu. Finalnie po 46 h reakcji uzyskano 1,35 mM produktu z 90% stopniem konwersji, a po ekstrakcji do fazy stałej stosując kolumienki polimerowe StrataX oraz 50% metanol w wodzie w celu opłukania zanieczyszczeń oraz 100% metanol jako eluent oraz chromatografię preparatywną na kolumnie C18 w fazie acetonitryl/woda uzyskano 20,6 mg produktu. Całkowita wydajność sposobu wyniosła 62%.

Uzyskany produkt scharakteryzowano za pomocą spektrometru NMR Bruker 400 MHz w deuterowanym chloroformie (CDCh) uzyskując dane spektralne 1H NMR i ¹³C NMR. Widmo protonowe 1H NMR otrzymanego 1-dehydrodipterokarpolu o wzorze 1 przedstawiono na rysunku fig. 5, a widmo węglowe ¹³C NMR przedstawiono na fig. 6.

Przykład 3 Otrzymywanie 1-dehydrodipterokarpolu za pomocą oczyszczonego rekombinowanego biokatalizatora AcmB2 ze Sterolibacterium denitrificans oraz metosulfonianu fenazyny jako akceptora elektronowego biokatalizatora w pH 8,0 i w temperaturze 45°C

Do minireaktora o pojemności 0,5 ml, zawierającego 25 mM potasowy bufor ortofosforanowy o pH 8,0 wprowadzono 5 mM metosulfoniany fenazyny, 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę dającą końcowe stężenie 16% (w/v), 0,005 ml 50 mM roztworu dipterokarpolu w 2-metoksyetanolu, tak by finalne stężenie dipterokarpolu w środowisku wyniosło 1 mM (a tym samym stężenie 2-metoksyetanolu wynosiło 2% (v/v)) oraz 0,005 ml nieoczyszczonego preparatu enzymatycznego o aktywności AcmB2 z S. denitrificans. Reakcję prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 45°C, przy ciągłym wstrząsaniu przez 24 godziny. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (90% ACN, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 30°C) na kolumnie AMT HALO 90 A RP-Amide, 2,7 pm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następowała separacja reagentów, czas retencji 1-dehydrodipterokarpolu to 2,5 min, a dipterokarpolu 2,8 min. Przebieg reakcji monitorowano poprzez pobranie i analizowanie próbki w czasie 0, 1,2, 3 i 24 godziny jej trwania. Przebieg reakcji przedstawiono na rysunku na fig. 7. Dla takich warunków uzyskano 84% konwersji substratu po 24 godzinach reakcji.

Przykład 4 Otrzymywanie 1-dehydrodipterokarpolu za pomocą oczyszczonego rekombinowanego biokatalizatora AcmB2 ze Sterolibacterium denitrificans oraz witaminy K3 jako akceptora elektronowego biokatalizatora w pH 9,0 i w temperaturze 20°C

Do minireaktora o pojemności 0,5 ml, zawierającego 25 mM potasowy bufor ortofosforanowy o pH 9, wprowadzono 5 mM witaminy K3 z roztworu 0,25 M w 1,4-dioksanie, 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę dającą końcowe stężenie 8% (w/v), 0,010 ml 50 mM roztworu dipterokarpolu w 1,4-dioksanie, tak by finalne stężenie dipterokarpolu w środowisku było bliskie 1 mM. Stężenie 1,4-dioksanu wynosiło 4% (v/v), a stężenie dipterokarpolu wyniosło 0,85 mM. W celu rozpoczęcia reakcji dodano 0,15 mg rekombinowanego AcmB2 z S. denitrificans. Reakcje prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 20°C, przy ciągłym wstrząsaniu przez 24 godziny. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (90% ACN, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 30°C) na kolumnie AMT HALO 90 A RP-Amide, 2,7 μm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następowała separacja reagentów, czas retencji 1dehydrodipterokarpolu to 2,5 min, a dipterokarpolu 2,8 min. Przebieg reakcji monitorowano poprzez pobranie i analizowanie próbki w czasie 0, 1,2, 3 i 24 godziny jej trwania. Przebieg reakcji przedstawiono na rysunku na fig. 8. Dla takich warunków uzyskano 89% konwersji substratu po 24 godzinach reakcji.

