PL243516B1 - Nowe pochodne 9H-fluorenu lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole - Google Patents

Nowe pochodne 9H-fluorenu lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole Download PDF

Info

Publication number
PL243516B1
PL243516B1 PL434014A PL43401420A PL243516B1 PL 243516 B1 PL243516 B1 PL 243516B1 PL 434014 A PL434014 A PL 434014A PL 43401420 A PL43401420 A PL 43401420A PL 243516 B1 PL243516 B1 PL 243516B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
amino
phenylbutan
mmol
dcm
fluoren
Prior art date
Application number
PL434014A
Other languages
English (en)
Other versions
PL434014A1 (pl
Inventor
Dawid PANEK
Dawid Panek
Barbara MALAWSKA
Barbara Malawska
Anna PASIEKA
Anna Pasieka
Jakub JOŃCZYK
Jakub Jończyk
Anna WIĘCKOWSKA
Anna Więckowska
Justyna GODYŃ
Justyna Godyń
Natalia SZAŁAJ
Natalia Szałaj
Marek BAJDA
Marek Bajda
Kinga SAŁAT
Kinga Sałat
Original Assignee
Univ Jagiellonski
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Jagiellonski filed Critical Univ Jagiellonski
Priority to PL434014A priority Critical patent/PL243516B1/pl
Priority to US17/907,152 priority patent/US20230117233A1/en
Priority to PCT/PL2021/050033 priority patent/WO2021235956A2/en
Priority to EP21745463.6A priority patent/EP4153561A2/en
Publication of PL434014A1 publication Critical patent/PL434014A1/pl
Publication of PL243516B1 publication Critical patent/PL243516B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C215/00—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C215/02—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C215/22—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being unsaturated
    • C07C215/28—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being unsaturated and containing six-membered aromatic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C217/00—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C217/54—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of at least one six-membered aromatic ring and amino groups bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
    • C07C217/56—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of at least one six-membered aromatic ring and amino groups bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton with amino groups linked to the six-membered aromatic ring, or to the condensed ring system containing that ring, by carbon chains not further substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C217/58—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of at least one six-membered aromatic ring and amino groups bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton with amino groups linked to the six-membered aromatic ring, or to the condensed ring system containing that ring, by carbon chains not further substituted by singly-bound oxygen atoms with amino groups and the six-membered aromatic ring, or the condensed ring system containing that ring, bound to the same carbon atom of the carbon chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/02—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C07C233/11—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/34—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups
    • C07C233/35—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/40—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to an acyclic carbon atom of a carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/57—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C233/62—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/02—Systems containing only non-condensed rings with a three-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14—The ring being saturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
    • C07C2603/02—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems
    • C07C2603/04—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings
    • C07C2603/06—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings containing at least one ring with less than six ring members
    • C07C2603/10—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings containing at least one ring with less than six ring members containing five-membered rings
    • C07C2603/12—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings containing at least one ring with less than six ring members containing five-membered rings only one five-membered ring
    • C07C2603/18—Fluorenes; Hydrogenated fluorenes

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest grupa nowych pochodnych 9H-fluorenu nadających się do wytwarzania substancji czynnych przeznaczonych do leczenia choroby Alzheimera, zwłaszcza jako wielofunkcyjnych inhibitorów enzymów BuChE, BACE1 oraz agregacji beta-amyloidu.

Description

Wynalazek dotyczy nowych pochodnych 9H-fluorenu lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, które stanowią związki o charakterze ligandów wielofunkcyjnych o potencjalnym wpływie na chorobę Alzheimera.
Jedną z nieuleczalnych chorób wymagających kompleksowego podejścia jest neurodegeneracyjna choroba Alzheimera (Alzheimeds disease, AD). Charakteryzuje się osłabieniem funkcji poznawczych i jest najczęściej występującym przewlekłym, postępującym rodzajem demencji. Dotyka głównie osób starszych po 65. roku życia. Obecnie szacuje się, że na całym świecie liczba chorych na demencję wynosi około 50 min, z czego chorzy na Alzheimera stanowią 60-80%. Jest ona schorzeniem nieuleczalnym, a jej patomechanizm nadal nie został w pełni wyjaśniony.
Kluczowymi zmianami neuropatologicznymi obserwowanymi w chorobie Alzheimera jest powstawanie zewnątrzneuronalnych agregatów peptydu β-amyloidu (Αβ) oraz wewnątrzkomórkowych splotów neurofibrylarnych powstających z nadmiernie fosforylowanego białka tau, które rozwijają się w obszarach mózgu odpowiedzialnych za procesy pamięciowe i funkcje poznawcze. Ponadto patomechanizm choroby obejmuje procesy takie jak ekscytotoksyczność, neurozapalenie, uszkodzenie mitochondriów, stres oksydacyjny, prowadzące do uszkodzenia funkcji neuronów, zaburzeń neuroprzekaźnictwa, postępującej neurodegeneracji i śmierci neuronów, a dalej demencji.
Wieloczynnikowy charakter choroby Alzheimera i jej złożoność stanowi problem w znalezieniu skutecznych sposobów jej zahamowania czy też leczenia. Aktualnie w terapii choroby stosowane są jedynie cztery leki (ostatni został zarejestrowany w 2003 roku) o ograniczonej skuteczności, działające jedynie objawowo w początkowych etapach choroby. Brak jest skutecznych leków, które działałyby na jej przyczyny.
Istnieje zatem pilna potrzeba odkrycia nowych bioaktywnych cząsteczek, a w przyszłości nowego leku działającego u podstaw powstawania AD.
Szczególnie pożądane jest uzyskanie związków będących ligandami wielofunkcyjnymi, które oddziaływałyby jednocześnie na różne znane obecnie mechanizmy związane z patogenezą i przebiegiem choroby Alzheimera, w szczególności związków pozwalających na jednoczesne hamowanie enzymów: butyrylocholinoesterazy i β-sekretazy oraz hamowanie agregacji β-amyloidu.
Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze I:
wzór I gdzie:
n lub m oznacza liczbę całkowitą o wartości 0 lub 1,
Ri stanowi atom wodoru lub grupę metylową,
R2 stanowi atom wodoru lub grupę metylową,
R3 stanowi atom wodoru, grupę metylową, trifluorometylową, tert-butylową, cyklopropylową, cykloheksylową lub fenylową bez podstawnika lub z podstawnikiem 2, 3 lub 4-metoksylowym, 2, 3 lub 4-trifluorometylowym, 2, 3 lub 4-izopropylowym lub 2, 3 lub 4-fe/'f-butylowym, lub jego farmaceutycznie dopuszczalne sole.
PL 243516 Β1
Korzystnie, związek według wynalazku jest związkiem o wzorze II:
wzór II gdzie:
Ri, R2 i R3 oznaczają grupy określone powyżej.
Korzystnie, związek według wynalazku został wybrany z grupy obejmującej: (2R,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-1-(benzylamino)-4-fenylobutan-2-ol, (2S,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-1-(benzyloamino)-4-fenylobutan-2-ol, (2R,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-1-((3-(ferf-butylo)benzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, (2R,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-1-((3-izopropylobenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, (2S,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-1-((4-(ferf-butylo)benzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, (2S,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-1-((3-metoksybenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, (2S,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-1-((2-metoksybenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, (2R,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-4-fenylo-1-((3-(trifluorometylo)benzylo)amino)-butan-2-ol, (2R,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-4-fenylo-1-(((S)-1-fenyloetylo)amino)butan-2-ol, (2R,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-4-fenylo-1-((2-fenylopropan-2-ylo)amino)butan-2-ol, (2S,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-1-((cykloheksylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, (2S,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-1-(ferf-butyloamino)-4-fenylobutan-2-ol, (2R,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-1-(neopentyloamino)-4-fenylobutan-2-ol, (2R,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-4-fenylo-1-((2,2,2-trifluoroetylo)amino)butan-2-ol, (2S,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-1-((cyklopropylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, (2R,3S)-3-((9/-/-fluoren-9-ylo)amino)-1-((cyklopropylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, A/-((2S,3S)-4-(benzyloamino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)-2-(9/-/-fluoreno-9-ylo)acetamid, A/-((2S,3S)-4-((4-(ferf-butylo)benzylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)-9/-/-fluoreno-9-karboksyamid, A/-((2S,3S)-4-((4-(terf-butylo)benzylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)-2-(9/-/-fluoreno-9-ylo)acetamid, 2-(9/-/-fluoreno-9-ylo)-A/-((2S,3S)-3-hydroksy-4-((2-metoksybenzylo)amino)-1-fenylobutan-2-ylo)acetamid, 2-(9/-/-fluoren-9-ylo)-A/-((2S,3R)-3-hydroksy-1-fenylo-4-((3-(trifluorometylo)benzylo)-amino)butan-2-ylo)acetamid, A/-((2S,3R)-3-hydroksy-1-fenylo-4-(((S)-1-fenyloetylo)amino)butan-2-ylo)-9/-/-fluoreno-9-karboksyamid, 2-(9/-/-fluoren-9-ylo)-A/-((2S,3R)-3-hydroksy-1-fenylo-4-(((S)-1-fenyloetylo)amino)butan-2-ylo)acetamid, A/-((2S,3R)-3-hydroksy-1-fenylo-4-((2-fenylopropan-2-ylo)amino)butan-2-ylo)-9/-/-fluoreno-9-karboksyamid, 2-(9/-/-fluoren-9-ylo)-A/-((2S,3R)-3-hydroksy-1-fenylo-4-((2-fenylopropan-2-ylo)amino)-butan-2-ylo)acetamid, A/-((2S,3R)-3-hydroksy-4-(neopentyloamino)-1-fenylobutan-2-ylo)-9/-/-fluoreno-9-karboksyamid, 2-(9/-/-fluoren-9-ylo)-A/-((2S,3R)-3-hydroksy-4-(neopentyloamino)-1-fenylobutan-2-ylo)acetamid i A/-((2S,3R)-4-((cyklopropylometylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)-2-(9/-/-fluoren-9-ylo)acetamid.
Związki stanowiące korzystne realizacje wynalazku zostały zaprezentowane w Tabeli 1 poniżej.
PL 243516 Β1
Tabela 1
Przykładowe związki według wynalazku.
Nazwa Struktura SMILES
(1) Η 9H H A O Ό O[C@H](CNCC1=CC=CC=C1)[C@ H](CC2=CC=CC=C2)NC3C4=C(C= CC=C4)C5=C3C=CC=C5
(2) H ?H H A O Ό O[C@@H](CNCC 1=CC=CC=C 1)[C @H](C C2=C C=C C=C2)NC 3 C4-C ( C=CC=C4)C5=C3C=CC=C5
(3) Η Η Π V .ΆύN N O O O[C@H](CNCC 1=CC(C(C)(C)C)=C C=C1)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N C3C4=C(C=CC=C4)C5=C3C=CC= C5
(4) /^\ η 9H Η Π] O Ό 0[C@H](CNCC 1=CC(C(C)C)=CC= C1 )[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC3 C4=C(C=CC=C4)C 5=C 3C=C C=C5
(5) Η ?H Η ΠΡ O Χί 0[C@@H](CNCC 1=CC=C(C(C)(C) C)C=C 1 )[C@H](CC2=CC=CC=C2) NC3C4=C(C=CC=C4)C5=C3C=CC =C5
(6) o— q p.p IZ X~O O[C@@H](CNCC1=CC(OC)=CC= C1)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC3 C4=C(C=CC=C4)C5=C3C=CC=C5
(7) Γ) zz '°h 0 [C@@H] (CNCC 1=C(OC)C=CC= C 1)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC3 C4=C(C=CC=C4)C5=C3C=CC=C5
PL 243516 Β1
(8) d& π -η O[C@H](CNCC 1=CC(C(F)(F)F)=C C=C1)[C@FI](CC2=CC=CC=C2)N C3C4-C(C-CC-C4)C5-C3C~CCC5
(9) ΛΛ η 9H h A O O O[C@H](CN[C@@H](C)C 1=CC=C C=C1)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N C3C4=C(C=CC=C4)C5=C3C=CC= C5
(10) Η 9H Η Π] O Ό O[C@H](CNC(C)(C)C1=CC=CC=C 1)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC3C4 =C(C=CC=C4)C5=C3C=CC=C5
(U) Z-\ Η ?H H O O Ό O[C@@H](CNCC1CCCCC1)[C@H ](CC2=CC=CC=C2)NC3C4=C(C=C C=C4)C5=C3C=CC=C5
(12) Z-Λ Η ?H H O Ό O[C@@H](CNC(C)(C)C)[C@H](C C1 =CC=CC=C 1)NC2C3=C(C=CC= C3)C4=C2C=CC=C4
(13) ΛΛ Η ?H H 1/ d-^-N O O O[C@H](CNCC(C)(C)C)[C@H](C C 1=CC=CC=C1)NC2C3=C(C=CC= C3)C4=C2C=CC=C4
(14) /=^ H QH Η ί F / \ π - π . Γ V>yN^^.N^AF Μ Ό O[C@H](CNCC(F)(F)F)[C@H](CC 1=CC=CC=C1)NC2C3=C(C=CC=C 3)C4=C2C=CC=C4
(15) ^9 T.~Z. J~~O O[C@@H](CNCC1CC1)[C@H](CC 2=CC=CC=C2)NC3C4=C(C=CC=C 4)C5=C3C=CC=C5
PL 243516 Β1
JT-3 (16) η 9Η η Λ Ο Ό O[C@H](CNCClCCl)rC@H](CC2 =CC=CC=C2)NC3C4=C(C=CC=C4 )C5=C3C=COC5
(17) d'& ^j> O=C(N[C@H]([C@@H](O)CNCC 1 -CC-CC-C1 )CC2=CC=CC=C2)CC 3C4=C(C=CC=C4)C5=C3C=CC=C 5
(18) Ο ρ λγ η ?Η η ° Μ O=C(N[C@H]([C@@H](O)CNCC 1 =CC=C(C(C)(C)C)C=C 1 )CC2=CC= CC=C2)C3C(C=CC=C4)=C4C5=C3 C=CC=C5
(19) /^\ Η 9Η Η Π| ο υ O=C(N[C@H]([C@@H](O)CNCC 1 =CC=C(C(C)(C)C)C=C 1 )CC2=CC= CC C2)CC3C4-C(C=CC-C4)C5 C 3C=CC=C5
(20) Ζ=\ Η ?Η Η Π ° °\ Ο U O=C(N[C@H]([C@@H](O)CNCC 1 =C(OC)C=CC=C 1)CC2=CC=CC=C 2)CC3C4=C(C=CC=C4)C5=C3C=C C=C5
(21) /^χθ ο ΖΙ ό| O=C(N[C@H]([C@H](O)CNCC1 = CC(C(F)(F)F)=CC=C1)CC2=CC=C C=C2)CC3C4=C(C=CC=C4)C5=C3 C=CC=C5
(22) ο /Ύ η 9Η η Π Ν Ν 0 = Μ O=C(N[C@H]([C@H](O)CN[C@@ H](C)C 1 -CC-CC=C 1 )CC2-CC=CC =C2)C3C(C=CC=C4)=C4C5=C3C= CC=C5
PL 243516 Β1
(23) H 9H H A O U 0=C(N[C@H]([C@H](0)CN[C@@ llj(C)Cl-CC-CC-Cl)CC2-CC-CC =C2)CC3C4=C(C=CC=C4)C5=C3C CC C5
(24) o H 9H Η Π] O ' u 0=C(N[C@H]([C@H](0)CNC(C)( OCI-CC CC CCCC2 cc-cc C 2)C3C(C-CC-C4)-C4C5-C3C-CC =C5
(25) IZ 5=o 0=C(N[C@H]([C@H](0)CNC(C)( C)C 1=CC=CC=C 1)CC2=CC=CC=C 2)CC3C4=C(C=CC=C4)C5=C3C=C C=C5
(26) O /Ί Η OH Η | ___( l Π - ΙΊ \ s N χ/'Χ/ N χ/Χ o 0=C(N[C@H]([C@H](0)CNCC(C) (C)C)CC 1=CC=CC=C 1 )C2C(C=CC =C3)=C3C4=C2C=CC=C4
(27) H 9H H O U 0=C(N[C@H]([C@H](0)CNCC(C) (C)C)CC 1-CC-CC-C1 )CC2C3=C( C=CC=C3)C4=C2C=CC=C4
(28) H 9H Η Λ O U 0=C(N[C@H]([C@H](0)CNCC 1C C1 )CC2=CC=CC=C2)CC3C4=C(C= CC=C4)C5-C3C-CC=C5
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest związek określony powyżej do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu choroby Alzheimera, zwłaszcza jako wielofunkcyjny inhibitor enzymów BuChE, BACE1 oraz agregacji beta-amyloidu.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie nowych pochodnych 9/-/-fluorenu określonych wzorem 1 do wytwarzania substancji czynnych przeznaczonych do leczenia choroby Alzheimera, zwłaszcza jako wielofunkcyjnych inhibitorów enzymów BuChE i BACE1 oraz agregacji beta-amyloidu.
PL 243516 Β1
Przedmiotem wynalazku są zatem nowe związki o charakterze ligandów wielofunkcyjnych o potencjalnym wpływie na chorobę Alzheimera, zarówno poprzez modyfikację przebiegu choroby, jak i łagodzenie jej objawów.
Nowe związki zostały zaprojektowane zgodnie z koncepcją ligandów wielofunkcyjnych. Mianem tym określane są cząsteczki działające na więcej niż jeden cel biologiczny, wywołując dzięki temu kompleksowe działanie w danej jednostce chorobowej. Osiągnięcie tego efektu jest możliwe, dzięki połączeniu w jednej cząsteczce fragmentów strukturalnych odpowiedzialnych za wiązanie z różnymi celami biologicznymi. Zastosowanie liganda wielofunkcyjnego pozwala zmniejszyć ilość przyjmowanych leków, a zatem uprościć terapię. Obniża także ryzyko wystąpienia potencjalnych interakcji z innymi przyjmowanymi lekami.
Nowa grupa związków będąca przedmiotem wynalazku została zsyntetyzowana i w badaniach doświadczalnych in vitro zostało potwierdzone jej wielokierunkowe działanie biologiczne - hamowanie enzymów: butyrylocholinoesterazy i β-sekretazy oraz hamowanie agregacji β-amyloidu. Poprzez działanie hamujące na enzym β-sekretazę oraz agregację β-amyloidu, nowe cząsteczki mogą stać się nową terapią w chorobie Alzheimera, ingerującą w przyczyny jej powstawania. Hamowanie enzymu butyrylocholinoesterazy może korzystnie łagodzić objawy choroby.
Związki wielofunkcyjne będące przedmiotem wynalazku charakteryzują się korzystnymi właściwościami lekopodobnymi oraz unikatowymi właściwościami biologicznymi.
Badania in vivo na zwierzętach wykazały skuteczność testowanego liganda wielofunkcyjnego, w modelach poprawy upośledzonych funkcji pamięciowych.
Związki wielofunkcyjne będące przedmiotem wynalazku zostały zsyntetyzowane, została potwierdzona ich struktura chemiczna, a w badaniach biologicznych ich aktywność.
Wyniki testów biologicznych wskazują na ich potencjał terapeutyczny w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych, w szczególności choroby Alzheimera.
Dla lepszego zrozumienia jego istoty, wynalazek został dodatkowo wyjaśniony na poniższych przykładach.
Ogólna procedura syntezy związków:
Reakcję otrzymywania związków 1-28 według wzoru 1 wynalazku prowadzi się w czterech etapach przedstawionych na schemacie 1:
Schemat 1. Warunki reakcji: (i) odpowiednia amina, pirydyna (kat. ilość), n-propanol/izopropanol, temp, wrzenia, 16 h; (ii) TFA, DCM, temp, pokojowa, 2 h; (iii) 9-bromo-9/-/-fluoren, K2CO3, acetonitryl, temp, pokojowa, 16 h; (iv) kwas 9/-/-fluoreno-9-karboksylowy/kwas 9/7fluoreno-9-octowy, EDC, HOBt, DMAP, DCM, temp, pokojowa, 24 h.
