PL242781B1

PL242781B1 - Water extract of allantoin from lichens of the genus Physcia and Phaeophyscia for use in dermatological preparations

Info

Publication number: PL242781B1
Application number: PL433604A
Authority: PL
Inventors: Sławomir Dresler; Roman Paduch; Maciej Strzemski; Hanna Wójciak; Ireneusz Sowa; Magdalena Wójciak; Barbara Hawrylak-Nowak
Original assignee: Univ M Curie Sklodowskiej; Univ Medyczny W Lublinie; Univ Przyrodniczy W Lublinie
Priority date: 2020-04-20
Filing date: 2020-04-20
Publication date: 2023-04-24
Also published as: PL433604A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest wodny ekstrakt alantoiny z porostów z rodzaju Physcia i Phaeophyscia, wyizolowany z gatunków Physcia dubia, Physcia adscendens i Phaeophyscia orbicularis do zastosowania w preparatach dermatologicznych regenerujących uszkodzoną skórę, zwłaszcza w leczeniu ran po oparzeniu różnej etiologii, zakażeń bakteryjnych i grzybiczych skóry, pielęgnacji skóry w łuszczycy, trądziku czy też regeneracji skóry podrażnionej, wysuszonej oraz skłonnej do stanów zapalnych.The subject of the invention is an aqueous extract of allantoin from lichens of the genus Physcia and Phaeophyscia, isolated from the species Physcia dubia, Physcia adscendens and Phaeophyscia orbicularis, for use in dermatological preparations regenerating damaged skin, especially in the treatment of burn wounds of various etiologies, bacterial and fungal skin infections, skin care skin in psoriasis, acne or regeneration of irritated, dry and prone to inflammation skin.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest wodny ekstrakt alantoiny z porostów z rodzaju Physcia i Phaeophyscia, w szczególności gatunków: Physcia dubia, Physcia adscendens i Phaeophyscia orbicularis, przedstawionych na rysunku w postaci zdjęć odpowiednio jako fig. 1, fig. 2 i fig. 3, do zastosowania w leczeniu ran skóry różnej etiologii, zwłaszcza po oparzeniach, zakażeniach bakteryjnych czy grzybiczych, a także pielęgnacji skóry w łuszczycy, trądziku czy też skóry podrażnionej, wysuszonej oraz skłonnej do stanów zapalnych.The subject of the invention is an aqueous extract of allantoin from lichens of the genus Physcia and Phaeophyscia, in particular the species: Physcia dubia, Physcia adscendens and Phaeophyscia orbicularis, shown in the drawing in the form of photographs as Fig. 1, Fig. 2 and Fig. 3, respectively, for use in treatment of skin wounds of various etiologies, especially after burns, bacterial or fungal infections, as well as skin care in psoriasis, acne or irritated, dry and inflammatory skin.

Znane jest z opisu patentowego PL 233572 zastosowanie alantoiny jako substancji czynnej w różnego rodzaju preparatach dermatologicznych i pielęgnacyjnych w postaci maści lub zasypek służących do pielęgnacji zarówno skóry dorosłych jak i dzieci, jednakże w tym przypadku, istnieje poważne ograniczenie w dostępności surowców roślinnych będących źródłem pozyskiwania alantoiny. Alantoina stosowana jest również w kosmetyce, przykładowo do produkcji nawilżających i zmiękczających skórę emulsji płynnych, kremów, żeli pod prysznic, antyperspirantów, a także kosmetyków pielęgnacyjnych dla dzieci. Jak podaje Fedoreyev i wsp. w artykule „Production of alantoin, rabdosiin and rosmarinic acid in callus cultures of the seacoastal plant Mertensia maritima (Boraginaceae)” (Plant Cell Tiss. Organ. Cult., 2012, 110:183-188) alantoina znalazła zastosowanie w ponad 1300 preparatach kosmetycznych.It is known from the patent description PL 233572 to use allantoin as an active substance in various types of dermatological and care preparations in the form of ointments or powders for the care of both adult and children's skin, however, in this case there is a serious limitation in the availability of plant materials that are the source of obtaining allantoin . Allantoin is also used in cosmetics, for example in the production of moisturizing and skin softening liquid emulsions, creams, shower gels, antiperspirants, as well as baby care cosmetics. According to Fedoreyev et al. in the article "Production of allantoin, rhabdosiin and rosmarinic acid in callus cultures of the seacoastal plant Mertensia maritima (Boraginaceae)" (Plant Cell Tiss. Organ. Cult., 2012, 110:183-188), allantoin was found used in over 1,300 cosmetic preparations.