Przykład 5 Otrzymywanie 1-dehydrodipterokarpolu za pomocą oczyszczonego rekombinowanego biokatalizatora AcmB2 ze Sterolibacterium denitrificans oraz 2,6-dichlorofenoloindofenolu jako akceptora elektronowego biokatalizatora w pH 6,5 i w temperaturze 30°C

Do minireaktora o pojemności 0,5 ml, zawierającego 25 mM potasowy bufor ortofosforanowy o pH 6,5 wprowadzono 2 mM 2,6-dichlorofenoloindofenolu, 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę dającą końcowe stężenie 8% (w/v), 0,005 ml 50 mM roztworu dipterokarpolu w 2-metoksyetanolu, tak by finalne stężenie dipterokarpolu w środowisku wyniosło 1 mM (a tym samym stężenie 2-metoksyetanolu wynosiło 2% (v/v)) oraz 0,15 mg rekombinowanego AcmB2. Reakcję prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 30°C, przy ciągłym mieszaniu przez 24 godzin. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (90% ACN, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 30°C) na kolumnie AMT HALO 90 A RP-Amide, 2,7 μm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następowała separacja reagentów, czas retencji 1-dehydrodipterokarpolu to 2,5 min, a dipterokarpolu 2,8 min. Dla takich warunków uzyskano 69% konwersji substratu po 24 godzinach reakcji.

Otrzymana w wyniku syntezy nowa pochodna dipterokarpolu została scharakteryzowana wykonując spektroskopię UV-Vis, magnetyczny rezonans jądrowy (NMR), analizę chromatograficzną ze spektroskopią mas (HPLC-MS) oraz pomiar jej temperatury topnienia

Spektroskopia UV-Vis

Maksimum absorbancji: Xmax = 226, 230 nm

Widmo UV-Vis przedstawiono na załączonym rysunku na fig. 9.

NMR (magnetyczny rezonans jądrowy)

Widmo wodorowe NMR przedstawiono na załączonym rysunku na fig. 5.

Widmo węglowe NMR przedstawiono na załączonym rysunku na fig. 6.

Analiza HPLC - MS (analiza chromatograficzna ze spektroskopią mas)

MS (m/z): 441,3 (M+H)+; 423,3 (M-H2O)⁺

Czystość związku określono metodą HPLC na 95%.

Chromatogram HPLC przedstawiono na załączonym rysunku na fig. 10, a masy i intensywność jonów fragmentacyjnych na fig. 11.

Temperatura topnienia (wyznaczona w aparacie Boetins’a typ PHMK)

Tt = 50-52°C

Wzór sumaryczny: C30H48O2

Masa molowa: 440,7 g/mol.

PL 248345 Β1

Lista sekwencji

SEQUENCE LISTING < 110> INSTYTUT KATALIZY I FIZYKOCHEMII POWIERZCHNI IM.JERZEGO HABERA POLSKIEJ AKADEMII NAUK < 120> Odwodorniona pochodna dipterokarpolu, sposAłb jej wytwarzania na drodze enzymatycznej oraz zastosowanie < 130> 55989/22 < 160> 1 < 170> BiSSAP 1.3.6 < 210> 1 <211> 558 < 212> PRT < 213> Stereolibacterium denitrificans <220>

