PL245879B1 - Ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina, zastosowanie postaci kompleksu liposomowego oraz sposób otrzymywania - Google Patents

Ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina, zastosowanie postaci kompleksu liposomowego oraz sposób otrzymywania Download PDF

Info

Publication number
PL245879B1
PL245879B1 PL438023A PL43802321A PL245879B1 PL 245879 B1 PL245879 B1 PL 245879B1 PL 438023 A PL438023 A PL 438023A PL 43802321 A PL43802321 A PL 43802321A PL 245879 B1 PL245879 B1 PL 245879B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
mol
rna
dspe
peg
polyethyleneimine
Prior art date
Application number
PL438023A
Other languages
English (en)
Other versions
PL438023A1 (pl
Inventor
Aleksander Franciszek Sikorski
Kazimierz Kuliczkowski
Aleksander CZOGALLA
Aleksander Czogalla
Adam Konka
Original Assignee
Acellmed Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Acellmed Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia filed Critical Acellmed Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority to PL438023A priority Critical patent/PL245879B1/pl
Priority to PCT/PL2022/000035 priority patent/WO2022255891A1/en
Publication of PL438023A1 publication Critical patent/PL438023A1/pl
Publication of PL245879B1 publication Critical patent/PL245879B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1277—Preparation processes; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina, zawierająca miRNA skompleksowane z polikationem polietylenoiminą (PEI — Polyethyleneimine) 1:4 do 1:7, zamknięte w otoczce liposomowej, zawierającej 74,65 - 79,65 mol% uwodornionej fosfatydylocholiny sojowej (HSPC - hydrogenated soy L-α-phosphatidylcholine), 5 mol% dioleilofosfatydyloetanolaminy (DOPE - dioleoylphosphatidylethanolamine), 4,55 mol% distearoilofosfatydyloetanoloaminowej pochodnej glikolu polietylenowego 2000 w postaci soli amonowej, (DSPE-PEG — 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-20001]), 0,8 mol% maleimidowej pochodnej DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal), 10-15 mol% cholesterolu. Wynalazek obejmuje także zastosowanie oraz sposób wytwarzania ukierunkowanej liposomowej postaci kompleksu RNA-polietylenoimina.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina, jego sposób otrzymywania oraz zastosowanie w terapii ostrej białaczki szpikowej/ostrej białaczki mieloblastycznej.
Ostra białaczka szpikowa (OBS, AML - Acute Myeloid Leukemia) jest najczęstszą białaczką u dorosłych z częstością występowania 4,2/100 000 wg danych amerykańskich z lat 2007-2013. Zasadnicze leczenie nie zmieniło się od 40 lat. Przeżycie pięcioletnie u młodszych <60 lat wynosi 40%, a u starszych 10-20%. W związku z tym poszukiwane są sposoby leczenia oparte m.in. na leczeniu precyzyjnym, tzn. ukierunkowanym na defekty komórki nowotworowej, które stwierdzane są w badaniach molekularnych. Dotyczy to korygowania nieprawidłowości w drogach sygnałowych i receptorach, zmian w epigenetyce oraz wpływu na immunologię nowotworu. Do tego nurtu epigenetycznego należą terapie oparte o niekodujące RNA. Badania na liniach komórkowych i komórkach pacjentów wykazały, że brak lub nadmiar tego typu cząsteczek może mieć wpływ na proliferację nowotworową.
W polskim opisie patentowym PAT.208054B1 ujawniono kompozycję lipidową do wytwarzania lipidowego nośnika dla leków genetycznych, zawierającą 38,7% wagowych fosfatydylocholiny (PC), 15,4% wagowych distearoilofosfatydyloetanoloaminowej pochodnej glikolu polietylenowego 2000 (sól amonowa) (DSPE-PEG), od 10,9% do 16,8% wagowych dioleiolofosfatydyloetanolaminy (DOPE), od 4,05% do 6,75% wagowych 33-N-dimetyloetanokarbamoilo cholesterolu (DC-CHOL) i od 23,4% do 30,6% wagowych soli trimetyloamoniowej 1,2-dioleilopropanu (DOTAP), przy czym PC, DOPE i DC-CHOL stanowią zewnętrzną błonę nośnika, a DOTAP wchodzi w skład rdzenia nośnika zamkniętego w jego wnętrzu.