Etap 1 (2S,3S)-3-[(fe/'f-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutan lub (2R,3S)-3-[(fe/'f-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutan (1 ekwiwalent) i odpowiednią aminę (1-2 ekwiwalenty) rozpuszczono w n-propanolu lub izopropanolu. Dodano katalityczną ilość pirydyny i mieszano w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przez 16 godzin. Następnie, rozpuszczalnik został oddestylowany, a otrzymana pozostałość została oczyszczona za pomocą chromatografii kolumnowej typu „flash” używając mieszaniny dichlorometanu (DCM) i metanolu (izokratyczny lub gradientowy rozdział).
Etap 2
Kolejnym etapem była deprotekcja grupy aminowej. Odpowiednią pochodną otrzymaną w pierwszym etapie rozpuszczono w dichlorometanie. Następnie, do roztworu wkroplono kwas trifluorooctowy (TFA) (5 mL/1 mmol substratu). Mieszaninę reakcyjną pozostawiono na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu reakcji, rozpuszczalnik i kwas oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a powstałą pozostałość rozpuszczono w wodnym roztworze amoniaku i ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne osuszono przy użyciu bezwodnego siarczanu (VI) sodu, przesączono i zagęszczono.
Etap 3 ‘
Aminowe związki finalne otrzymywano w wyniku reakcji substytucji nukleofilowej 9-bromo-9H-fluorenu (1 ekwiwalent) z pierwszorzędową grupą aminową produktu otrzymanego w etapie 2 (1 ekwiwalent). Reakcje te prowadzono w obecności węglanu potasu (2 ekwiwalenty) w acetonitrylu przez 16 h w temperaturze pokojowej. Produkt finalny oczyszczono za pomocą ekstrakcji (woda/octan etylu) i chromatografii kolumnowej typu „flash” używając mieszaniny rozpuszczalników dichlorometanu i metanolu (izokratyczny lub gradientowy układ).
Etap 4
Amidowe związki finalne otrzymywano w reakcji pomiędzy odpowiednim kwasem i aminą otrzymaną w etapie 2 w obecności czynników sprzęgających oraz zasady. Do roztworu kwasu 9H-fluoreno-9-karboksylowego lub 9H-fluoreno-9-octowego (1 ekwiwalent) w bezwodnym dichlorometanie (10 mL/1 mmol substratu) dodano w kolejności dimetyloaminopirydyny (DMAP, 0.5 ekwiwalentu), hydroksybenzotriazolu (HOBt, 1.3 ekwiwalentu) oraz 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC, 1.3 ekwiwalentu). Mieszaninę reakcyjną pozostawiono na pół godziny w temperaturze pokojowej, a następnie dodano odpowiednio 1-podstawiony 1,3-diamino-4-fenylobutan-2-ol (1 ekwiwalent). Całość pozostawiono na 24 h w temperaturze pokojowej. Produkt finalny oczyszczono za pomocą ekstrakcji (woda/dichlorometan) i chromatografii kolumnowej typu „flash” używając dichlorometanu i metanolu (izokratyczny lub gradientowy układ).
Metody analityczne
Widma protonowego rezonansu magnetycznego (1H NMR) rejestrowano przy 300 lub 500 MHz, widma węglowego rezonansu magnetycznego (13C NMR) rejestrowano przy 75 lub 126 MHz używając spektrometru Mercury-300 „Varian” lub Jeol 500, stosując tetrametylosilan (TMS) jako standard wewnętrzny. Jako rozpuszczalnik próbek związków stosowano deuterowany chloroform CDCl3. Wartości J przedstawiono w jednostkach hertz (Hz); s (singlet), br. s (szeroki singlet), d (dublet), dd (dublet dubletów), br. d (szeroki dublet), br. dd (szeroki dublet dubletów), ddd (dublet dubletów dubletów), dt (dublet tripletów), dtt (dublet tripletów tripletów), dtd (dublet tripletów dubletów), t (triplet), br. t (szeroki triplet), td (triplet dubletów), tt (triplet tripletów), q (kwartet), qd (kwartet dubletów), m (multiplet).
Analiza chromatografii cieczowej ze spektrometrem masowym (LC-MS) została wykonana na aparacie Acquity TQD firmy Waters, zaopatrzonym w kolumnę Acquity UPLC BEH C18 1.7 μm, (2.1x100 mm). Rozdział prowadzono w następujących warunkach: przepływ 0.3 mL/min w gradiencie wody (+0.1% HCOOH) i acetonitrylu (+0.1% HCOOH) w czasie 10 minut. Zastosowano detektor UV DAD w zakresie 200-700 nm. W analizie masowej zastosowano metodę jonizacji elektrosprej przy potencjale kapilary 3 kV.
Związki oczyszczano metodą zautomatyzowanej chromatografii kolumnowej typu „flash” lub metodą wysokosprawnej preparatywnej chromatografii cieczowej, kolumnowej (HPLC). „Flash” chromatografię wykonywano na aparacie Isolera One firmy Biotage. Jako wypełnienie kolumn stosowano żel krzemionkowy o wielkości porów 50 μm. Preparatywne HPLC wykonywano na aparacie LC-4000 firmy Jasco. Zastosowano kolumnę Phenomenex Luna C8 5 μm (15x21.2 mm) oraz gradient H2O/CH3CN z dodatkiem 0.1% kwasu mrówkowego.
Chromatografię cienkowarstwową (TLC) wykonywano na płytkach z folii aluminiowej, powleczonej żelem krzemionkowym 60 F 254 o grubości 0.2 mm (Merck). W celu identyfikacji plam używano lampy UV przy długości fali λ = 254 nm oraz roztworu wywołującego z ninhydryną.
Przykład 1. Synteza związków 1 -28 według wzoru 1:
Przykład 1.1. Synteza związku 1
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2 S ,3 R )-4-(benzyloamino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminian (1A)
Reakcję (2 S ,3 S )-3-[( tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (2 g, 7.6046 mmol) z benzyloaminą (0.893 g, 8.3651 mmol) w obecności katalitycznej ilości pirydyny w 40 mL izopropano lu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 1.788 g (63.5%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.38, MW 370.49, Wzór: C22H30N2O3, MS m/z 371.24 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.32-7.39 (m, 4H), 7.25-7.32 (m, 3H), 7.17-7.24 (m, 3H), 4.68 (d, J = 9.17 Hz, 1H), 3.88-4.02 (m, 1H), 3.75-3.88 (m, 2h), 3.51-3.61 (m, 1H), 3.42 (br. s, 2H), 3.01 (d, J = 13.75 Hz, 1H), 2.73-2.91 (m, 3H), 1.20-1.39 (m, 9H).
(2 R ,3 S )-3-amino-1-(benzyloamino)-4-fenylobutan-2-ol (1B)
Reakcję tert-butylo ((2 S ,3 R )-4-(benzyloamino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminianu (1A) (0.700 g, 2.589 mmol) z 2 mL TFA w 1 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2.
Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.440 g (86.14%), TLC (DCM/MeOH/NH3(aq), 9/0.5/0.05 ν/ν/ν) Rf = 0.32, MW 270.38, Wzór: C17H22N2O, MS m/z 271.28 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.11-7.40 (m, 10H), 3.77-3.90 (m, 2H), 3.63 (ddd, J = 8.31, 4.87, 3.44 Hz, 1H), 3.10-3.16 (m, 1H), 2.81-2.97 (m, 3H), 2.72-2.81 (m, 1H), 2.47 (dd, J = 13.46, 10.02 Hz, 1H), 2.24 (br. s, 3H).
(2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1 -(benzylamino)-4-fenylobutan-2-ol (1)
Reakcję pomiędzy (2R,3S)-3-amino-1-(benzyloamino)-4-fenylobutan-2-olem (1B) (200 mg,
0.7397 mmol) i 9-bromo-9H-fluorenem (181.3 mg, 0.7397 mmol) w obecności węglanu potasu (204.5 mg, 1.4794 mmol) w 6 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 107 mg (33.30%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.38, MW 434.58, Wzór: C30H30N2O, MS m/z 435.49 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.66-7.74 (m, 2H), 7.62 (d, J = 7.45 Hz, 1H), 7.27-7.41 (m, 8H), 7.13-7.25 (m, 5H), 6.98-7.13 (m, 2H), 4.96 (s, 1H), 3.62-3.90 (m, 2H), 3.59 (dt, J = 9.59, 4.65 Hz, 1H), 3.00 (dt, J = 9.17, 4.58 Hz, 1H), 2.80-2.95 (m, 2H), 2.73 (dd, J = 13.75, 4.58 Hz, 1H), 2.59 (br. s, 3H), 2.43 (dd, J = 13.46, 9.45 Hz, 1H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 144.38, 144.00, 141.29, 140.98, 139.23, 138.85, 129.37, 129.16, 128.69, 128.59, 128.48,
128.41, 127.65, 127.57, 127.22, 126.40, 125.70, 125.33, 120.33, 120.00, 69.977, 66.08, 56.17, 55.51, 53.39, 38.92.
Przykład 1.2. Synteza związku 2
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2 S ,3 S )-4-(benzyloamino)-3-hydroksy-1 -fenylobutan-2-ylo)karbaminian (2A)
Reakcję (2 R ,3 S )-3-[( tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (2 g, 7.6046 mmol) z benzyloaminą (0.893 g, 8.3651 mmol) w obecności katalitycznej ilości pirydyny w 40 mL izopropanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (2-8% MeOH w DCM). Wydajność: 1.33 g (46.97%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.38, MW 370.49, Wzór: C22H30N2O3, MS m/z 371.50 (M+H+), 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.17-7.38 (m, 10H), 4.97 (d, J = 9.38 Hz, 1H), 3.66-3.81 (m, 3H), 3.54-3.62 (m, 1H), 2.82-3.00 (m, 2H), 2.56-2.73 (m, 2H), 2.31 (br. s, 2H), 1.32-1.46 (m, 9H).
(2 S ,3 S )-3-amino-1 -(benzyloamino)-4-fenylobutan-2-ol (2B)
Reakcję tert-butylo ((2 S ,3 S )-4-(benzyloamino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-yl(karbaminianu (2A) (0.330 g, 1.222 mmol) z 1 mL TFA w 0.5 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.220 g (91.36%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.28, MW 270.38, Wzór: C17H22N2O, MS m/z 271.42 (M+H+), 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.15-7.36 (m, 10H), 3.73-3.86 (m, 2H), 3.53 (dt, J = 7.77, 4.03 Hz, 1H), 2.81-2.99 (m, 2H), 2.78 (d, J = 4.10 Hz, 1H), 2.66-2.74 (m, 1H), 2.53 (dd, J = 13.19, 9.08 Hz, 1h), 1.95 (br. s, 4H).
(2 S ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-(benzyloamino)-4-fenylobutan-2-ol (2)
Reakcję pomiędzy (2S,3S)-3-amino-1-(benzyloamino)-4-fenylobutan-2-olem (2B) (100 mg, 0.3698 mmol) i 9-bromo-9 H-fluorenem (90.6 mg, 0.3698 mmol) w obecności węglanu potasu (102 mg, 0.7396 mmol) w 3 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 28.6 mg (17.80%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.38, MW 434.58, Wzór: C30H30N2O, MS m/z 435.31 (M+H+), 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.62-7.74 (m, 4H), 7.10-7.43 (m, 14H), 4.95 (s, 1H), 3.70 (s, 2H), 3.50 (ddd, J = 8.21, 5.27, 3.52 Hz, 1H), 2.93 (ddd, J = 8.79, 5.27, 3.52 Hz, 1H), 2.71 (dd, J = 13.48, 5.27 Hz, 1H), 2.56-2.67 (m, 2H), 2.50 (dd, J = 13.48, 8.79 Hz, 1H), 1.47 (br. s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 144.33, 144.27, 141.11, 140.92, 139.42, 139.11, 129.22, 129.06, 128.52, 128.48, 128.29, 128.26, 127.39, 127.36, 127.10, 126.25, 125.47, 125.32, 120.10, 119.96, 69.38, 66.20, 56.41, 54.35, 53.94, 40.94.
Przykład 1.3. Synteza związku 3
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2S,3R)-4-((3-(tert-butylo)benzylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminian (3A)
Reakcję (2 S ,3S )-3-[( tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (0.731 g, 2.7795 mmol) z 3-tert-butylobenzyloaminą (0.500 g, 3.0575 mmol) w obecności katalitycznej ilości pirydyny w 20 mL izopropanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 0.500 g (42.23%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.38, MW 426.60, Wzór: C26H38N2O3, 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.26-7.38 (m, 5H), 7.15-7.24 (m, 4H), 4.68-4.74 (m, 1H), 3.74-3.90 (m, 3H), 3.50-3.59 (m, 1H), 2.54-3.38 (m, 6H), 1.29-1.40 (m, 18H).
(2 R ,3 S )-3-amino-1-((3-( tert-butylo)benzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (3B)
Reakcję tert-butylo ((2S,3R)-4-((3-(tert-butylo)benzylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminianu (3A) (0.500 g, 1.172 mmol) z 1.5 mL TFA w 1 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.350 g (91.62%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.33, MW 326.48, Wzór: C21H30N2O, 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM- d) δ ppm 7.08-7.38 (m, 9H), 3.77-3.92 (m, 2H), 3.61-3.68 (m, 1H), 3.12-3.20 (m, 1H), 2.93 (m, 2H), 2.82 (m, 1H), 2.43-2.50 (m, 1H), 2.25 (br. s, 4H), 1.34 (s, 9H).
(2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-((3-( tert-butylo)benzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (3)
Reakcję pomiędzy (2R,3S)-3-amino-1-((3-(tert-butylo)benzylo)amino)-4-fenylobutan-2-olem (3B) (100 mg, 0.3063 mmol) i 9-bromo-9 H-fluorenem (75.1 mg, 0.3063 mmol) w obecności węglanu potasu (84.6 mg, 0.6126 mmol) w 4 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 44 mg (29.27%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.4, MW 490.69, Wzór: C34H38N2O, MS m/z 491.40 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.68-7.78 (m, 3H), 7.63 (d, J = 7.45 Hz, 1H), 7.23-7.44 (m, 9H), 7.16-7.21 (m, 2H), 7.11-7.15 (m, 2H), 4.98 (s, 1H), 3.75 (br. s, 2H), 3.55 (m, J = 9.16 Hz, 1H), 2.92-3.02 (m, 2H), 2.76-2.83 (m, 1H), 2.50 (br. s, 1H), 2.40 (dd, J = 13.46, 9.45 Hz, 1H), 1.33 (s, 9H), 1.31 (br. s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 151.55, 144.54, 144.09, 141.31, 140.98, 139.12, 138.89, 129.38, 128.56, 128.46, 128.39,
127.64, 127.18, 126.34, 126.18, 126.02, 125.71, 125.29, 124.47, 120.35, 120.00, 70.22, 66.10, 56.51, 55.54, 53.54, 39.46, 34.76, 31.50.
Przykład 1.4. Synteza związku 4
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2 S ,3 R )-3-hydroksy-4-((3-izopropylobenzylo)amino)-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminian (4A)
Reakcję (2S ,3 S)-3-[( tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (0.379 g, 1.4411 mmol) z 3-izopropylobenzyloaminą (0.2366 g, 1.5852 mmol) w obecności katalitycznej ilości pirydyny w 10 mL izopropanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 0.366 g (61.56%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.38, MW 412.57, Wzór: C25H3SN2O3, 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.10-7.37 (m, 9H), 5.58 (br. s, 1H), 4.78 (d, J = 8.79 Hz, 1H), 4.31-4.38 (m, 1H), 3.91-4.03 (m, 1H), 3.68-3.86 (m, 3H), 3.53-3.62 (m, 1H), 3.41-3.51 (m, 3H), 2.53-3.02 (m, 7H), 1.15-1.41 (m, 9H).
(2R,3S)-3-amino-1-((3-izopropylobenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (4B)
Reakcję tert-butylo ((2S,3R)-3-hydroksy-4-((3-izopropylobenzylo)amino)-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminianu (4A) (0.366 g, 0.8871 mmol) z 1.5 mL TFA w 1 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.1955 g (70.53%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.35, MW 312.46, Wzór: C20H28N2O, 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.13-7.33 (m, 9H), 3.83-3.87 (m, 1H), 3.75-3.81 (m, 1H), 3.62-3.68 (m, 1H), 3.14 (dt, J = 10.17, 4.37 Hz, 1H), 2.86-2.96 (m, 3H), 2.79 (dd, J = 12.03, 8.02 Hz, 1H), 2.48 (dd, J = 13.75, 9.74 Hz, 1H), 2.44 (br. s, 4H), 1.27 (d, J = 7.45 Hz, 6H).
(2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-((3-izopropylobenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (4)
Reakcję pomiędzy (2R,3S)-3-amino-1-((3-izopropylobenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-olem (4B) (50 mg, 0.1600 mmol) i 9-bromo-9 H-fluorenem (39.2 mg, 0.1600 mmol) w obecności węglanu potasu (44 mg, 0.3200 mmol) w 3 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 27.8 mg (36.44%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.43, MW 476.66, Wzór: C33H3SN2O, MS m/z
477.45 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.67-7.77 (m, 3H), 7.62 (d, J = 7.45 Hz, 1H), 7.37-7.44 (m, 2H), 7.34 (dt, J = 14.32, 7.16 Hz, 2H), 7.15-7.29 (m, 6H), 7.09-7.15 (m, 3H), 4.98 (s, 1H), 3.71-3.80 (m, 2H), 3.52-3.58 (m, 1H), 2.85-3.00 (m, 3H), 2.78 (dd, J = 13.75, 4.01 Hz, 1H), 2.34-2.53 (m, 2H), 1.53 (br. s, 3H), 1.25 (d, J = 6.87 Hz, 6H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 149.31, 144.50, 144.05, 141.29, 140.97, 139.14, 139.04, 129.37, 128.65, 128.56, 128.45,
128.37, 127.64, 127.17, 126.58, 126.35, 125.71, 125.68, 125.27, 120.34, 119.97, 70.09, 65.97, 56.39, 55.53, 53.31, 39.30, 34.13, 24.22, 24.07.
Przykład 1.5. Synteza związku 5
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2S,3S)-4-((4-(tert-butylo)benzylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminian (5A)
Reakcję (2R,3S)-3-[(tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (2 g, 7.6046 mmol) z 4-tert-butylobenzyloaminą (1.364 g, 8.3651 mmol) w obecności katalitycznej ilości pirydyny w 40 mL n-propanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 2.2289 g (68.97%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.35, MW 426.60, Wzór: C26H38N2O3, MS m/z 427.53 (M+H+), 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.15-7.39 (m, 9H), 4.93-5.04 (m, 1H), 3.64-3.79 (m, 3H), 3.53-3.66 (m, 1H), 2.82-3.00 (m, 2H), 2.09-2.75 (m, 4H), 1.40 (s, 9H), 1.32 (s, 9H).
(2 S ,3 S )-3-amino-1-((4-( tert-butylo)benzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (5B)
Reakcję tert-butylo ((2S,3S)-4-((4-(tert-butylo)benzylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminianu (5A) (1.2 g, 2.817 mmol) z 3 mL TFA w 1.5 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.862 g (93.87%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.28, MW 326.48, Wzór: C21H30N2O, MS m/z 327.37 (M+H+), 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.13-7.39 (m, 9H), 4.06 (br. s, 4H), 3.90-3.97 (m, 1h), 3.75-3.82 (m, 1H), 3.63-3.75 (m, 1H), 2.99-3.07 (m, 1H), 2.84-2.98 (m, 2H), 2.74-2.82 (m, 1H), 2.56-2.69 (m, 1H), 1.30 (s, 9H).