< 223> Sekwencja aminokwasowa AcmB2 ze Stereolibacterium denitrificans

Chol-lS < 400> 1

Met Ser Gly Glu Thr Phe Asp Thr Asp Ile Val Ile Val Gly Ser Gly 15 1015

Ala Gly Gly Met Thr Ala Ala Leu Ala Ala His Glu Ala Gly Leu Arg 20 2530

Ala Leu Ile Val Glu Lys Thr Gin Tyr Tyr Gly Gly Ser Thr Ala Arg 35 4045

Ser Gly Gly Gly Ile Trp Ile Pro Asn Asn Tyr Leu Met Gin Arg Ala 50 5560

Gly Val Ala Asp Ser Phe Glu Glu Ala Arg Thr Tyr Leu Gin Ala Thr 65 7075

Val Gly Glu Arg Ser Pro Gin Ala Ser Arg Asp Ala Tyr Leu Thr His 85 9095

Ala Val Asp Met Ile Ala Trp Leu Gly Lys Glu Thr Asp Val Gin Cys

100

105

110

PL 248345 Β1

Ser

Tyr

Met

Leu

Gly

Tyr

Ala

Asp

Tyr

Pro

Glu

Lys

Pro

Gly

Gly Lys

Ala

115 Glu

Gly

Arg

Ala

Val

120 Glu

Pro

Gin

Leu

Phe

125 Asp

Gly

Lys

Leu Leu

130 Gly

Glu

Asp

Leu

Ala

135 Phe

Leu

Arg

Pro

140 Val

Ile

Pro

Thr

Pro 145 160 Ala

Gly

Leu

Ser

Phe

150 Thr

Ala

Gly

Glu

Tyr

155 Lys

Gin

Leu

Gly

Leu

Val Lys

Arg

Thr

Trp

165 Gin

Gly

Lys

Ala

Thr

170 Ala

Leu

Arg

Ile

Gly

175 Leu

Arg Leu

Ile

Ala

180 Ala

His

Leu

Ser

Gly

185 Lys

Lys

Met

Leu

Met

190 Met

Gly

Gin Ala

Leu

195 Ile

Gly

Arg

Leu

Arg

200 Leu

Ser

Leu

Lys

205 Arg

Gly

Ile

Pro Leu

210 Trp

Leu

Asp

Thr

Pro

215 Leu

Gin

Asp

Leu

Val

220 Ile

Glu

Asn

Gly

Arg 225 240 Val

Val

Gly

Ile

Glu

230 Val

Leu

Lys

Asp

Gly

235 Gin

Pro

Leu

Thr

Ile

Arg Ala

Thr

Lys

Gly

245 Val

Val

Leu

Ala

250 Gly

Cys

Phe

Ala

Arg

255 Asn

Leu Glu

Met

Arg

260 Leu

Lys

Tyr

Gin

Lys

265 Gin

Pro

Ile

Thr

270 Glu

Trp

Thr Val

Ala

275 Ser

Asp

Gly

Asn

Thr

280 Gly

Asp

Gly

Ile

Gin

285 Ala

Gly

Met

Arg Ile

290 Gly

Ala

Ile

Asp

295 Leu

Met

Asp

Glu

Ala

300 Trp

Trp

Gly

Pro

Ser 305 320 Ser

Leu

Pro

Asn

310 Ser

Pro

Phe

315 His

Val

Ala

Glu

Arg

Gly Phe

Pro

Gly

Leu

325 Ile

Met

Val

Asn

Gin

330 Lys

Gly

Gin

Arg

Phe

335 Thr

Asn Glu

Ser

Ala

340 Ser

Tyr

Val

Glu

Val

345 Val

Gin

Ala

Met

Tyr

350 Arg

Leu

His

355

360

365

PL 248345 Β1

Thr

Pro

Asp

Asn

Pro

His

Val

Pro

Cys

Trp

Phe

Ile

Phe

Asp

Gin

Arg

370

375

380

Tyr Ile 385 400

Arg

Asp

Asn

Tyr

Val 390

Phe

Ala

Ser

Leu

Phe 395

Pro

Gly

Gin

Lys

Pro Leu

Gin

Glu

Met

Leu 405

Asp

Ser

Gly

Tyr

Ile 410

Arg

Lys

Ala

Asp

Thr 415

Ala Ala

Glu

Leu

Ala 420

Arg

Gin

Leu

Asn

Ile 425

Glu

Pro

Ala

Leu 430

Thr

Thr Glu

Val

Ser 435

Lys

Phe

Asn

Ser 440

Ala

Arg

Gin

Gly

Glu 445

Asp

Val

Phe Ser

Gly 450

Arg

Gly

Gin

Ser

Ala 455

Tyr

Asp

Arg

Tyr

Phe 460

Gly

Asp

Pro

Val Tyr 465 480

Thr

Pro

Asn

Ala

Asn 470

Leu

Ala

Pro

Ile

Glu 475

Gin

Ala

Pro

Tyr

Ala Val

Val

Gin

Val

Val 485

Ala

Gly

Asp

Leu

Gly 490

Thr

Lys

Gly

Leu 495

Thr Lys

Asp

Glu

Phe 500

Ala

Arg

Val

Lys

Thr 505

Thr

Asp

Gly

Arg

Ile 510

Ile

Gly Thr

Leu

Tyr 515

Cys

Val

Gly

Asn

Asn 520

Ser

Ala

Ser

Val

Met 525

Gly

Ala

Tyr Tyr