W innym polskim opisie patentowym PAT.233741B1 opisano kompozycję lipidową służąca do wytworzenia kierowanego za pomocą przeciwciał liposomowego nośnika leków genetycznych w postaci asODN, miRNA, charakteryzującą się tym, że zawiera od 35,2% do 42,5% wagowych fosfatydylocholiny (PC), od 12,3% do 14,8% wagowych dioleilofosfatydyloetanolaminy (DOPE), od 4,9% do 5,9% wagowych 3-N-dimetyloetanokarbamoilocholesterolu (DC-CHOL), od 10,7% do 16,6% wagowych DSPE-PEG, od 4,6% do 6,2% wagowych maleimidowej pochodnej DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal), od 19,8% do 25,7% wagowych soli trimetyloaminowej 1,2-dioleilopropanu (DOTAP), 8 ±1,4 μg przeciwciał antyCD20/mg lipidu oraz 9 μg kwasów nukleinowych/mg lipidu. Kompozycja znajduje zastosowanie do wytwarzania liposomowego nośnika leków genetycznych do leczenia białaczki.
Z polskiego zgłoszenia patentowego P.407947 znana jest ukierunkowana, liposomowa postać kompleksu oligonukleotyd (DNA)-polietylenoimina charakteryzująca się tym, że stosunek oligonukleotydu do polietylenoiminy zawiera się w przedziale od 1 : 10 do 1 : 3, a kompleks otoczony jest dwuwarstwą lipidową umożliwiającą przyłączenie cząsteczki rozpoznającej marker powierzchniowy komórek patologicznych oraz jej sposób otrzymywania i zastosowanie. Kompozycję stosuje się do wytwarzania leku do leczenia nowotworów układu krwionośnego.
Problemem stawianym przed niniejszym wynalazkiem jest zaproponowanie skutecznego systemu liposom - kwas nukleinowy - czynnik rozpoznający określoną komórkę (jej marker powierzchniowy), który mógłby efektywnie być stosowany w terapii nowotworów, zwłaszcza ostrej białaczki szpikowej / ostrej białaczki mieloblastycznej. Celem wynalazku jest opracowanie ukierunkowanej, liposomowej postaci RNA hamującej proliferację komórek nowotworowych charakteryzującej się selektywnością działania, niską nieswoistą cytotoksycznością oraz wysoką wydajnością dostarczania kwasów nukleinowych do komórek nowotworowych, który osobno lub w połączeniu ze standardowo stosowanymi cytostatykami znacząco poprawi efektywność leczenia.
Aby liposomy mogły zostać zastosowane w formulacji farmaceutycznej, muszą zachowywać stabilność podczas wielomiesięcznego przechowywania. Dlatego celem wynalazku jest uzyskanie postaci leku, która nie tylko chroni zamknięte kwasy nukleinowe przed działaniem enzymów obecnych w płynach biologicznych, ale zachowuje określone parametry fizykochemiczne podczas długoterminowego przechowywania. Nieoczekiwanie, wspomniane problemy rozwiązano w prezentowanym wynalazku.