(2 S ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-((4-( tert-butylo)benzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (5)
Reakcję pomiędzy (2 S ,3 S )-3-amino-1-((4-( tert-butylo)benzylo)amino)-4-fenylobutan-2-olem (5B) (150 mg, 0.4594 mmol) i 9-bromo-9 H-fluorenem (112.6 mg, 0.4594 mmol) w obecności węglanu potasu (127 mg, 0.9188 mmol) w 4 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 42.1 mg (18.65%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.48, MW 490.69, Wzór: C34H38N2O, MS m/z 491.47 (M+H+), 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.63-7.74 (m, 4H), 7.12-7.43 (m, 13H), 4.96 (s, 1H), 3.74 (br. s, 2H), 3.48-3.58 (m, 1H), 2.88-2.99 (m, 1H), 2.67-2.80 (m, 1H), 2.43-2.66 (m, 4H), 1.70 (br. s, 2H), 1.26-1.37 (m, 9H); 13C NMR (75 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 150.30, 144.46, 144.41, 141.11, 140.92, 139.18, 136.25, 129.22, 128.77, 128.48, 128.23, 127.32, 127.06, 126.26, 125.52, 125.41, 125.35, 120.08, 119.93, 69.40, 65.97, 56.11, 54.12, 53.86, 40.88, 34.50, 31.37.
Przykład 1.6. Synteza związku 6
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2 S ,3 S )-3-hydroksy-4-((3-metoksybenzylo)amino)-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminian (6A)
Reakcję (2 R ,3 S )-3-[( tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (2.000 g, 7.594 mmol) z 3-metoksybenzyloaminą (1.042 g, 7.594 mmol) w obecności katalitycznych ilości pirydyny w 20 mL izopropanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (1-7% MeOH w DCM). Wydajność: 1.218 g (40.0%), TLC (DCM/MeOH, 9.5/0.5 ν/ν) Rf = 0.45, MW 400.52, Wzór: C23H32N2O4, 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.17-7.37 (m, 6H), 6.86-6.92 (m, 2H), 6.81 (dd, J = 8.02, 2.29 Hz, 1H), 4.68 (br. s, 1H), 3.73-3.84 (m, 5H), 3.48-3.55 (m, 1H), 2.97 (dd, J = 14.03, 4.87 Hz, 1H), 2.66-2.90 (m, 3H), 2.07 (br. s, 3H), 1.35 (s, 9H).
(2 S ,3 S )-3-amino-1-((3-metoksybenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (6B)
Reakcję tert-butylo ((2 S ,3 S )-3-hydroksy-4-((3-metoksybenzylo)amino)-1-fenylobutan-2-ylo) karbaminianu (6A) (1.218 g, 3.041 mmol) z 6 mL TFA w 4 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.780 g (85.40%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.34, MW 300.40, Wzór: C18H24N2O, 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM- d) δ ppm 7.15-7.34 (m, 6H), 6.89-6.94 (m, 2H), 6.81-6.84 (m, 1H), 3.83-3.87 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.76-3.81 (m, 1H), 3.62 (ddd, J = 8.31, 4.87, 3.44 Hz, 1H), 3.12-3.17 (m, 1H), 2.84-2.93 (m, 2H), 2.78 (dd, J = 12.03, 8.59 Hz, 1H), 2.46 (dd, J = 13.46, 10.02 Hz, 1H), 2.09 (br. s, 4H).
(2 S ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-((3-metoksybenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (6)
Reakcję pomiędzy (2S,3S)-3-amino-1-((3-metoksybenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-olem (6B) (120 mg, 0.3998 mmol) i 9-bromo-9 H-fluorenem (98 mg, 0.3998 mmol) w obecności węglanu potasu (110 mg, 0.7996 mmol) w 3 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 27.1 mg (14.60%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.33, MW 464.61, Wzór: C31H32N2O2, MS m/z 465.35 (M+H+), 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.61-7.73 (m, 4H), 7.11-7.43 (m, 10H), 6.90-7.00 (m, 2H), 6.79 (dd, J = 8.21, 2.34 Hz, 1H), 4.96 (s, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.66 (s, 2H), 3.45-3.57 (m, 1H), 2.90-3.00 (m, 1H), 2.57-2.76 (m, 3H), 2.44-2.55 (m, 1H), 1.82 (br. s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 159.76, 144.33, 144.26, 141.11, 139.10, 129.51, 129.21, 128.48, 128.31, 127.35, 127.12, 126.28, 125.46, 121.27, 120.10, 114.60, 112.70, 69.51, 66.21, 56.44, 55.21, 54.54, 53.94, 40.91.
Przykład 1.7. Synteza związku 7
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2 S ,3 S )-3-hydroksy-4-((2-metoksybenzylo)amino)-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminian (7A)
Reakcję (2R,3S)-3-[(tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (2 g, 7.6046 mmol) z 2-metoksybenzyloaminą (1.146 g, 8.3651 mmol) w obecności katalitycznej ilości pirydyny w 40 mL n-propanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 1.94 g (63.82%), TLC (DCM/MeOH, 9.5/0.5 ν/ν) Rf = 0.16, MW 400.52, Wzór: C23H32N2O4, MS m/z 401.38 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.18-7.32 (m, 6H), 7.13 (d, J = 7.45 Hz, 1H), 6.83-6.92 (m, 2H), 5.02 (d, J = 9.74 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.59-3.78 (m, 4H), 3.14 (br. s, 2H), 2.84-2.97 (m, 2H), 2.52-2.64 (m, 2H), 1.36-1.44 (m, 9H).
(2 S ,3 S )-3-amino-1-((2-metoksybenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (7B)
Reakcję tert-butylo ((2S,3S)-3-hydroksy-4-((2-metoksybenzylo)amino)-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminianu (7A) (0.700 g, 2.333 mmol) z 3 mL TFA w 1.5 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.500 g (95.24%), TLC (DCM/MeOH, 9.5/0.5 ν/ν) Rf = 0.22, MW 300.40, Wzór: C18H24N2O2, MS m/z 301.25 (M+H+), 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.15-7.34 (m, 7H), 6.85-6.96 (m, 2H), 3.85-3.92 (m, 1h), 3.83 (s, 3H), 3.75-3.82 (m, 1H), 3.59 (dt, J = 7.47, 3.59 Hz, 1H), 2.83-2.94 (m, 3H), 2.44-2.75 (m, 6H).
(2 S ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-((2-metoksybenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (7)
Reakcję pomiędzy (2S,3S)-3-amino-1-((2-metoksybenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-olem (7B) (150 mg, 0.4993 mmol) i 9-bromo-9 H-fluorenem (122.4 mg, 0.4993 mmol) w obecności węglanu potasu (138 mg, 0.9986 mmol) w 4 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 85.7 mg (36.95%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.31, MW 464.61, Wzór: C31H32N2O2, MS m/z 465.41 (M+H+), 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.64-7.74 (m, 3H), 7.57 (d, J = 7.03 Hz, 1H), 7.08-7.42 (m, 11H), 6.88-6.98 (m, 2H), 4.91 (s, 1H), 4.00 (br. s, 2h), 3.91 (s, 3H), 3.47-3.56 (m, 1h), 2.64-2.82 (m, 2H), 2.28-2.61 (m, 3H), 1.46 (br. s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 158.16, 144.73, 144.47, 141.04, 140.78, 139.24, 131.36, 129.24, 128.92, 128.39, 128.03,
127.23, 126.91, 126.13, 125.58, 125.46, 120.54, 120.04, 119.70, 110.64, 69.48, 65.65, 55.28, 54.49, 53.62, 51.86, 40.86.
Przykład 1.8. Synteza związku 8
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2 S ,3 R)-3-hydroksy-1-fenylo-4-((3-(trifluorometylo)benzylo)amino)butan-2-ylo)karbaminian (8A)
Reakcję (2S,3S)-3-[(tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (2.0 g, 7.595 mmol) z 3-(trifluorometylo)benzyloaminą (1.463 g, 8.355 mmol) w obecności katalitycznej ilości pirydyny w 45 mL izopropanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (50% EtOAc w DCM). Wydajność: 1.97 g (59.16%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.4, MW 438.49, Wzór: C23H29F3N2O3, MS m/z 439.03 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.58 (s, 1H), 7.44-7.56 (m, 3H), 7.19-7.37 (m, 6H), 4.65 (br. d, J = 7.45 Hz, 1H), 3.80-3.91 (m, 3H), 3.49-3.55 (m, 1H), 2.79-3.01 (m, 2H), 2.75 (br. s, 2H), 1.35 (s, 9H), NH nie zarejestrowane.
(2 R ,3 S )-3-amino-4-fenylo-1-((3-(trifluorometylo)benzylo)amino)butan-2-ol (8B)
Reakcję tert-butylo ((2 S ,3 R )-3-hydroksy-1-fenylo-4-((3-(trifluorometylo)benzylo)amino)-butan-2-ylo)karbaminianu (8A) (1.177 g, 2.67 mmol) z 6 mL TFA w 2 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.734 g (80.8%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.1, MW 338.37, Wzór: C18H21F3N2O, MS m/z 339.13 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.60 (s, 1H), 7.55 (br. d, J = 8.02 Hz, 2H), 7.42-7.49 (m, 1H), 7.21-7.29 (m, 3H), 7.09-7.21 (m, 3H), 3.89-3.96 (m, 1H), 3.75-3.87 (m, 5H), 3.26 (br. dd, J = 9.16, 4.58 Hz, 1H), 2.86-2.94 (m, 1H), 2.77 (d, J = 4.58 Hz, 1H), 2.75-2.83 (m, 1H), 2.48 (dd, J = 13.75, 9.74 Hz, 1H).
(2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-4-fenylo-1 -((3-(trifluorometylo)benzylo)amino)-butan-2-ol (8)
Reakcję pomiędzy (2 R ,3 S )-3-amino-4-fenylo-1-((3-(trifluorometylo)benzylo)amino)butan-2-olem (8B) (300 mg, 0.8866 mmol) i 9-bromo-9 H-fluorenem (217 mg, 0.8866 mmol) w obecności węglanu potasu (245 mg, 1.7732 mmol) w 10 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM), HPLC preparatywne (acetonitryl/woda gradient 20-90%). Wydajność: 32 mg (7.19%), TlC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.4, MW 502.58, Wzór: C31H29F3N2O, MS m/z 503.37 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.57-7.61 (m, 3H) 7.53 (d, J = 7.45 Hz, 1H) 7.36-7.46 (m, 3H) 7.30 (q, J = 6.87 Hz, 3H) 7.05-7.22 (m, 5H) 6.98 (d, J = 6.87 Hz, 2H) 4.84 (s, 1H) 3.66 (dt, J = 8.45, 4.08 Hz, 1H) 3.48-3.60 (m, 5H) 3.00-3.09 (m, 1H) 2.83 (br. d, J = 10.88 Hz, 1H) 2.59 (br. dd, J = 13.75, 4.01 Hz, 2H) 2.38 (dd, J = 13.17, 9.74 Hz, 1H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 144.02, 143.65, 141.24, 141.02, 140.49, 138.97, 132.29, 130.84 (q, J = 1.00 Hz), 129.36, 129.07, 128.66, 128.62, 128.59, 127.72, 127.31, 126.43, 125.70 (q, J = 4.20 Hz) 125.63, 125.25, 124.35, (q, J = 4.02 Hz), 120.40, 120.13, 70.58, 66.46, 55.61, 55.47, 54.31, 39.43.
Przykład 1.9. Synteza związku 9
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2S,3R)-3-hydroksy-1 -fenylo-4-(((S)-1 -fenyloetylo)amino)butan-2-ylo)karbaminian (9A)
Reakcję (2 S ,3 S )-3-[( tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (2.390 g, 9.077 mmol) z (S )-1-fenyloetan-1-aminą (1.000 g, 8.252 mmol) w obecności katalitycznej ilości pirydyny w 20 mL izopropanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (1-8% MeOH w DCM). Wydajność: 2.543 g (72.9%), TLC (DCM/MeOH, 9.5/0.5 ν/ν) Rf = 0.32, MW 384.52, Wzór: C23H32N2O3, MS m/z 385.59 (M+H+), 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.09-7.43 (m, 10H), 4.68 (d, J = 8.79 Hz, 1H), 3.67-3.85 (m, 2H), 3.36-3.57 (m, 3H), 2.70-2.99 (m, 2H), 2.56 (d, J = 4.69 Hz, 2H), 2.23 (br. s, 2H), 1.17-1.47 (m, 10H).
(2 R ,3 S )-3-amino-4-fenylo-1 -(((S )-1 -fenyloetylo)amino)butan-2-ol (9B)
Reakcję tert-butylo ((2 S ,3 R )-3-hydroksy-1-fenylo-4-((( S )-1-fenyloetylo)amino)butan-2-ylo)karbaminianu (9A) (0.375 g, 0.975 mmol) z 5 mL TFA w 4 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.275 g (99.0%), TLC (DCM/MeOH/NH3(aq), 9.5/0.5/0.05 ν/ν/ν) Rf = 0.21, MW 284.40, Wzór: C18H24N2O, 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.04-7.40 (m, 10H), 3.70-3.83 (m, 1H), 3.46-3.60 (m, 2H),
3.02-3. 12 (m, 1H), 2.69-2.91 (m, 3H), 2.54 (dd, J = 11.72, 8.21 Hz, 1H), 2.41 (dd, J = 13.48, 9.38 Hz, 1H), 1.56 (br. s, 2H), 1.33-1.44 (m, 3H).
(2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-4-fenylo-1 -(((S )-1 -fenyloetylo)amino)butan-2-ol (9)
Reakcję pomiędzy (2 R ,3 S )-3-amino-4-fenylo-1-((( S )-1-fenyloetylo)amino)butan-2-olem (9B) (150 mg, 0.5274 mmol) i 9-bromo-9H-fluorenem (129 mg, 0.5274 mmol) w obecności węglanu potasu (146 mg, 1.055 mmol) w 5 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 63 mg (26.63%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.33, MW 448.61, Wzór: C31H32N2O, MS m/z 449.52 (M+H+), 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.65 (d, J = 7.62 Hz, 2H), 7.13-7.40 (m, 14H), 6.94-7.03 (m, 2H), 4.80 (s, 1H), 4.18 (br. s, 3H), 3.59-3.77 (m, 2H), 3.20-3.33 (m, 1H), 2.47-2.73 (m, 4H), 1.40 (d, J = 6.45 Hz, 3H); 13C NMR (75 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 145.71, 145.52, 140.84, 140.34, 140.14, 138.14, 129.32, 128.86, 128.64, 128.21, 128.08, 127.50, 127.09, 126.54, 125.26, 124.68, 119.85, 68.67, 61.82, 60.43, 57.98, 48.93, 36.51,22.36.
Przykład 1.10. Synteza związku 10
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2 S ,3 R )-3-hydroksy-1-fenylo-4-((2-fenylopropan-2-ylo)amino)butan-2-ylo)karbaminian (10A)
Reakcję (2 S ,3 S )-3-[( tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (1.947 g, 7.396 mmol) z 2-fenylopropan-2-aminą (1.000 g, 7.396 mmol) w obecności katalitycznej ilości pirydyny w 15 mL izopropanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash”(1-5% MeOH w DCM). Wydajność: 0.700 g (23.70%), TLC (DCM/MeOH, 9.5/0.5 ν/ν) Rf = 0.36, MW 398.55, Wzór: C24H34N2O3, MS m/z 399.42 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.44 (d, J = 7.45 Hz, 2H), 7.34 (t, J = 7.45 Hz, 2H), 7.15-7.30 (m, 6H), 4.57 (d, J = 8.59 Hz, 1H), 3.78 (br. s, 1H), 3.44 (br. s, 3H), 2.98 (dd, J = 13.75, 4.01 Hz, 1H), 2.82 (dd, J = 13.75, 7.45 Hz, 1h), 2.37-2.52 (m, 2H), 1.51-1.57 (m, 6H), 1.35 (s, 9H).
(2 R ,3 S )-3-amino-4-fenylo-1 -((2-fenylopropan-2-ylo)amino)butan-2-ol (10B)
Reakcję tert-butylo ((2S,3R)-3-hydroksy-1-fenylo-4-((2-fenylopropan-2-ylo)amino)butan-2-ylo)karbaminianu (10A) (0.700 g, 1.756 mmol) z 5 mL TFA w 4 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.408 g (77.84%), TLC (DCM/MeOH/NH3(aq), 9.5/0.5/0.05 ν/ν/ν) Rf = 0.22, MW 298.43, Wzór: C19H26N2O, 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.45 (dd, J = 7.16, 1.15 Hz, 2H), 7.05-7.37 (m, 8H), 3.50-3.56 (m, 1H), 3.06 (dtd, J = 9.49, 4.49, 4.49, 2.15 Hz, 1H), 2.86 (d, J = 7.73 Hz, 1H), 2.76-2.82 (m, 1H), 2.64 (dt, J = 11.89, 2.94 Hz, 1H), 2.63 (br. s, 3H), 2.46 (ddd, J = 11.74, 8.02, 2.29 Hz, 1H), 2.33-2.42 (m, 1H), 1.53 (s, 6H).
(2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-4-fenylo-1-((2-fenylopropan-2-ylo)amino)butan-2-ol (10)
Reakcję pomiędzy (2R,3S)-3-amino-4-fenylo-1-((2-fenylopropan-2-ylo)amino)butan-2-ol (10B) (150 mg, 0.5026 mmol) i 9-bromo-9 H-fluorenem (123 mg, 0.5026 mmol) w obecności węglanu potasu (139 mg, 1.005 mmol) w 5 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 54 mg (23.22%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.35, MW 462.64, Wzór: C32H34N2O, MS m/z 463.35 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.61-7.70 (m, 2H), 7.14-7.44 (m, 14H),
6.98- 7.03 (m, 2H), 4.86 (s, 1H), 3.71 (br. s, 1H), 3.38 (br. s, 1H), 2.52-2.73 (m, 5H), 1.47-1.61 (m, 8H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 146.15, 145.93, 140.29, 129.45, 128.72, 128.62, 128.23, 127.64, 127.49, 127.26, 126.58, 126.02, 125.40, 124.68, 119.92, 119.87, 70.23, 61.98, 60.40, 53.54, 45.22, 36.26, 29.04.
Przykład 1.11. Synteza związku 11
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2 S ,3 S )-4-((cykloheksylometylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminian (11A)
Reakcję (2 R ,3 S )-3-[( tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (1.5 g, 5.7034 mmol) z cykloheksylometanaminą (0.710 g, 6.2737 mmol) w obecności katalitycznej ilości pirydyny w 40 mL izopropanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 1.33 g (61.98%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.38, MW 376.54, Wzór: C22H36N2O3, MS m/z 377.35 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.17-7.33 (m, 5H), 4.99 (d, J = 9.17 Hz, 1H), 3.74 (q, J = 8.02 Hz, 1H), 3.64 (dd, J = 9.16, 3.44 Hz, 1H), 3.07 (br. s, 2H), 2.85-2.98 (m, 2H), 2.56-2.69 (m, 2H), 2.38-2.51 (m, 2H), 1.63-1.76 (m, 5H), 1.36-1.45 (m, 9H), 1.08-1.35 (m, 4H), 0.82-0.95 (m, 2H).
(2S,3S)-3-amino-1 -((cykloheksylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (11B)
Reakcję tert-butylo ((2 S ,3 S )-4-((cykloheksylometylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminianu (11A) (1.33 g, 3.5322 mmol) z 3 mL TFA w 2 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.965 g (98.97%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν/ν) Rf = 0.25, MW 276.42, Wzór: C17H28N2O, MS m/z 277.26 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.28-7.34 (m, 2H), 7.19-7.26 (m, 3H), 3.59 (dt,
J = 7.30, 3.51 Hz, 1H), 2.90-2.97 (m, 3H), 2.65-2.89 (m, 4H), 2.52-2.64 (m, 3H), 2.45 (dd, J = 12.03, 6.87 Hz, 1H), 1.64-1.79 (m, 5H), 1.50 (dtt, J = 14.43, 7.32, 7.32, 3.51, 3.51 Hz, 1H), 1.10-1.30 (m, 3H), 0.86-0.97 (m, 2H).