Pro 530

Gly

Pro

Gly

Cys

Thr 535

Ile

Gly

Pro

Ala

Met 540

Ala

Phe

Gly

Ile 545

Ala

Arg

His

Ala 550

Ala

Gly

Ile

Glu

Arg 5 5 5

Ser

Ala

Val

Claims

1. Odwodorniona pochodna dipterokarpolu o nazwie chemicznej 1-dehydrodipterokarpol o wzorze 1

Wzór 1.

2. Sposób wytwarzania 1-dehydrodipterokarpolu na drodze enzymatycznej regioselektywnej dehydrogenacji dipterokarpolu, znamienny tym, że enzymatyczną regioselektywną dehydrogenację dipterokarpolu prowadzi się w obecności dehydrogenazy 3-ketosteroidowej (AcmB2) ze Sterolibacterium denitrificans Chol-1S o sekwencji identycznej do SEQ ID NO. 1 lub podobnej do SEQ ID NO. 1 tj. nie różniący się o więcej niż 30% aminokwasów od zaprezentowanej SEQ ID NO. 1, pod warunkiem, że wykazuje aktywność enzymatyczną dla dipterokarpolu, w środowisku wodno-organicznym, które zawiera akceptor elektronowy biokatalizatora, bufor o pH w zakresie 6,5-9,0, solubilizator i rozpuszczalnik organiczny, który to sposób obejmuje następujące etapy:

C. wydziela się uzyskany produkt.

3. Sposób, według zastrz. 2, znamienny tym, że bufor o pH w zakresie 6,5-9,0 jest wybrany z grupy obejmującej: potasowy bufor ortofosforanowy, bufor glicyna - wodorotlenek sodu i bufor chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanowego.

4. Sposób, według zastrz. 2, znamienny tym, że akceptor elektronowy biokatalizatora jest wybrany z grupy obejmującej: 2,6-dichloroindofenol, metosiarczan fenazyny, heksacyjanożelazian III potasu, związki z grupy chinonów, w tym zwłaszcza witamina K3, i ich mieszaniny.

5. Sposób, według zastrz. 4, znamienny tym, że akceptor elektronowy biokatalizatora stanowi 2,6-dichloroindofenol o stężeniu w środowisku reakcji przynajmniej 0,15 mM, przy pH 6,5.

6. Sposób, według zastrz. 4, znamienny tym, że akceptor elektronowy biokatalizatora stanowi metosiarczan fenazyny, heksacyjanożelazian III potasu lub witamina K3 w zakresie stężeń w środowisku reakcji od 0,8 do 15 mM, przy pH 8,0 lub 9,0.

7. Sposób, według zastrz. 2, znamienny tym, że stężenie solubilizatora w środowisku reakcji wynosi 0-20%, korzystnie 4-16% (v/w).

8. Sposób, według zastrz. 7, znamienny tym, że solubilizatorem jest 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryna.

9. Sposób, według zastrz. 2, znamienny tym, że ilość użytego rozpuszczalnika wynosi 1-10% (v/v).

10. Sposób, według zastrz. 2, znamienny tym, że rozpuszczalnik wybrany jest z grupy obejmującej 2-metoksyetanol i 1,4-dioksan.

11. Sposób, według zastrz. 2, znamienny tym, że temperatura w etapie B wynosi 30°C.

12. Sposób, według zastrz. 2, znamienny tym, że produkt w etapie C wydziela się metodami ekstrakcji lub/i chromatografii.

13. 1 -dehydrodipterokarpol do zastosowania jako lek.

14. 1-dehydrodipterokarpol do zastosowania w leczeniu nowotworu.

15. 1-dehydrodipterokarpol do zastosowania według zastrz. 14, znamienny tym, że nowotwór jest wybrany z grupy obejmującej: raka płuc, raka jelita grubego, raka szyjki macicy i raka przełyku.