Pierwszym przedmiotem wynalazku jest ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina, zawierająca miRNA skompleksowane z polikationem polietylenoiminy (PEI - Polyethyleneimine) 1 : 3 do 1 : 10, zamknięte w otoczce liposomowej, zawierającej 74,65-79,65 mol% uwodornionej fosfatydylocholiny sojowej (HSPC - hydrogenated soy L-a-phosphatidylcholine), 5 mol% dioleilofosfatydyloetanolaminy (DOPE - dioleoylphosphatidylethanolamine), 4,55 mol% distearoilofosfatydyloetanoPL 245879 B1 loaminowej pochodnej glikolu polietylenowego 2000 w postaci soli amonowej, (DSPE-PEG - 1,2-distearoyl-sn-giycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]), 0,8 mol% maleimidowej pochodnej DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal), 10-15 mol% cholesterolu, przy czym liposomowa postać kompleksu charakteryzuje się niską polidyspersyjnością Pl < 0,1 i zawiera przyłączoną cząsteczkę rozpoznającą marker powierzchniowy komórek patologicznych, przy czym miRNA stanowi MicroRNA-193b oraz MicroRNA-203. Korzystnie średnica tak uzyskanych liposomów nie przekracza 150 nm, korzystniej wynosi ona 120 nm (±20 nm) i korzystnie postać kompleksu charakteryzuje się niską polidyspersyjnością Pl < 0,1 miRNA (microRNA, MicroRNA) znane jest ze stanu techniki [microRNA-193b (Bhayadia R, et al., 2018, J. Clin. Onc. 36,1007) oraz MicroRNA-203 (Guo Y, et al., 2019 Bioengineered, 10:1,345-352)]. W korzystnej realizacji wynalazku otoczka liposomowa zawiera 77,15 mol% uwodornionej fosfatydylocholiny sojowej (HSPC), 5 mol% DOPE, 12,5 mol% cholesterolu, 4,55 mol% DSPE-PEG, 0,8 mol% maleimidowej pochodnej DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal). W innej korzystnej realizacji wynalazku stosunek RNA/PEI wynosi 1 : 5.
Cel liposomu wyznaczają antygeny CD33, CD34 oraz CD117 na komórkach blastycznych białaczki mieloblastycznej. W rozwiązaniu wg wynalazku otrzymuje się liposomy posiadające na swojej powierzchni korzystnie aptamery, cząsteczki oligodezoksynukleotydów, wiążące swoiście wskazane powyżej antygeny CD33, CD34 lub CD117. Sekwencje odpowiednich aptamerów są znane ze stanu techniki, gdzie:
- dla CD33 sekwencja AGT CTT TTC CGA CCC ATC TTA AAA CGGT [Yang C. and Naranmandura H, Biomater. Sci., 2019, 7, 938]),
- dla CD34 (5'-CTT TAA TGC GGG GTA ATT TCT TTT CCA TAA TCG C-3') [Deng J, Materials Science and Engineering C 79 (2017) 305-314],
- dla CD117 (c-kit) 5'GGGG CCGG GGCA AGGG GGGG GTAC CGTG GTAG GAC3' [Zhao N, et al. Biomaterials. 2015; 67: 42-51].
Powyższe aptamery syntetyzowane są w postaci zmodyfikowanej na końcu 3' poprzez dodanie grupy tiolowej umożliwiającej wiązanie z maleimidową pochodną DSPE-PEG.
Drugim przedmiotem wynalazku jest zastosowanie ukierunkowanej, liposomowej postaci kompleksu RNA-polietylenoimina, określonej w pierwszym przedmiocie wynalazku, do zastosowania w leczeniu ostrej białaczki szpikowej / ostrej białaczki mieloblastycznej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania liposomowej ukierunkowanej postaci kompleksu RNA/PEI, obejmujący:
a) mieszanie RNA z polietylenoiminą w stosunku od 1 : 4 do 1 : 7,
b) kompleksowanie mieszaniny RNA z PEI, korzystnie poprzez inkubację przez 30-60 min w temperaturze pokojowej 4-7 części molowych PEI (N) w wodzie o przewodności nie większej niż 0,06 μS/cm z 1 częścią molową (P) RNA, również w wodzie o przewodności nie większej niż 0,06 μS/cm, uzupełniając mieszaninę 0,1 objętości 10-krotnie stężonego PBS,
c) odparowywanie mieszaniny chloroformowych roztworów lipidów wchodzących w skład otoczki do uzyskania suchego filmu lipidowego,
d) usuwanie pozostałości rozpuszczalników organicznych, korzystnie w wyparce próżniowej,
e) uwadnianie się suchego filmu lipidowego z etapu d) mieszaniną, korzystnie RNA/PEI otrzymaną w etapie b), korzystniej przez 40 minut,
f) kalibrowanie uzyskanych w etapie e) liposomów, korzystnie w ekstruderze ciśnieniowym, stosując filtry poliwęglowe.