(2 S ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-((cykloheksylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (11)
Reakcję pomiędzy (2 S ,3 S )-3-amino-1-((cykloheksylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-olem (11B) (150 mg, 0.5432 mmol) i 9-bromo-9H-fluorenem (133 mg, 0.5432 mmol) w obecności węglanu potasu (150 mg, 1.0864 mmol) w 5 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 119.2 mg (49.84%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.34, MW 440.63, Wzór: C30H36N2O, MS m/z 441.29 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.70 (t, J = 7.16 Hz, 2H), 7.63 (dd, J = 7.45, 1.15 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 7.45 Hz, 1H), 7.38 (td, J = 7.30, 2.58 Hz, 2H), 7.25-7.34 (m, 4H), 7.13-7.23 (m, 3H), 4.96 (s, 1H), 3.52 (br. s, 1H), 2.81-2.87 (m, 1H), 2.77 (dd, J = 13.75, 4.58 Hz, 1h),
2.64 (br. s, 1H), 2.53 (dd, J = 13.17, 9.17 Hz, 2H), 2.37 (br. s, 2H), 1.95 (d, J = 11.46 Hz, 1H), 1.55-1.86 (m, 5H), 1.02-1.48 (m, 6h), 0.71-0.92 (m, 2H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 144.52, 144.28, 141.15, 140.88, 139.22, 129.36, 128.54, 128.32, 128.28, 127.42, 127.01,
126.33, 125.57, 125.42, 120.22, 119.93, 69.57, 66.71, 54.51, 53.53, 41.10, 36.44, 31.84, 31.61, 31.03, 26.80, 26.18, 26.06.
Przykład 1.12. Synteza związku 12
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2 S ,3 S )-4-( tert-butyloamino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminian (12A)
Reakcję (2 R ,3 S )-3-[( tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (1.5 g, 5.6961 mmol) z tert-butyloaminą (0.4586 g, 6.2657 mmol) w obecności katalitycznych ilości pirydyny w 30 mL n-propanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (2-8% MeOH w DCM). Wydajność: 0.9917 g (51.75%), TLC (DCM/MeOH, 9.5/0.5 ν/ν) Rf = 0.13, MW 336.48, Wzór: C19H32N2O3, MS m/z 337.54 (M+H+), 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- d) δ ppm 7.16-7.32 (m, 5H), 4.92-5.04 (m, 1H), 3.67-3.79 (m, 1H), 3.42 (dd, J = 9.38,
2.34 Hz, 1H), 2.82-2.98 (m, 2H), 2.56-2.64 (m, 1H), 2.40-2.51 (m, 1H), 2.08 (br. s, 2H), 1.41 (s, 9H), 1.05 (s, 9H).
(2 S ,3 S )-3-amino-1 -(tert-butyloamino)-4-fenylobutan-2-ol (12B)
Reakcję tert-butylo ((2S,3S)-4-(tert-butyloamino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminianu (12A) (0.685 g, 2.0358 mmol) z 3 mL TFA w 1.5 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.450 g (93.56%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.17, MW 236.36, Wzór: C14H24N2O, MS m/z 237.32 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.29-7.34 (m, 2H), 7.18-7.27 (m, 3H), 3.77 (br. s, 4H),
3.67- 3.71 (m, 1H), 3.09-3.14 (m, 1H), 2.91-3.00 (m, 2H), 2.78 (dd, J = 12.03, 5.73 Hz, 1H),
2.64- 2.71 (m, 1H), 1.23 (s, 9H).
(2 S ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-( tert-butyloamino)-4-fenylobutan-2-ol (12)
Reakcję pomiędzy (2S,3S)-3-amino-1-(tert-butyloamino)-4-fenylobutan-2-olem (12B) (75 mg, 0.3175 mmol) i 9-bromo-9H-fluorenem (77.8 mg, 0.3175 mmol) w obecności węglanu potasu (87.7 mg, 0.6350 mmol) w 2.5 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 65 mg (51.14%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.25, MW 400.57, Wzór: C27H32N2O, MS m/z 401.34 (M+H+), 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.71 (dd, J = 7.33, 4.40 Hz, 2H), 7.51 (dd, J = 16.41, 7.03 Hz, 2H), 7.35-7.43 (m, 2H), 7.24-7.33 (m, 4H), 7.11-7.24 (m, 3H), 4.95 (s, 1H), 3.63 (br. s, 3H), 3.54-3.62 (m, 1H), 3.12-3.20 (m, 1H), 2.80-3.02 (m, 3H), 2.59 (dd, J = 11.72, 5.86 Hz, 1H), 0.96 (s, 9H); 13C NMR (75 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 145.81, 145.51, 140.63, 140.27,
138.87, 129.39, 128.60, 128.37, 128.32, 127.53, 127.32, 126.34, 125.33, 124.89, 120.08, 119.93,
68.07, 61.25, 60.78, 52.51,45.84, 38.28, 27.61.
Przykład 1.13. Synteza związku 13 tert-butylo ((2 S ,3 R )-3-hydroksy-4-(neopentyloamino)-1 -fenylobutan-2-ylo)karbaminian (13A)
Reakcję (2 S ,3 S )-3-[ tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (3.020 g, 11.47 mmol) z 2,2-dimetylopropan-1-aminą (1.0 g, 11.47 mmol) w obecności katalitycznej ilości pirydyny w 30 mL n-propanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 2.981 g (74.17%), TLC (DCM/MeOH, 9.5/0.5 ν/ν) Rf = 0.22, MW 350.50, Wzór: C20H34N2O3, 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.28-7.32 (m, 2H), 7.20-7.27 (m, 3H), 4.79 (d, J = 9.16 Hz, 1H), 3.86 (br. s, 1H), 3.46-3.53 (m, 1H), 3.01 (dd, J = 14.03, 4.87 Hz, 1H), 2.86-2.94 (m, 1H), 2.68-2.82 (m, 2H), 2.88 (br. s, 2H), 2.34-2.44 (m, 2h), 1.37 (s, 9H), 0.95 (s, 9H).
(2 R ,3 S )-3-amino-1 -(neopentyloamino)-4-fenylobutan-2-ol (13B)
Reakcję tert-butylo ((2 S ,3 R )-3-hydroksy-4-(neopentyloamino)-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminianu (13A) (1.0 g, 3.9938 mmol) z 3 mL TFA w 1.5 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.5557 g (77.79%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.22, MW 250.39, Wzór: C15H26N2O, MS m/z 251.28 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.30-7.35 (m, 2H), 7.20-7.26 (m, 3H), 3.63-3.71 (m, 1H), 3.15-3.21 (m, 1H), 2.97-3.00 (m, 1H), 2.96 (d, J = 4.01 Hz, 1H), 2.83 (dd, J = 12.03, 8.02 Hz, 1h), 2.70 (br. s, 4H), 2.47-2.54 (m, 2H), 2.40-2.44 (m, 1H), 0.96 (s, 9H).
(2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1 -(neopentyloamino)-4-fenylobutan-2-ol (13)
Reakcję pomiędzy (2 R ,3 S )-3-amino-1-(neopentyloamino)-4-fenylobutan-2-olem (13B) (120 mg, 0.4790 mmol) i 9-bromo-9 H-fluorenem (117 mg, 0.4790 mmol) w obecności węglanu potasu (132 mg, 0.9580 mmol) w 4 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 25.8 mg (13.0%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.33, MW 414.27, Wzór: C28H34N2O, MS m/z 415.37 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.62-7.73 (m, 4H), 7.27-7.41 (m, 3H), 7.20-7.26 (m, 2H), 7.09-7.19 (m, 3H), 6.88-7.04 (m, 1h), 4.96 (s, 1H), 4.75-5.22 (m, 5H), 3.03-3.23 (m, 1H), 2.54 (br. s, 2H), 1.91-1.99 (m, 3H), 0.75-1.19 (m, 9H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 144.61, 144.15, 140.65, 138.78, 129.97, 129.37, 128.55, 128.44, 128.31, 127.59, 127.03,
126.35, 125.25, 120.36, 119.98, 70.32, 60.49, 55.16, 53.52, 38.87, 28.70, 21.15, 14.29.
Przykład 1.14. Synteza związku 14
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2 S ,3 R )-3-hydroksy-1-fenylo-4-((2,2,2-trifluoroetylo)amino)butan-2-ylo)karbaminian (14A)
Reakcję (2 S ,3 S )-3-[( tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (1.5 g, 5.6961 mmol) z 2,2,2-trifluoroetan-1-aminą (1.242 g, 12.5314 mmol) w obecności katalitycznej ilości pirydyny w 45 mL izopropanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 0.980 g (47.42%), TLC (DCM/MeOH, 9.5/0.5 ν/ν) Rf = 0.5, MW 362.39, Wzór: C17H25F3N2O3, MS m/z 363.26 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM- d) δ ppm 7.29-7.34 (m, 2H), 7.19-7.26 (m, 3H), 4.53 (d, J = 9.16 Hz, 1H), 3.77-3.85 (m, 1H), 3.47 (ddd, J = 7.45, 5.44, 3.72 Hz, 1H), 3.17-3.28 (m, 2H), 3.02 (dd, J = 13.75, 4.58 Hz, 1h), 2.84-2.97 (m, 2H), 2.75-2.82 (m, 1H), 2.15 (br. s, 1H), 1.37 (s, 9H), NH nie zarejestrowano.
(2 R ,3 S )-3-amino-4-fenylo-1-((2,2,2-trifluoroetylo)amino)butan-2-ol (14B)
Reakcję tert-butylo ((2S,3R)-3-hydroksy-1-fenylo-4-((2,2,2-trifluoroetylo)amino)butan-2-ylo)karbaminianu (14A) (1.1 g, 3.0354 mmol) z 3 mL TFA w 1.5 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (roztwór wodny amoniaku/DCM). Wydajność: 0.588 g (73.86%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.26, MW 262.28, Wzór: C12H17F3N2O, 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM- d) δ ppm 7.29-7.37 (m, 2H), 7.17-7.28 (m, 3H), 3.60 (ddd, J = 8.02, 4.58, 3.44 Hz, 1H), 3.19-3.28 (m, 2H), 3.16 (dt, J = 10.17, 4.37 Hz, 1H), 2.95-3.01 (m, 1H), 2.83-2.94 (m, 2H), 2.50 (dd, J = 13.46, 10.02 Hz, 1H), 1.69 (br. s, 4H).
(2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-4-fenylo-1 -((2,2,2-trifluoroetylo)amino)butan-2-ol (14)
Reakcję pomiędzy (2R,3S)-3-amino-4-fenylo-1-((2,2,2-trifluoroetylo)amino)butan-2-olem (14B) (150 mg, 0.5725 mmol) i 9-bromo-9H-fluorenem (140 mg, 0.5725 mmol) w obecności węglanu potasu (158 mg, 1.145 mmol) w 5 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM), HPLC preparatywne (acetonitryl/woda 20-90%). Wydajność: 67 mg (27.46%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.65, MW 426.48, Wzór: C25H25F3N2O, MS m/z 427.26 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 6.86-7.69 (m, 13H), 4.77 (s, 1H), 3.38-3.52 (m, 2H), 2.98-3.17 (m, 3H), 2.83 (dd, J = 12.03, 8.02 Hz, 1H), 2.67-2.75 (m, 2H), 2.58 (dd, J = 14.32, 9.16 Hz, 1H), 1.74 (br. s, 2H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 141.80, 141.18, 137.80, 135.69, 135.51, 130.82, 130.62, 129.08, 129.01, 128.99, 128.86, 128.78, 128.76, 127.79, 127.49, 127.36, 120.77, 120.73, 122.36 (q, J = 285.00 Hz), 67.08, 60.40, 59.75, 59.32, 49.62, 32.79.
Przykład 1.15. Synteza związku 15
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2 S ,3 S )-4-((cyklopropylometylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminian (15A)
Reakcję (2R,3S)-3-[(tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (2.000 g, 7.594 mmol) z cyklopropylometanaminą (0.540 g, 7.594 mmol) w obecności katalitycznej ilości pirydyny w 20 mL izopropanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (DCM/MeOH/NH3(aq), 9.5/0.5/0.05 ν/ν/ν). Wydajność: 1.007 g (39.6%), TLC (DCM/MeOH/NH3(aq), 9.5/0.5/0.05 ν/ν/ν) Rf = 0.32, MW 334.46, Wzór: C19H30N2O3, 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.15-7.31 (m, 5H), 4.98 (d, J = 9.16 Hz, 1H), 3.66-3.76 (m, 1H), 3.53-3.60 (m, 1H), 2.84-2.99 (m, 2H), 2.54-2.69 (m, 2H), 2.36-2.47 (m, 2H), 2.22 (br. s, 2H), 1.39 (s, 9H), 0.83-0.93 (m, 1H), 0.44 (d, J = 7.45 Hz, 2H), 0.07 (d, J = 4.58 Hz, 2H).
(2 S ,3 S )-3-amino-1 -((cyklopropylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (15B)
Reakcję tert-butylo ((2 S ,3 S )-4-((cyklopropylometylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminianu (15A) (0.600 g, 1.795 mmol) z 3 mL TFA w 1 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.2997 g (71.29%), TLC (DCM/MeOH/NH3(aq), 9/1/0.1 ν/ν/ν) Rf = 0.19, MW 234.34, Wzór: C14H22N2O, 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.26-7.34 (m, 2H), 7.15-7.24 (m, 3H), 4.09 (br. s, 1H), 3.28-3.41 (m, 2H), 3.16 (br. s, 2H), 2.95-3.05 (m, 2H), 2.81-2.94 (m, 2H), 2.70-2.77 (m, 1H), 1.23 (s, 1H), 1.07-1.19 (m, 1H), 0.74-0.89 (m, 1H), 0.59-0.67 (m, 2H), 0.22-0.39 (m, 2H).
(2 S ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1 -((cyklopropylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (15)
Reakcję pomiędzy (2 S ,3 S )-3-amino-1-((cyklopropylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-olem (15B) (150 mg, 0.6401 mmol) i 9-bromo-9 H-fluorenem (157 mg, 0.6401 mmol) w obecności węglanu potasu (177 mg, 1.280 mmol) w 5 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja woda/octan etylu, chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 103.4 mg (40.56%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.4, MW 398.55, Wzór: C27H30N2O, MS m/z 399.25 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.68 (dd, J = 7.45, 5.16 Hz, 2H), 7.60 (dd, J = 12.03, 7.45 Hz, 2H), 7.37 (t, J = 7.40 Hz, 2H), 7.23-7.32 (m, 4H), 7.14-7.21 (m, 3H), 5.11 (s, 1H), 3.60 (dt, J = 8.88, 4.15 Hz, 1H), 2.88 (dt, J = 8.74, 4.51 Hz, 1H), 2.82 (dd, J = 13.17, 5.16 Hz, 1h), 2.77 (m, J = 10.90 Hz, 1H), 2.62-2.71 (m, 1H), 2.58 (dd, J = 13.17, 8.59 Hz, 1H), 2.51 (dd, J = 12.60, 6.30 Hz, 1H), 2.28 (dd, J = 12.32, 6.59 Hz, 1H), 1.65 (br. s, 3H), 0.79-0.92 (m, 1H), 0.35-0.51 (m, 2H), -0.05-0.08 (m, 2H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 144.68,
144.42, 141.03, 140.86, 139.25, 129.38, 128.57, 128.30, 128.28, 127.41, 127.11, 126.35, 125.46, 125.37, 120.17, 119.95, 69.55, 67.42, 56.92, 55.38, 54.87, 41.28, 10.95, 4.83, 3.85.
Przykład 1.16. Synteza związku 16
Synteza produktów pośrednich tert-butylo ((2 S ,3 R )-4-((cyklopropylometylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminian (16A)
Reakcję (2 S ,3 S )-3-[( tert-butoksykarbonylo)amino]-1,2-epoksy-4-fenylobutanu (2.000 g, 7.594 mmol) z cyklopropylometanaminą (0.540 g, 7.594 mmol) w obecności katalitycznej ilości pirydyny w 20 mL izopropanolu przeprowadzono według opisu w etapie 1. Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa „flash” (DCM/MeOH/NH3(aq), 9.5/0.5/0.05 ν/ν/ν). Wydajność: 1.116 g (43.9%), TLC (DCM/MeOH/NH3(aq), 9.5/0.5/0.05 ν/ν/ν) Rf = 0.32, MW 334.46, Wzór: C19H30N2O3, MS m/z 335.39 (M+H+), 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.15-7.34 (m, 5H), 4.65 (d, J = 8.59 Hz, 1H), 3.81-3.96 (m, 1H), 3.51-3.64 (m, 1H), 2.71-3.18 (m, 6H), 2.42-2.59 (m, 1H), 1.31-1.38 (m, 10H), 1.01-1.12 (m, 1h), 0.49-0.67 (m, 2H), 0.25 (d, J = 1.72 Hz, 2H).
(2 R ,3 S )-3-amino-1 -((cyklopropylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (16B)
Reakcję tert-butylo ((2 S ,3 R )-4-((cyklopropylometylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)karbaminianu (16A) (0.600 g, 1.795 mmol) z 3 mL TFA w 1 mL DCM przeprowadzono według opisu w etapie 2. Oczyszczanie: ekstrakcja (wodny roztwór amoniaku/DCM). Wydajność: 0.284 g (67.56%), TLC (DCM/MeOH/NH3(aq), 9/1/0.1 ν/ν/ν) Rf = 0.19, MW 234.34, Wzór: C14H22N2O, MS m/z 235.26 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.28-7.34 (m, 2H), 7.18-7.27 (m, 3H), 3.68 (ddd, J = 8.45, 4.73, 3.44 Hz, 1H), 3.11-3.17 (m, 1H), 2.92-2.97 (m, 2H), 2.79-2.85 (m, 1H), 2.45-2.72 (m, 8H), 0.94-1.03 (m, 1h), 0.47-0.56 (m, 2H), 0.14-0.20 (m, 1H).
(2R,3 S)-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1 -((cyklopropylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol (JT-3) (16)
Reakcję pomiędzy (2 R ,3 S )-3-amino-1-((cyklopropylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-olem (16B) (150 mg, 0.6401 mmol) i 9-bromo-9H-fluorenem (157 mg, 0.6401 mmol) w obecności węglanu potasu (177 mg, 1.280 mmol) w 5 mL acetonitrylu przeprowadzono według opisu w etapie 3. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/octan etylu), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 60.1 mg (23.58%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.4, MW 398.55, Wzór: C27H30N2O, MS m/z 399.15 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.71 (t, J = 7.45 Hz, 2H), 7.65 (dd, J = 16.90, 7.16 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.40 Hz, 2H), 7.34, (td, J = 7.40, 1.15 Hz, 1H), 7.25-7.32 (m, 3H), 7.16-7.23 (m, 3H), 5.14 (s, 1h), 3.63 (m, 1H), 2.97-3.11 (m, 2H), 2.91 (dd, J = 13.46, 3.72 Hz, 1H), 2.60-2.71 (m, 1H), 2.56 (dd, J = 12.89, 6.59 Hz, 1H), 2.48 (dd, J = 13.75, 9.74 Hz, 1H), 2.28 (dd, J = 12.03, 6.30 Hz, 1H), 1.40 (br. s, 3H), 0.83-0.97 (m, 1H), 0.48-0.56 (m, 1H), 0.44 (tt, J = 8.38, 4.51 Hz, 1H), -0.04-0.12 (m, 2H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 144.61, 144.24, 141.07, 140.86, 139.06, 129.40, 128.61, 128.36, 128.31, 127.52, 127.13, 126.40, 125.54, 125.37, 120.23, 119.93,
69.99, 67.27, 56.59, 55.74, 54.12, 39.44, 10.92, 5.06, 3.72.