Znanym dotychczas, innym źródłem pozyskiwania naturalnej alantoiny stosowanej w dostępnych na rynku preparatach, są rośliny z rodziny Boraginaceae takie jak, żywokost lekarski, farbownik lekarski czy różne gatunki żmijowca, które obok aktywnej substancji alantoiny, wykazują również obecność toksycznych alkaloidów pirolizydynowych, które jak podaje Wang i in. w artykule „Metabolic activation of pyrrolizidine alkaloids leading to phototoxicity and photogenotoxicity in myman HaCaT keratinocytes” (J. Environ. Sci. Health Environ Carcinog. Ecotoxicol. Rev.,2014,32) obok działania heptotoksycznego mogą wykazywać działanie kancerogenne skóry.Known so far, another source of obtaining natural allantoin used in preparations available on the market, are plants from the Boraginaceae family, such as comfrey, medical dye or various species of echium, which, apart from the active substance of allantoin, also show the presence of toxic pyrrolizidine alkaloids, which, according to Wang et al. in the article "Metabolic activation of pyrrolizidine alkaloids leading to phototoxicity and photogenotoxicity in myman HaCaT keratinocytes" (J. Environ. Sci. Health Environ Carcinog. Ecotoxicol. Rev., 2014, 32) in addition to heptotoxic activity, they may have a carcinogenic effect on the skin.

Celem wynalazku było pozyskanie biologicznie aktywnej substancji - alantoiny z naturalnego, ekologicznego i łatwo dostępnego surowca.The aim of the invention was to obtain a biologically active substance - allantoin from a natural, ecological and easily available raw material.

Istotą wynalazku jest wodny ekstrakt alantoiny o wysokiej zawartości alantoiny wraz z mieszaniną polifenoli, otrzymywany z porostów z rodzaju Physcia i Phaeophyscia do zastosowania w leczeniu ran skóry różnej etiologii, zwłaszcza po oparzeniach, zakażeniach bakteryjnych czy grzybiczych.The essence of the invention is an aqueous extract of allantoin with a high content of allantoin together with a mixture of polyphenols, obtained from lichens of the genus Physcia and Phaeophyscia for use in the treatment of skin wounds of various etiology, especially after burns, bacterial or fungal infections.

Wynalazek rozwiązuje problem techniczny w postaci pozyskania naturalnej, biologicznie akty wnej substancji znajdującej zastosowanie jako składnik różnych preparatów maści, mazideł czy emulsji mających zastosowanie w leczeniu schorzeń skóry różnej etiologii, jej regeneracji i pielęgnacji.The invention solves the technical problem of obtaining a natural, biologically active substance that can be used as a component of various ointments, liniments or emulsions used in the treatment of skin diseases of various etiologies, its regeneration and care.

Stosunkowo duża zawartość alantoiny wraz z mieszaniną polifenoli w tak pozyskanym ekstrakcie, w znacznym stopniu powoduje usuwanie tkanki martwiczej skóry, oczyszcza rany, a także pobudza regenerację naskórka i wszelkie procesy naskórkowania.The relatively high content of allantoin together with a mixture of polyphenols in the extract obtained in this way significantly removes necrotic skin tissue, cleanses wounds, and stimulates the regeneration of the epidermis and all epidermal processes.

Zarówno wynalazek jak i jego skutki działania w leczeniu dermatologicznym przedstawiono w poniższych przykładach wykonania.Both the invention and its effects in dermatological treatment are shown in the following embodiments.

Przykład 1.Example 1.

Sposób otrzymywania ekstraktów według wynalazku.Method of obtaining extracts according to the invention.

Piechy porostów z poszczególnych gatunków Physcia dubia, Physcia adscendens i Phaeophyscia orbicularis, oczyszczono, oddzielono od kory drzew, wysuszono, zmielono i przesiano przez sito o średnicy oczek 1,6 mm. Poszczególne próbki o wadze 10 g zwilżono alkoholem etylowym, a po odparowaniu alkoholu zalano 50 ml wody destylowanej i homogenizowano w porcelanowym moździerzu. Po procesie kawitacji z użyciem łaźni ultradźwiękowej o mocy ultradźwięków 240 W oraz częstotliwości 35 kHz, przeprowadzano ekstrakcję każdej z próbek w ciągu ok. 30 minut, w temperaturze 50°C. Następnie, części stałe homogenatu oddzielano od roztworu poprzez wirowanie i przesączenie przez filtr strzykawkowy o średnicy porów 0,45 μm. Metodą elektroforezy kapilarnej określano zawartość alantoiny na poziomie 0,148 g; 0,280 g; oraz 0,160 g w 100 g wodnego ekstraktu odpowiednio w Phaeophyscia orbicularis, Physcia dubia oraz Physcia adscendens, w odniesieniu do wzorca alantoiny o czystości >98%. Wyliczoną średnią z trzech pomiarów zawartość alantoiny w wybranych gatunkach porostów z rodzaju Physcia i Phaeophyscia przedstawiono w poniższej tabeli 1.Lichen buds from particular species of Physcia dubia, Physcia adscendens and Phaeophyscia orbicularis were cleaned, separated from tree bark, dried, ground and sieved through a sieve with a mesh size of 1.6 mm. Individual samples weighing 10 g were wetted with ethyl alcohol, and after the alcohol had evaporated, 50 ml of distilled water were poured over them and homogenized in a porcelain mortar. After the cavitation process using an ultrasonic bath with an ultrasound power of 240 W and a frequency of 35 kHz, each sample was extracted for about 30 minutes at a temperature of 50°C. The solids of the homogenate were then separated from the solution by centrifugation and filtration through a 0.45 Pm syringe filter. The content of allantoin was determined at the level of 0.148 g by capillary electrophoresis; 0.280g; and 0.160 g in 100 g of aqueous extract in Phaeophyscia orbicularis, Physcia dubia and Physcia adscendens, respectively, relative to the allantoin standard with a purity of >98%. The calculated average of three measurements of allantoin content in selected species of lichens of the genus Physcia and Phaeophyscia is presented in Table 1 below.