W korzystnej realizacji wynalazku w etapie f) stosuje się kolejno filtry 400 nm, 200 nm i 100 nm. W następnej korzystnej realizacji wynalazku filtrację w etapie f) powtarza się dziesięciokrotnie. W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku w etapie d) odparowuje się mieszaninę roztworów chloroformowych zawierających: 74,65-79,65 mol% uwodornionej fosfatydylocholiny sojowej (HSPC - hydrogenated soy L-a-phosphatidylcholine), 5 mol% dioleilofosfatydyloetanolaminy (DOPE - dioleoylphosphatidylethanolamine), 4,55 mol% distearoilofosfatydylo etanoloaminowej pochodnej glikolu polietylenowego 2000 (sól amonowa) (DSPE-PEG - 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]), 0,8 mol% maleimidowej pochodnej DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal), 10-15 mol% cholesterolu.
W jeszcze innej korzystnej realizacji wynalazku mieszanina roztworów chloroformowych zawiera: 77,15 mol% uwodornionej fosfatydylocholiny sojowej (HSPC), 5 mol% DOPE, 12,5 mol% cholesterolu, 4,55 mol% DSPE-PEG, 0,8 mol% maleimidowej pochodnej DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal).
Proponowany według niniejszego wynalazku, kierowany za pomocą aptamerów preparat charakteryzuje się korzystnym stosunkiem lipid/lek, który umożliwia przenoszenie inhibitorowych cząsteczek RNA do komórek docelowych, działając przeciwnowotworowo i/lub uwrażliwiając komórki nowotworowe na leki o charakterze cytostatycznym. Dodatkowo, odpowiednio „szczelna” otoczka lipidowa stanowi ochronę miRNA przed działaniem rybonukleaz. Możliwe jest zamykanie w liposomach różnych cząsteczek RNA, a także przyłączanie różnych cząstek kierujących do otoczki liposomowej. Wynalazek odznacza się wysoką selektywnością i cytotoksycznością względem komórek docelowych, potwierdzonymi badaniami in vitro i in vivo, przez co minimalizuje efekty uboczne terapii cytostatykami. Ponadto, przedstawiony preparat liposomowy podawany w drodze iniekcji dożylnych powinna cechować wysoka stabilność zarówno podczas wielomiesięcznego przechowywania, jak i w kontakcie z surowicą ludzką, co czyni go kandydatem do stanowienia obiecującej, odpowiedniej formulacji farmaceutycznej.