Przykład 1.17. Synteza związku 17
Synteza produktów pośrednich - jak w przykładzie 1.2
N-((2 S ,3 S )-4-(benzyloamino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)-2-(9 H -fluoreno-9-ylo)acetamid (17)
Reakcję pomiędzy (2S,3S)-3-amino-1-(benzyloamino)-4-fenylobutan-2-olem (2B) (180 mg, 0.6662 mmol) i kwasem 9 H-fluoreno-9-octowym (149 mg, 0.6662 mmol) w obecności DMAP (41 mg, 0.3331 mmol), HOBt (117 mg, 0.8661 mmol) oraz EDC (166 mg, 0.8661 mmol) w 10 mL dichlorometanu przeprowadzono według opisu w etapie 4. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/DCM), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 53.1 mg (16.73%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.39, MW 476.62, Wzór: C32H32N2O2, MS m/z 477.31 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, METHANOL-d4) δ ppm 7.75 (d, J = 7.45 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 7.45 Hz, 1H), 7.17-7.36 (m, 15H), 4.23-4.29 (m, 2H), 3.85 (ddd, J = 8.02, 5.73, 2.29 Hz, 1H), 3.79 (d, J = 1.15 Hz, 2H), 2.93 (dd, J = 13.75, 5.73 Hz, 1h), 2.80 (dd, J = 13.75, 9.17 Hz, 1H), 2.58-2.69 (m, 3H), 2.56 (dd, J = 15.47, 7.45 Hz, 1H), NH, CONH, OH nie zarejestrowane; 13C NMR (126 MHz, METHANOL-d4) δ ppm 172.89, 146.43, 140.64, 128.99, 128.53, 128.32, 128.18, 127.37, 127.07, 127.02, 126.82, 126.16, 124.22, 119.50, 69.61,
53.31, 52.81, 51.00, 43.59, 39.48, 37.16.
Przykład 1.18. Synteza związku 18
Synteza produktów pośrednich - jak w przykładzie 1.5
N-((2 S ,3 S )-4-((4-( tert-butylo)benzylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)-9 H-fluoreno-9-karboksyamid (18)
Reakcję pomiędzy (2 S ,3 S )-3-amino-1-((4-( tert-butylo)benzylo)amino)-4-fenylobutan-2-olem (5B) (150 mg, 0.4601 mmol) i kwasem 9 H-fluoreno-9-karboksylowym (97 mg, 0.4601 mmol) w obecności DMAP (28 mg, 0.2301 mmol), HOBt (81 mg, 0.5981 mmol) oraz EDC (115 mg, 0.5981 mmol) w 8 mL dichlorometanu przeprowadzono według opisu w etapie 4. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/DCM), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM), HPLC preparatywne (acetonitryl/woda gradient 20-90%). Wydajność: 23.3 mg (9.77%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.38, MW 518.70, Wzór: C35H38N2O2, MS m/z 519.32 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.74 (d, J = 7.45 Hz, 2H), 7.47 (d, J = 7.45 Hz, 1H), 7.37-7.44 (m, 2H), 7.24-7.36 (m, 5H), 7.11-7.22 (m, 5H), 7.01-7.06 (m, 2H), 5.62 (d, J = 9.17 Hz, 1H), 4.68 (s, 1H), 4.05 (q, J = 9.20 Hz, 1H), 3.56 (s, 3H), 3.43 (br. s, 2H), 2.65-2.74 (m, 2H), 2.55 (dd, J = 12.03, 4.01 Hz, 1H), 2.27 (dd, J = 12.03, 9.74 Hz, 1H), 1.29 (s, 9H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 171.02, 150.71, 141.72, 141.45, 141.25, 137.83, 129.34, 128.47, 128.39, 128.25, 127.85, 127.68, 126.50, 125.64, 125.47, 125.04, 120.45, 120.36, 68.64, 56.20, 52.84, 52.30, 51.35, 38.17, 34.62, 31.41.
Przykład 1.19. Synteza związku 19
Synteza produktów pośrednich - jak w przykładzie 1.5
N-((2 S ,3 S )-4-((4-( tert-butylo)benzylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)-2-(9 H-fluoreno-9-ylo)acetamid (19)
Reakcję pomiędzy (2 S ,3 S )-3-amino-1-((4-( tert-butylo)benzylo)amino)-4-fenylobutan-2-olem (5B) (200 mg, 0.6135 mmol) i kwasem 9 H-fluoreno-9-octowym (138 mg, 0.6135 mmol) w obecności DMAP (37 mg, 0.3068 mmol), HOBt (108 mg, 0.7976 mmol) oraz EDC (153 mg, 0.7976 mmol) w 10 mL dichlorometanu przeprowadzono według opisu w etapie 4. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/DCM), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 119.4 mg (36.56%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.38, MW 532.73, Wzór: C36H40N2O2, MS m/z 533.41 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.75 (d, J = 8.02 Hz, 2H), 7.47 (d, J = 7.45 Hz, 1H), 7.16-7.40 (m, 14H), 5.92 (d, J = 9.17 Hz, 1H), 4.40 (t, J = 6.59 Hz, 1H), 4.11 (q, J = 8.40 Hz, 1H), 3.74-3.80 (m, 1H), 3.64-3.73 (m, 2H), 2.82 (d, J = 7.45 Hz, 2H), 2.71 (dd, J = 15.47, 6.87 Hz, 1H), 2.66 (dd, J = 15.47, 7.45 Hz, 1H), 2.55 (dd, J = 12.03, 4.01 Hz, 1H), 2.43-2.51 (m, 1H), 1.28 (s, 9H), NH, OH nie zarejestrowano; 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 171.31, 150.77, 146.45, 146.36, 140.93, 140.84, 138.11, 134.89, 129.50, 128.61, 128.28, 127.53, 127.51, 127.43, 127.21, 126.60, 125.66, 124.58, 124.53, 120.10, 68.08, 52.79, 52.54, 51.51, 43.81,40.30, 38.58, 34.61, 31.39.
Przykład 1.20. Synteza związku 20
Synteza produktów pośrednich - jak w przykładzie 1.7
2-(9 H-fluoreno-9-ylo)-N-((2 S ,3 S )-3-hydroksy-4-((2-metoksybenzylo)amino)-1-fenylobutan-2-ylo)acetamid (20)
Reakcję pomiędzy (2S,3S)-3-amino-1-((2-metoksybenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-olem (7B) (300 mg, 0.9994 mmol) i kwasem 9H-fluoreno-9-octowym (138 mg, 0.9994 mmol) w obecności DMAP (61 mg, 0.4997 mmol), HOBt (176 mg, 1.2992 mmol) oraz EDC (249 mg, 1.2992 mmol) w 10 mL dichlorometanu przeprowadzono według opisu w etapie 4. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/DCM), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 110.8 mg (22.15%), TlC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.44, MW 506.65, Wzór: C33H34N2O3, MS m/z 507.63 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.70 (d, J = 7.45 Hz, 2H), 7.44 (d, J = 7.45 Hz, 1H), 7.30-7.36 (m, 3H), 7.17-7.28 (m, 8H), 7.04 (dd, J = 7.45, 1.72 Hz, 1H), 6.79-6.87 (m, 2H), 6.24 (d, J = 9.16 Hz, 1H), 4.72 (br. s, 2H), 4.40 (t, J = 7.16 Hz, 1H), 4.11-4.18 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.63-3.74 (m, 3H), 2.84 (d, J = 8.02 Hz, 2H), 2.66 (dd, J = 15.47, 6.87 Hz, 1H), 2.54-2.62 (m, 2H), 2.50 (dd, J = 12.03, 9.74 Hz, 1H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM- d) δ ppm 171.44, 157.69, 146.62, 146.53, 140.93, 140.77, 138.28, 130.55, 129.81, 129.61, 128.60, 127.40, 127.35, 127.11, 126.57, 124.61, 124.59,
120.78, 120.03, 120.00, 110.60, 67.88, 55.40, 52.78, 51.58, 48.60, 43.82, 40.34, 38.49.
Przykład 1.21. Synteza związku 21
Synteza produktów pośrednich - jak w przykładzie 1.8
2-(9 H-fluoren-9-ylo)-N-((2 S ,3 R )-3-hydroksy-1-fenylo-4-((3-(trifluorometylo)benzylo)-amino)butan-2-ylo)acetamid (21)
Reakcję pomiędzy (2 S ,3 R )-3-amino-4-fenylo-1-((3-(trifluorometylo)benzylo)amino)butan-2-olem (8B) (314 mg, 0.9280 mmol) i kwasem 9 H-fluoreno-9-octowym (208 mg, 0.9280 mmol) w obecności DMAP (57 mg, 0.4640 mmol), HOBt (163 mg, 1.2064 mmol) oraz EDC (231 mg, 1.2064 mmol) w 10 mL dichlorometanu przeprowadzono według opisu w etapie 4. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/DCM), dwukrotnie chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w dCm). Wydajność: 130.0 mg (25.72%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.5, MW 544.62, Wzór: C33H31F3N2O2, MS m/z 545.11 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.74 (br. d, J = 5.16 Hz, 2H), 7.44-7.55 (m, 3H), 7.32-7.43 (m, 5H), 7.16-7.31 (m, 7H) 5.71 (d, J = 9.16 Hz, 1H) 4.42 (t, J = 6.59 Hz, 1H) 4.11 (q, J = 8.02 Hz, 1H) 3.63-3.79 (m, 2H) 3.53 (d, J = 6.87 Hz, 1H) 2.75-2.87 (m, 2H) 2.61-2.72 (m, 2H) 2.52 (dd, J = 12.03, 3.44 Hz, 1H) 2.31 (t, J = 10.30 Hz, 1H) 2.53 (br. s, 2H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 171.02, 146.30, 146.22, 140.93, 140.85, 140.43, 137.99, 131.52, 131.51, 130.92 (q, J = 32.00 Hz), 129.43, 129.03, 128.63, 127.61, 127.55, 127.46, 127.20, 126.62, 124.83 (q, J = 3.62 Hz), 124.54, 124.47, 124.25 (q, J = 4.20 Hz), 122.01 (q, J = 273.40 Hz), 120.13, 120.09, 68.31, 53.02, 52.28, 51.89, 43.82, 40.31, 38.65.
P r z y k ł a d 1.22. Synteza związku 22
Synteza produktów pośrednich - jak w przykładzie 1.9
N-((2 S ,3 R )-3-hydroksy-1-fenylo-4-((( S )-1-fenyloetylo)amino)butan-2-ylo)-9 H-fluoreno-9-karboksyamid (22)
Reakcję pomiędzy (2 R ,3 S )-3-amino-4-fenylo-1-((( S )-1-fenyloetylo)amino)butan-2-olem (9B) (200 mg, 0.7032 mmol) i kwasem 9 H-fluoreno-9-karboksylowym (148 mg, 0.7032 mmol) w obecności DMAP (43 mg, 0.3516 mmol), HOBt (124 mg, 0.9142 mmol) oraz EDC (175 mg, 0.9142 mmol) w 10 mL dichlorometanu przeprowadzono według opisu w etapie 4. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/DCM), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 107.8 mg (32.16%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.37, MW 476.62, Wzór: C32H32N2O2, MS m/z 477.52 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm (dd, J = 15.18, 7.73 Hz, 2H), 7.44 (t, J = 7.45 Hz, 1H), 7.37 (t, J = 7.45 Hz, 1H), 7.08-7.33 (m, 12H), 6.77-6.87 (m, 2H), 5.62 (d, J = 8.59 Hz, 1H), 4.64 (s, 1H), 4.10-4.19 (m, 1H), 3.41-3.61 (m, 1H), 3.25 (dt, J = 7.16, 3.87 Hz, 1H), 2.65 (dd, J = 14.03, 4.87 Hz, 1H), 2.39-2.49 (m, 2H), 2.29 (dd, J = 12.60, 4.58 Hz, 1H), 1.88-1.96 (m, 1H), 1.55-1.71 (m, 1H) 1.28 (d, J = 6.87 Hz, 3H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 171.63, 141.57, 141.27, 141.22, 137.20, 129.23, 128.69, 128.48, 127.85, 127.49, 126.95, 126.48, 125.65, 124.95, 120.35, 70.28, 58.96, 56.31,48.92, 36.54, 34.05, 25.06.
Przykład 1.23. Synteza związku 23
Synteza produktów pośrednich - jak w przykładzie 1.9
2-(9 H-fluoren-9-ylo)- N-((2 S ,3 R )-3-hydroksy-1-fenylo-4-((( S )-1-fenyloetylo)amino)butan-2-ylo)acetamid (23)
Reakcję pomiędzy (2 R ,3 S )-3-amino-4-fenylo-1-((( S )-1-fenyloetylo)amino)butan-2-olem (9B) (150 mg, 0.5274 mmol) i kwasem 9 H-fluoreno-9-octowym (118 mg, 0.5274 mmol) w obecności DMAP (32 mg, 0.2637 mmol), HOBt (93 mg, 0.6856 mmol) oraz EDC (131 mg, 0.6856 mmol) w 8 mL dichlorometanu przeprowadzono według opisu w etapie 4. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/DCM), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 77.0 mg (29.76%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.38, MW 490.65, Wzór: C33H34N2O2, MS m/z 491.56 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLORO
FORM-d) δ ppm 7.72 (dd, J = 7.45, 4.58 Hz, 2H), 6.97-7.43 (m, 16H), 5.83 (br. d, J = 28.10 Hz, 1H), 4.38 (t, J = 6.87 Hz, 1H), 4.16-4.27 (m, 1H), 3.64-3.72 (m, 1H), 3.32-3.43 (m, 1H), 2.78-2.88 (m, 1H), 2.46-2.65 (m, 4H), 2.77 (br. s, 2H), 2.26-2.39 (m, 1H), 1.31-1.41 (m, 3H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 171.61, 146.42, 140.77, 140.75, 137.90, 129.27, 128.71, 128.60, 127.51, 127.49, 127.44, 127.38, 127.29, 126.80, 126.56, 124.58, 120.01, 119.99, 70.62, 58.60, 53.96, 49.06, 43.76, 40.67, 36.78, 24.11.
Przykład 1.24. Synteza związku 24
Synteza produktów pośrednich - jak w przykładzie 1.10
N-((2 S ,3 R )-3-hydroksy-1-fenylo-4-((2-fenylopropan-2-ylo)amino)butan-2-ylo)-9 H-fluoreno-9-karboksyamid (24)
Reakcję pomiędzy (2 R ,3 S )-3-amino-4-fenylo-1-((2-fenylopropan-2-ylo)amino)butan-2-olem (10B) (150 mg, 0.5026 mmol) i kwasem 9 H-fluoreno-9-karboksylowym (106 mg, 0.5026 mmol) w obecności DMAP (31 mg, 0.2513 mmol), HOBt (88 mg, 0.6534 mmol) oraz EDC (125 mg, 0.6534 mmol) w 8 mL dichlorometanu przeprowadzono według opisu w etapie 4. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/DCM), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 68.14 mg (27.63%), TlC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.45, MW 490.65, Wzór: C33H34N2O2, MS m/z 491.54 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.73 (dd, J = 13.75, 7.45 Hz, 2H), 7.41-7.48 (m, 2H), 7.35-7.40 (m, 3H), 7.28-7.34 (m, 3H), 7.19-7.27 (m, 3H), 7.10-7.17 (m, 3H), 6.84-6.90 (m, 2H), 5.27 (br. d, J = 9.20 Hz, 1H), 4.66 (s, 1H), 4.09 (qd, J = 8.40, 4.58 Hz, 1H), 3.04 (dt, J = 8.59, 4.60 Hz, 1H), 3.20 (br. s, 2H), 2.81 (dd, J = 14.03, 4.30 Hz, 1H), 2.54 (dd, J = 14.03, 8.31 Hz, 1H), 2.18 (d, J = 4.58 Hz, 2H), 1.43 (s, 3H) 1.38 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM- d) δ ppm 171.26, 146.92, 141.66, 141.65, 141.17, 141.13, 137.30, 129.37, 128.49, 128.37, 127.88, 127.81, 126.62, 126.48, 126.07, 125.68, 124.97, 120.39, 120.36, 70.56, 56.30, 55.77, 52.64, 44.23, 36.47, 29.78, 28.97.
Przykład 1.25. Synteza związku 25
Synteza produktów pośrednich - jak w przykładzie 1.10
2-(9 H-fluoren-9-ylo)-N-((2 S ,3 R )-3-hydroksy-1-fenylo-4-((2-fenylopropan-2-ylo)amino)-butan-2-ylo)acetamid (25)
Reakcję pomiędzy (2 R ,3 S )-3-amino-4-fenylo-1-((2-fenylopropan-2-ylo)amino)butan-2-olem (10B) (150 mg, 0.5026 mmol) i kwasem 9 H-fluoreno-9-octowym (118 mg, 0.5026 mmol) w obecności DMAP (31 mg, 0.2513 mmol), HOBt (88 mg, 0.6534 mmol) oraz EDC (125 mg, 0.6534 mmol) w 8 mL dichlorometanu przeprowadzono według opisu w etapie 4. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/DCM), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 84.3 mg (33.23%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.48, MW 504.67, Wzór: C34H36N2O2, MS m/z 505.63 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM- d) δ ppm 7.72 (dd, J = 7.45, 4.01 Hz, 2H), 7.39-7.46 (m, 3H), 7.29-7.38 (m, 4H), 7.16-7.29 (m, 7H), 7.06-7.11 (m, 2H), 6.01 (br. d, J = 8.60 Hz, 1H), 4.39 (t, J = 6.87 Hz, 1H), 4.27 (ddd, J = 8.59, 5.73, 2.29 Hz, 1H), 3.33 (q, J = 4.60 Hz, 1H), 3.18 (br. s, 2H), 2.88 (dd, J = 14.32, 5.16 Hz, 1H), 2.67 (dd, J = 14.03, 8.31 Hz, 1H), 2.56 (dd, J = 14.89, 6.30 Hz, 1H), 2.45 (dd, J = 14.89, 7.45 Hz, 1h), 2.37 (dd, J = 12.60, 4.01 Hz, 1H), 2.30 (dd, J = 12.03, 5.16 Hz, 1H), 1.44 (d, J = 6.87 Hz, 6H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 171.47, 146.92, 146.40, 140.76, 137.89, 129.33,
128.62, 128.42, 127.54, 127.52, 127.45, 127.31, 126.67, 126.57, 126.02, 124.56, 124.53, 120.04,
120.02, 55.80, 53.59, 53.48, 44.43, 43.75, 40.66, 36.70, 29.70, 29.10.
Przykład 1.26. Synteza związku 26
Synteza produktów pośrednich - jak w przykładzie 1.13
N-((2 S ,3 R )-3-hydroksy-4-(neopentyloamino)-1-fenylobutan-2-ylo)-9 H-fluoreno-9-karboksyamid (26)
Reakcję pomiędzy (2 R ,3 S )-3-amino-1-(neopentyloamino)-4-fenylobutan-2-olem (13B) (150 mg, 0.5991 mmol) i kwasem 9 H-fluoreno-9-karboksylowym (138 mg, 0.5991 mmol) w obecności DMAP (37 mg, 0.2996 mmol), HOBt (105 mg, 0.7788 mmol) oraz EDC (149 mg, 0.7788 mmol) w 8 mL dichlorometanu przeprowadzono według opisu w etapie 4. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/DCM), chromatografia kolumnowa „flash” (0-10% MeOH w DCM). Wydajność: 51.3 mg (19.33%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.34, MW 442.60, Wzór: C29H34N2O2, MS m/z 443.22 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.73-7.77 (m, 2H), 7.47 (t, J = 7.73 Hz, 1H), 7.40-7.45 (m, 2H), 7.34 (td, J = 7.45, 1.15 Hz, 1H), 7.25-7.30 (m, 1H), 7.15-7.23 (m, 4H), 6.97 (dd, J = 7.45, 2.29 Hz, 2H), 5.67 (d, J = 8.59 Hz, 1H), 4.66 (s, 1H), 4.33-4.41 (m, 1H), 3.37-3.42 (m, 1H), 3.13 (dd, J = 14.32, 4.01 Hz, 1H), 3.04 (dd, J = 12.60, 1.72 Hz, 1H), 2.85 (d, J = 12.03 Hz, 1H), 2.75 (dd, J = 14.32, 8.59 Hz, 1H), 2.61 (dd, J = 12.89, 4.87 Hz, 1H), 2.54 (d, J = 12.03 Hz, 1H), 1.23 (s, 9H), NH, OH nie zarejestrowane;
13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 172.86, 141.80, 141.26, 140.43, 136.51, 129.43,
128.75, 128.60, 128.05, 127.81, 126.80, 125.71, 124.60, 120.55, 69.58, 61.30, 55.51, 53.29, 52.34, 36.08, 31.24, 27.75.