PL 242781 Β1PL 242781 B1

Tabela 1.Table 1.

Gatunek Species I Zawartość alantoiny (% s.m.) I Allantoin content (% DM) Phaeophyscia orbicularis Phaeophyscia orbicularis I 0,74% and 0.74% Physcia dubia Physcia dubia I 1,40% I 1.40% Physcia adscendens Physcia adscendens 0,80% 0.80%

Przykład 2.Example 2.

Wpływ ekstraktów według wynalazku na żywotność komórek skóry.Effect of the extracts according to the invention on the viability of skin cells.

Wodne ekstrakty otrzymane w przykładzie 1. Physcia dubia, Physcia adscendens i Phaeophyscia orbicularis o różnych, stężeniach alantoiny zawierających się w granicach 25-250 pg/ml wykorzystano do eksperymentów opartych o analizy toksyczności wyrażonych jako stabilność błon komórkowych (metoda Neutral Red uptake) i wpływu na aktywność enzymu dehydrogenazy bursztynianowej związanej z metabolizmem komórkowych (metoda MTT). Badania przeprowadzono z wykorzystaniem ludzkich fibroblastów skóry właściwej. Komórki hodowano w płynie RPMI 1640 z dodatkiem 10% surowicy cielęcej. Inkubację komórek a następnie badanie prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze zawierającej 5% przepływ CO2. Zasadniczą analizę przeprowadzono w sterylnych płytkach 96-dołkowych, stosując gęstość komórek wynoszącą 1 χ 10⁵ komórek/ml (1 χ 10⁴ komórek/dołek). Inkubację komórek z badanymi ekstraktami prowadzono przez 24 godziny.Aqueous extracts obtained in Example 1. Physcia dubia, Physcia adscendens and Phaeophyscia orbicularis with different allantoin concentrations ranging from 25-250 pg/ml were used for experiments based on the analysis of toxicity expressed as the stability of cell membranes (Neutral Red uptake method) and on the activity of the succinate dehydrogenase enzyme associated with cell metabolism (MTT method). The studies were conducted using human dermal fibroblasts. Cells were cultured in RPMI 1640 fluid supplemented with 10% calf serum. Cell incubation followed by testing was carried out at 37°C in an atmosphere containing 5% CO2 flow. The primary analysis was performed in sterile 96-well plates using a cell density of ^1χ105 cells/ml ( ^1χ104 cells/well). Cells were incubated with the tested extracts for 24 hours.

Wpływ różnych stężeń ekstraktu na aktywność dehydrogenazy bursztynianowej żywych komórek oraz stabilność błon komórkowych ludzkich fibroblastów skóry właściwej, przeanalizowano z użyciem metod spektrofotometrycznych - MTT opartej na ocenie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej żywych komórek oraz NR oceniającej stabilność błon komórkowych.The effect of different concentrations of the extract on the activity of succinate dehydrogenase of living cells and the stability of cell membranes of human dermal fibroblasts was analyzed using spectrophotometric methods - MTT based on the assessment of succinate dehydrogenase activity of living cells and NR assessing the stability of cell membranes.