Rozwiązanie zapewnia potencjał bezpiecznego stosowania tej grupy leków w leczeniu nowotworów w formie indywidualnej monoterapii lub w połączeniu ze stosowanymi powszechnie cytostatykami lub inhibitorami BCL-2 (np. Venetoclax), a zatem może poprawić efektywność leczenia nowotworów. Przykład
Kompleks liposomów otrzymuje się jak poniżej:
a) RNA miesza się z polietylenoiminą (PEI - Polyethyleneimine) w stosunku 1 : 5, gdzie poprzez stosunek RNA/PEI rozumie się ilość moli fosforu (P) w kwasie nukleinowym do moli azotu (N) w polietylenoiminie,
b) mieszaninę RNA z PEI kompleksuje się, poprzez inkubację przez 30-60 min w temperaturze pokojowej 5 części molowych PEI (N) w wodzie miliQ (j.w. 0,06 μS/cm) z 1 częścią molową (P) RNA również w wodzie klasy miliQ, po czym uzupełnia się mieszaninę 1/10 projektowanej objętości końcowej preparatu 10-krotnie stężonego PBS (phosphate-buffered saline, buforowana fosforanem sól fizjologiczna, tu 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4),
c) mieszaninę chloroformowych roztworów lipidów, wchodzących w skład otoczki, o zawartości odpowiednio: 77,15 mol% uwodornionej fosfatydylocholiny sojowej (HSPC), 5 mol% DOPE, 12,5 mol% cholesterolu, 4,55 mol% DSPE-PEG, 0,8 mol% maleimidowej pochodnej DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal), odparowuje się do uzyskania suchego filmu lipidowego, po czym usuwa się pozostałości rozpuszczalników organicznych w wyparce próżniowej,
d) uwadnia się suchy film lipidowy z etapu c) mieszaniną, RNA/PEI otrzymaną w etapie b), przez przynajmniej 40 minut,
e) uzyskane w etapie d) liposomy kalibruje się, w ekstruderze ciśnieniowym, stosując filtry poliwęglanowe o średnicy porów 400, 200 oraz 100 nm kolejno (Nucleopore, WHATMAN), przy czym zawiesinę przeciska się dziesięciokrotnie przez każdy filtr,
f) uzyskane liposomy o średnicy ok. 100 nm (80-150 nm) inkubuje się przez noc z roztworem tiolowanego aptameru, wiążącego swoiście antygeny CD33, CD34 lub CD117, w dwukrotnym nadmiarze molowym aptameru w stosunku do maleimidowej pochodnej DSPE-PEG,
g) niezwiązany aptamer usuwa się poprzez chromatografię na kolumnie wypełnionej żelem Sepharose 6B (1 x 25 cm dla małych objętości) lub dializuje z zastosowaniem worków dializacyjnych o dużych porach (MWCO >30 kDa ),
h) uzyskany preparat liposomowy o średnicy 120 (+20 nm) charakteryzuje się niewielką polidyspersyjnością (współczynnik PI <0,1).
Wielkość otrzymanych pęcherzyków mierzy się techniką dynamicznego rozpraszania światła przy użyciu aparatu ZetaSizer, firmy Malvern Ltd., UK.
Celem uzyskania kompleksu liposomów wg wynalazku stosowano maleimidową pochodną DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal). Reszta maleimidowa umożliwia kowalencyjne przyłączenie grup tiolowych białka, tworząc wiązanie tioeterowe charakteryzujące się dużą trwałością. Grupy tiolowe w przyłączanych aptamerach projektuje się na etapie ich syntezy.

Claims (12)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina, zawierająca miRNA skompleksowane z polikationem polietylenoiminy (PEI - polyethyleneimine) w stosunku 1 : 4 do 1 : 7, zamknięte w otoczce liposomowej, zawierającej 74,65-79,65 mol% uwodornionej fosfatydylocholiny sojowej (HSPC - hydrogenated soy L-α-phosphatidylcholine), 5 mol% dioleilofosfatydyloetanolaminy (DOPE - dioleoylphosphatidylethanolamine), 4,55 mol% distearoilofosfatydyloetanoloaminowej pochodnej glikolu polietylenowego 2000 w postaci soli amonowej, (DSPE-PEG - 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]), 0,8 mol% maleimidowej pochodnej DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal), 10-15 mol% cholesterolu, przy czym liposomowa postać kompleksu charakteryzuje się niską polidyspersyjnością Pl < 0,1 i zawiera przyłączoną cząsteczkę rozpoznającą marker powierzchniowy komórek patologicznych, przy czym miRNA stanowi MicroRNA-193b oraz MicroRNA-203.
  2. 2. Ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina wg zastrz. 1, znamienna tym, że średnica tak uzyskanych liposomów nie przekracza 150 nm, korzystniej wynosi ona 120 nm (±20 nm).
  3. 3. Ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina wg zastrz. 1, znamienna tym, że otoczka liposomowa zawiera 77,15 mol% uwodornionej fosfatydylocholiny sojowej (HSPC), 5 mol% DOPE, 12,5 mol% cholesterolu, 4,55 mol% DSPE-PEG, 0,8 mol% maleimidowej pochodnej DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal).