Przykład 1.27. Synteza związku 27
Synteza produktów pośrednich - jak w przykładzie 1.13
2-(9 H-fluoren-9-ylo)-N-((2 S ,3 R )-3-hydroksy-4-(neopentyloamino)-1-fenylobutan-2-ylo)acetamid (27)
Reakcję pomiędzy (2 R ,3 S )-3-amino-1-(neopentyloamino)-4-fenylobutan-2-olem (13B) (150 mg, 0.5991 mmol) i kwasem 9 H-fluoreno-9-octowym (134 mg, 0.5991 mmol) w obecności DMAP (37 mg, 0.2996 mmol), HOBt (105 mg, 0.7788 mmol) oraz EDC (149 mg, 0.7788 mmol) w 8 mL dichlorometanu przeprowadzono według opisu w etapie 4. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/DCM), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 124.3 mg (45.43%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.35, MW 456.63, Wzór: C30H36N2O2, MS m/z 457.44 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM- d) δ ppm 7.72 (dd, J = 7.45, 5.16 Hz, 2H), 7.50 (dd, J = 7.45, 1.15 Hz, 1H), 7.18-7.41 (m, 8H), 7.09-7.14 (m, 2H), 5.52 (d, J = 8.59 Hz, 1h), 4.31 (t, J = 5.73 Hz, 1H), 4.10-4.19 (m, 1H), 3.10 (br. s, 1H), 3.02 (dd, J = 14.32, 4.58 Hz, 1H), 2.81 (t, J = 5.16 Hz, 2H), 2.61-2.72 (m, 2H), 2.42 (d, J = 11.46 Hz, 1H), 2.04-2.09 (m, 1H), 1.98 (br. s, 1H), 0.98 (s, 9H), NH, OH nie zarejestrowane; 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 171.76, 145.94, 145.76, 140.92, 140.76, 137.25,
129.46, 128.71, 127.78, 127.62, 127.37, 126.74, 124.74, 124.25, 120.08, 70.02, 61.50, 53.54, 52.54, 43.96, 39.68, 36.33, 31.25, 27.66.
Przykład 1.28. Synteza związku 28
Synteza produktów pośrednich - jak w przykładzie 1.16
N-((2 S ,3 R )-4-((cyklopropylometylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)-2-(9 H-fluoren-9-ylo)acetamid (28)
Reakcję pomiędzy (2 R ,3 S )-3-amino-1-((cyklopropylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-olem (16B) (150 mg, 0.6401 mmol) i kwasem 9 H-fluoreno-9-octowym (144 mg, 0.6401 mmol) w obecności DMAP (39 mg, 0.3201 mmol), HOBt (112 mg, 0.8321 mmol) oraz EDC (160 mg, 0.8321 mmol) w 8 mL dichlorometanu przeprowadzono według opisu w etapie 4. Oczyszczanie: ekstrakcja (woda/DCM), chromatografia kolumnowa „flash” (5% MeOH w DCM). Wydajność: 103.7 mg (36.76%), TLC (DCM/MeOH, 9/1 ν/ν) Rf = 0.27, MW 440.59, Wzór: C29H32N2O2, MS m/z 441.36 (M+H+), 1H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.76 (d, J = 7.45 Hz, 2H), 7.56 (dd, J = 14.32, 8.02 Hz, 2H), 7.37 (t, J = 7.40 Hz, 2H), 6.98-7.33 (m, 8H), 4.62-4.73 (m, 1H), 3.99 (dd, J = 13.17, 8.02 Hz, 1H), 3.80-3.90 (m, 1H), 3.55-3.69 (m, 1H), 2.98-3.18 (m, 4H), 2.81 (d, J = 7.45 Hz, 2H), 2.34-2.65 (m, 1H), 2.04 (br. s, 2H), 0.53-0.78 (m, 1H), 0.30-0.45 (m, 2h), 0.01-0.14 (m, 2H); 13C NMR (126 MHz, CHLOROFORM- d) δ ppm 174.29, 146.96, 140.85, 129.52, 128.73, 127.50, 127.37, 127.28, 126.57, 124.76, 124.72, 120.03, 56.15, 54.06, 51.10, 44.35, 44.05, 39.43, 37.97, 10.39, 3.88, 3.74.
Przykład 2. Aktywność związków w warunkach in vitro
Przykład 2.1. Badanie zdolności hamowania enzymów: butyrylocholinoesterazy z osocza końskiego (eq BuChE) oraz ludzkiej osoczowej butyrylocholinoesterazy (h BuChE)
Do zbadania aktywności zastosowano spektrofotometryczny test Ellmana [Ellman i współ.] zmodyfikowany do oznaczeń na płytkach 96-dołkowych. Odczynniki: kwas 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoesowy) (DTNB), eq BuChE oraz jodek butyrylotiocholiny (BTC) zakupiono od Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy). hBuChE pochodziła z Vivonics (Bedford, MA, USA). Enzymy przygotowano przez rozpuszczenie w wodzie demineralizowanej do uzyskania stężenia 0.384 U/ml. Roztwory podstawowe badanych związków przygotowano przez rozpuszczenie w DMSO do uzyskania stężenia 0.0034 M. Następnie rozcieńczano je wodą, aby uzyskać odpowiednie stężenia w dołkach. W pierwszym etapie wykonania testu, 25 μl związku badanego (lub mieszaniny DMSO/woda w odpowiednim stosunku, dla prób ślepych) inkubowano w 0.1 M buforze fosforanowym (200 μl, pH = 8,0) z DTNB (20 μl; 0.0025 M) i odpowiednim enzymem (20 μl; eqBuChE lub hBuChE) w temperaturze 25°C (enzym zwierzęcy) lub 36°C (enzym ludzki). Po 5 minutach okresu inkubacji dodawano 20 μl roztworu BTC (0.00375 M). Po kolejnych 5 minutach mierzono zmiany absorbancji roztworów przy długości fali równej 412 nm, stosując wielofunkcyjny czytnik mikropłytek (EnSpire Multimode; PerkinElmer; Waltham, MA, USA). Wszystkie związki badano w stężeniu przesiewowym 10 μM (eq BuChE) lub 1 μM (h BuChE). Procent hamowania enzymu obliczano z równania 100-(S/B)x100, gdzie S i B oznaczały odpowiednio aktywność enzymatyczną w dołku z badaną próbką i bez próbki. Dla związków o zdolności hamowania enzymu w stężeniu przesiewowym większej niż 50% (eq BuChE) lub 80% (h BuChE), określano wartości IC50. Aby określić wartość IC50, zastosowano siedem różnych stężeń każdego związku, w celu uzyskania aktywności enzymatycznej od 5% do 95%. Wszystkie reakcje przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Wartości IC50 obliczano stosując regresję nieliniową (GraphPad Prism 5 [GraphPad Software, San Diego, CA, USA 5.00]) dla zależności procentu hamowania enzymu względem zastosowanego stężenia inhibitora. Jako związki odniesienia zastosowano takrynę i donepezyl.
Przykład 2.2. Badanie zdolności hamowania enzymu ludzkiej rekombinowanej beta-sekretazy (h BACE1)
Do zbadania aktywności wykorzystano test FRET [Vassar, i współ.], stosując 384-dołkowe czarne płytki i czytnik mikropłytek (EnSpire Multimode; PerkinElmer; Waltham, MA, USA). Test został zakupiony od Life Technologies Polska Sp. z o.o. (Warszawa, Polska). Długość fali analitycznej zoptymalizowano i ustalono dla wzbudzenia 553 nm, a dla emisji 576 nm. Roztwory podstawowe badanych związków przygotowano w DMSO, a następnie dalej rozcieńczano buforem testowym (50 mM octan sodu; pH 4.5) do uzyskania odpowiednich stężeń w dołkach. W pierwszym etapie badania, 10 μl substratu (wygaszacz Rh-EVNLDAEFK, oparty na tak zwanej szwedzkiej mutacji APP) mieszano z 10 μl badanego związku (lub buforu testowego; dla próby ślepej). Reakcję enzymatyczną inicjowano przez dodanie 10 μl enzymu (hBACE1, 1 U/ml). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 25°C przez 60 minut, a następnie dodawano 10 μl roztworu zatrzymującego reakcję (2.5 M octan sodu). Po zatrzymaniu reakcji, mierzono fluorescencję przy długości fali 576 nm. Procent hamowania enzymu obliczano ze wzoru [1-(S60-S0)/(C60-C0)]x100, gdzie S0 i S60 oznaczały fluorescencję badanej próbki (zawierającej enzym, substrat i badany związek) na początku reakcji i odpowiednio po 60 minutach, podczas gdy Co i Cso były analogicznymi intensywnościami fluorescencji w próbie ślepej (zawierającej enzym, substrat i bufor). Wszystkie badane związki zbadano w stężeniu 50 μM, w trzech powtórzeniach. Wartości IC50 określono dla związków badanych z co najmniej 80% zdolnością hamowania enzymu w stężeniu przesiewowym 50 μM. Jako związek odniesienia zastosowano inhibitor BACE1 IV (Calbiochem, Merck; Nottingham, Wielka Brytania) [Stachel i współ.]. Wartość IC50 inhibitora IV określono, stosując osiem różnych stężeń związku, dających hamowanie enzymu między 10% a 95%. Wartości IC50 dla wszystkich związków badanych obliczono stosując regresję nieliniową (GraphPad Prism 5 [GraphPad Software, San Diego, CA, USA 5.00]) dla zależności procentu hamowania enzymu względem zastosowanego stężenia inhibitora.
Przykład 2.3. Badanie aktywności antyagregacyjnej względem beta-amyloidu (Ae)
Do oznaczeń wykorzystano test tioflawinowy T [Levine III]. Zrekombinowany ludzki peptyd APi-42 (wstępnie potraktowany HFIP, Merck Millipore, Darmstadt, Niemcy) rozpuszczono w DMSO, otrzymując roztwór podstawowy o stężeniu 75 μM. Roztwór dalej rozcieńczano w buforze HEPES (150 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl), do stężenia 7.5 μM. Następnie, roztwór A8i-42 dodawano do badanych związków (używano czarnych płytek 96-dołkowych) i rozcieńczano roztworem tioflawiny T (stężenie końcowe 10 μM). Końcowa mieszanina zawierała 1.5 μM A8i-42, 10 μM testowanego związku i 3% DMSO. Fluorescencję mierzono co 300 s (długość fali wzbudzenia wynosiła 440 nm, długość fali emisji 490 nm), stosując ciągłe mieszanie pomiędzy pomiarami. Do pomiaru fluorescencji zastosowano wielofunkcyjny czytnik mikropłytek (Synergy H4; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). Fluorescencja zaczynała rosnąć po około 4 godzinach, osiągała plateau po 20 godzinach i pozostawała praktycznie niezmieniona przez kolejne 28 godzin inkubacji. Intensywności fluorescencji w fazie plateau (w obecności i nieobecności związków badanych) uśredniano, a następnie odejmowano od nich średnie wartości fluorescencji odpowiednich dołków w czasie t = 0 h. Procent hamowania agregacji A8i-42 obliczano ze wzoru %inh = (1-Fi/Fo)x1OO%, gdzie Fi jest wzrostem fluorescencji A8i-42 w próbce ze związkiem badanym, natomiast Fo to wzrost fluorescencji samego A8i-42 (bez związku badanego). Do oznaczenia wartości IC50 wykorzystano rozcieńczenia związków badanych w zakresie stężeń w dołkach od 30 nM do 30 μM. Wartości IC50 obliczano przy użyciu regresji nieliniowej (GraphPad Prism 5 [GraphPad Software, San Diego, CA, USA 5.00]) dla zależności procentu hamowania agregacji względem zastosowanego stężenia inhibitora.
Wyniki aktywności in vitro uzyskane dla przykładowych związków według wynalazku zostały zgromadzone w Tabeli 2.
PL 243516 Β1
Tabela 2
Wyniki badań biologicznych in vitro.
Nazwa Struktura e^BuChE® ICso [μΜ] ABuChEb ICsd [μΜ]/%ΐηΙι ABACE-Γ ICse |pM|/%inh inh. Αβ %inh
Λ Η QH H ΓΗ
(2 L H 0.627 0.196 10.11 82.5%
(1) o ii1
(2 Λ H ?H H Α^Ν,^Α^,Ν^χ 0 0.333 0.571 4.82 86.3%
(2) Ό
O Η 9H H Ί, 78.25% 68.0% 6.35 90.9%
(3) □ X
H QH H i)
O ___A II 0.514 0.489 3.92 83.7%
(4) Ό
o Η ?H H f
N N χ/Α 0.803 61.98% 6.64 75.6%
(5) j Ό
Η ?H H f x il
o ^.n^A^n^T II Α-^ο 1 2.196 67.72% 2.25 93.3%
(6) j X1
\ Η H l· Π
ę JL U O 0.278 0.268 7.23 86.7%
(7) 0 X
PL 243516 Β1
751 0.721 3.19 72.4%
264 0.812 20.12 63%
345 1.167 17.18 90.8%
955 76.48% 8.60 78.6%
842 58.81% 48.66% 67.2%
.18 61.27% 8.59 80.2%
078 67.87% 36.83% 82.5%
975 1.033 nd nd
313 0.207 61.34% 79.0%
PL 243516 Β1
1.756 66,39% 11.5 42,5%
1.220 55.61% 1.12 63.5%
3.022 77.14% 78.33% 86.7%
2.203 74.46% 71.1% <10%
2.019 54.33% 2.12 <10%
<10% 72.58% <10% (23) (24) (25)
8.86
2.84
1.27
0.558
21.37%
71.70%
7.36 59.4%
5.15 61%
4.96 63%
PL 243516 Β1 (26) (27)
1.088 61.07% 54.53% 39.5%
0.383 0.207 52.4% 53.5%
1.188 0.246 12.3 73.4%
“wartości IC50 hamowania butyrylocholinocstcrazy zwierzęcej (z węgorza elektrycznego) lub procent hamowania enzymu w stężeniu inhibitora 10 μΜ Wartości IC50 hamowania butyiylocholinocstcrazy ludzkiej lub procent hamowania enzymu w stężeniu inhibitora 1 μΜ, Cwartości ICso hamowania β-sckrctazy zwierzęcej lub procent hamowania enzymu w stężeniu inhibitora 50 μΜ, dproccnt hamowania agregacji β-amyloidu w stężeniu 10 μΜ, nd - nicoznaczono.
Przykład 3. Badania toksyczności ostrej i farmakokinetyki
Zwierzęta laboratoryjne
Badania zostały przeprowadzone w Zakładzie Toksykologii i Farmacji Wojskowej, Wydziału Wojskowych Nauk o Zdrowiu w Hradec Kralove, Uniwersytetu Obrony w Brnie w Czechach, w Centrum Badań Biomedycznych oraz w Zakładzie Biochemii Klinicznej Szpitala Uniwersyteckiego Hradec Kralove w Czechach. Wszystkie procedury odbywały się pod nadzorem Komisji Etyki Wydziału Wojskowych Nauk o Zdrowiu (nr 20/19; MO 215611/2019-684800). W badaniach wykorzystano samce i samice szczepu myszy domowej (Mus musculus) ICR-CD1 (masa ciała ok. 20-25 g). Zwierzęta były przetrzymywane w standardowych, odpowiednio dobranych do ich rozmiarów klatkach, podzielone na grupy o maksymalnej liczbie 8 osobników. Zwierzętom z grup badanych podawano badany związek dootrzewnowo (dawki w badaniu toksyczności ostrej: 10, 20, 40 i 60 mg/kg, dawka w badaniu parametrów farmakokinetycznych 10 mg/kg). Grupy kontrolne otrzymywały 1% Tween 80.
Aparatura użyta do badań
Wirówka U-320R (Boeco, Hamburg, Niemcy), mikroskop ΒΧ-51 (Olympus, Tokio, Japonia), system chromatografii cieczowej składający się z pompy Ultimate 3000 RS Dionex (Thermo Scientific, San Jose, Kalifornia, USA) w połączeniu ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości z analizatorem orbitrap (Q Exactive Focus, Thermo Scientific, San Jose, Kalifornia, USA).
Analiza wyników
W badaniu toksyczności ostrej do obliczeń statystycznych użyto programu IBM SPSS Statistics (wersja 24, USA). Przy porównywaniu wartości średnich dla grup (n = 4) zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA). Do analizy post hoc użyto test t-Studenta. Różnicę średnich uznawano za istotną statystycznie przy poziomie istotności (h < 0.05). Do obliczeń statystycznych w badaniach parametrów farmakokinetycznych użyto programu GraphPadPrism (wersja 6.05, USA). Wyniki przedstawiono jako średnie pomiarów ± błąd standardowy średniej (SEM, n = 6). Standardową analizę niekompartmentową przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Kinetica (wersja 4.0, USA).
Przykład 3.1. Badanie toksyczności ostrej związku JT3 (16)
Procedura badania
Badanie ocenia profil toksyczny związku poprzez obserwację pojawiających się efektów niepożądanych, analizę parametrów biochemicznych oraz analizę histopatologiczną oraz wyznacza maksymalną tolerowaną dawkę (MTD). Myszy losowo przydzielono do grup eksperymentalnych składają
PL 243516 Β1 cych się z dwóch samców i dwóch samic. Po podaniu badanego związku zwierzęta obserwowano pod kątem objawów toksyczności. Klasyfikacji objawów toksyczności dokonano tak jak w poprzednim opublikowanym badaniu [J. Misik]. Utratę masy ciała lub zmniejszenie spożycia żywności oceniano zgodnie z klasyfikacją FELASA [K.L. Chapman] w ciągu pierwszych dwóch godzin, a następnie okresowo przez kolejne 46 godzin. Wszystkie zwierzęta, które przeżyły 48 godzin poddano eutanazji. Krew pobrano do analizy biochemicznej, a wybrane narządy (nerki i wątrobę) pobrano do badania histopatologicznego. Krew żylną pobierano do heparynizowanych probówek. Osocze następnie rozdzielono (3000 χ g, 5 min, 4°C) przy użyciu wirówki. Stężenie mocznika i kreatyniny oraz aktywność aminotransferazy alaninowej (ALT), aminotransferazy asparaginowej (AST), fosfatazy alkalicznej (ALP), amylazy i dehydrogenazy mleczanowej (LDH) oznaczono w akredytowanym laboratorium biochemicznym. Pobrane narządy: wątrobę i nerki wykorzystano do standardowego badania histopatologicznego. Narządy utrwalono 10% obojętną buforowaną formaliną, poddano obróbce histologicznej i wybarwiono hematoksyliną i eozyną tak jak w poprzednim opublikowanym badaniu [J. Pejchal]. Zmiany histopatologiczne oceniono mikroskopowo.
Wyniki badania
Wyznaczenie maksymalnej tolerowanej dawki związku JT-3
Na podstawie obserwowanych efektów niepożądanych, występujących zmian biochemicznych oraz wyników analizy histopatologicznej u myszy, którym podawano związek JT-3 w czterech dawkach (10, 20, 40 i 60 mg/kg) określono maksymalną tolerowaną dawkę (MTD) na poziomie 10 mg/kg.
Wpływ związku JT-3 na pcjawienie się efektów niepożądanych w dawce 10 mg/kg
W dawce oznaczonej jako MTD (10 mg/kg) obserwowano łagodne działania niepożądane, występujące u niektórych zwierząt oraz umiarkowane drżenie zaobserwowane u jednego ze zwierząt. Obserwowane objawy niepożądane przedstawiono w Tabeli 3.