Wyniki w postaci % żywotności komórek zadawanych ekstraktami według wynalazku (oznaczone metodą NR) i % metabolizmu komórkowego (oznaczony metodą MTT), w porównaniu z próbą kontrolną - czyste komórki skóry, przedstawiono w tabelach 2, 3 i 4. Otrzymane wyniki żywotności oparte o metodę MTT wskazują, że badane ekstrakty nie ograniczają metabolizmu mitochondrialnego, a nawet przy zastosowaniu stężeń powyżej 200 pg/ml aktywność dehydrogenazy bursztynianowej wzrastała w porównaniu do kontroli. Przeprowadzona obserwacja wskazuje, że komórki poddane działaniu badanych ekstraktów utrzymują lub zwiększają swój metabolizm, co może sugerować pozytywny wpływ badanych ekstraktów na ewentualne ich wykorzystanie nie tylko jako czynniki użyteczne kosmetycznie lecz również lecznicze. Wynik taki jest odzwierciedleniem pozytywnego wpływu preparatu na zwiększenie żywotności komórek badanych fibroblastów, co pośrednio świadczy o terapeutycznych właściwościach preparatu w zakresie regeneracji uszkodzonej skóry. Wyniki testu NR nie wykazują istotnego wpływu preparatu na stabilność błon komórkowych, co potwierdza fakt braku toksycznych właściwości preparatu. Ponadto, ekstrakt z Physcia adscendens pobudza podziały komórkowe, o czym świadczy wzrost uzyskanych wyników, a tym samym ilości komórek do wartości przekraczających 6% w stosunku do kontroli przy zastosowaniu stężenia ekstraktu wynoszącym 225 pg/ml. Wynik ten wskazuje na pozytywny wpływ badanego ekstraktu na potencjalne pobudzenie własności regeneracyjnych skóry, której istotnym składnikiem są fibroblasty tkanki łącznej.The results in terms of % cell viability treated with the extracts according to the invention (determined by the NR method) and % cell metabolism (determined by the MTT method), compared to the control sample - pure skin cells, are presented in tables 2, 3 and 4. The obtained viability results based on the method MTT indicate that the tested extracts do not limit mitochondrial metabolism, and even at concentrations above 200 pg/ml, the activity of succinate dehydrogenase increased compared to the control. The conducted observation indicates that the cells treated with the tested extracts maintain or increase their metabolism, which may suggest a positive effect of the tested extracts on their possible use not only as cosmetic but also therapeutic agents. This result reflects the positive effect of the preparation on increasing the cell viability of the examined fibroblasts, which indirectly proves the therapeutic properties of the preparation in the regeneration of damaged skin. The results of the NR test do not show a significant effect of the preparation on the stability of cell membranes, which confirms the lack of toxic properties of the preparation. In addition, the Physcia adscendens extract stimulates cell division, as evidenced by the increase in the obtained results, and thus the number of cells to values exceeding 6% compared to the control using the extract concentration of 225 pg/ml. This result indicates a positive effect of the tested extract on the potential stimulation of the regenerative properties of the skin, an important component of which are connective tissue fibroblasts.

Dodatkowo, wykonano obserwację komórek ludzkich fibroblastów potraktowanych ekstraktem Physcia dubia pod mikroskopem z wykorzystaniem metody May-Grunwald-Giemsa. Zdjęcia mikroskopowe, oznaczone na rysunku jako fig. 4 - obraz kontrolny - bez zastosowania preparatu według wynalazku, fig. 5 - komórki ludzkich fibroblastów potraktowane roztworem ekstraktu Physcia dubia o stężeniu - 25 pg/ml, fig. 6 - komórki ludzkich fibroblastów potraktowane roztworem ekstraktu Physcia dubia o stężeniu - 125 pg/ml, a fig. 7 - komórki ludzkich fibroblastów potraktowane roztworem ekstraktu Physcia dubia o stężeniu 225 pg/ml, uwidaczniają jądra komórkowe jako najciemniejsze obszary, zaś jaśniejsze wokół nich to cytoplazma.In addition, human fibroblast cells treated with Physcia dubia extract were observed under a microscope using the May-Grunwald-Giemsa method. Microscopic photos, marked in the figure as Fig. 4 - control image - without using the preparation according to the invention, Fig. 5 - human fibroblast cells treated with a solution of Physcia dubia extract at a concentration of -25 pg/ml, Fig. 6 - human fibroblast cells treated with a solution of the extract Physcia dubia at -125 pg/ml, and Fig. 7 - human fibroblast cells treated with Physcia dubia extract solution at 225 pg/ml show the cell nuclei as the darkest areas, while the lighter areas around them are the cytoplasm.

Wizualizacja efektu działania preparatu na zdrowe komórki ludzkich fibroblastów nie wykazała istotnych różnic w morfologii tych komórek w stosunku do kontroli.Visualization of the effect of the preparation on healthy human fibroblast cells showed no significant differences in the morphology of these cells compared to the control.

Claims

1. Water extract of allantoin from lichens of the genus Physcia and Phaeophyscia for use in the treatment of skin wounds of various etiologies, especially after burns, bacterial or fungal infections.