  4. 4. Ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina wg zastrz. 1, znamienna tym, że cząsteczkę rozpoznającą marker powierzchniowy komórek patologicznych stanowią aptamery wiążące swoiście antygeny CD33, CD34 lub CD117.
  5. 5. Ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina wg zastrz. 1, znamienna tym, że stosunek RNA/PEI wynosi 1 : 5.
  6. 6. Ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina, określona w zastrz. 1, do zastosowania w leczeniu ostrej białaczki szpikowej / ostrej białaczki mieloblastycznej.
  7. 7. Sposób otrzymywana liposomowej ukierunkowanej postaci kompleksu RNA/PEI, określonej w zastrz. 1, obejmujący:
    a) mieszanie RNA z polietylenoiminą w stosunku molowym od 1 : 4 do 1 : 7 ,
    b) kompleksowanie mieszaniny RNA z PEI, korzystnie poprzez inkubację przez 30-60 min w temperaturze pokojowej 4-7 części molowych PEI (N) w wodzie o przewodności nie większej niż 0,06 μS/cm z 1 częścią molową (P) RNA, również w wodzie o przewodności nie większej niż 0,06 μS/cm, uzupełniając mieszaninę 0,1 objętości 10-krotnie stężonego PBS,
    c) odparowywanie mieszaniny chloroformowych roztworów lipidów wchodzących w skład otoczki do uzyskania suchego filmu lipidowego,
    d) usuwanie pozostałości rozpuszczalników organicznych, korzystnie w wyparce próżniowej,
    e) uwadnianie się suchego filmu lipidowego z etapu d) mieszaniną, korzystnie RNA/PEI otrzymaną w etapie b), korzystniej przez 40 minut,
    f) kalibrowanie uzyskanych w etapie e) liposomów, korzystnie w ekstruderze.
  8. 8. Sposób wg zastrz. 7, znamienny tym, że w etapie f) stosuje się kolejno filtry 400 nm, 200 nm i 100 nm.
  9. 9. Sposób wg zastrz. 7, znamienny tym, że w etapie a) RNA miesza się z PEI w stosunku 1 : 5.
  10. 10. Sposób wg zastrz. 7, znamienny tym, że filtrację w etapie f) powtarza się dziesięciokrotnie.
  11. 11. Sposób wg zastrz. 7, znamienny tym, że w etapie d) odparowuje się mieszaninę roztworów chloroformowych zawierających: 74,65-79,65 mol% uwodornionej fosfatydylocholiny sojowej (HSPC - hydrogenated soy L-a-phosphatidylcholine), 5 mol% dioleilofosfatydyloetanolaminy (DOPE - dioleoylphosphatidylethanolamine), 4,55 mol% distearoilofosfatydyloetanoloaminowej pochodnej glikolu polietylenowego 2000 (sól amonowa) (DSPE-PEG - 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]), 0,8 mol% maleimidowej pochodnej DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal), 10-15 mol% cholesterolu.
  12. 12. Sposób wg zastrz. 11, znamienny tym, że mieszanina roztworów chloroformowych zawiera: 77,15 mol% uwodornionej fosfatydylocholiny sojowej (HSPC), 5 mol% DOPE, 12,5 mol% cholesterolu, 4,55 mol% DSPE-PEG, 0,8 mol% maleimidowej pochodnej DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal).