Tabela 3
Objawy zatrucia obserwowane u samców i samic myszy po podaniu związku JT-3 w dawce 10 mg/kg (MTD).
Efekt toksyczny Myszy
Samiecl Samiec 2 Samical Samica2
Hiper/hipowentylacja + + + +
Opadanie powiek + +
Ogólne wyczerpanie + + + +
Drżenie + + + ++
Drgawki +
Zmiana masy ciała w 24 h (%) -1.3 -1.2 -3.9 -5.8
Zmiana masy ciała w 48 h (%) -2.4 -0.7 -0.4 -5.2
Objawy zatrucia zostały ocenione jako łagodne (+), umiarkowane (++) i ciężkie (+++).
Wpływ związku JT-3 na parametry biochemiczne w dawce 10 mg/kg
Wyznaczono poziom mocznika, kreatyniny, enzymów wątrobowych, fosfatazy alkalicznej (ALP), amylazy, oraz dehydrogenazy mleczanowej (LDH). W dawce oznaczonej jako MTD (10 mg/kg) nie zaobserwowano istotnych statystycznie zmian w porównaniu z próbą kontrolną.
PL 243516 Β1
Tabela 4
Parametry biochemiczne po podaniu związku JT-3 w dawce 10 mg/kg (MTD).
Parametry Próba kontrolna JT-3 (10 mg/kg)
Mocznik (mg/dL) 36.2±8.4 33.8 ± 8.2
Kreatynina (pg/dL) n.d. n.d.
ALT (U/L) 31.7 ±9.6 29.0 ±6.5
AST (U/L) 56.9 ±7.4 56.8 ±6.6
ALP (U/L) 67.5 ±21.9 68.4 ±27.2
Amylaza (U/L) 3158 ±497 2955 ± 501
LDH (U/L) 249 ± 47 275 ± 94
ti.d. wartość poniżej granicy wy crywalności
Wpływ związku JT-3 na pojawienie się zmian histopatologicznych w dawce 10 mg/kg
W dawce JT-3 wyznaczonej jako MTD (10 mg/kg), u dwóch zwierząt zaobserwowano jedynie sporadyczne naciekanie neutrofili do tkanki wątrobowej oraz tkanki tłuszczowej, bez jakichkolwiek oznak zniszczenia wątroby czy nerek oraz łagodne podrażnienie otrzewnej w miejscu podania, natomiast u dwóch pozostałych nie obserwowano takich zmian.
Przykład 3.2. Badanie parametrów farmakokinetycznych związku JT3 (16)
Procedura badania
Po podaniu związku JT-3 w dawce MTD (10 mg/kg) zwierzęta poddawano głębokiej terminalnej anestezji w 0, 3, 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 240 i 360 minucie od podania (sześć zwierząt na przedział czasu; n = 6) i pobierano im krew przez nakłucie serca do heparynizowanych probówek. Próbki odwirowano (3000 χ g, 10 minut, 10°C). Osocze przechowywano w -80°C do czasu analizy HPLC. Krew w naczyniach mózgowych zakłócałaby poziom rzeczywistych stężeń w tkance mózgowej, dlatego zwierzęta perfundowano przezsercowo roztworem soli fizjologicznej (0.9% NaCI) przez 5 minut (10 mL/min). Po perfuzji czaszkę otworzono, a mózg ostrożnie usunięto i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy HPLC.
Analiza HPLC
Analizy ilościowe związku JT-3 w osoczu i mózgu przeprowadzono za pomocą HPLC. Metoda została w pełni zwalidowana dla osocza i częściowo zwalidowana dla homogenatu mózgu zgodnie z wytycznymi EMA i FDA w sprawie walidacji metod bioanalitycznych [Research, C, Anonymous].
Wyniki badania
Zmiany stężeń JT-3 w osoczu i mózgu
Ustalono bardzo dobrą penetrację związku JT-3 do mózgu. Po podaniu dootrzewnowym w stosunkowo krótkim czasie osiąga on w OUN wyższe stężenie niż w osoczu. Maksymalne stężenie związku oznaczono w 60. minucie od podania, co w pełni pokrywa się z czasem badania aktywności związku we wcześniej przeprowadzonych testach pamięciowych.
Na Fig. 1 przedstawiono zmiany stężeń JT-3 w osoczu i mózgu po pojedynczym podaniu związku w dawce MTD (10 mg/kg).
Parametry farmakokinetyczne dla JT-3
Dla związku JT-3 wyznaczono podstawowe parametry farmakokinetyczne, które zebrano w Tabeli 5.
PL 243516 Β1
Tabela 5
Wyznaczone parametry farmakokinetyczne dla JT-3 w osoczu i mózgu.
OSOCZE Wartości
Cmax (ng/mL) 430.09 ± 57.94
Ttnax (min) 23.33 ±4.97
AUCtotai (min.ng/mL) 58 804.62 ± 3 318.21
λζ (1/min) 0.0045 ± 0.0004
Half-life (min) 161.44 ± 14.25
MRT (min) 217.10± 17.65
CL (L/min/kg) 0.17±0.01
Vz (L/kg) 40.93 ± 4.95
Vss (L/kg) 38.17 ±4.47
MÓZG
Cmax (llg/g) 833,00 ± 62.32
Tinax(min) 55.00 ± 6.80
AUCtotai (min.ng/g) 650 923.00 ± 152 288.00
Cmax = maksymalne stężenie JT-3 w osoczu; Tmax = czas Cmax; AUCtotai = pole pod krzywą zależności stężenia od czasu od zera do nieskończoności; λζ = stała szybkości końcowej; okres półtrwania odnosi się do fazy eliminacji; MRT = średni czas przebywania cząsteczki w ciele; CL = klierens; Vz = objętość dystrybucji podczas fazy końcowej; Vss = pozorna objętość dystrybucji w stanie ustalonym.
Przykład 4. Badania behawioralne związku JT3 (16)
Zwierzęta laboratoryjne
Badania zostały przeprowadzone w Katedrze Farmakodynamiki Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez liii Lokalną Komisję Etyczną ds. Doświadczeń na Zwierzętach w Krakowie (nr zgody 53/2017 i 250/2019) i zostały wykonane zgodnie z obowiązującym rozporządzeniem Unii Europejskiej (86/609/EEC). W badaniach wykorzystano samce dwóch różnych szczepów myszy domowej (Mus musculus): Albino Swiss CD-1 (masa ciała ok. 20-24 g, wiek ok. 6 tyg.) oraz myszy C57BL/6J (masa ciała ok. 18-22 g, wiek ok. 6 tyg.). Do testu biernego unikania, ruchliwości spontanicznej oraz testu pręta obrotowego wykorzystano szczep CD-1, natomiast do testów labiryntu wodnego Morrisa i labiryntu Barnes’a użyto myszy C57BL/6J. Zwierzęta były przetrzymywane w standardowych, odpowiednio dobranych do ich rozmiarów klatkach, podzielone na grupy o maksymalnej liczbie 10 osobników. Zwierzętom z grup badanych w fazie uczenia, 1 h przed rozpoczęciem doświadczeń podawano badany związek dootrzewnowo (dawki w badaniu wstępnym, tj. w teście biernego unikania: 10, 30 i 60 mg/kg), a 30 minut później 1 mg/kg skopolaminy podskórnie. W testach oceniających aktywność prokognitywną JT-3 użyto dwóch grup kontrolnych - jedna z nich otrzymywała sól fizjologiczną, a druga sól fizjologiczną i skopolaminę.
Aparatura użyta do badań
Aparat do testu biernego unikania (LE 800 Passive Avoidance Apparatus, Harvard Apparatus, Hiszpania); labirynt wodny Morrisa (Panlab Harvard Apparatus, Hiszpania); Labirynt Barnes’a (Panlab Harvard Apparatus, Hiszpania); aktometry (Activity Cage 7441, Ugo Basile, Włochy); pręt obrotowy (RotaRod apparatus RR 0711, May Commat, Turcja).
Analiza wyników
Do obliczeń statystycznych użyto programu GraphPadPrism (wersja 8.0, USA). Wyniki przedstawiono jako średnie pomiarów ± błąd standardowy średniej (SEM). Przy porównywaniu wartości średnich dla grup zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), analizę wariancji z powtarzanymi pomiarami lub test t-Studenta dla prób niezależnych, dobierane w zależności od przeprowadzonego doświadczenia behawioralnego. Do analizy post hoc użyto testu Dunnett’a. Różnicę średnich uznawano za istotną statystycznie przy poziomie istotności p < 0.05.
Przykład 4.1. Test biernego unikania (Passive Avoidance Task)
Procedura testu
Test ocenia pamięć kontekstualną. Aparat składa się z dwóch komór (biała: 26 cm χ 26 cm χ 34 cm; czarna: 13 cm χ 7,5 cm χ 7,5 cm) oddzielonych drzwiami. Test składa się z dwudniowej procedury. W pierwszym dniu (faza nabycia) badany związek lub sól fizjologiczną podano zwierzętom 1 h przed testem (podanie i.p.). W celu indukcji zaburzeń pamięci, po 30 min podano również skopolaminę (1 mg/kg, s.c.). Pierwszego dnia testu mysz umieszczana była w jasnym kompartmencie. Po 30 s okresu habituacji i eksploracji tej komory, drzwi pomiędzy dwoma kompartmentami otwierały się automatycznie. Jeżeli mysz weszła do ciemnego kompartmentu, drzwi zamykały się, a mysz była poddana działaniu szoku elektrycznego (natężenie bodźca: 0,2 mA; czas trwania bodźca: 2 s). Mierzono latencję wejścia do ciemnej komory. 24 h później (faza odtworzenia) powtórzono te same czynności poza podaniem związku/soli fizjologicznej/skopolaminy oraz narażeniem myszy na działanie szoku elektrycznego. Zwierzęta były umieszczane w białej komorze na okres 180 s. Po 30 s drzwi pomiędzy kompartmentami otwierały się i podobnie jak w fazie nabycia mierzono czas latencji wejścia do ciemnego kompartmentu. Wydłużenie latencji drugiego dnia badania (faza odtworzenia), w porównaniu z dniem pierwszym, wiąże się z potencjalnym prokognitywnym efektem związku JT-3.
Wyniki testu
W teście biernego unikania w dniu drugim testu, tj. w próbie odtworzenia, wykazano istotną statystycznie różnicę pomiędzy grupą kontrolną, która otrzymała skopolaminę i grupą, której podano skopolaminę i związek JT-3 w dawce 10 mg/kg (p < 0,01). Wyższe dawki związku JT-3 (30 mg/kg i 60 mg/kg) nie były aktywne (Fig. 2). Ze względu na uzyskane istotnie statystycznie wyniki dla związku JT-3 w dawce 10 mg/kg, dawka 10 mg/kg została wybrana do badań poszerzonych, tj. testu labiryntu wodnego Morrisa oraz labiryntu Barnes’a.
Na Figurze 2 zaprezentowano wpływ badanego związku JT-3 na procesy pamięciowe u myszy w teście biernego unikania. Wyniki przedstawiono jako średnią latencję [s] ±SEM wejścia do czarnego kompartmentu. Analiza statystyczna: analiza wariancji z powtarzanymi pomiarami oraz test post hoc Dunnett’a. Istotność statystyczna względem grupy kontrolnej, która otrzymała skopolaminę: ** p < 0.01, **** p < 0.0001.
Przykład 4.2. Test labiryntu wodnego Morrisa
Procedura testu
Eksperyment bada pamięć przestrzenną myszy zależną od hipokampa. Aparat składa się z basenu (średnica 120 cm, wysokość 60 cm) wypełnionego wodą (do wysokości ok. 45 cm) o temperaturze ok. 25°C. Basen podzielony jest na cztery ćwiartki (NE, NW, SE, SW). W wybranej strefie (NW) znajduje się ukryta pod wodą (ok. 0,5 cm poniżej poziomu wody) wykonana z pleksiglasu niewidoczna dla zwierząt platforma (średnica 12 cm). Na ścianach pomieszczenia umieszczono geometryczne kształty w określonych kolorach, które służyły jako punkty orientacyjne dla zwierząt. Platforma pozostaje w tym samym miejscu przez 6 kolejnych dni fazy nabycia (fazy uczenia się). Nad basenem znajduje się kamera połączona z komputerem i oprogramowaniem (Smart v. 3.0, Panlab Harvard Apparatus, Hiszpania), co umożliwia automatyczne rejestrowanie ruchu zwierząt i analizę wszystkich przedstawionych poniżej parametrów.
W tym etapie badania, każda z myszy była codziennie poddana czterem próbom (odstęp między próbami ok. 1 h). Każdorazowo mysz była delikatnie wkładana do basenu w innym miejscu (inna ćwiartka basenu). Przez kolejnych 60 s mysz przeszukiwała basen w celu odnalezienia platformy. Jeżeli po upływie 60 s zwierzę nie odnalazło platformy, zostawało na nią kierowane przez osobę wykonującą doświadczenie i pozostawiane tam na 15 s. Następnie mysz wyciągano z basenu, delikatnie osuszano i przenoszono do domowych klatek. W trakcie fazy nabycia (uczenia) mierzono czas oraz dystans pokonany do odnalezienia platformy. Dodatkowo, przeanalizowano trajektorie poruszania się w basenie. Siódmego dnia przeprowadzono właściwy test oceniający pamięć przestrzenną. W tej fazie badane związki i skopolamina nie były podawane. Z basenu usunięto platformę, mysz była umiesz czana w basenie, w losowo wybranej ćwiartce i pozostawała w nim na okres 60 s. Mierzono latencję odnalezienia miejsca, w którym uprzednio (w fazie nabycia/uczenia) znajdowała się platforma, a także liczbę przepłynięć przez miejsce, gdzie w fazie nabycia znajdowała się platforma. Dodatkowo mierzono całkowity czas przebywania i odległość pokonaną we właściwej ćwiartce basenu (w strefie NW, w której w fazie nabycia znajdowała się platforma), a także prędkość i całkowitą drogę przebytą przez zwierzę w ciągu 60 s testu. Skrócenie czasu latencji i drogi odnalezienia platformy w fazie nabycia w grupie badanej w porównaniu z grupą kontrolną, która otrzymała skopolaminę, świadczy o uczeniu się zwierząt, natomiast skrócenie latencji odnalezienia miejsca platformy w dniu siódmym świadczy o lepszych zdolnościach przywoływania śladu pamięciowego.
Wyniki testu
Wpływ związku JT-3 na procesy pamięciowe w próbie nabycia
W labiryncie wodnym Morrisa, w próbie nabycia (dni 1-6), analiza wariancji z powtarzanymi pomiarami wykazała istotny statystycznie efekt podania substancji (F[2,132] = 136,5, p < 0,0001); wykazano również istotny statystycznie wpływ dnia próby na czas latencji odnalezienia platformy (F[5,132] = 18,06, p < 0,0001). Interakcja związek χ dzień próby była istotna statystycznie (F[10,132] = 1,967, p < 0,05).
W próbie nabycia analiza post hoc (test Dunnett’a) wykazała istotną statystycznie różnicę w czasie latencji odnalezienia ukrytej platformy pomiędzy grupą kontrolną, która otrzymała skopolaminę, a grupą, której podano skopolaminę i JT-3 w dawce 10 mg/kg tylko w dniu piątym próby (p < 0,01). (Fig. 2).
Wpływ związku JT-3 na procesy pamięciowe w fazie odtworzenia
Podczas siódmego dnia testu (próba odtworzenia, bez podania skopolaminy i JT-3) mierzono czas spędzony w strefie NW, liczbę przepłynięć miejsca, gdzie w fazie nabycia znajdowała się ukryta platforma, całkowity dystans, dystans przebyty w strefie docelowej (NW), czas do pierwszego wpłynięcia w strefę docelową oraz liczbę wpłynięć do tej strefy. Związek JT-3 nie wpływał na żaden z badanych parametrów (Fig. 3).
Na Figurze 3 przedstawiono wpływ związku JT-3 na procesy uczenia się w fazie nabycia w teście labiryntu wodnego Morrisa. Wyniki przedstawiono jako średnią latencję odnalezienia platformy [s] ±SEM. Analiza statystyczna: analiza wariancji z powtarzanymi pomiarami oraz test post hoc Dunnett’a. Istotność statystyczna względem grupy kontrolnej, która otrzymała skopolaminę: ** p < 0,01, **** p < 0,0001.
Na Figurze 4 przedstawiono wpływ związku JT-3 na odtwarzanie śladów pamięciowych w dniu 7. w teście labiryntu wodnego Morrisa. Wyniki przedstawiono jako średni czas w strefie NW [%] ±SEM, średnią liczbę przepłynięć przez miejsce, gdzie w dniach 1-6 znajdowała się platforma ±SEM, średni dystans całkowity [cm] ±SEM, średni czas, który upłynął do wpłynięcia w strefę NW [s] ±SEM, średnią liczbę wpłynięć w strefę NW ±SEM, średni dystans w strefie NW [%] ±SEM. Analiza statystyczna: jednoczynnikowa analiza wariancji oraz test post hoc Dunnett’a. Istotność statystyczna względem grupy kontrolnej, która w dniach 1-6 otrzymała skopolaminę: * - p < 0,05, *** - p < Ο,οΟι, **** - p < 0,0001.
Przykład 4.3. Test Labiryntu Barnes’a
Procedura testu
Test służy do badania pamięci przestrzennej (zależnej od hipokampa). W odróżnieniu od testu wodnego labiryntu Morrisa nie wykorzystuje dodatkowego stresora, jakim jest woda i wymuszone pływanie. Labirynt Barnes’a ma 18 otworów ewakuacyjnych (miejsc ucieczki) rozmieszczonych równomiernie na zewnętrznych krawędziach okrągłej platformy, a tylko jeden z nich prowadzi do pudełka tzw. escape box, w którym mysz może się schować. Przez pierwsze cztery dni (faza nabycia) mysz umieszczano na środku labiryntu w komorze startowej, zapalano światło, następnie podnoszono komorę i zaczynano mierzyć czas. Liczono też liczbę błędów, czyli do ilu otworów ewakuacyjnych mysz podeszła, przed podejściem po raz pierwszy do właściwego otworu oraz całkowitą liczbę błędów do momentu wejścia do otworu ewakuacyjnego. Jeżeli mysz po 180 s nie weszła do otworu ewakuacyjnego została tam naprowadzana przez eksperymentatora. Każda mysz była poddawano czterem próbom dziennie.
Piątego dnia, który jest fazą odtworzenia (bez podania związków), usunięto pudełko z otworu ewakuacyjnego i przez 90 s liczono całkowitą liczbę błędów, liczbę błędów popełnionych do momentu pierwszego podejścia myszy do otworu, gdzie wcześniej znajdywało się pole ucieczki oraz latencję do pierwszego podejścia myszy do tego otworu. Liczono również liczbę podejść do tego otworu oraz czas, jaki mysz przy nim spędziła. W dniu dwunastym - „test właściwy” (bez podania związków) oceniano wpływ związku na pamięć długoterminową. Doświadczenie przebiegało tak, jak w fazie odtwo rzenia; mierzono te same parametry. Między dniem piątym a dwunastym zwierzęta przebywały w klatkach domowych.
Wyniki testu
Wpływ związku JT-3 na proces uczenia się w fazie nabycia
W labiryncie Barnes’a, w próbie nabycia (dni 1-4), analiza wariancji z powtarzanymi pomiarami wykazała istotny statystycznie efekt leczenia na czas latencji odnalezienia miejsca ucieczki (F[2,96] = 14,83, p < 0,0001); wykazano również istotny statystycznie wpływ dnia próby na czas latencji odnalezienia tego miejsca (F[3,96] = 3,118, p < 0,05). Interakcja była istotna statystycznie (F[6,96] = 2,274, p < 0,05). Analiza post hoc (test Dunnett’a) wykazała istotne statystycznie różnice w czasie latencji odnalezienia miejsca ucieczki pomiędzy grupą kontrolną, która nie otrzymała skopolaminy oraz grupą kontrolną, której podano skopolaminę w dniach trzecim (p < 0,05) i czwartym testu (p < 0,01). Istotne statystycznie różnice zaobserwowano również pomiędzy grupą, która otrzymała skopolaminę i JT-3 w dawce 10 mg/kg, a grupą kontrolną, której podano skopolaminę w czwartym dniu testu (p < 0,05).