PL438023A 2021-05-31 2021-05-31 Ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina, zastosowanie postaci kompleksu liposomowego oraz sposób otrzymywania PL245879B1 (pl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL438023A PL245879B1 (pl) 2021-05-31 2021-05-31 Ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina, zastosowanie postaci kompleksu liposomowego oraz sposób otrzymywania
PCT/PL2022/000035 WO2022255891A1 (en) 2021-05-31 2022-05-31 A targeted liposomal form of an rna-polyethyleneimine complex, use of the form of the liposomal complex and a preparation process thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL438023A PL245879B1 (pl) 2021-05-31 2021-05-31 Ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina, zastosowanie postaci kompleksu liposomowego oraz sposób otrzymywania

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL438023A1 PL438023A1 (pl) 2022-12-05
PL245879B1 true PL245879B1 (pl) 2024-10-28

Family

ID=84323488

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL438023A PL245879B1 (pl) 2021-05-31 2021-05-31 Ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina, zastosowanie postaci kompleksu liposomowego oraz sposób otrzymywania

Country Status (2)

Country Link
PL (1) PL245879B1 (pl)
WO (1) WO2022255891A1 (pl)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118453517B (zh) * 2024-07-15 2024-10-08 杭州珞米医疗科技有限公司 一种靶向结合ldlr的组合物及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL407947A1 (pl) * 2014-04-18 2015-10-26 Wrocławskie Centrum Badań Eit + Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Ukierunkowana, liposomowa postać kompleksu oligonukleotyd-polietylenoimina, jej zastosowanie oraz sposób otrzymywania

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022255891A1 (en) 2022-12-08
PL438023A1 (pl) 2022-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xi et al. Drug loading techniques for exosome-based drug delivery systems
CN102300556B (zh) 含有阴离子药物的药物组合物及其制备方法
Han et al. Novel cationic cholesterol derivative-based liposomes for serum-enhanced delivery of siRNA
Gallas et al. Chemistry and formulations for siRNA therapeutics
Kim et al. Highly tumor-specific DNA nanostructures discovered by in vivo screening of a nucleic acid cage library and their applications in tumor-targeted drug delivery
US20100285111A1 (en) Self-assembling micelle-like nanoparticles for systemic gene delivery
KR20100085079A (ko) 핵산 유전자 전달용 저밀도 지단백질 유사(ＬＤＬ―ｌｉｋｅ) 양이온성 나노입자, 그의 제조방법 및 이를 이용한 핵산 유전자의 전달 방법
JP2002538096A (ja) 生理活性複合体のリポソームへのカプセル化
ES2832330T3 (es) Vector para administración pulmonar, agente inductor y usos
WO2011108955A1 (en) Multi -targeting system comprising a nanocarrier, nucleic acid(s) and non-nucleic acid based drug(s)
PL208054B1 (pl) Kompozycja lipidowa do wytwarzania lipidowego nośnika dla leków genetycznych i jej zastosowanie
PL245879B1 (pl) Ukierunkowana liposomowa postać kompleksu RNA-polietylenoimina, zastosowanie postaci kompleksu liposomowego oraz sposób otrzymywania
CN104095814A (zh) 一种三嵌段聚合物胶束、制备方法及应用
WO2023099722A1 (fr) Nanoparticules pour la liberation d&#39;acides nucleiques
JPWO2014030601A1 (ja) アニオン性を有する新規ナノバブルポリ−リポ・プレックスの製造方法
JP2022075622A (ja) 薬物送達キャリア及びそれを用いて多種類の治療剤を共同送達する医薬製剤
CN106913880B (zh) 一种含有rspo1的靶向给药系统及其制备与应用
CN116199666B (zh) 两亲性化合物及其药物组合物
Jung et al. Linear polyethyleneimine-doxorubicin conjugate for pH-responsive synchronous delivery of drug and microRNA-34a
KR20240050281A (ko) 고분자 핵산 전달용 생체막-양친성 고분자 하이브리드 나노소낭
Kanvinde et al. Non-viral gene therapy vectors for cancer treatment
CN110960536B (zh) 含阿司匹林的药物、其制备方法、药物组合物及应用
Grant-Serroukh Lipid nanoparticles for mRNA-mediated cancer therapy
Muralidharan et al. Lipid Nanocarriers for RNAi-Based Cancer Therapy
Alhazza Investigating a Hybrid Cyclic/Linear and Linear Peptides as Vehicles for Nucleic Acid Delivery