W próbie tej analiza wariancji z powtarzanymi pomiarami wykazała istotny statystycznie efekt leczenia na liczbę błędów popełnionych przed odnalezieniem miejsca ucieczki (F[2,93] = 7,653, p < 0,001). Ponadto, wykazano istotny statystycznie wpływ dnia próby na liczbę błędów popełnionych przed odnalezieniem tego miejsca (F[3,93] = 4,021, p < 0,01). Interakcja nie była istotna statystycznie (F[6,93] = 1,334, p = 0,25). Analiza post hoc (test Dunnett’a) nie wykazała znamiennych statystycznie różnic w liczbie błędów wykonanych przed odnalezieniem miejsca ucieczki pomiędzy grupą kontrolną i grupą kontrolną, która otrzymała skopolaminę a grupą, której podano skopolaminę i związek JT-3 w dawce 10 mg/kg (Fig. 5 i 6).
Na Figurze 5 przedstawiono wpływ związku JT-3 na procesy uczenia się w teście labiryntu Barnes’a w fazie nabycia. Wyniki przedstawiono jako średnią latencję do odnalezienia miejsca ucieczki [s] ±SEM. Analiza statystyczna: analiza wariancji z powtarzanymi pomiarami oraz analiza post hoc Dunnett’a. Istotność statystyczna względem grupy kontrolnej, która otrzymała skopolaminę: * p < 0,05, ** p < 0,01.
Na Figurze 6 przedstawiono wpływ związku JT-3 na liczbę błędów popełnionych przed dotarciem do celu w teście labiryntu Barnes’a w fazie nabycia. Wyniki przedstawiono jako średnią liczbę błędów popełnionych przed dotarciem do celu ±SEM w dniach 1-4 testu. Analiza statystyczna: analiza wariancji z powtarzanymi pomiarami oraz test post hoc Dunnett’a: p > 0,05.
Wpływ związku JT-3 na fazę odtworzenia - dzień 5. i dzień 12.
W dniu piątym (bez podania związku) jednoczynnikowa analiza wariancji wykazała istotną statystycznie różnicę pomiędzy grupami dla czasu latencji odnalezienia miejsca, gdzie znajdowało się wcześniej pole ucieczki (F[2,21] = 3,315, p = 0,0561), jednak nie dla liczby błędów popełnionych przed odnalezieniem tego pola (F[2,23] = 1,901, p = 0,1722). Analiza post hoc wyników dla dnia piątego wykazała znamienne statystycznie różnice pomiędzy grupą kontrolną, a grupą kontrolną, która otrzymywała skopolaminę w dniach 1-4 w czasie latencji do odnalezienia miejsca, gdzie znajdowało się pole ucieczki (p < 0,05). Związek JT-3 w dniu piątym nie był aktywny.
W dniu dwunastym jednoczynnikowa analiza wariancji wykazała istotny statystycznie wpływ związku JT-3 w dawce 10 mg/kg zarówno na czas latencji (F[2,24] = 6,928, p < 0,01), jak i liczbę błędów popełnionych przed dotarciem do celu (F[2,22] = 23,60, p < 0,0001).
Analiza post hoc wyników dla dnia dwunastego wykazała istotne statystycznie skrócenie czasu latencji do odnalezienia miejsca, gdzie znajdowało się pole ucieczki w grupie kontrolnej w porównaniu z grupą kontrolną, która otrzymała skopolaminę w dniach 1-4 (p < 0,01). W grupie otrzymującej JT-3 oraz skopolaminę skrócenie czasu latencji również było znamienne statystycznie w porównaniu z grupą kontrolną, której podano skopolaminę (p < 0,05).
Analiza post hoc wyników dla dnia dwunastego wykazała istotne statystycznie zmniejszenie liczby błędów popełnionych do odnalezienia miejsca, gdzie znajdowało się pole ucieczki w grupie kontrolnej w porównaniu z grupą kontrolną otrzymującą skopolaminę (p < 0,0001). Ponadto, w grupie, której podano badany związek JT-3 w dawce 10 mg/kg i skopolaminę, zmniejszenie liczby błędów było również znamienne statystycznie w porównaniu z grupą kontrolną, która otrzymała skopolaminę (p < 0,0001) (Fig. 7).
Na Figurze 7 przedstawiono wpływ związku JT-3 na odtwarzanie śladów pamięciowych w teście labiryntu Barnes’a w dniu piątym i dwunastym testu. Wyniki przedstawiono jako średnią latencję do odnalezienia miejsca ucieczki [s] ±SEM w dniu piątym i dwunastym oraz średnią liczbę błędów popeł nionych ±SEM w dniu piątym i dwunastym. Analiza statystyczna: jednoczynnikowa analiza wariancji oraz test post hoc Dunnett’a. Istotność statystyczna względem grupy kontrolnej, która w dniach 1-4 otrzymywała skopolaminę: * p < 0,05, **p < 0,01, **** p < 0,0001.
Przykład 4.4. Test ruchliwości spontanicznej
Procedura testu
W tym teście badany był wpływ związku JT-3 na ruchliwość spontaniczną myszy. Eksperyment przeprowadzony był w aktometrach (klatkach o wymiarze 40 cm χ 40 cm χ 30 cm), które wyposażone są w fotokomórki z czujnikiem impulsów. Aparat rejestrował liczbę ruchów poziomych i pionowych w czasie 60 min testu. Myszy wkładano do aktometru, pomiar trwał przez 1 h, w czasie której aparat liczył liczbę przekroczeń wiązek światła, czyli aktywność ruchową. 60 min przed rozpoczęciem badania myszom podano dootrzewnowo związek JT-3 w dawce 10 mg/kg. Myszom stanowiącym kontrolę podano 1% roztwór Tween 80. W trakcie pomiaru ograniczono do minimum wpływ czynników zewnętrznych na ruchliwość myszy (hałas, obecność ludzi w tym samym pomieszczeniu).
Wynik testu
Dla związku JT-3 test ruchliwości spontanicznej wykonano dla dwóch dawek - 10 mg/kg, którą użyto do innych testów oraz 30 mg/kg, która również była badana w teście biernego unikania. Żadna z tych dawek nie zaburzała ruchliwości zwierząt (F[2,13] = 2,220, p = 0,15), jednak po dawce wyższej liczba ruchów myszy była mniejsza niż po dawce niższej. Różnice te nie osiągnęły znamienności statystycznej (Fig. 8).
Na Figurze 8 przedstawiono wpływ związku JT-3 na ruchliwość spontaniczną myszy. Wyniki przedstawiono jako średnią liczbę ruchów ±SEM wykonanych przez myszy w ciągu 60 min testu. Analiza statystyczna: jednoczynnikowa analiza wariancji oraz test post hoc Dunnett’a: p > 0,05.
P r z y k ł ad 4.5. Test pręta obrotowego
Procedura testu
Przed przeprowadzeniem doświadczenia myszy były odpowiednio przetrenowane (3 dni, prędkość obrotu pręta: 18 obrotów/min). Urządzenie składa się z pręta ustawionego w pozycji poziomej. Ma on długość 75 cm i jest podzielony na 4 tory, wprawiany jest w ruch obrotowy za pomocą silnika elektrycznego. Ten metalowy pręt jest umieszczony 50 cm nad stołem, aby zniechęcić myszy do zeskakiwania z niego. W dniu właściwego testu, 24 h po ostatnim treningu zwierząt, myszy umieszczano kolejno na pręcie na czas 60 s (dla każdej prędkości obrotu). Szybkość obracania się pręta ustawiono na kolejno 6, 18 i 24 obrotów/min. Niezdolność myszy do utrzymania się na pręcie przez 60 s uznawano za zaburzenie koordynacji ruchowej.
Wynik testu
W teście pręta obrotowego oceniono wpływ związku JT-3 podanego w dawkach 10 mg/kg i 30 mg/kg na koordynację motoryczną myszy. Nie stwierdzono negatywnego wpływu badanych dawek związku JT-3 na koordynację ruchową zwierząt. Wszystkie zwierzęta utrzymywały się na pręcie przez 60 s przy prędkościach 6, 18 i 24 obrotów/min.
Bibliografia:
G.L. Ellman, K.D. Courtney, V. Andres Jr., R.M. Featherstone, A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical pharmacology, 1961, 7.2: 88-95.
R. Vassar, B. D. Bennett, S. Babu-Khan, S. Kahn, E. A. Mendiaz, P. Denis, D.B. Teplow, S. Ross, P. Amarante, R. Loeloff, Y. Luo, S. Fisher, J. Fuller, S. Edenson, J. Lile, M.A. Jarosinski, A.L. Biere, E. Curran, T. Burgess, J.C. Louis, F. Collins, J. Treanor, G. Rogers, M. Citron, β-Secretase cleavage of Alzheimer’s amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. science, 1999, 286.5440: 735-741.
Stachel, Shawn J., et al. Structure-based design of potent and selective cell-permeable inhibitors of human β-secretase (BACE-1). Journal of medicinal chemistry, 2004, 47.26: 6447-6450.
Levine III, H. Solution beta-amyloid peptides: detection of amyloid aggregation in thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer’s disease. Protein Sci., 1993, 2: 404-410.
J. Misik, E. Nepovimova, J. Pejchal, J. Kassa, J. Korabecny, O. Soukup, Cholinesterase Inhibitor 6-Chlorotacrine - In Vivo Toxicological Profile and Behavioural Effects, Curr. Alzheimer Res. 15 (2017) 552-560.
K. L. Chapman, H. Holzgrefe, L.E. Black, M. Brown, G. Chellman, C. Copeman, J. Couch, S. Creton, S. Gehen, A. Hoberman, L.B. Kinter, S. Madden, C. Mattis, H.A. Stemple, S. Wilson, Phar
PL 243516 Β1 maceutical toxicology: Designing studies to reduce animal use, while maximizing human translation, Reguł. Toxicol. Pharmacol. 66 (2013) 88-103.
J. Pejchal, J. Novotny, V. Mafak, J. Ósterreicher, A. Tichy, J. Vavrova, Z. Śinkorova, L. Zarybnicka, E. Novotna, J. Chladek, A. Babicova, K. Kubelkova, K. Kuca, Activation of p38 MAPK and expression of TGF-βΙ in rat colon enterocytes after whole body γ-irradiation, Int. J. Radiat. Biol. 88 (2012)348-358.
Research, C. for D. E. and. Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry http://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/bioanalytical-method-validation-guidance-industry (accessed Jan 3, 2020).
https://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidance/ucm070107.pdf
Anonymous. Bioanalytical method validation https://www.ema.europa.eu/en/bioanalytical-method-validation (accessed Jan 3, 2020).

Claims (5)

1. Związek o wzorze I:
wzór T gdzie:
n lub m oznacza liczbę całkowitą o wartości 0 lub 1,
Ri lub R2 oznacza H lub CH3,
R3 oznacza H, CH3, CF3, fert-butyl, cyklopropyl, cykloheksyl lub grupę:
O-R4 gdzie R4 oznacza: H, 2, 3 lub 4 -OCH3, 2, 3 lub 4 CF3, 2, 3 lub 4 izopropyl, lub fert-butyl, lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
2. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest związkiem o wzorze II:
wzór II gdzie
R1, R2 i R3 oznaczają grupy określone w zastrz. 1.
3. Związek według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że jest związkiem wybranym z grupy obejmującej:
(2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-(benzylamino)-4-fenylobutan-2-ol, (2 S ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-(benzyloamino)-4-fenylobutan-2-ol, (2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-((3-( tert-butylo)benzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, (2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-((3-izopropylobenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, (2 S ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-((4-( tert-butylo)benzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, (2 S ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-((3-metoksybenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, (2 S ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-((2-metoksybenzylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, (2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-4-fenylo-1-((3-(trifluorometylo)benzylo)amino)-butan-2-ol, (2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-4-fenylo-1-((( S )-1-fenyloetylo)amino)butan-2-ol, (2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-4-fenylo-1-((2-fenylopropan-2-ylo)amino)butan-2-ol, (2 S ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-((cykloheksylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, (2 S ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-( tert-butyloamino)-4-fenylobutan-2-ol, (2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-(neopentyloamino)-4-fenylobutan-2-ol, (2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-4-fenylo-1-((2,2,2-trifluoroetylo)amino)butan-2-ol, (2 S ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-((cyklopropylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol, (2 R ,3 S )-3-((9 H-fluoren-9-ylo)amino)-1-((cyklopropylometylo)amino)-4-fenylobutan-2-ol,
N-((2 S ,3 S )-4-(benzyloamino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)-2-(9 H-fluoreno-9-ylo)acetamid,
N-((2 S ,3 S )-4-((4-( tert-butylo)benzylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)-9 H-fluoreno-9-karboksyamid,
N-((2 S ,3 S )-4-((4-( tert-butylo)benzylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)-2-(9 H-fluoreno-9-ylo)acetamid,
2-(9 H-fluoreno-9-ylo)-N-((2 S ,3 S )-3-hydroksy-4-((2-metoksybenzylo)amino)-1-fenylobutan-2-ylo)acetamid,
2-(9 H-fluoren-9-ylo)-N-((2 S ,3 R )-3-hydroksy-1-fenylo-4-((3-(trifluorometylo)benzylo)-amino)butan-2-ylo)acetamid,
N-((2 S ,3 R )-3-hydroksy-1-fenylo-4-((( S )-1-fenyloetylo)amino)butan-2-ylo)-9 H-fluoreno-9-karboksyamid,
2-(9 H-fluoren-9-ylo)-N-((2 S ,3 R )-3-hydroksy-1-fenylo-4-((( S )-1-fenyloetylo)amino)butan-2-ylo)acetamid,
N-((2 S ,3 R )-3-hydroksy-1-fenylo-4-((2-fenylopropan-2-ylo)amino)butan-2-ylo)-9 H-fluoreno-9-karboksyamid,
2-(9 H-fluoren-9-ylo)-N-((2 S ,3 R )-3-hydroksy-1-fenylo-4-((2-fenylopropan-2-ylo)amino)-butan-2-ylo)acetamid,
N-((2 S ,3 R )-3-hydroksy-4-(neopentyloamino)-1-fenylobutan-2-ylo)-9 H-fluoreno-9-karboksyamid, 2-(9 H-fluoren-9-ylo)-N-((2 S ,3 R )-3-hydroksy-4-(neopentyloamino)-1-fenylobutan-2-ylo)acetamid i N-((2 S ,3 R )-4-((cyklopropylometylo)amino)-3-hydroksy-1-fenylobutan-2-ylo)-2-(9 H-fluoren-9-ylo)acetamid.
4. Związek określony w zastrz. 1-3 do stosowania w farmacji.
5. Związek określony w zastrz. 1-3 do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu choroby Alzheimera, zwłaszcza jako wielofunkcyjny inhibitor enzymów BuChE, BACE1 oraz agregacji beta-amyloidu.
PL434014A 2020-05-20 2020-05-20 Nowe pochodne 9H-fluorenu lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole PL243516B1 (pl)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL434014A PL243516B1 (pl) 2020-05-20 2020-05-20 Nowe pochodne 9H-fluorenu lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole
US17/907,152 US20230117233A1 (en) 2020-05-20 2021-05-20 Novel 9h-fluorene derivatives or their pharmaceutically acceptable salts
PCT/PL2021/050033 WO2021235956A2 (en) 2020-05-20 2021-05-20 Novel 9h-fluorene derivatives or their pharmaceutically acceptable salts
EP21745463.6A EP4153561A2 (en) 2020-05-20 2021-05-20 9h-fluoren derivates or their pharmaceutically acceptable salts

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL434014A PL243516B1 (pl) 2020-05-20 2020-05-20 Nowe pochodne 9H-fluorenu lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL434014A1 PL434014A1 (pl) 2021-11-22
PL243516B1 true PL243516B1 (pl) 2023-09-04

Family

ID=77022165

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL434014A PL243516B1 (pl) 2020-05-20 2020-05-20 Nowe pochodne 9H-fluorenu lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230117233A1 (pl)
EP (1) EP4153561A2 (pl)
PL (1) PL243516B1 (pl)
WO (1) WO2021235956A2 (pl)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY27967A1 (es) * 2002-09-10 2004-05-31 Pfizer Acetil 2-hindroxi-1,3-diaminoalcanos
US20050239836A1 (en) * 2004-03-09 2005-10-27 Varghese John Substituted hydroxyethylamine aspartyl protease inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
PL434014A1 (pl) 2021-11-22
WO2021235956A2 (en) 2021-11-25
WO2021235956A3 (en) 2022-02-03
EP4153561A2 (en) 2023-03-29
US20230117233A1 (en) 2023-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Viayna et al. Synthesis and multitarget biological profiling of a novel family of rhein derivatives as disease-modifying anti-Alzheimer agents
CA2149924C (en) Use of phenserine to treat cognitive disorders
Makhaeva et al. Amiridine-piperazine hybrids as cholinesterase inhibitors and potential multitarget agents for Alzheimer's disease treatment
Prinz et al. 1, 4-Substituted 4-(1H)-pyridylene-hydrazone-type inhibitors of AChE, BuChE, and amyloid-β aggregation crossing the blood–brain barrier
US11026910B2 (en) α- and γ-truxillic acid derivatives and pharmaceutical compositions thereof
Meden et al. Structure-activity relationship study of tryptophan-based butyrylcholinesterase inhibitors
Liu et al. Design, synthesis, and biological evaluation of novel (4-(1, 2, 4-oxadiazol-5-yl) phenyl)-2-aminoacetamide derivatives as multifunctional agents for the treatment of Alzheimer's disease
WO2014134306A1 (en) Heterocyclic inhibitors of the sodium channel
EP2681209B1 (en) Compounds and methods for the treatment of pain and other disorders
Krátký et al. Investigation of salicylanilide and 4-chlorophenol-based N-monosubstituted carbamates as potential inhibitors of acetyl-and butyrylcholinesterase
Panek et al. Discovery of new, highly potent and selective inhibitors of BuChE-design, synthesis, in vitro and in vivo evaluation and crystallography studies
CN111417620B (zh) 肌酸前药、其组合物以及使用方法
CN111170884B (zh) 一类水杨酰胺类化合物、其制备方法和用途
Wang et al. Design, Synthesis, and Proof of Concept of Balanced Dual Inhibitors of Butyrylcholinesterase (BChE) and Histone Deacetylase 6 (HDAC6) for the Treatment of Alzheimer’s Disease
Pasieka et al. Novel drug-like fluorenyl derivatives as selective butyrylcholinesterase and β-amyloid inhibitors for the treatment of Alzheimer’s disease
Xia et al. Design, synthesis, and biological evaluation of novel tryptanthrin derivatives as selective acetylcholinesterase inhibitors for the treatment of Alzheimer's disease
PL243516B1 (pl) Nowe pochodne 9H-fluorenu lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole
US20220073461A1 (en) (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)(phenyl)-acetamide derivatives and their use in the treatment of neurological diseases
Gryzło et al. Novel functionalized amino acids as inhibitors of GABA transporters with analgesic activity
ES2340298T3 (es) Inhibidores selectivos de butirilcolinesterasa.
WO2012031118A2 (en) Cell permeable inhibitors of anaphase promoting complex
JP2002540197A (ja) 抗菌剤
Tan et al. Discovery of cinnamamide/ester triazole hybrids as potential treatment for Alzheimer’s disease
US10556892B2 (en) Piperazinyl methanone NAAA inhibitors
KUMAR et al. Synthesis and acetylcholinesterase/butyrylcholinesterase inhibition activity of arecoline-, 4-thiazolidinone-and piperidine-based conjugates